Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN messager (ARNm), comme l’épissage alternatif, jouent un rôle important dans la régulation du développement embryonnaire, de la fonction cellulaire et de l’immunité. De nouvelles évidences révèlent que l’épissage alternatif serait également impliqué dans la régulation de la maturation et de l’activation des cellules du système hématopoïétique. Le facteur hnRNP L a été identifié comme étant le principal régulateur de l’épissage alternatif du gène codant pour le récepteur CD45 in vitro. Le récepteur CD45 est une tyrosine phosphatase exprimée par toutes les cellules du système hématopoïétique qui contrôle le développement et l’activation des lymphocytes T. Dans un premier temps, nous avons étudié la fonction du facteur hnRNP L dans le développement des lymphocytes T et dans l’épissage de l’ARNm de CD45 in vivo en utilisant des souris dont le gène de hnRNP L a été supprimé spécifiquement dans les cellules T. La délétion de hnRNP L dans les thymocytes résulte en une expression aberrante des différents isoformes de CD45 avec une prédominance de l'isoforme CD45RA qui est généralement absent dans le thymus. Une conséquence de la délétion de hnRNP L est une diminution de la cellularité du thymus causée par un blocage partiel du développement des cellules pré-T au stade DN4. Cette réduction du nombre de cellules dans le thymus n’est pas liée à une hausse de la mort cellulaire. Les thymocytes déficients pour hnRNP L démontrent plutôt une prolifération augmentée comparée aux thymocytes sauvages due à une hyper-activation des kinases Lck, Erk1/2 et Akt. De plus, la délétion de hnRNP L dans le thymus cause une perte des cellules T en périphérie. Les résultats des expériences in vitro suggèrent que cette perte est principalement due à un défaut de migration des thymocytes déficients pour hnRNP L du thymus vers la périphérie en réponse aux chimiokines. L’épissage alternatif de CD45 ne peut expliquer ce phénotype mais l’identification de cibles par RNA-Seq a révélé un rôle de hnRNP L dans la régulation de l’épissage alternatif de facteurs impliqués dans la polymérisation de l’actine. Dans un second temps, nous avons étudié le rôle de hnRNP L dans l’hématopoïèse en utilisant des souris dont la délétion de hnRNP L était spécifique aux cellules hématopoïétiques dans les foies fœtaux et la moelle osseuse. L’ablation de hnRNP L réduit le nombre de cellules progénitrices incluant les cellules progénitrices lymphocytaires (CLPs), myéloïdes (CMPs, GMPs) et mégakaryocytes-érythrocytaires (MEPs) et une perte des cellules hématopoïétiques matures. À l’opposé des cellules progénitrices multipotentes (MPPs) qui sont affectées en absence de hnRNP L, la population de cellules souches hématopoïétiques (HSCs) n’est pas réduite et prolifère plus que les cellules contrôles. Cependant, les HSCs n’exprimant pas hnRNP L sont positives pour l'Annexin V et expriment CD95 ce qui suggère une mort cellulaire prononcée. Comme pour les thymocytes, une analyse par RNA-Seq des foies fœtaux a révélé différents gènes cibles de hnRNP L appartenant aux catégories reliées à la mort cellulaire, la réponse aux dommages à l’ADN et à l’adhésion cellulaire qui peuvent tous expliquer le phénotype des cellules n’exprimant pas le gène hnRNP L. Ces résultats suggèrent que hnRNP L et l’épissage alternatif sont essentiels pour maintenir le potentiel de différenciation des cellules souches hématopoïétiques et leur intégrité fonctionnelle. HnRNP L est aussi crucial pour le développement des cellules T par la régulation de l’épissage de CD45 ainsi que pour leur migration. / Post-transcriptional modifications of pre-mRNA by alternative splicing are important for cellular function, development and immunity. New evidence reveals that alternative splicing is implicated in the regulation of maturation and activation of hematopoietic cells. HnRNP L has been identified as the main regulator of alternative splicing of CD45 in vitro. The receptor tyrosine phosphatase CD45, which is expressed on all hematopoietic cells, is known for its role in the development and activation of T cells. First, we have investigated the function of hnRNP L in T cell development and CD45 pre-mRNA splicing in vivo using T cell specific deletion of hnRNP L in mice. The hnRNP L deletion results in aberrant expression of CD45 isoforms, predominantly CD45RA, which is usually absent from the thymus. Ablation of hnRNP L results in a partial block in pre-T cell development at the DN4 stage. This reduction in thymic cellularity is not due to an increase in cell death. In fact, hnRNP L deficient thymocytes demonstrate accelerated proliferation compared to wild-type cells due principally to a hyper-activation of the kinases Lck, Erk1/2 and Akt. Moreover, hnRNP L deletion results in a loss of peripheral T cells. In vitro studies suggest that this loss of peripheral cells is caused by a defect in response to chemokine signals. Since CD45 pre-mRNA splicing cannot explain this phenotype, the identification of hnRNP L targets by RNA-Seq has shown that hnRNP L plays a role in the regulation of alternative splicing of factors involved in actin polymerization. Secondly, we studied the role of hnRNP L in hematopoiesis using knockout mice in which hnRNP L is conditionally deleted specifically in fetal liver and bone marrow hematopoietic cells. Ablation of hnRNP L reduces the number of cell lineage committed progenitors including the common lymphoid progenitors (CLPs), common myeloid and granulocyte progenitors (CMPs, GMPs) and the megakaryocyte-erythrocyte progenitors (MEPs) as well as the mature hematopoietic cells. In contrast to multipotent progenitors (MPPs) that are affected by the absence of hnRNP L, the hematopoietic stem cell (HSC) population is not reduced. In fact, HSCs from hnRNP L deleted mice demonstrate increased cell cycling. However, hnRNP L deficient HSCs express high levels of Annexin V and CD95, which suggests an increased cell death. As for the thymus, a RNA-Seq analysis of fetal livers revealed different targets of hnRNP L among gene categories related to cell death, DNA damage responses and cell adhesion that may explain the phenotype observed in the hnRNP L deficient HSCs. These results suggest that hnRNP L and alternative splicing are essential for the survival and maintenance of the differentiation potential of HSCs. HnRNP L is also crucial for the development of T cells by regulating both their migration and the splicing of CD45.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La variante lymphocytaire du syndrome hyperéosinophilique (L-SHE) est une pathologie extrêmement rare caractérisée par une prolifération monoclonale de lymphocytes T surproduisant l’interleukine IL-5, responsable d’une hyperéosinophilie persistante. En outre, un immunophénotype aberrant CD3−CD4+ est fréquemment observé à la surface des cellules T clonales. Cette pathologie se distingue par une lymphoprolifération chronique indolente habituellement révélée par une hyperéosinophilie sanguine et une infiltration éosinophilique des tissus cutanés. Toutefois, l’évolution vers un lymphome T observée chez certains patients suggère la présence d’un potentiel malin des cellules T. Ce modèle représente donc une rare opportunité d’identifier les changements moléculaires liés aux différentes étapes du processus transformant lymphoïde T. Dans le cadre de ce travail, nous avons cherché à établir les caractéristiques cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de patients L-SHE. L’analyse cytogénétique de cellules T CD3−CD4+ isolées au moment du diagnostic chez deux patientes (P1 et P2) a révélé la présence d’une délétion similaire 6q13-q22.1. En étudiant les stades cliniques successifs de P1 et P2, nous avons montré la persistance des cellules porteuses de la délétion 6q au cours de la progression chronique et leur prédominance lors du développement d’un lymphome T chez P1. Ces résultats suggèrent l’implication précoce et potentiellement critique de la délétion 6q dans cette pathologie lymphoproliférative T. L’analyse des dérégulations transcriptionnelles résultant de ce remaniement a montré une réduction de l’expression des gènes pro-apototiques BACH2 et PA26 dans les cellules T CD3−CD4+ de P1 et P2. En particulier, BACH2, dont l’expression diminue continuellement au cours de l’évolution de P1, jouerait un rôle oncosuppresseur dans la lymphogenèse T. Afin d’identifier les modifications moléculaires des cellules T clonales, nous avons analysé l’expression de 95% des gènes humains dans les cellules T CD3−CD4+ de trois patients en phase chronique (P1, P2 et P3). La grande homologie des changements transcriptionnels chez les trois patients indique une altération des mêmes mécanismes moléculaires. Ainsi, un profil immunophénotypique exhaustif, validé chez trois patients supplémentaires, a pu être établi. En outre, les dérégulations des voies apoptotiques, TGFβ ou 9 encore de signalisation intracellulaire altèrent l’homéostasie des cellules T CD3−CD4+ pouvant favoriser la perte de la capacité apoptotique et/ou la croissance cellulaire. Cette signature moléculaire a été étendue par l’identification de 20 microARNs dont l’expression est dérégulée dans les cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de 6 patients. Par ailleurs, la modification de l’expression des récepteurs impliqués dans la migration leucocytaire au cours de l’évolution de P1 pourrait expliquer l’infiltration ganglionnaire des cellules T clonales et la progression du lymphome. La caractérisation des désordres cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ chez les patients L-SHE permettrait à terme d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques et contribuer ainsi au développement de nouvelles cibles thérapeutiques dans une grande diversité de pathologies lymphoprolifératives de type Th2.

Les modifications post-transcriptionnelles de l’ARN messager (ARNm), comme l’épissage alternatif, jouent un rôle important dans la régulation du développement embryonnaire, de la fonction cellulaire et de l’immunité. De nouvelles évidences révèlent que l’épissage alternatif serait également impliqué dans la régulation de la maturation et de l’activation des cellules du système hématopoïétique. Le facteur hnRNP L a été identifié comme étant le principal régulateur de l’épissage alternatif du gène codant pour le récepteur CD45 in vitro. Le récepteur CD45 est une tyrosine phosphatase exprimée par toutes les cellules du système hématopoïétique qui contrôle le développement et l’activation des lymphocytes T. Dans un premier temps, nous avons étudié la fonction du facteur hnRNP L dans le développement des lymphocytes T et dans l’épissage de l’ARNm de CD45 in vivo en utilisant des souris dont le gène de hnRNP L a été supprimé spécifiquement dans les cellules T. La délétion de hnRNP L dans les thymocytes résulte en une expression aberrante des différents isoformes de CD45 avec une prédominance de l'isoforme CD45RA qui est généralement absent dans le thymus. Une conséquence de la délétion de hnRNP L est une diminution de la cellularité du thymus causée par un blocage partiel du développement des cellules pré-T au stade DN4. Cette réduction du nombre de cellules dans le thymus n’est pas liée à une hausse de la mort cellulaire. Les thymocytes déficients pour hnRNP L démontrent plutôt une prolifération augmentée comparée aux thymocytes sauvages due à une hyper-activation des kinases Lck, Erk1/2 et Akt. De plus, la délétion de hnRNP L dans le thymus cause une perte des cellules T en périphérie. Les résultats des expériences in vitro suggèrent que cette perte est principalement due à un défaut de migration des thymocytes déficients pour hnRNP L du thymus vers la périphérie en réponse aux chimiokines. L’épissage alternatif de CD45 ne peut expliquer ce phénotype mais l’identification de cibles par RNA-Seq a révélé un rôle de hnRNP L dans la régulation de l’épissage alternatif de facteurs impliqués dans la polymérisation de l’actine. Dans un second temps, nous avons étudié le rôle de hnRNP L dans l’hématopoïèse en utilisant des souris dont la délétion de hnRNP L était spécifique aux cellules hématopoïétiques dans les foies fœtaux et la moelle osseuse. L’ablation de hnRNP L réduit le nombre de cellules progénitrices incluant les cellules progénitrices lymphocytaires (CLPs), myéloïdes (CMPs, GMPs) et mégakaryocytes-érythrocytaires (MEPs) et une perte des cellules hématopoïétiques matures. À l’opposé des cellules progénitrices multipotentes (MPPs) qui sont affectées en absence de hnRNP L, la population de cellules souches hématopoïétiques (HSCs) n’est pas réduite et prolifère plus que les cellules contrôles. Cependant, les HSCs n’exprimant pas hnRNP L sont positives pour l'Annexin V et expriment CD95 ce qui suggère une mort cellulaire prononcée. Comme pour les thymocytes, une analyse par RNA-Seq des foies fœtaux a révélé différents gènes cibles de hnRNP L appartenant aux catégories reliées à la mort cellulaire, la réponse aux dommages à l’ADN et à l’adhésion cellulaire qui peuvent tous expliquer le phénotype des cellules n’exprimant pas le gène hnRNP L. Ces résultats suggèrent que hnRNP L et l’épissage alternatif sont essentiels pour maintenir le potentiel de différenciation des cellules souches hématopoïétiques et leur intégrité fonctionnelle. HnRNP L est aussi crucial pour le développement des cellules T par la régulation de l’épissage de CD45 ainsi que pour leur migration. / Post-transcriptional modifications of pre-mRNA by alternative splicing are important for cellular function, development and immunity. New evidence reveals that alternative splicing is implicated in the regulation of maturation and activation of hematopoietic cells. HnRNP L has been identified as the main regulator of alternative splicing of CD45 in vitro. The receptor tyrosine phosphatase CD45, which is expressed on all hematopoietic cells, is known for its role in the development and activation of T cells. First, we have investigated the function of hnRNP L in T cell development and CD45 pre-mRNA splicing in vivo using T cell specific deletion of hnRNP L in mice. The hnRNP L deletion results in aberrant expression of CD45 isoforms, predominantly CD45RA, which is usually absent from the thymus. Ablation of hnRNP L results in a partial block in pre-T cell development at the DN4 stage. This reduction in thymic cellularity is not due to an increase in cell death. In fact, hnRNP L deficient thymocytes demonstrate accelerated proliferation compared to wild-type cells due principally to a hyper-activation of the kinases Lck, Erk1/2 and Akt. Moreover, hnRNP L deletion results in a loss of peripheral T cells. In vitro studies suggest that this loss of peripheral cells is caused by a defect in response to chemokine signals. Since CD45 pre-mRNA splicing cannot explain this phenotype, the identification of hnRNP L targets by RNA-Seq has shown that hnRNP L plays a role in the regulation of alternative splicing of factors involved in actin polymerization. Secondly, we studied the role of hnRNP L in hematopoiesis using knockout mice in which hnRNP L is conditionally deleted specifically in fetal liver and bone marrow hematopoietic cells. Ablation of hnRNP L reduces the number of cell lineage committed progenitors including the common lymphoid progenitors (CLPs), common myeloid and granulocyte progenitors (CMPs, GMPs) and the megakaryocyte-erythrocyte progenitors (MEPs) as well as the mature hematopoietic cells. In contrast to multipotent progenitors (MPPs) that are affected by the absence of hnRNP L, the hematopoietic stem cell (HSC) population is not reduced. In fact, HSCs from hnRNP L deleted mice demonstrate increased cell cycling. However, hnRNP L deficient HSCs express high levels of Annexin V and CD95, which suggests an increased cell death. As for the thymus, a RNA-Seq analysis of fetal livers revealed different targets of hnRNP L among gene categories related to cell death, DNA damage responses and cell adhesion that may explain the phenotype observed in the hnRNP L deficient HSCs. These results suggest that hnRNP L and alternative splicing are essential for the survival and maintenance of the differentiation potential of HSCs. HnRNP L is also crucial for the development of T cells by regulating both their migration and the splicing of CD45.

La maladie du greffon contre l’hôte (GVHD) est la principale cause de mortalité et de morbidité suite aux greffes de cellules souches hématopoïétiques. Plusieurs patients demeurent réfractaires aux traitements actuels ce qui rend nécessaire le développement de nouvelles stratégies afin de combattre cette maladie. Dans l’étude qui suit, nous avons utilisé un nouvel agent thérapeutique, le TH9402, une molécule photosensible et démontré qu’elle permet, lorsqu’exposée à la lumière visible (514 nm), d’éliminer sélectivement les cellules T activées in vivo tout en préservant les cellules T au repos et les cellules T régulatrices (Tregs). Les Tregs ainsi préservés peuvent abroger la réponse alloréactive par la sécrétion d’IL-10 ou par contact cellule-cellule via un mécanisme impliquant le CTLA-4. Nous avons découvert que la signalisation du CTLA-4 était associée à une hausse de la population Treg in vitro. Cette hausse est due à la conversion de cellules T CD4+CD25- en Tregs et non à une prolifération sélective des Tregs. Dans la deuxième partie de cette étude, nous avons démontré que la signalisation de CTLA-4 était associée à une augmentation de l’expression de la protéine Indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO). Ces effets nécessitent la déplétion du tryptophane ainsi que de la protéine de phase aigue GCN2. Finalement, nous avons observé que l’infusion de cellules traitées au TH9402 chez des patients souffrant de GVHD chronique est associée à une augmentation de la population Treg chez ces patients sans causer de lymphopénie ni de diminution de la réponse immunitaire dirigée contre les antigènes viraux. Ces résultats suggèrent que le traitement au TH9402 pourrait représenter une approche particulièrement intéressante pour le traitement de la GVHD chronique réfractaire aux traitements actuels. De plus, l’augmentation de l’expression d’IDO pourrait être utilisée comme valeur prédictive de la réponse du patient au traitement. Ceci pourrait permettre d’améliorer la qualité de soins ainsi que de la qualité de vie des patients souffrant de GVHD chronique. / Graft versus host disease (GVHD) is the primary cause of mortality and morbidity following hematopoietic stem cell transplantation. Many patients remain refractory to current treatments, emphasizing the need to develop new therapeutic strategies. In the present study, we have used a novel therapeutic agent, TH9402, and shown that once activated by visible light (514 nm), this photosensitizer becomes specifically cytotoxic toward activated T cells while preserving resting T cells and regulatory T cells (Tregs). Preserved Tregs can display anti GVHD activity through IL-10 and CTLA-4 dependent mechanisms. Furthermore, CTLA-4 signaling was associated with an increased Treg population. This increase resulted from FOXP3 induction in CD4+CD25- cells and not selective proliferation of Tregs. In the second part of this study, we showed that CTLA-4 signaling was associated with enhanced expression of indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO). The expression of IDO results in the generation of anti GVHD activity and an increase in the Treg population following TH9402 treatment. This increased Treg population was mediated by tryptophan degradation and implied acute phase protein GCN2 activity. Finally, we show that the infusion of TH9402 treated cells in patients suffering from chronic GVHD resulted in an increase of the Treg population as early as 8 weeks after treatment initiation without causing lymphopenia or hyporesponsiveness toward viral antigens. Furthermore, the increase of IDO corresponded to patient response to treatment. These results suggest that TH9402 represents a most interesting therapeutic approach for patients with refractory chronic GVHD. IDO expression could also be used to predict patient responsiveness to the treatment. This could increase the quality of the treatment as well as the quality of life of patients suffering from refractory chronic GVHD.

La variante lymphocytaire du syndrome hyperéosinophilique (L-SHE) est une pathologie extrêmement rare caractérisée par une prolifération monoclonale de lymphocytes T surproduisant l’interleukine IL-5, responsable d’une hyperéosinophilie persistante. En outre, un immunophénotype aberrant CD3−CD4+ est fréquemment observé à la surface des cellules T clonales. Cette pathologie se distingue par une lymphoprolifération chronique indolente habituellement révélée par une hyperéosinophilie sanguine et une infiltration éosinophilique des tissus cutanés. Toutefois, l’évolution vers un lymphome T observée chez certains patients suggère la présence d’un potentiel malin des cellules T. Ce modèle représente donc une rare opportunité d’identifier les changements moléculaires liés aux différentes étapes du processus transformant lymphoïde T.<p>Dans le cadre de ce travail, nous avons cherché à établir les caractéristiques cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de patients L-SHE. L’analyse cytogénétique de cellules T CD3−CD4+ isolées au moment du diagnostic chez deux patientes (P1 et P2) a révélé la présence d’une délétion similaire 6q13-q22.1. En étudiant les stades cliniques successifs de P1 et P2, nous avons montré la persistance des cellules porteuses de la délétion 6q au cours de la progression chronique et leur prédominance lors du développement d’un lymphome T chez P1. Ces résultats suggèrent l’implication précoce et potentiellement critique de la délétion 6q dans cette pathologie lymphoproliférative T. L’analyse des dérégulations transcriptionnelles résultant de ce remaniement a montré une réduction de l’expression des gènes pro-apototiques BACH2 et PA26 dans les cellules T CD3−CD4+ de P1 et P2. En particulier, BACH2, dont l’expression diminue continuellement au cours de l’évolution de P1, jouerait un rôle oncosuppresseur dans la lymphogenèse T.<p>Afin d’identifier les modifications moléculaires des cellules T clonales, nous avons analysé l’expression de 95% des gènes humains dans les cellules T CD3−CD4+ de trois patients en phase chronique (P1, P2 et P3). La grande homologie des changements transcriptionnels chez les trois patients indique une altération des mêmes mécanismes moléculaires. Ainsi, un profil immunophénotypique exhaustif, validé chez trois patients supplémentaires, a pu être établi. En outre, les dérégulations des voies apoptotiques, TGFβ ou<p>9<p>encore de signalisation intracellulaire altèrent l’homéostasie des cellules T CD3−CD4+ pouvant favoriser la perte de la capacité apoptotique et/ou la croissance cellulaire. Cette signature moléculaire a été étendue par l’identification de 20 microARNs dont l’expression est dérégulée dans les cellules T CD3−CD4+ d’une cohorte de 6 patients. Par ailleurs, la modification de l’expression des récepteurs impliqués dans la migration leucocytaire au cours de l’évolution de P1 pourrait expliquer l’infiltration ganglionnaire des cellules T clonales et la progression du lymphome.<p>La caractérisation des désordres cytogénétiques et moléculaires des cellules T CD3−CD4+ chez les patients L-SHE permettrait à terme d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques et contribuer ainsi au développement de nouvelles cibles thérapeutiques dans une grande diversité de pathologies lymphoprolifératives de type Th2. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les lymphocytes T CD8 ont un rôle essentiel dans la protection contre les agents pathogènes intracellulaires et la progression tumorale. Ainsi, la compréhension de la diversité des mécanismes de différenciation des lymphocytes T CD8 naïfs en cellules effectrices, ainsi qu’en cellules mémoires compétentes, est fondamentale pour le développement efficace de vaccins à cellules T. Dans ce travail de thèse, nous avons abordé deux questions centrales : (1)Très tôt après l’activation des cellules T CD8, quels sont les mécanismes par lesquels les cellules T effectrices agissent comme effecteurs pro-inflammatoires en recrutant d’autres cellules? Et quel est leur rôle dans la réponse immunitaire? (2) Quel est le rôle du contexte infectieux dans le programme de différenciation des lymphocytes T CD8 ? Est-il responsable de l’hétérogénéité des cellules répondeuses et a-t-il un rôle dans les différents effets protecteurs des cellules mémoires? Afin de répondre à ces questions, nous avons choisit d’utiliser des cellules T CD8 exprimant un récepteur pour l’antigène transgéniques (TCR-Tg) pour suivre la différentiation in vivo des lymphocytes T CD8. De plus, la méthode de RT-PCR sur des séries de cellules uniques, nous a permis d’analyser la co-expression des ARNm dans ces cellules. Comme l’utilisation à haute fréquence de cellules TCR-Tg a été fortement critiquée, nous avons comparé la différenciation de ces cellules avec celle des cellules endogènes (non transgéniques et rares). Dans ce premier manuscrit nous avons observé un comportement similaire, ce qui a renforcé l'avantage d'utiliser des cellules TCR Tg pour étudier les réponses immunitaires des lymphocytes T CD8. De plus, nous avons conclu que la diversité des réponses immunitaires des lymphocytes T CD8 n’est pas conditionnée par la fréquence de cellules naïves. Dans un deuxième manuscrit, nous avons comparé la réponse des cellules OT1 TCR-Tg (spécifiques de l’antigène OVA) à l'infection bactérienne LM-OVA (Listeria Monocytogènes exprimant OVA) avec la réponse des cellules P14 TCR-Tg (spécifiques de l’épitope GP33) à l’infection par le virus LCMV. Nous avons montré que les cellules OT1, stimulées par l’OVA dans un contexte bactérien (LM-OVA), présentent un profil d’expression génique distinct de celui des cellules P14 stimulées par le GP33 dans un contexte viral (LCMV). Nous avons également co-stimulé les cellules P14 et OT1 dans une même souris suivant le même contexte bactérien avec LM-GP33 et LM-OVA. Dans ce cas, nous n’avons pas observé de différence dans le profil d’expression génique. L’ensemble des résultats démontrent que les stimulations spécifiques des cellules T CD8 par différents agents pathogènes génèrent des cellules T CD8 présentant des caractéristiques différentes qui ne sont pas déterminées par la spécificité du TCR mais plutôt par le contexte infectieux. De plus, nous avons montré que les cellules mémoires endogènes résultant de la stimulation des CD8 en présence de LCMV ont été plus efficaces après une deuxième réponse immunitaire que des cellules mémoires générées après stimulation avec LM-GP33 (bactérie). Nous avons également observé que la protection plus efficace dans le contexte viral est associée à des cellules T CD8 qui présentent un phénotype de cellules T mémoires effectrices (TEM) tandis que les cellules T CD8 générées dans un contexte bactérien ont plutôt un phénotype associé aux cellules T mémoires centrales (TCM). Ces résultats démontrent que différents pathogènes induisent différents profils de différentiation des cellules T CD8 et que malgré l’élimination efficace des différents pathogènes dans une réponse primaire, la qualité des cellules mémoires générées au cours de cette réponse peut être différente. Dans un troisième manuscrit, nous avons étudié les mécanismes de recrutement d’autres cellules par les lymphocytes T CD8 activés à un temps précoce de la réponse immunitaire. (...) / CD8 T cells are essential for the elimination of intracellular pathogens and tumor cells. Understanding how naïve CD8 T cells differentiate into effector cells capable of eliminating pathogens and to generate adequate memory cells during immune responses is fundamental for optimal T cell vaccine design. In this PhD thesis work we addressed two central questions: 1) What are the mechanisms by which early effector T cells could act as pro-inflammatory effectors? And what is their role in the immune response? 2) How heterogeneous are CD8 responses? Could different pathogens modulate CD8 T cell differentiation programs and be responsible for CD8 cell-to-cell heterogeneity? Could they also generate memory cells with different protection capacities? To address these questions related to the diversity of CD8 T cell differentiation during immune responses, we used the single cell RT-PCR technique to detect ex vivo expression of mRNA in each individual cell, and Brefeldin A injected mice to detect ex vivo intracellular proteins. As experimental system to evaluate in vivo cell activation we used T cell receptor transgenic (TCR-Tg) CD8 T cells. Since the use of TCR-Tg cells to study immune responses has been subjected to criticism (due to high frequency of naïve-precursor transfers), in a first Ms. we compared the behavior of TCR-Tg and endogenous (non-transgenic and present at low frequency) cells in the same mouse. We found fully overlapping behavior between these two cell populations, which reinforced the advantage of using TCR-Tg cells to study CD8 immune responses. In addition, we concluded that the frequency of naïve-precursors do not induce diversity on CD8 T cell differentiation patterns. In a second Ms. we evaluated the impact of different pathogens in the diversity of CD8 T cell properties during two different immune responses: OT1 TCR-Tg cells (specific for OVA antigen) in the response to LM-OVA (Listeria Monocytogenes expressing OVA) infection; and P14 TCR-Tg cells (specific for GP33 epitope) in the response to Lymphocytic choriomeningitis vírus (LCMV) infection. We found that OT1 and P14 cells had different properties. As this difference could also be attributed to the different TCR avidity between OT1 and P14 cells, we then compared the behavior of P14 and OT-1 cells in the same mouse, co-injected with LM-OVA and LM-GP33. Since no differences were then detected, these results demonstrated that priming with different pathogens generates CD8 T cells with different characteristics that are not determined by TCR usage, but rather by the infection context. In addition, when looking for the protection capacity of endogenous CD8 memory cells generated in bacterial or viral context, we found that memory cells generated after LCMV priming were more efficient in responding to a second challenge, than memory cells generated after LM-GP33 priming. We also found that this better protection is associated with a T cell effector memory (TEM) phenotype associated with the LCMV infection, in contrast with a T cell central memory (TCM) phenotype generated after LM-OVA infection. These results demonstrate that different pathogens are responsible for diversity of CD8 T cell differentiation patterns and that even when distinct pathogens are efficiently eliminated during the primary immune response the quality of the memory generated may differ. In a third Ms. we studied the mechanisms by which effector CD8 T cells attracted other cell types in the early days of an immune response. We used two experimental systems: the response of OT1 TCR-Tg cells to LM-OVA infection; and the response of anti-HY TCR-Tg cells to male cells (“sterile”-non infectious context). In both cases we found that immediately after activation, CD8 T cells expressed high levels of pro-inflammatory cytokines and chemokines (such as TNFα, XCL1, CCL3 and CCL4). (...)

L’immunothérapie a permis des avancées majeures dans la thérapie du cancer. Le traitement par des cellules T modifiées pour exprimer un récepteur chimérique d’antigène (CAR) a changé complètement la vision de la thérapie de la leucémie. L’efficacité de ce traitement sur des cancers résistants, a ouvert la voie à la thérapie cellulaire et génique dans ce contexte. Malgré les premiers résultats très positifs, il s’avère que l’épuisement cellulaire et la perte des cellules T thérapeutiques est un problème majeur pour maintenir l’efficacité de la thérapie CAR et prévenir les rechutes. Les travaux présentés dans cette thèse visent à permettre l’utilisation d’autres types cellulaires pour la thérapie CAR. L’hypothèse de travail est que les cellules NK ou les cellules souches hématopoïétiques (HSC) permettrait de dépasser les limites de la thérapie CAR utilisant les cellules T. Pour permettre l’utilisation des cellules NK, un des problèmes technique est la transduction par les vecteurs viraux. Les travaux présentés ici démontrent que l’utilisation de l’enveloppe BaEV permet une transduction efficace des NK avec un vecteur lentiviral. Par cette méthode nous avons pu générer de grandes quantités de cellules NK transduites avec un CAR, prouvant la possibilité d’utiliser les NK dans la thérapie CAR. L’utilisation des HSC dans la thérapie CAR, permettrait de produire des cellules CAR T en permanence pour renouveler les cellules T épuisées. Cependant, la surexpression d’un récepteur CAR sur toutes les cellules dérivant des HSC pourrait être un problème. Pour permettre l’utilisation des HSC, nous avons développé des promoteurs spécifiques courts restreignant l’expression du transgène à une population précise. Nous avons prouvé la spécificité d’un promoteur T et démontré la possibilité de l’utiliser dans le contexte de la thérapie CAR utilisant les HSC. Ces travaux sont une preuve de concept de l’utilisation d’autres cellules que les cellules T dans la thérapie CAR. / Immunotherapy has allowed major advances in cancer therapy. The treatment using modified T cells with a chimeric antigen receptor (CAR) completely changed the vision of leukemia therapy. The efficiency against resistant cancer paved the way to cellular and gene therapy in this context. Despite very positive results at first, the disappearance and exhaustion of therapeutic cells seems to be a major problem to maintain the efficiency of the CAR treatment and prevent relapses. The work of this thesis is to allow the use cell types other than T cells for CAR therapy. The hypothesis is that NK cells or hematopoietic stem cells (HSC) could overcome the limitation of CAR therapy using T cells. To allow the use of CAR NK cells, a major technical issue is the transduction by viral vectors. The work presented here shows the use of BaEV envelope to pseudotype vectors allows an efficient transduction of NK cells. Using this method, we were able to produce large amounts of CAR NK cells, showing the possibility to use NK cells in CAR therapy. The use of HSC in CAR therapy, could allow the permanent replenishment of the pool of CAR T cells once exhausted. Despite that advantage, the overexpression of a CAR receptor on all hematopoietic cells coming from those HSC could be an issue. To allow the use of HSC, we developed short specific promoters restraining the expression of the transgene to a precise population. We prove the specificity of a T cell promoter and demonstrated the possibility to use it in CAR therapy using HSC. This work is a proof of concept of the use of other population than T cells in CAR therapy.

Le lymphome angioimmunoblastique à cellules T (AITL) est un lymphome périphérique à cellules T agressif dont les symptômes sont la lymphadénopathie et l'hypergammaglobulinémie. Actuellement, les patients atteints du AITL ont des options de thérapeutiques limitées et des résultats cliniques défavorables, avec un taux de survie sur 5 ans d'environ 30%. Les cellules tumorales du AITL proviennent de cellules T CD4+ appelées cellules T auxiliaires folliculaires (Tfh). Les cellules Tfh sont essentielles dans le centre germinatif (GC), où elles facilitent l'expansion et la différentiation des cellules B en plasmocytes. Cette fonction d'aide est soutenue par de nombreuses protéines dérivées des cellules Tfh et des programmes de transcription qui pourraient aussi fonctionner dans les cellules tumorales du AITL. Par conséquent, la perturbation des principaux mécanismes de signalisation soutenant l'identité des cellules Tfh et leurs interactions avec les cellules B pourrait inhiber la croissance du AITL. Des études ont démontré que les cellules hyperactives de type Tfh provoquent une accumulation de cellules immunitaires telles que les cellules B, les plasmocytes et les macrophages dans les tumeurs. Cependant, le microenvironnement du AITL n'a pas été bien étudié et il n'a pas été vérifié si certaines cellules immunitaires pourraient être utilisées pour arrêter la croissance de la tumeur. Bien que l’on trouve des cellules Tfh circulantes dans l’AITL humain, le taux de propagation peut varier d’un patient à l’autre. Ainsi, une possibilité est la présence de mécanismes de surveillance immunitaire s'opposant à la progression de la tumeur. En accord avec cette hypothèse, un signal positif pour la phagocytose nommé SLAMF7 (contrebalancé par la voie inhibitrice CD47-SIRPα) est exprimé dans un sous-ensemble de patients atteints du AITL. Toutefois, la corrélation entre les différents niveaux d'expression du SLAMF7 et l'amélioration des résultats pour les patients n'a pas été étudiée. En utilisant des souris Roquinsan/+, qui développent spontanément l’AITL, nous avons étudié le rôle des mécanismes de signalisation immunitaire dans les cellules tumorales de type Tfh et du microenvironnement tumoral. Nous avons cherché à inhiber les protéines et les voies de signalisation typiques des cellules Tfh dans les tumeurs afin d'évaluer la valeur thérapeutique potentielle. Nous avons aussi étudié le rôle de la phagocytose dépendante des macrophages dans le contexte SLAMF7 et comment la modulation de la signalisation de CD47-SIRPα peut améliorer l'efficacité de la phagocytose des cellules tumorales. Notre hypothèse centrale est qu'en supprimant les programmes fondamentaux des cellules Tfh ou en favorisant l'élimination phagocytaire des cellules tumorales de type Tfh, nous pouvons favoriser la régression de la tumeur. Nous avons démontré que les tumeurs AITL nécessitent des protéines d’identité des cellules Tfh essentielles telles que le facteur de transcription Bcl6 et la protéine adaptatrice SAP, ainsi que la communication entre les cellules T et B (T-B). Même en l'absence de GC classiques, les cellules tumorales de type Tfh ont apporté un soutien aux cellules B. Cela est démontré par des titres élevés d'IgG et l'accumulation de cellules précurseurs des plasmocytes dans les tumeurs. Nous avons trouvé des preuves de l'opposition entre la surveillance immunitaire et l'évasion au sein des tumeurs de type AITL, car les cellules Tfh augmentent l’expression de la molécule inhibitrice CD47 tandis que les macrophages stimulent le niveau de SLAMF7. Les cellules de type AITL ont été phagocytées plus efficacement in vitro quand la signalisation du CD47 était bloquée. En résumé, nous démontrons que les voies de signalisation importantes pour l'identité des cellules Tfh et la communication entre les cellules T et B sont essentielles pour la progression de l’AITL et suggèrent qu’une surveillance immunitaire continue par les macrophages peut influencer l’évolution de la maladie. Des études futures pourraient explorer la possibilité de combiner des inhibiteurs de l'activité des cellules Tfh ou T-B avec des médicaments qui stimulent l'activité phagocytaire antitumorale pour améliorer l'efficacité thérapeutique du traitement. / Angioimmunoblastic T cell lymphoma (AITL) is an aggressive peripheral T cell lymphoma manifesting with symptoms such as generalized lymphadenopathy and hypergammaglobulinemia. Currently, AITL patients have limited treatment options and poor clinical outcomes with a 5-year survival rate around 30%. AITL tumor cells derive from a subset of CD4+ T cell, the T follicular helper (Tfh) cell. Tfh cells are essential in germinal centers (GC), where they facilitate B cell expansion and differentiation into plasma cells. This helper function is supported by numerous Tfh cell-derived proteins and transcriptional programs which may still be operational in AITL tumor cells. Therefore, disrupting key signaling mechanisms sustaining Tfh cell identity and their ability to interact with B cells could inhibit AITL tumor growth. Studies have demonstrated that these hyperactive Tfh-like cells lead to the accumulation of immune cell subsets such as B cells, plasma cells, and macrophages within tumor lymph nodes. Nevertheless, the AITL tumor microenvironment itself has not been well-studied and whether some immune cells could be harnessed to impede tumor growth has not been tested. In human AITL, although circulating Tfh cells have been reported, the rate of tumor spreading can vary between patients. As such, one possibility is the presence of immune surveillance mechanisms opposing tumor progression. In line with this idea, SLAMF7, a positive signal for macrophage-mediated phagocytosis (counterbalanced by the inhibitory CD47-SIRPα pathway), is expressed in a subset of AITL patients. Despite this, whether differing levels of SLAMF7 expression correlates with improved patient outcomes has not been investigated. Using Roquinsan/+ mice, a spontaneous AITL-like mouse model, we addressed the role of immune signaling mechanisms within Tfh-like tumor cells and the surrounding tumor microenvironment that would promote tumor regression. First, we aimed to inhibit signature Tfh cell proteins and downstream signaling pathways in developed AITL-like tumors to evaluate potential therapeutic value. Second, we investigated the role of macrophage-mediated phagocytosis in the context of SLAMF7 and how modulating CD47-SIRPα signaling may enhance the efficiency of AITL tumor cell engulfment. Our central hypothesis is that by removing fundamental Tfh cell supporting programs from tumor cells or by promoting the phagocytic removal of Tfh-like tumor cells we can favour tumor regression and impair future growth. Through this work, we demonstrated that AITL-like tumors continuously require critical Tfh cell identity proteins such as transcription factor Bcl6 and adaptor protein SAP, as well as T cell-B cell (T-B) crosstalk. Importantly, despite the absence of conventional GCs, Tfh-like tumor cells provided functional support to B cells as evidenced by elevated IgG titers and accumulation of plasma cell precursors in tumors. We also found evidence of opposition between immune surveillance and evasion within AITL-like tumors as Tfh-like cells upregulated inhibitory CD47 levels while macrophages increased expression of prophagocytic SLAMF7. Moreover, AITL-like tumor cells were more efficiently phagocytosed in vitro when CD47 signaling was blocked. Taken together, we demonstrate that pathways important for Tfh cell identity and T-B communication are critical for AITL-like disease progression and suggest that ongoing macrophage-mediated immune surveillance may influence disease outcomes. Future studies may explore combining inhibitors of Tfh cell activity or T-B crosstalk along with drugs which boost antitumor phagocytic activity to further improve the therapeutic efficacy of treatment.

Immunotherapy, especially the adoptive transfer of T cells and immune checkpoint blockade therapy, have revolutionized cancer therapy. In particular, utilizing antigen-specific T cells for adoptive cell therapy has enabled the development of specific and effective strategies. It has paved the way for developing more accurate and personalized cancer immunotherapies. Adoptive cell therapy (ACT) results depend on the characteristics of ex vivo expanded T cells, such as their differentiation and clonal diversity. However, ex vivo expanded specific T cells often express several inhibitory receptors involved in T-cell exhaustion and markers of terminal effector differentiation. Accordingly, we hypothesized that blocking one or several inhibitory receptors during the ex vivo expansion could improve the expansion and differentiation of antigen-specific T cells. Preconditioning the ACT products and combinatorial immunotherapy approaches are newly developed concepts in cancer therapy to optimize cancer immunotherapy for a larger group of patients. To study the development of antigen-specific T-cells in combination with checkpoint blockade, we have adopted a method that allows the expansion of rare antigen-specific T cell precursors from PBMCs via multiple stimulations, using antigen-pulsed dendritic cells. In the current study, we utilized our protocol to generate and expand antigen-specific CD8+ T cells targeting the oncogenic Epstein-Barr virus (EBV)-LMP2 and a tumor-associated antigen (TAA) from the Wilms Tumor 1 (WT1) protein. We employed two approaches to abolish the negative regulatory receptors, antibody-mediated blockade and deletion via CRISPR/Cas9. We evaluated the impact of checkpoint blockade on antigen-specific T cells development, proliferation, and function. Additionally, TCR clonality and transcriptomic changes were assessed by genomic studies, including single-cell RNA (scRNA) sequencing and T-cell receptor sequencing. Supporting our hypothesis, we observed that blocking both PD-L1 and TIM3 (not any of them alone) significantly enhanced LMP2 and WT1-specific T cell generation and expansion. Additionally, checkpoint blockade resulted in higher specific T cell function, including cytokine production and in vitro targeted cytotoxicity. Using scRNA-seq and TCR sequencing approaches, we first remarked that the specific T cells are highly oligoclonal and identified a few dominant shared clones between donors. Immune checkpoint blockade did not confer consistent transcriptional signatures but may have a clonotype and donor-specific impact on the expression of activation and exhaustion-related genes. Overall, immune checkpoint blockade did not markedly alter the clonal composition of the T-cell product. We also evaluated the impact of CD5 deletion in antigen-specific T cell priming and expansion as an inhibitory receptor and a part of the immune response synapse. However, in a human ACT setting, our data show that the CRISPR/Cas9 mediated CD5 deletion only has modest effects on antigen-specific T-cell generation. However, future combinations with the blockade of other immune checkpoint may be warranted. Conclusion We demonstrated that blocking PD-L1 and TIM3 during the ex vivo expansion improves antigen-specific T-cell yield. We show that blocking multiple checkpoints can synergistically optimize specific T-cell production without compromising the response's specificity. It is a rapidly implementable strategy to enhance the number and quality of ex vivo expanded antigen-specific T cells for immunotherapy. / Le transfert adoptif de cellules T et le traitement par le blocage des points de contrôle immunologiques ont révolutionné le traitement du cancer. En particulier, l'utilisation de cellules T antigène-spécifiques en thérapie cellulaire adoptive a facilité le développement d'immunothérapies anticancéreuses plus précises et personnalisées. Les résultats de la thérapie cellulaire adoptive (TCA) sont liés à la qualité des cellules T spécifiques expansées ex vivo, telles que leur état de différenciation et leur diversité clonale. Cependant, le pré-conditionnement des produits de thérapie cellulaire adoptive et les traitements d'immunothérapie combinatoire sont de nouveaux concepts en développement de la thérapie du cancer pour optimiser l'immunothérapie du cancer dans un plus grand groupe de patients. Nous avons formulé l’hypothèse que le blocage d'un ou plusieurs récepteurs inhibiteurs au cours de l'expansion ex vivo favorise une meilleure expansion et une meilleure fonction des cellules T destinées à la TCA. Pour étudier l’expansion et la différenciation de cellules T antigène-spécifiques lors d’un blocage des points de contrôle, nous avons adopté une méthode qui nous permet de stimuler et expanser de rares cellules T antigène-spécifiques à partir de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs) via de multiples stimulations utilisant des cellules dendritiques chargées avec l’antigène d’intérêt. Nous avons utilisé deux approches pour supprimer l’activité des récepteurs régulateurs négatifs, les anticorps bloquants des points de contrôle et la délétion génique via CRISPR/Cas9. Nous démontrons que le blocage combiné de PD-L1 et TIM3 améliore considérablement la l'expansion de cellules T CD8+ spécifiques à des antigènes viraux et tumoraux. De plus, le blocage des points de contrôle a entraîné la génération de cellules T spécifiques fonctionelles tel que démontré par la production de cytokines et la cytotoxicité in vitro. En utilisant de séquençage de l'ARN en cellule unique (scRNA-seq) et de séquençage des récepteurs des lymphocytes T (TCP-seq), nous avons remarqué que les cellules T spécifiques sont très fortment oligoclonales. Nous avons également identifié quelques clones dominants partagés entre les donneurs. L’application de l’inhibition des points de controles ne confère pas de signatures transcriptionelles particulières mais pourrait affecter certains clones provenant de certains donneurs davantage que d’autres. De plus, le peu de changements dans la composition clonale des cellules expandues suggèrent que le blocage de ces points de contrôle immunologiques n’altère pas de façon significative le produit cellulaire obtenu. Des données récentes soutiennent également un rôle du CD5 dans la régulation de l'activation des cellules T naïves et leur état fonctionnel. Cependant, dans un contexte compatible avec la TCA, nos données montrent que la suppression de CD5 via CRISPR/Cas9 n'a que des effets modestes sur la génération de cellules T antigène-spécifiques. Par contre, la combinaison éventuelle avec l’inhibition de d’autres points de contrôle immunologiques pourrait être envisagée. En conclusion, nos travaux fournissent une nouvelle méthode pour générer des cellules T spécifiques pour la TCA et la caractérisation à plus haute résolution de cellules T spécifiques expansées ex vivo. Nous avons donc démontré que le blocage combiné de plusieurs points de contrôle peut optimiser de manière synergique la production de cellules T spécifiques sans compromettre la spécificité de la réponse. Il s'agit là d'une stratégie rapidement applicable pour améliorer le nombre et la qualité des cellules T antigène-spécifiques expansées ex vivo pour l'immunothérapie.