Mémoire du D.E.S. : Biologie médicale : Université de Nantes : 2005. Thèse d'exercice : Pharmacie : Université de Nantes : 2005. / Bibliogr. f. 124-127 [75 réf.].

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative de type autosomique dominante. Ce désordre est caractérisé par un éventail de signes cliniques incluant, principalement, des mouvements involontaires de type choréiformes, mais également des atteintes cognitives et psychiatriques. La pathologie est causée par une mutation du gène codant pour la huntingtine (HTT) entrainant ainsi la production d'une protéine anormale, la huntingtine mutée (mHTT). De par son caractère ubiquitaire, la mHTT se retrouve dans chacune des cellules de l'organisme et contribue à la dégénérescence des cellules, aussi bien au niveau du système nerveux central qu'en périphérie. En effet, les patients souffrant de la MH présentent également de l'atrophie musculaire, des anomalies cardiaques et des dysfonctionnements au niveau du système immunitaire. Des travaux effectués dans le laboratoire de recherche de la Dre Cicchetti ont montré que les cerveaux de patients MH sont aussi caractérisés par des anomalies vasculaires, qui incluent des changements au niveau de la densité et du diamètre des vaisseaux sanguins ainsi qu'une augmentation de la perméabilité de la barrière hématoencéphalique (BHE). Cherchant à élucider l'origine de ces anomalies vasculaires, nous avons étudié les plaquettes qui, en plus de jouer un rôle dans l'hémostase, sont également impliquées dans le maintien de l'intégrité vasculaire. Les résultats d'immunobuvardage ont montré que les thrombocytes contiennent étonnamment la plus forte concentration en mHTT de toutes les cellules sanguines. La libération de facteurs plaquettaires a été mesurée par ELISA chez les patients MH et les contrôles. Nous avons également effectué des tests d'hémostase et de déplétion plaquettaire dans le modèle de souris R6/2 de la maladie. Nos résultats indiquent que les plaquettes huntingtoniennes sont dysfonctionnelles en ce qui concerne la libération de facteurs de thrombose et d'angiogenèse. Nos travaux chez un modèle murin de MH mettent en lumière le rôle insoupçonné des plaquettes dans l'homéostasie de la BHE. Dans le cadre de ce projet, le transcriptome plaquettaire et les vésicules extracellulaires dérivées de plaquettes (VEP) ont été également caractérisés. D'une part, nous avons montré que les plaquettes possédaient une signature transcriptomique unique pouvant, si validée, être utilisée comme potentiel biomarqueur de la maladie. D'autre part, les VEP provenant de patients atteints de MH et leur contenu en mHTT restent inchangés. L'ensemble des données que nous avons obtenues sur les plaquettes MH témoignent de l'impact de la mHTT en périphérie. Afin de diminuer la charge en protéines pathologiques, l'une des voies de dégradation serait la production d'anticorps par les cellules immunitaires. Cet aspect a déjà été mis en lumière dans d'autres maladies neurodégénératives, mais à ce jour, les mécanismes de dégradation de la mHTT dans la MH n'ont pas été élucidés. Nos travaux ont toutefois montré la présence d'auto-anticorps contre la mHTT/HTT dans le plasma humain à l'aide de deux méthodes complémentaires que nous avons développées à cet effet : des ELISA et des immunobuvardages. Plus précisément, nous avons observé que : 1) les patients présentant des caractéristiques cliniques sévères de la MH développent une réponse immunitaire plus importante contre HTT/mHTT que les témoins appariés, 2) le sexe influence le nombre d'anticorps anti-mHTT dans la MH et 3) les anticorps reconnaissant la structure 3D de mHTT pleine longueur corrèlent avec les scores du test de capacité fonctionnelle totale chez les patients à des stades avancés de la maladie. Ces données ouvrent la voie à l'utilisation potentielle d'anticorps pour, par exemple, neutraliser la mHTT périphérique et ainsi ralentir le développement de la pathologie. En résumé, mes travaux de recherche se sont donc consacrés à l'étude des composantes sanguines - plus particulièrement des plaquettes et des auto-anticorps - par l'utilisation d'un modèle murin MH et d'échantillons de sang provenant de patients atteints de la MH. Les données obtenues permettent (1) de confirmer l'impact de la pathologie huntingtonienne sur le système sanguin et vice-versa, (2) d'améliorer notre compréhension des mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent la MH, et (3) d'aider à identifier et développer de nouvelles cibles thérapeutiques. / Huntington's disease (HD) is an autosomal dominant neurodegenerative disorder characterized by a whole spectrum of clinical signs including early involuntary movements, such as chorea, cognitive impairments and psychiatric disturbances. The pathology is caused by a mutation in the gene coding for huntingtin (HTT), which results in the production of an abnormal form of this protein: mutant huntingtin (mHTT). Due to the ubiquitous expression of HTT, mHTT is found in every cell of the body and contributes to the cellular dysfunction in the central nervous system as well as various other peripheral organs. Accordingly, HD patients present with muscular atrophy, cardiac abnormalities and dysfunctions of the immune system, among other things. Work conducted in Dr. Cicchetti's laboratory has extended these findings to include brain vascular abnormalities, such as changes in blood vessel density and diameter, and increased permeability of the blood-brain barrier (BBB). Seeking to elucidate the origin of these vascular anomalies, we studied platelets which, in addition to playing a role in hemostasis, are also involved in maintaining vascular integrity. Immunoblot results indicated that thrombocytes contain the highest concentration of mHTT of all blood cells. Following platelet function assessment, we reported that platelets derived from HD patients are dysfunctional with respect to the release of thrombosis and angiogenesis factors. Further investigation of the functional role of platelets in HD was performed using platelet depletion assays in a commonly used transgenic mouse model of HD (R6/2). These experiments supported the clinical findings and further highlighted an unsuspected role of platelets in BBB homeostasis. As part of this project, the platelet transcriptome and the platelet derived extracellular vesicles (PEV) were also characterized. These experiments revealed a unique transcriptomic signature that can, if validated, be used as a potential biomarker of the disease while assessment of PEV derived from HD patients uncovered no differences in number or mHTT content from those derived from controls. All the data we obtained on HD platelets testify to the impact of mHTT on the periphery. In order to reduce the pathological protein load, one of the degradation pathways would be the production of antibodies by immune cells. This aspect has already been highlighted in other neurodegenerative diseases, but to date, the mechanisms of mHTT degradation in HD have not been elucidated. However, our work has now shown the presence of autoantibodies against mHTT/HTT in human plasma using two complementary methods that we have developed for this purpose: ELISA and immunoblot assays. Specifically, we observed that: 1) patients with severe clinical features of HD develop a stronger immune response against HTT/mHTT than matched controls, 2) gender influences the number of anti-mHTT antibodies in the plasma of HD patients and 3) antibodies recognizing the 3D structure of full-length mHTT correlate with total functional capacity test scores in patients at advanced stages of the disease. These data highlight the potential use of antibodies to neutralize peripheral mHTT which may, if confirmed, slow down the development of the pathology. My research work has focused on the study of blood components - in particular platelets and autoantibodies - using a mouse model of HD and blood samples from HD patients. Taken together, the data I have generated has the potential (1) to confirm the impact of HD-related pathology on the blood system and vice-versa, (2) to improve our understanding of the pathophysiological mechanisms that underlie HD and (3) to help identify and develop new therapeutic targets.

Les transplanteurs ont actuellement trois options lorsqu'ils doivent choisir une source de cellules pour la greffe de cellules souches hématopoïétiques soit le sang de cordon, la moelle osseuse ou le sang périphérique mobilisé. Les cellules souches hématopoïétiques retrouvées dans le sang des adultes sains pourraient toutefois être une autre option intéressante pour la transplantation. Les résultats de cette présente étude, récemment publié dans la revue Cytotherapy, montrent le potentiel des cellules CD34+ trappées dans les chambres de leucoréduction à générer les différentes lignées cellulaires retrouvées dans le sang. Un système de culture in vitro en milieu sans sérum et en condition hypoxique a été mis a point. La différenciation des cellules dans l'hématopoïèse durant la culture a été caractérisée par analyse multiparamétrique du phénotype avec SPADE. L'expansion a généré une grande hétérogénéité populationnelle mais principalement des progéniteurs engagés vers l'érythropoïèse et la mégacaryopoïèse.

Le lupus érythémateux disséminé (LED) est une maladie auto-immune systémique dont le diagnostic est très complexe. Le clinicien doit baser son diagnostic sur une liste de 11 critères reliés à des observations cliniques et à des mesures sérologiques. Afin de faciliter ce diagnostic, plusieurs groupes recherchent de nouveaux marqueurs biologiques quantifiables. C'est dans ce but que la cytométrie en flux a été utilisée afin de comparer les cellules du sang des patients et celles de sujets sains. La caractérisation exhaustive des sous-populations cellulaires montre que l'expression de HLA-DR est amplifiée chez les patients même si la maladie est inactive. De plus, l'analyse du contenu sérique en cytokines inflammatoires a montré que la quantité de GM-CSF était plus importante chez les patients LED. Nos travaux suggèrent que HLA-DR et GM-CSF pourraient être considérés comme des candidats intéressants dans les études sur le diagnostic du LED.

L'ensemble des événements permettant la fabrication et le renouvellement continu des cellules du sang représente une série de processus complexes, appelée hématopoïèse, ayant lieu dans la moelle osseuse. L'hématopoïèse repose sur une réserve de cellules souches, dites hématopoïétiques, possédant des capacités uniques de différenciation (capacité à générer l'ensemble des cellules du sang) et d'auto-renouvellement (capacité à générer une cellule fille identique à la cellule mère). Nous avons réalisé une étude mathématique de l'hématopoïèse à l'aide de modèles non-linéaires structurés en âge et maturité. Elle a permis de mettre en évidence l'influence des cellules souches hématopoïétiques sur la population totale de cellules du sang, ces cellules agissant activement sur la stabilité de la population. Par l'étude de modèles non structurés en maturité, réduits par intégration à un système d'équations différentielles avec retard distribué, nous avons mis en évidence l'existence de solutions oscillantes et, à travers l'étude d'une bifurcation de Hopf, de solutions périodiques, avec de très longues périodes en comparaison de la durée du cycle cellulaire. Ces oscillations sont caractéristiques de maladies du sang dites cycliques, dont la leucémie myéloïde chronique, une forme très répandue de leucémie. Notre travail représente une contribution à l'étude de cette maladie. Enfin, nous nous sommes intéressés à un modèle d'hématopoïèse prenant en compte l'action de facteurs extérieurs à la moelle osseuse qui agissent sur la différenciation des cellules souches. Nous avons établi l'existence de solutions oscillantes pouvant décrire certaines maladies hématologiques cycliques.

Rasa3 est un membre de la famille GAP1 des GTPase activating proteins. Cette protéine stimule la fonction GTPase intrinsèque des petites protéines G telles que Ras et Rap. Rasa3 présente une haute affinité pour l’Ins(1,3,4,5)P4 et le PtdIns(4,5)P2, et est principalement exprimée dans les cellules du système hématopoïétique chez la souris.<p>Dans le but d’étudier chez la souris le rôle physiologique de Rasa3 dans les cellules hématopoïétiques, nous avons d’une part généré et analysé des souris transgéniques surexprimant une forme normale (TgN) ou mutée et catalytiquement inactive (TgM) de la protéine Rasa3 dans les lymphocytes B et/ou T. D’autre part, nous avons reçu des souris Rasa3+/- exprimant une protéine Rasa3 tronquée et catalytiquement inactive. Comme les souris Rasa3-/- meurent pendant la gestation, des transferts de cellules hématopoïétiques souches de foie fœtal d’embryons Rasa3-/- ont été réalisés dans des souris SCID. Les souris SCID après reconstitution développent le système hématopoïétique des souris Rasa3-/-.<p>Nous avons découvert que l’expression de Rasa3 est régulé au niveau de l’ARNm et de la protéique après activation des lymphocytes B par la voie du récepteur aux antigènes (BCR).<p>L’analyse des souris Rasa3 TgN a permis de mettre en évidence une diminution de la survie des lymphocytes B in vitro et une diminution de la réponse immune à un antigène T-indépendant (TI) in vivo. Les souris TgM présentent un phénotype inverse aux souris TgN.<p>Six à 8 semaines après reconstitution, les souris SCID Rasa3-/- présentent un phénotype opposé à celui des souris TgN :leurs lymphocytes B ont une meilleure survie in vitro et une meilleure réponse immune à un antigène TI in vivo. On observe également chez ces souris SCID Rasa3-/- une augmentation du nombre de lymphocytes B dans certaines sous-populations spléniques.<p>L’observation prolongée des souris SCID Rasa3-/- a mis en évidence une diminution de leur survie. A l’autopsie, 90% d’entre elles développent une splénomégalie reflétant une hématopoïèse extra-médullaire. Soixante pourcents d’entre-elles présentent de l’ostéosclérose dans de la cavité médullaire du fémur, associée à une augmentation du pourcentage de mégacaryocytes. D’un point de vue sanguin, les souris SCID Rasa3-/- développent une thrombocytopénie sévère. Des hémorragies et une anémie régénérative ont également été observées. Les causes exactes de la thrombocytopénie doivent encore être investiguées dans le cadre de ce travail.<p>Enfin, environ 15 % des souris SCID Rasa3-/- ont montré une infiltration massive de la rate et de la moelle osseuse par des cellules progénitrices CD117+, suggérant qu’une fraction d’entre-elles développent une leucémie myéloïde aigue.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les facteurs génétiques peuvent apporter des réponses à plusieurs questions que nous nous posons sur les traits humains, les maladies et la réaction aux médicaments, entre autres. Avec le temps, le développement continu d'outils d'analyse génétique nous a permis d'examiner ces facteurs et de trouver des explications pertinentes. Cette thèse explore plusieurs méthodes et outils génétiques, tels que le séquençage pan-exomique et le génotypage sur puce, dans un contexte d'analyse familial et populationnel pour étudier ces facteurs génétiques qui jouent un rôle dans une maladie rare, la cardiomyopathie dilatée (DCM), et dans deux traits complexes soient les globules rouges et les plaquettes. DCM est une maladie rare qui est définie par un ventricule gauche dilaté et une dysfonction systolique. Environ 30% des cas de DCM sont héréditaires, et plus de 50 gènes ont été associés à un rôle dans la pathogénicité de DCM. Le dépistage génétique est un outil de référence dans la gestion clinique de DCM familiale. Par contre, pour la majorité des patients, les tests génétiques ne parviennent pas à identifier une mutation causale dans un gène candidat. Les cellules sanguines remplissent une variété de fonctions biologiques, incluant le transport de l'oxygène, les fonctions immunologiques, ainsi que la guérison de plaies. Les niveaux de ces cellules et leurs paramètres auxiliaires sont mesurés par un test sanguin, et une différence avec les valeurs optimales peut signifier certains troubles. De plus, ces traits sont étudiés méticuleusement dans le contexte des maladies cardiovasculaires (CVD) où différents niveaux sont associés avec un risque variable de CVD ou sont des prédicteurs de complications de CVD. iii J'ai examiné la DCM et les traits sanguins avec comme objectif de découvrir des nouvelles associations de mutations génétiques. Pour la DCM, j'ai évalué la pertinence d'un séquençage pan-exomique dans un environnement clinique. Je rapporte plusieurs nouvelles mutations dans des gènes candidats (DSP, LMNA, MYH7, MYPN, RBM20, TNNT2) et des mutations nonsenses dans deux gènes nouvellement associés (TTN et BAG3), et je démontre que les mutations nonsenses influencent la maladie d'une manière différente des autres mutations causales. Je rapporte aussi une mutation dans un nouveau gène, FLNC, qui cause une forme rare et distincte de cardiomyopathie. Pour l'étude des traits complexes, dans le grand consortium Blood Cell Consortium (BCX), j'ai utilisé l’exomechip pour disséquer le rôle des variantes rares et communes dans les globules rouges et les plaquettes. J'ai identifié 16 nouvelles régions génomiques associées avec les globules rouges et 15 avec les plaquettes, parmi lesquelles se retrouvent plusieurs variantes de basses fréquences (MAP1A, HNF4A, ITGA2B, APOH), et j'ai démontré un chevauchement significatif de régions associées avec d'autres traits, incluant les lipides. Mes résultats sur la DCM ont mis en évidence le rôle de plusieurs gènes candidats, et suggèrent un traitement différent au niveau de la gestion clinique des patients qui portent des mutations dans BAG3 et FLNC. En ce qui concerne les traits sanguins, mes résultats contribuent à enrichir le répertoire de régions associées avec ces traits, soulignant l'importance de l'utilisation de grands ensembles de données pour détecter les variantes rares ou de basses fréquences. La découverte de gènes dans les maladies rares et les traits complexes contribue à la compréhension des mécanismes sous-jacents qui ultimement favorisera de meilleurs diagnostics, gestions et traitements de maladies. / Genetic factors hold within them the answers to many questions we have on human traits, disease, and drug response among others. With time, the continuously advancing genetic tools have enabled us to examine those factors and provided and continue to provide astonishing answers. This thesis utilizes various methods of genetic tools such as exome sequencing and chip-based genotyping data in the context of both family and population-based analyses to interrogate the genetic factors that play a role in a rare disease, dilated cardiomyopathy (DCM), and in two complex traits, red blood cells and platelets. DCM is a rare disease that is defined by a dilated left ventricle and systolic dysfunction. It is estimated that 30% of DCM cases are hereditary and more than 50 genes have been linked to play a role in the pathogenesis of DCM. Genetic screening of known genes is a gold standard tool in the clinical management of familial DCM. However, in the majority of probands, genetic testing fails to identify the causal mutation. Blood cells play a variety of biological functions including oxygen transport, immunological functions, and wound healing. Levels of these cells and their associated indices are measured by a blood test, and deviation from optimal values may indicate certain disorders. Additionally, these traits are heavily studied in the context of cardiovascular disease (CVD) where different levels associate with a variable risk of CVD or are predictors of CVD complications or outcomes (for example, a higher level of white blood cells or lower level of hemoglobin). I examined both DCM and blood cell traits and aimed to discover new mutations and variants that are associated with each. For DCM, I evaluated the value of whole exome vi sequencing in a clinical setting, and I report a number of novel mutations in candidate genes (DSP, LMNA, MYH7, MYPN, RBM20, TNNT2) and truncating mutations in two newly established genes, TTN and BAG3, and I demonstrate that truncating mutations in the latter influence disease differently than other causal mutations. I also report a mutation in a novel gene, FLNC that causes a rare and distinct form of cardiomyopathy. In examining complex traits, I dissected the role of common and rare variants in red blood cells and platelets within a large consortium, the Blood Cell Consortium (BCX) using the ExomeChip, and identified 16 novel loci associated with red blood cell traits and 15 with platelet traits, some of which harbored low-frequency variants (MAP1A, HNF4A, ITGA2B, APOH), and demonstrated a substantial overlap with other phenotypes predominantly lipids. My results on DCM establish the role of a number of candidate genes in this disorder and suggest a different course of clinical management for patients that carry mutations in BAG3 and FLNC. As for blood cell traits, my results contributed to expanding the repertoire of loci associated with red blood cell and platelet traits and illustrate the importance of using large datasets to discover low-frequency or rare variants. Gene discovery in rare disease and complex traits gives insight into the underlying mechanisms which ultimately contributes to a better diagnosis, management, and treatment of disease.