Dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs), le groupe de protéines Polycomb (PcG) répriment les gènes de développement en participant ainsi à la maintenance de l’état de pluripotence. Ce complexe dépose la H3K27me3au niveau des éléments régulateurs induisant une compaction de la chromatine. Cette marque forme en plus des marquesactives H3K4me3 présentes des domaines bivalents. Etrangement, des boucles d’ADN dites entre le promoteur et enhancer, généralement associé à l’activation du gènes, sont observées au niveau des gènes bivalents avant leur activation.On suppose que la fonction du PcG pourrait être de neutraliser l'enhancer conférant une future activation rapide des gènes.Au cours de ma thèse, j’ai identifié les boucles d’ADN formé par les réprimés par PcG dans les mESCs. Pour cela,j’ai effectué un profilage épigénomique de 4 marques d'histones et identifié près de 2500 promoteurs bivalents et 13000enhancers. En utilisant des données publiées de Hi-C à haute résolution, j’ai identifié toutes les boucles formées par les domaines bivalents. Etonnement, j’ai pu identifier que de nombreux gènes réprimés par PcG interagissent avec des enhancers actifs. Cette observation a été suivie d'une validation par le 4C-seq. De plus, j’ai effectué une caractérisation fonctionnelle des boucles en utilisant deux approches. Tout d'abord, j'ai mis en place, en collaboration avec D. Bourc'his(Institut Curie), un système de culture de mESCs (2i + VitC) où le taux de H3K27me3 est réduit. J'ai effectué un profilage épigénomique similaire révélant que les promoteurs réprimés par PcG ont perdu la marque H3K27me3. En RNA-seq, j’ai démontré que l’expression des gènes ne change pas après le PcG soit détacher des promoteurs.. Ensuite, par la réalisation de plusieurs validations en 4C-seq j’ai démontré que les interactions avec les enhancers ne sont pas affecté alors que la moitié des enhancers interagissant perdent leurs marques activatrices. Dans le système 2i+VitC, ces gènes semblent être réprimés par un autre mécanisme suite à la perte du PcG. De plus, j’utilise une approche ciblée pour enlever localement laH3K27me3 de deux gènes bivalents en utilisant le système Cette technique est en cours d’optimisation.Notre étude est la plus systématique au niveau génomique des boucles d'ADN dans le cadre de la régulation des gènes PcG. Notre étude révèle une nouvelle fonction du PcG qui est la répression de boucle d’ADN déjà établies entre promoteurs et enhancers. / In the mouse embryonic stem cells (mESCs), Polycomb Group Proteins (PcG) repress developmental genes and thereby participating in the maintenance of the pluripotency. PcG repress genes by depositing the H3K27me3 histone marks on their regulatory elements, followed by chromatin compaction. In addition to the H3K27me3 marks, those genes carry H3K4me3 active marks and were characterized as bivalent. Intriguingly, at many PcG repressed genes, DNA loops can be observed with enhancer elements, which are normally thought to have an activating function. The aim of my project is to both describe and mechanistically dissect the function of Polycomb repressed promoter – enhancer loops.During my PhD, I aimed firstly to identify all promoter–enhancer loops involved by PcG repressed genes in mESCs. I have performed ChIP-seq profiling of 4 histone marks and identified around 2500 PcG repressed promoters and 13000 enhancers. Using a recently published high-resolution Hi-C data in mESCs, I have identified all DNA loops that are formed by PcG repressed promoters. Surprisingly, a high percentage of bivalent promoters were found to contact active enhancers. The presence of those loops were validated by ultra-high 4C-seq on selected genes and imply a small significant increase of the gene expression without leading to a complete activation of the gene. I have established a more physiological ESC model (2i+VitC) where H3K27me3 is reduced at all promoters. I have performed ChIP-seq, where bivalent promoters were all classified as H3K27me3 negative. RNA-seq experiments have showed that those genes do not become activated. 4C-seq experiments have revealed that those loops do not disappear after PcG removal, whereas the half of interacted enhancer loose their H3K27ac active marks. Those genes seem to remain repressed by an unknown mechanism. These results argue for a possible role of PcG in preparing the gene for their activation by blocking the productivity of such DNA loops. Secondly, I aimed to functionally characterize those DNA loops by using a CRISPR/dCas9 approach to completely remove H3K27me3 from two PcG repressed genes that contact active enhancers Pax6 and Nkx1-1 genes. This system is still under optimization steps.My project revealed the most systematic characterization of DNA loops under the regulation of PcG, providing important insight how PcG function to inactivate such loops. I have highlighted an additional function of PcG which the involvement in the repression of already establish loops between active enhancers and promoters and thereby blocking the productivity of such activating loops. This function is an addition to the already described repressive function of PcG on both promoters and poised enhancers.

L’épithélium mammaire est composé de cellules luminales et basales myoépithéliales. Il comprend des cellules souches et progénitrices qui gouvernent le développement de la glande. Leur dérégulation est probablement à l’origine de certains cancers du sein très agressifs, dits « triple-­‐négatifs » (négatifs pour les récepteurs hormonaux et HER2), pour lesquels il n’existe pas de thérapie ciblée. L’équipe a identifié un nouveau marqueur spécifique du compartiment basal comprenant les cellules souches, la Podoplanine (Pdpn), dont l’expression est concentrée aux contactsintercellulaires basal-­‐luminal. La Pdpn est une glycoprotéine transmembranaire connectée au cytosquelette, impliquée dans le développement denombreux tissus et la tumorigenèse. Son rôle dans la glande mammaire n’a jamais été étudié. A l’aide d’une délétion génique conditionnelle, nous avons trouvé que l’absence de Pdpn dans l’épithélium mammaire perturbe la fonction des cellules souches/progénitrices basales ainsi quel’expression de plusieurs composants du signalosome de la voie Wnt/b-­‐caténine. De plus, la perte de Pdpn dans un modèle murin de tumorigénèsemammaire induite par l’activation de la signalisation Wnt/b-­‐caténine réduit la fréquence des tumeurs mammaires triple-­‐négatives, limite l’expansiondes cellules initiatrices de tumeurs et favorise l’expression de marqueurs moléculaires associés à un programme de transition mésenchymo-­‐épithéliale. Au moyen d’expériences de gain de fonction dans une lignée de cellules basales mammaires, Nous avons montré que les phénotypes décrits précédemment reposent sur des mécanismes moléculaires impliquant la Pdpn dans le contrôle positif de l’activation de la voie Wnt/b-­‐caténine. Notre étude révèle un rôle pour la Pdpn dans le contrôle des cellules souches et de leur réponse à la signalisation Wnt/b-­‐caténine au cours du développement et de la tumorigénèse mammaire. / Stem cells (SC) drive mammary development, giving rise postnatally to an epithelial bilayer composed of luminal and basal myoepithelial cells. The molecular identity of SCs and the factors regulating their function remain poorly defined. We identified the transmembrane protein, Podoplanin (Pdpn), as a specific marker of the basal compartment, including multipotent SCs, and found Pdpn localized at the basal-luminal interface. Embryonic deletion of Pdpn targeted to basal cells diminished basal and luminal SC activity and affected expression of several Wnt/b-catenin (Wnt/b-cat) signaling components. Moreover, Pdpn deletion attenuated mammary tumor formation in a mouse model of b-cat-induced breast cancer, limiting tumor-initiating cell expansion and promoting molecular features associated with mesenchymal-to-epithelial cell transition. In line with the loss-of-function data, we demonstrated that mechanistically, Pdpn enhanced Wnt/b-cat signaling in mammary basal cells. Overall, our study reveals a role for Pdpn in mammary development and tumorigenesis through the control of Wnt/b-cat-responsive SCs.

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont à l’origine de la progression tumorale, des métastases et rechutes tardives. Elles ont été identifiées dans de nombreux cancers, comme le cancer du sein triple négatif (TNBC) et cancers de grade III-IV. Elles sont résistantes aux chimiothérapies et radiothérapie et résident dans une niche immuno-répressive. Cette étude vise à évaluer une stratégie d’immunothérapie qui cible sélectivement les CSC dans le modèle murin 4T1-GFP-Luc mimant le TNBC. Le phénotype/ génotype des mamosphères a été initialement caractérisé. Basée sur l’analyse génomique des CSC, nous avons développé une immunothérapie active associée à des agents immuno-modulateurs. Nous avons mesuré la taille des tumeurs et suivi l’apparition des métastases par bioluminescence. Une étude immunologique et analyse génomique de la tumeur a été réalisée. La combinaison thérapeutique provoque le recrutement dans la tumeur de lymphocytes T (CD4 +, CD8 +) et lymphocytes B par augmentation de CXCL13, une réduction des lymphocytes T reg et cellules myéloïdes suppressives. Cette induction de réponse immunitaire provoque la diminution de la taille de la tumeur et des métastases. Cette nouvelle immunothérapie active de type vaccinale pourra être utilisée en association avec les traitements actuels pour des mesures prophylactiques et curatives dans une grande variété de cancers. / Cancer stem cells (CSCs) are responsible for tumor progression, metastases, and late relapses. They have been identified in many cancers, such as triple negative breast cancer (TNBC) and grade III to IV cancers. They are resistant to chemotherapy and radiotherapy and reside in an immuno-repressive niche.This study aims to evaluate a immunotherapy strategy that selectively targets CSCs in the mouse model 4T1-GFP-Luc mimicking TNBC. The phenotype / genotype of mammosphere was initially characterized. Based on genomic analysis of CSC, we have developed an active immunotherapy associated with immunomodulatory agents. We measured the size of tumors and monitored the appearance of metastases by bioluminescence. We performed an immunological study and genomic tumor analysis. The therapeutic combination causes the recruitment of CD4 + and CD8 + T lymphocytes and B lymphocytes with increased CXCL13, the reduction of T reg cells and suppressive myeloid cells in the tumor. This induction of intra-tumor immune response leads to a decrease in tumor size and metastases.This new active immunotherapy can be used in combination with current treatments for prophylactic and curative measures in a wide variety of cancers.

Le raccourcissement progressif des télomères, en grande partie dû à la réplication incomplète des télomères, est l’une des caractéristiques principales du vieillissement. De façon encore plus frappante, une attrition trop marquée ou rapide des télomères est l’une des causes majeures d’un vieillissement prématuré. Les patients diagnostiqués avec un tel syndrome présentent généralement des mutations délétères dans un gène de maintien de l’homéostasie des télomères. Parmi les symptômes physiologiques, on remarque chez ces patients, des dégénérescences dans les tissus hautement prolifératifs, dus à l’exhaustion des cellules souches. Les cellules souches adultes, spécialisées et présentes dans nos tissus, permettent normalement la régénération des organes grâce à leur potentiel prolifératif et de différenciation. Afin de maintenir leur intégrité génomique, les cellules souches expriment une enzyme, la télomérase, capable de rallonger les extrémités terminales des chromosomes, et ainsi de maintenir intègre les télomères de ces cellules subissant des divisions cellulaire et subsistant dans l’organisme durant la vie de l’individu. En revanche, l’expression de la télomérase s’amenuise au cours du temps, les télomères se raccourcissent et les fonctions des cellules souches sont altérées. Nous étudions ce phénomène en utilisant comme modèle cellulaire, les cellules souches embryonnaires de souris, dont le gène de la télomérase réverse transcriptase a été anéanti génétiquement (mESC Tert -/-). Notamment, ces cellules, qui possèdent des télomères extrêmement courts n’arrivent pas à se différencier correctement. D’une étude précédente, mon laboratoire avait montré que ces cellules ne réussissaient pas à réprimer l’expression des gènes de pluripotence, comme Pou5F1/Oct4 et Nanog, et donc montraient des difficultés à sortir de l’état indifférencié. Au cours de mes recherches, nous avons montré que ce défaut était en fait dû à une altération en profondeur de l’épigénétique de ces cellules. Après avoir observé une déméthylation globale de l’ADN, nous avons constaté une augmentation de la marque d’histone H3K27me3 à travers le génome. De plus, moduler la présence de H3K27me3 via des petits inhibiteurs du complexe PRC2, ou par une approche génétique, modifie également le potentiel de différenciation des cellules souches. À la suite de cette étude, nous avons voulu en savoir davantage sur le signal liant attrition des télomères et défaut de différenciation. Lorsque les télomères sont très courts, la voie de réparation de l’ADN les reconnait comme une cassure double-brin. Parmi les acteurs de la réparation de l’ADN, la protéine p53 joue un rôle central puisqu’elle influence le destin cellulaire. Candidat idéal, nous avons cherché à savoir si p53 influençait la différenciation des mESC Tert -/- en utilisant une approche génétique. Nous avons été surpris de constater que l’absence de p53 restaurait le potentiel de différenciation des mESC Tert -/-. Ainsi et pour la première fois, nous avons montré que le raccourcissement des télomères pouvait avoir un effet très global sur les cellules. Nos recherches permettront de mieux appréhender certaines problématiques, notamment en matière de vieillissement. / The progressive decline of telomere length, mainly due to incomplete DNA replication at telomeres, is one of the main features of aging. Even more strikingly, excessive or rapid telomere attrition is one of the major causes of premature aging. Patients diagnosed with such syndromes have deleterious mutations in genes that maintain telomere homeostasis. For these patients, physiological manifestations include degeneration in highly proliferative tissues due to stem cell exhaustion. Adult stem cells, present in our tissues, typically allow the regeneration of organs due to their proliferative and differentiation potential. To maintain their replicative potential, stem cells express an enzyme, called telomerase, that is capable of lengthening the terminal ends of chromosomes. The maintenance of telomere length and, consequently favoring genomic stability, is crucial for stem cells that undergo cell division and remain in the organism throughout the individual's life. However, in stem cells, telomerase expression decreases over time, leading to telomere attrition and defects in stem cell functions. We studied this phenomenon using mouse embryonic stem cells disrupted for telomerase reverse transcriptase (mESC Tert -/-) as a model. In particular, these cells, which have extremely short telomeres, are unable to differentiate appropriately. Previously, my colleagues had shown that these cells failed to repress the expression of pluripotency genes, such as Pou5f1/Oct4 and Nanog, and therefore were refractory to differentiation. Here, we uncovered that profound epigenetic alterations influenced mESC Tert-/- cell fate. In addition to global DNA demethylation, we found an increase in H3K27me3 throughout the genome. Furthermore, modulating the levels of H3K27me3 via small inhibitors of the PRC2 complex or by a genetic approach also altered the differentiation potential of stem cells. Following this study, we wanted to learn more about the signals linking telomere attrition and differentiation failure. When telomeres are very short, the DNA repair pathway recognizes them as a double-strand break. Among the actors in DNA repair, the p53 protein plays a central role in influencing cell fate. As an ideal candidate, we investigated whether p53 influenced the differentiation of Tert-/- mESCs using a genetic approach. We were surprised to find that the absence of p53 restored the differentiation potential of Tert-/- mESCs. Thus, for the first time, we have shown that telomere shortening can have a very global effect on stem cells. Our research will allow us to better understand specific problems, particularly in the field of aging.

La stabilité de la longueur des télomères est cruciale pour le maintien de l’intégrité du génome. De nombreux problèmes peuvent survenir lors de la perte de l’intégrité des télomères, tels que le vieillissement prématuré ainsi que d’autres maladies incluant, l’insuffisance de la moelle osseuse et les cancers. Certaines cellules, telles que les cellules souches embryonnaires, expriment la télomérase permettant le maintien de la longueur des télomères. Le laboratoire Harrington a démontré que l’absence de la télomérase engendre un défaut de différenciation des mESCs à télomères courts (mESCs Tert -/-) ainsi que des perturbations épigénétiques. Ils ont aussi détecté un rétablissement de l’habilité de différenciation des mESCs Tert -/- dans le contexte d’un « knockout » de Trp53. Nous avons cherché à comprendre comment Trp53 influence la différenciation des mESCs à télomères courts en étudiant l’impact de Cdkn1a (p21) sur leur différenciation. En utilisant CRISPR/Cas9, nous avons généré plusieurs clones Cdkn1a KO afin d’analyser leur capacité à se différencier. Nous avons également étudié l’impact d’un Trp53 KO dans les mESCs Tert -/- sur les marques épigénétiques ainsi que sur la longueur des télomères. Cette étude ne nous permet pas de conclure comment p53 impact la différenciation de ces cellules, même s’il semble apparent que p21 ne soit pas directement impliqué. La poursuite de ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme de différenciation des mESCs et son lien avec l’intégrité des télomères et par conséquent, contribuera à mieux connaître l’impact des télomères dans le vieillissement et ses maladies associées. / Telomere length stability is crucial for the maintenance of genome integrity. Many problems can arise from a loss of telomere integrity, such as premature aging, and other diseases including anemia, bone marrow failure, and cancer. Some cells, such as embryonic stem cells, express telomerase, which allows telomere length maintenance. The Harrington group showed that the absence of telomerase generates a defect in the differentiation of ES cells with eroded telomeres (mESCs Tert -/-) and was accompanied by other epigenetic modifications. They also detected a rescue in differentiation of mESCs Tert -/- that were disrupted or knocked out (KO) for the tumor suppressor p53, encoded by Trp53. We aimed to understand how Trp53 impacts mESCs differentiation by looking at the impact of Cdkn1a (p21) on the differentiation of those cells as well as the impact of p53 KO on epigenetic marks. Using CRISPR/Cas9, we generated several p21 KO clones to analyze their ability to differentiate. We also assessed the impact of a p53 KO in mESCs Tert -/- on epigenetic marks and telomere lengths. This study does not allow us to conclude how p53 impacts differentiation of those cells, even though it appears that p21 is not directly implicated. The continuation of this project will allow a better understanding of the differentiation mechanism in mESCs and its relationship to telomere integrity, and a deeper appreciation of the impact of telomeres in aging and correlated diseases.

Au cours des trois dernières décennies, l’amélioration des soins périnataux a permis une meilleure survie des nouveau-nés nés prématurément (<37 semaines de gestation), et en particulier ceux extrêmement prématurés (<28 semaines). Plusieurs études ont montré une vulnérabilité accrue des individus prématurés aux maladies chroniques. En effet, la naissance prématurée est associée à des modifications au niveau des systèmes cardiovasculaire, pulmonaire, métabolique ou encore osseux. On retrouve également une réduction de la capacité à l’exercice, souvent attribuée à l’atteinte cardio-pulmonaire. Cependant, l’impact de la naissance prématurée sur le développement et la fonction des muscles squelettiques, un acteur essentiel de la capacité d’exercice et de la santé cardiorespiratoire, reste à élucider. Afin de faire état de la littérature concernant l'impact de la naissance prématurée sur les muscles squelettiques, nous avons réalisé une revue systématique et méta-analyse. Dans l’ensemble, les résultats indiquaient une altération de la masse et de la fonction des muscles squelettiques chez les individus nés prématurément comparés à ceux nés à terme. Cette étude a également mis en évidence un manque évident de connaissances des mécanismes liant les impacts de la naissance prématurée et le développement et la fonction des muscles squelettiques depuis l’enfance jusqu’à l’âge adulte. L’objectif de cette thèse est donc d’identifier comment les conditions associées à une naissance prématurée en début de vie ont un impact sur la santé des muscles squelettiques plus tard dans la vie. Dans un premier article, utilisant un modèle animal mimant les conditions délétères liées à la naissance prématurée, nous avons rapporté un stress oxydatif et une inflammation tissulaire des muscles aux stades néonatal, juvéniles et adultes. Ces modifications étaient associées à un changement des types de fibres, une fibrose et à des altérations fonctionnelles suggérant un phénotype de vieillissement prématuré. Dans un deuxième article nous avons mis en évidence chez les adultes nés prématurément une réduction de l’aire musculaire et de la force (préhension et extenseur de la jambe) associées à une rigidité musculaire accrue comparées aux individus nés à terme. Dans un troisième article nous avons approfondi les mécanismes physiopathologiques et nous avons mis en évidence que ce phénotype observé en modèle expérimental et chez l’humain serait en partie expliqué par une atteinte de la capacité myogénique des cellules souches musculaires, cruciales pour le développement et la réparation musculaire tout au long de la vie. En effet, nous avons démontré qu’une exposition aux conditions délétères liées à la naissance prématurée induit une inflammation chronique de faible intensité caractérisée par une régulation positive de la voie TNF-α/NF-κB dans le muscle squelettique. Cette inflammation est responsable d’une altération de la capacité myogénique des cellules souches musculaires et de la capacité régénérative du muscle. Ces altérations peuvent entraîner une modification de la santé musculaire et un phénotype de vieillissement/faiblesse musculaire à l’âge adulte. Dans l’ensemble, les travaux présentés dans cette thèse ouvrent une nouvelle voie de recherche dans notre compréhension des conséquences de la naissance prématurée sur la santé à long terme. Ils apportent plusieurs éléments déterminants concernant les mécanismes sous-jacents expliquant l’atteinte musculaire suite à une naissance prématurée. Ces travaux permettent de souligner l’importance de déterminer des stratégies visant à améliorer la santé des muscles squelettiques, avec le postulat que ces interventions peuvent représenter une nouvelle voie pour prévenir les maladies chroniques suite à une naissance prématurée. / Over the last three decades, improved perinatal care allow the survival of the vast majority of infants born preterm (<37 weeks of gestation), especially those extremely prematurely (<28 weeks). Several studies have shown an increased vulnerability of individuals born preterm to chronic diseases. Indeed, premature birth is associated with changes in cardiovascular, pulmonary, metabolic and bone systems. Preterm birth is associated with reduce exercise capacity explained by the cardiopulmonary impairment. However, the impact of preterm birth on the development and function of skeletal muscles, critical player of exercise capacity and cardiorespiratory health, remains to be exam. To report the literature regarding the impact of premature birth on skeletal muscles, we conducted a systematic review and meta-analysis. Overall, the results indicated impaired skeletal muscle mass and function in individuals born prematurely compared to those born at term. This study also highlighted a clear lack of knowledge of the mechanisms linking the impacts of premature birth and the development and function of skeletal muscles from childhood to adulthood. The objective of this thesis is therefore to identify how conditions associated with premature birth early in life impact skeletal muscle health later in life. In a first article, using an animal model mimicking the deleterious conditions associated to premature birth, we reported oxidative stress and muscle tissue inflammation. These modifications were associated with fiber typing changing, fibrosis and functional alterations suggesting a premature aging phenotype. In a second article we demonstrated in adults born preterm a reduction of muscle area and strength (grip and leg extensor) associated with increased stiffness of the tissue compared to individuals born at term. Thus, individuals born preterm appear to show signs of premature muscle aging, as observed in the animal model. In a third article, we demonstrated that this phenotype observe could be explained by an impairment of the myogenic capacity of muscle stem cells, crucial for muscle development and repair throughout the life. Indeed, we reported that exposure to deleterious conditions linked to premature birth induces low-grade inflammation characterized by an upregulation of the TNF-α/NF-κB pathway in skeletal muscle. This inflammation is responsible for an alteration of the myogenic capacity of muscle stem cells and of the regenerative capacity of muscle. These modifications could lead to altered muscle health and an aging/weakened muscle phenotype in adulthood. Overall, the work presented in this thesis opens a new avenue of research to enhance our understanding of the consequences of preterm birth on long-term health. We provide several determining elements concerning the underlying mechanisms explaining muscle damage following preterm birth. This work highlights the importance of determining strategies aimed at improving skeletal muscle health, with the postulate that these interventions may represent a new avenue for preventing chronic diseases following premature birth.

Les cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSCs) offrent de nouvelles perspectives dans de nombreux domaines, notamment pour la médecine régénérative, la thérapie cellulaire et le développement de substances médicamenteuses. La reprogrammation des cellules somatiques en iPSCs est très prometteuse; cependant, l’ensemble des mécanismes moléculaires impliqués reste méconnu. Ce processus produit souvent des populations d’iPSCs hétérogènes, avec des potentiels de différenciation variables, ce qui soulève des inquiétudes quant à leur fiabilité en vue de leur utilisation clinique. Notre étude suggère que cette variabilité pourrait être reflétée par la stabilité des lignées iPSCs, avec des implications potentielles concernant leurs capacités de différenciation, ainsi que le risque d’instabilité génomique et d’oncogenèse. Afin d’explorer ces questions, nous avons caractérisé les lignées d’iPSCs à l’aide de diverses techniques, notamment la qPCR pour analyser l’expression des gènes de pluripotence, la cytométrie en flux pour la détection des marqueurs de surface, ainsi que le pyroséquençage et le séquençage après traitement au bisulfite pour évaluer les profils épigénétiques. Par ailleurs, l’analyse métabolique via le système SeaHorse FX a permis d’examiner les profils métaboliques des cellules. La dérégulation d’acteurs clés tels que la marque H3K27me3, phénomène couramment observé dans de nombreux cancers, souligne les similarités entre la pluripotence et l’oncogenèse. Notre recherche met en lumière l’importance de surveiller étroitement les lignées d’iPSCs, de comprendre leur comportement à long terme et de développer de nouveaux outils de caractérisation pour garantir leur qualité en vue d’une utilisation plus sécuritaire, en particulier lorsqu’il s’agit de thérapie cellulaire et de la génération de meilleurs modèles de maladies in vitro. Après avoir utilisé cette caractérisation plus rigoureuse pour sélectionner la lignée iPSCs la plus stable, nous l’avons utilisée pour développer un modèle du syndrome d’Alagille. Le syndrome d’Alagille (ALGS) est une maladie multisystémique caractérisée au niveau hépatique par un appauvrissement des voies biliaires, une cholestase et une fibrose. Dans le but de mieux comprendre la physiopathologie de l’ALGS, nous avons mis au point un modèle 3D in vitro en utilisant des organoïdes hépatiques dérivés d’iPSCs. En utilisant la technologie CRISPR/Cas9, des clones d’iPSCs isogéniques avec différents types de mutations dans le gène JAG1 ont été générés. Ces iPSCs mutées ont été différenciées en cellules progénitrices hépatiques, mésenchymateuses et endothéliales, qui ont ensuite été caractérisées par qPCR, cytométrie en flux, immunofluorescence, ainsi que par des tests d’angiogenèse sur Matrigel, pour composer des organoïdes hépatiques. L’étude a révélé que les mutations de JAG1 affectaient tous les types cellulaires au sein des organoïdes, entraînant une altération de la formation des canaux biliaires, reproduisant l’appauvrissement des canaux biliaires ainsi que les anomalies vasculaires, caractéristiques de l’ALGS. Les organoïdes ont été coupés et analysés par histologie et immunofluorescence, ce qui a permis de mieux visualiser les structures biliaires et vasculaires affectées. De plus, des organoïdes hybrides combinant des cellules mutées et des cellules saines ont mis en évidence le rôle des cellules parenchymateuses dans le phénotype de la maladie. En outre, la dérégulation de voies de signalisation importantes telles que YAP/TAZ et la perte de SOX9 sont en corrélation avec la rareté des canaux biliaires. Ce modèle de développement humain représentatif de l’ALGS, utilisant des organoïdes hépatiques dérivés d’iPSCs, permet de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie, en particulier en ce qui concerne la rareté des canaux biliaires, le défaut de régénération et la fibrose, et offre également une plateforme pour des études plus approfondies et des interventions thérapeutiques potentielles. / Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) offer new prospects in many fields, including regenerative medicine, cell therapy and drug development. The reprogramming of somatic cells into iPSCs is highly promising; however, the full molecular mechanisms involved remain poorly understood. This process often produces heterogeneous iPSC populations with variable differentiation potential, raising concerns about their reliability for clinical use. Our study suggests that this variability could be reflected by the stability of iPSCs lineages, with potential implications concerning their differentiation capabilities, as well as the risk of genomic instability and oncogenesis. To explore these issues, we characterized iPSCs lines using a variety of techniques, including qPCR to analyze pluripotency gene expression, flow cytometry to detect surface markers, and pyrosequencing and sequencing after bisulfite treatment to assess epigenetic profiles. In addition, metabolic analysis using the SeaHorse FX system was used to examine cell energy profiles. The deregulation of key players such as the H3K27me3 mark, a phenomenon commonly observed in many cancers, highlights the similarities between pluripotency and oncogenesis. Our research highlights the importance of closely monitoring iPSCs lines, understanding their long-term behavior and developing new characterization tools to ensure their quality for safer use, particularly when it comes to cell therapy and the generation of better in vitro disease models. After using this more rigorous characterization to select the most stable iPSCs line, we used it to develop a model of Alagille syndrome. Alagille syndrome (ALGS) is a multisystem disease characterized in the liver by bile duct impoverishment, cholestasis and fibrosis. To better understand the pathophysiology of ALGS, we have developed a 3D in vitro model using iPSC-derived liver organoids. Using CRISPR/Cas9 technology, isogenic iPSC clones with different types of mutations in the JAG1 gene were generated. These mutated iPSCs were differentiated into liver, mesenchymal and endothelial progenitor cells, which were then characterized by qPCR, flow cytometry, immunofluorescence, as well as angiogenesis assays on Matrigel, to compose liver organoids. The study revealed that JAG1 mutations affected all cell types within the organoids, resulting in impaired bile duct formation, mimicking the bile duct depletion and vascular abnormalities characteristic of ALGS. The organoids were cut and analyzed by histology and immunofluorescence, allowing better visualization of the affected bile and vascular structures. In addition, hybrid organoids combining mutated and healthy cells highlighted the role of parenchymal cells in the disease phenotype. Furthermore, dysregulation of key signaling pathways such as YAP/TAZ and loss of SOX9 correlate with the scarcity of bile ducts. This representative human developmental model of ALGS, using iPSCs-derived liver organoids, provides insight into the pathophysiology of the disease, particularly regarding bile duct sparsity, regeneration defect and fibrosis, and offers a platform for further studies and potential therapeutic interventions.

Les biotechnologies constituent aujourd'hui un secteur d'activités dynamique offrant de nouvelles perspectives d'innovations. Ces connaissances, permettant d'allier deux entités jusqu'ici traitées séparément, la technique et le vivant, sont en proie de révolutionner notre rapport au monde à de nombreux égards. La présente étude a plus spécifiquement vocation à se pencher sur les innovations biologiques produites à partir d'éléments extraits du corps humain, tels que les cellules souches et les gènes. La biologie cellulaire et le génie génétique se sont imposés comme des secteurs phares des biotechnologies en raison des progrès significatifs qu'ils pourraient permettre pour le traitement de certaines maladies génétiques rares. Toutefois, la protection juridique devant être octroyée à ce type de créations suscite un flot de réactions souvent très partagées au sein de l'opinion publique. Si le brevet est reconnu comme l'outil de propriété industrielle privilégié pour protéger efficacement les inventions, son application au domaine du vivant, et qui plus est au corps humain, demeure plus délicate et controversée. L'inadéquation des critères de brevetabilité aux inventions biotechnologiques fait aujourd'hui obstacle à la prise en considération de ces nouvelles formes de créations par la propriété intellectuelle. Ce projet de recherche s'inscrit dans une perspective globale et transversale, visant à comprendre en quoi le domaine brevetable est influencé par une série de considérations éthiques et par la superposition d'intérêts économiques et sociaux divergents. Il s'agit ainsi de tenter de clarifier les délimitations de l'objet brevetable et de réfléchir à l'opportunité de nouvelles admissions dans le champ de la brevetabilité tout en maintenant certains garde-fous essentiels à la protection des droits fondamentaux individuels. Dès lors, cette étude s'intéresse aux outils et stratégies disponibles afin de renforcer la coopération entre les acteurs impliqués dans ce débat et d'assurer un meilleur équilibre entre les différents intérêts en présence. / Biotechnologies are now a key economic sector offering new prospects for innovation. Technology and life are brought together in a single discipline to develop new knowledge that could revolutionize our world's vision in many ways. Our study focuses on biological innovations made up of elements extracted from the human body, such as stem cells ang genes. Cell biology and genetic engineering are the most attractive and dynamic areas of biotechnology. They are leading to major advances in the treatment of some rare genetic diseases. However, the legal protection of these forms of inventions raises a lot of issues and leads to a flood of divergent reactions in public opinion. Patent is traditionally recognized as the most appropriate industrial property tool to protect inventions. Its application to the life field and especially to human body remains however more controversial. The difficulties stemming from patentability criteria where biotechnological inventions are concerned illustrate the shortcomings of industrial property law in grasping these new forms of creation. This report adopts a global and transversal point of view in order to understand how the scope of patentability is influenced by a range of ethical considerations as well as economic and social interests. The main objective of this work is to clarify the boundaries of patentability and to reflect on the opportunity of new admissions as patent-eligible subject matter while ensuring protection of human fundamental rights such as bodily integrity and human dignity. This paper brings up the tools and strategies that could be used to strengthen cooperation between the different actors involved in this debate but also to ensure a better balance of interests at stake.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Facteur de transcription Ikaros / La rétine constitue un modèle très intéressant pour l'étude du développement du système nerveux. Elle origine de cellules neuroépithéliales qui se diviseront et se différencieront pour donner naissance à 6 différents types de neurones et un type de cellule gliale. Au cours du développement, la majorité des cellules progénitrices de la rétine (CPRs) sont multipotentes et quelques unes ont même le potentiel de générer tous les différents types cellulaires de la rétine. Cependant, à des stades plus tardifs, les CPRs perdent alors la compétence qui leur permet de générer les cellules dites précoces et acquièrent la capacité de générer les cellules dites tardives. Il est clair que l'ensemble des types cellulaires est produit dans un ordre bien précis et concomitant, mais les mécanismes moléculaires par lesquels les CPRs changent leur compétence au cours du temps pour générer chaque type de cellule au bon moment restent toutefois inconnus. Le facteur de transcription Ikaros avait été largement étudié dans le système hématopoïétique, cependant son rôle potentiel au niveau du système nerveux n'avait que très peu été exploré. Dans cette étude nous avons investigué l'hypothèse qu'Ikaros puisse contrôler la compétence temporelle des CPRs. Nous avons premièrement observé qu'Ikaros est exprimé dans les CPRs au début du développement tandis qu'à des stades plus avancés son expression devient alors restreinte à une sous-population pour finalement être absente dans l'ensemble des CPRs aux derniers stades du développement de la rétine. De plus, chez la rétine adulte, Ikaros est exprimé dans les neurones différenciés de type précoce. En effectuant une analyse clonale à l'aide de rétrovirus, nous avons montré qu'en induisant l'expression d'Ikaros dans les CPRs à des stades tardifs, où il n'est normalement pas exprimé, il est possible d'induire la production de cellules de type précoce au dépend des cellules produites tardivement. De plus, l'analyse de souris dont le gène Ikaros à été inactivé nous a révélé que plusieurs cellules nées précocement au cours du développement sont manquantes. L'ensemble de ces résultats suggère donc un modèle dans lequel l'expression d'Ikaros est à la fois nécessaire et suffisante pour conférer une compétente temporelle précoce au CPRs. Une fois la diversité cellulaire générée, des vagues d'apoptoses successives ont lieu de manière à éliminer les cellules extranuméraires ou corriger les erreurs de connections. La mort cellulaire programmée ou apoptose est donc un procédé essentiel au développement du système nerveux. Cependant, les régulateurs extracellulaires de cette mort cellulaire developpementale restent toutefois très méconnus. Dans cette thèse, nous avons étudié le rôle de la voie de signalisation du CNTF/LIF durant le développement rétinien in vivo. Nous démontrons que l'exposition au CNTF durant le développement postnatal de la rétine in vivo retarde l'expression de la rhodopsine et résulte en un important déficit spécifique en photorécepteurs. Plus spécifiquement, nous montrons que l'exposition au CNTF induit une augmentation importante de la mort cellulaire des précurseurs postmitotiques des photorécepteurs bâtonnets. De plus, nous montrons que le blocage de la voie du CNTF/LIF durant le développement de la rétine de souris in vivo résulte en une diminution significative de la mort cellulaire developpementale des photorécepteurs. Nous démontrons aussi que la voie CNTF/LIF est responsable de l'apoptose spécifique des photorécepteurs issuent de clones contenant seulement des photorécepteurs sans toutefois affecter les photorécepteurs issuent de clones mixtes. Nous avons observé que la stimulation ou le blocage de la voie du CNTF/LIF contrôle l'expression génique des isoformes neuronale et endotheliale de la synthase d'oxide nitrique (NOS) et la production subséquente d'oxide nitrique (NO) à partir de ces enzymes est responsable de l'apoptose induite par CNTF . Ces résultats suggèrent donc que la voie de signalisation du CNTF/LIF est active au cours du dévelopement rétinien et agit via la régulation de la production d'oxide nitrique afin de moduler la mort cellulaire programmée des précurseurs postmitotiques des photorécepteurs bâtonnets.

Au LOEX, un modèle de folliculogénèse a été caractérisé. Ce modèle consiste à incorporer des follicules pileux immatures de souris dans les peaux reconstruites par génie tissulaire. À l'aide des peaux reconstruites, nous avons comparé l'influence des cellules dermiques sur la différenciation des cellules souches des follicules pileux. La maturation in vitro des follicules pileux immatures sur les fibroblastes murins et humains a mené à l'apparition d'inclusions intradermiques. Cependant, les études de caractérisation ont révélé la présence de marqueurs de différenciation épidermique dans les kystes dérivants des follicules pileux immatures cultivés sur fibroblastes humains, contrairement à ceux cultivés sur fibroblastes murins. Ces derniers ont plutôt des caractéristiques histologiques qui ressemblent davantage aux cellules retrouvées au niveau de la gaine folliculaire externe du follicule pileux. Un dérèglement de la voie de signalisation Wnt pourrait expliquer ces phénomènes, puisque la p-caténine et le facteur Lef-l ne sont pas activés dans ces peaux reconstruites.