Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4609_1.pdf: 2368658 bytes, checksum: de9d3c8edffdfaadc4530589a7694fed (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fungos filamentosos de sedimento do manguezal Barra das Jangadas, foram isolados e identificados com objetivo de proceder a caracterização enzimática. Foram coletadas amostras de sedimento do manguezal Barra das Jangadas nos meses de março e abril/2004 e outubro/2005 (período de estiagem); junho e julho/2004 e julho/2005 (período chuvoso). As coletas foram realizadas em quatro pontos em manguezais do estuário formado pelos rios Jaboatão e Pirapama, perfazendo um total de 24 amostras. Foram isoladas e identificadas 50 espécies de fungos filamentosos em 273 UFC x 104. Penicillium e Aspergillus foram os gêneros melhor representados, com 21 e 11 espécies, respectivamente, seguidos de Trichoderma (5), Fusarium, Phoma e Talaromyces (2). Os demais gêneros foram representados por uma só espécie: Cladosporium, Eupenicillium, Gongronella, Microsphaeropsis, Mucor, Stilbella e Thielavia. Das 50 espécies testadas para seleção qualitativa enzimática, 21 apresentaram atividade positiva para fenoloxidase e 11 para celulase; entretanto, nenhuma foi positiva para xilanase. Em relação a análise enzimática quantitativa, apresentaram melhor atividade para celulase Microsphaeropsis olivacea (0,4546 U/mg) e Stilbella clavispora (0,3584 U/mg); para xilanase Phoma capitulum (271 U/mg) e Trichoderma aureoviride (268 U/mg). Para as fenoloxidases, Aspergillus sclerotiorum (739,7569 nanokatals/mg), Penicillium commune (8,785982 U/mg) e Penicillium oxalicum (28,6021 U/mg/min) foram os maiores produtores de lacase, manganês peroxidase e lignina peroxidase, respectivamente. Os fungos selecionados demonstraram potencial para serem introduzidos em processos de biorremediação, com perspectivas de resultados promissores para tratamentos de resíduos e efluentes fenólicos

Orientador: Daniela Alonso Bocchini / Banca: Kelly Johana Dussan Medina / Banca: Jonas Contiero / Resumo: Os principais desafios para a produção de etanol celulósico se relacionam aos custos de obtenção das celulases, à disponibilização da celulose presente nos materiais lignocelulósicos (para maior rendimento da sacarificação enzimática), bem como à eficiente conversão da glicose liberada em etanol. As celulases microbianas têm sido extensivamente estudadas nos últimos anos, visando a sua aplicação no bagaço de cana-de-açúcar para liberação de açúcares fermentescíveis e posteriormente a produção de etanol celulósico. O presente trabalho teve como objetivo o estudo da produção de celulases por oito fungos endofíticos, por fermentação em estado sólido (FES) e a utilização dos extratos enzimáticos na sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado. Os fungos foram cultivados utilizando-se quatro misturas (1:1 p/p) de diferentes substratos lignocelulósicos, sendo selecionada para cada fungo, a mistura que proporcionou as maiores atividades de celulases nos extratos enzimáticos obtidos. Tais enzimas foram utilizadas na sacarificação do bagaço de cana submetido a pré-tratamento hidrotérmico alcalino (NaOH 5% p/v), o qual apresentou a vantagem de gerar uma baixa concentração de inibidores, seguindo três diferentes protocolos de sacarificação. Nesta etapa, foram selecionados os fungos Phomopsis stipata SC 04 (concentrações de glicose de 3,82 e 4,72 mg/mL nos hidrolisados obtidos pelos Protocolos 1 e 2 de sacarificação respectivamente) e Botryosphaeria sp. AM 01 (concentração de gl... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The main challenges for cellulosic ethanol production have been related to cellulases costs, to the availability of cellulose in lignocellulosic materials (for higher yield of enzymatic saccharification), as well as to the efficient conversion of glucose in ethanol. Microbial cellulases have been extensively studied in the last years, aiming its application on sugarcane bagasse to release of fermentable sugars and later the cellulosic ethanol production. The present work had as objective the study of cellulase production by eight endophytic fungi by solid-state fermentation (SSF), and the use of the enzymatic extracts in saccharification of pre-treated sugarcane bagasse. The fungi were cultivated using four mixtures (1:1 w/w) of different lignocellulosic substrates, has being selected for each fungus, the mixture that provided the highest cellulases activities in the enzymatic extracts obtained. These enzymes were used in the saccharification of sugarcane bagasse submitted to alkaline hydrothermal pre-treatment (NaOH 5% w/v), which had the advantage of generates a low inhibitors concentration, following three different saccharification protocols. In this step, the fungi selected were Phomopsis stipata SC 04 (glucose concentration of 3.82 and 4.72 mg/mL in the hydrolysates obtained from saccharification Protocols 1 and 2, respectively), and Botryosphaeria sp. AM 01 (glucose concentration of 4.01 mg/mL in the hydrolysate obtained from saccharification Protocol 2). Experimental ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química / Made available in DSpace on 2013-06-25T21:10:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 309605.pdf: 2444803 bytes, checksum: e4dbe219196b1e3c35b537991c4883d9 (MD5) / As enzimas celulásicas vêm sendo amplamente utilizadas em substituição aos produtos químicos nas indústrias têxteis em etapas de biopolimento, conferindo aos artigos têxteis maior maciez e melhor acabamento superficial através de um processo ambientalmente correto. Neste contexto, o foco deste trabalho foi avaliar a etapa de biopolimento sob diferentes condições reacionais. Os processos enzimáticos, e em particular a aplicação de celulase investigada neste trabalho, apresentam limitantes como a inibição proporcionada pelos produtos solúveis da reação, afetando diretamente a cinética enzimática. Além disso, a aplicação de celulase na etapa de biopolimento forma como subproduto microfibrilas insolúveis de algodão, que após secas geram um fino pó que acompanham principalmente os artigos felpudos acabados, dando um aspecto indesejável ao produto final. Neste trabalho, aplicou-se celulase comercial sobre tecido felpudo na presença dos inibidores glicose e celobiose, com o objetivo de avaliar o grau de redução da atividade enzimática, a adsorção da celulase sobre o substrato, perda de massa da amostra e geração do pó resultante da clivagem das fibras de algodão pela celulase e posterior análise de suas características físicas. Inicialmente, em escala de bancada, o processo de biopolimento foi simulado utilizando-se concentrações enzimáticas de 5,0 a 50,0 L/gsubstrato e agitação orbital branda, através de shaker em banho termostático, na presença de concentrações iniciais dos inibidores glicose e celobiose. Nesta etapa avaliou-se o efeito dos inibidores (a) em tratamento com diferentes concentrações de celulase após 1 h de hidrólise e (b) através de cinética enzimática a uma concentração de 50,0 L/gsubstrato, onde amostras foram coletadas ao longo do período de reação. Por meio destes experimentos foi possível observar uma maior ação inibitória da glicose sobre as enzimas que compõem o complexo celulásico. Já para a celobiose não se observou um grande inibidor nas condições de teste. No processo com sobrecarga enzimática (342,5 L/gsubstrato), 3 h de tratamento e agitação mecânica intensa através de equipamento laboratorial de tingimento e testes de solidez à lavagem, os resultados foram similares ao processo anterior, contudo o efeito de inibição da celobiose tornou-se mais pronunciado após 1 h de tratamento. Além disso, observou-se ao longo do processo um aumento na adsorção da celulase sobre o substrato quando aplicado glicose e celobiose, obtendo-se uma adsorção ao fim de 180 min de 3,84 e 3,54 mg/gsubstrato, respectivamente. Já na ausência de concentrações iniciais dos inibidores, a adsorção foi de 2,91 mg/gsubstrato. Foi possível, através da utilização de sobrecarga enzimática, a obtenção e quantificação do pó de algodão. Este pó, após tratamento de lavagem, secagem e pesagem, foi submetido à análise de difração de raio X para avaliação do grau de cristalinidade e imagens superficiais através de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Os resultados de cristalinidade e análise superficial dos fragmentos de algodão não apresentaram diferenças expressivas para os tratamentos na ausência e na presença de concentrações iniciais dos inibidores glicose e celobiose. Os resultados deste trabalho são importantes para balizar a aplicação do biopolimento de tecidos felpudos de algodão na indústria têxtil, evitando as condições que favoreçam a geração de pó no produto final. / The cellulase enzymes are being largely used substituting the chemicals agents in textile industry in bio-polishing process, giving to the textile fabrics softness and superficial finishing through an environmental correct process. Over this context, the focus of this work is to evaluate the bio-polishing process with different reaction conditions. The enzymatic processes, through the cellulase application, have limitations as an inhibition proportionate by the soluble products of the reaction, directly affecting the enzymatic kinetics. Moreover, the cellulase application in the bio-polishing step makes insoluble microfibrils of cotton as byproduct, generating a fine powder that, after dried, accompany the terry towels until the consumer, making an unwanted aspect to the final product. In this work, commercial cellulase was applied on terry cloth in the presence of inhibitors glucose and cellobiose, in order to evaluate the reduction of enzymatic activity degree, the cellulase adsorption on the substrate, weight losses of the sample and obtainment of cotton powder followed by analysis of their physical characteristics. Initially in bench scale, the bio-polishing process was simulated under conditions of enzyme concentration ranging from 5,0 to 50,0 L/gsubstrate and mild orbital agitation, through shaker in termostated bath, in the presence of inhibitors glucose and cellobiose. In this stage the inhibitors' effects was evaluated (a) in treatment with different celulase concentrations after 1 hour of hydrolysis and (b) through enzyme kinetics at a concentration of 50,0 L/gsubstrate, on which samples were collected througout the period of reaction. Through these experiments it was possible to observe a greater glucose inhibitory action over the enzymes that compose the celulasic complex. Yet the cellobiose was not observed as a great inhibitor in the test conditions. In the process with enzymatic overload (342,5 L/g), 3 hour treatment and intense mechanical agitation through the laboratory equipment of dyeing and wash fastness test, obtained similar results comparing to the previous process, however the cellobiose´s inhibitory effect became more pronounced after 1 hour treatment. Furthermore, it was observed through the process a raise in the cellulase adsorption over the substrate when applied glucose and cellobiose, yielding an adsorption of 3,84 and 3,54 mg/gsubstrate at the end of 180 minutes, respectively. Yet in the absence of initial inhibitors concentration, the adsorption was 2,91 mg/gsubstrate. It was possible, through the use of enzymatic overload, to obtain and quantificate the cotton powder. This powder, after washing, drying and weighing treatment, was subjected to x-ray diffraction analysis to evaluate the crystallinity index and superficial images by Scanning Electron Microscope (SEM). The results of cristallinity and superficial analysis of cotton's fragments didn't show expressive differences to the treatments in the absence and presence of initial concentrations of inhibitors glucose and cellobiose. The results of this issue are important to guide the application of bio-polishing of cotton terry fabrics in the textily industry, avoiding the conditions that foment the beget of powder in the final product.

Orientadora : Profª Drª Emanuel Maltempi de Souza, Prof. Dr. Luciano Fernandes Huergo / Co-orientadores : Dr.Helisson Faoro / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências : Bioquímica. Defesa: Curitiba, 2014 / Inclui referências / Resumo: Celulases apresentam diversas utilidades industriais, desde uso em etapas de polimento de tecidos até produção de biocombustíveis, especialmente de bioetanol de 2ª geração. Na busca por novas celulases, a prospecção em bactérias colonizadoras de plantas pode levar a identificação de enzimas particulares. Este trabalho teve como objetivo identificar, expressar e caracterizar genes de possíveis celulases e hemicelulases presentes no genoma de Azospirillum brasilense, uma bactéria colonizadora de rizosfera de gramíneas. Genes codificando glicosil-hidrolases foram identificados por comparação de sequências. Os genes identificados foram posteriormente clonados e expressos em E. coli. Dos 10 genes codificando prováveis glicosil hidrolases, 4 foram clonados em vetor de expressão. Dois dos plasmídeos obtidos, contendo genes de uma celulase e uma hemicelulase, permitiram superexpressar as proteínas recombinantes em E.coli que foram purificadas com sucesso. Porém, as 4 enzimas não demonstraram atividade de degradação celulolítica ou hemicelulolítica. Com a finalidade de se identificar se realmente há enzimas com atividade de degradação de celulose ou xilana em A. brasilense, a bactéria foi cultivada em meios específicos contendo apenas celulose ou xilana como fonte de carbono. Evidência de crescimento foi observada apenas na presença de xilana, o que leva a crer que há maquinaria ativa capaz de degradar este polímero em A. brasilense estirpe FP2. Palavras-chave: celulases, xilanases, Azospirillum brasilense. / Abstract: Cellulases have many industrials uses, from polishing fabrics to biofuel production, especially second generation bioethanol. Searching for new cellulases, bioprospection in plant-root-colonizing bacteria could lead to discover novel enzymes. This study aimed to identify and characterize possible cellulolytic and hemicellulolytic enzymes in genome of Azospirillum brasilense. Sequence comparison was used for identification of glycosyl hydrolases (cellulases and xylanases) in the A. brasilense draft genome. Four out of 10 selected genes were cloned and overexpressed in E. coli. Of these four, a probable cellulase and a hemicellulase were purified successfully. However, the four enzymes had no degradation activity. In order to determine if A. brasilense is capable of degrading cellulose or xylan, the bacterium was grown in media containing either cellulose or xylan as sole carbon source. Only xylan sustained A. brasilense growth, suggesting the presence of active machinery capable for degrading this polymer in A. brasilense strain FP2. Key-words: cellulases, xylanases, Azospirillum brasilense.

Orientador : Marcos Silveira Buckeridge / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-31T15:26:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_ClovisOliveira_M.pdf: 3125498 bytes, checksum: 0125c921c82fb08014159de5b5f15833 (MD5) Previous issue date: 2001 / Mestrado

Orientador: Alcides Lopes Leão / Coorientador: Mario de Oliveira Neto / Banca: Fábio de Lima Leite / Banca: Walter Ruggeri Waldman / Banca: Germano Andrade Siqueira / Banca: Claudio Angeli Sansigolo / Resumo: As fibras de caroá contêm elevado teor de celulose (≈ 65%), podendo ser utilizada como fonte renovável de energia para a produção de nanocelulose e etanol de segunda geração (2G). Desse modo, objetivou-se com esta pesquisa obter nanocelulose e etanol a partir da fibra de caroá, por meio de uma metodologia capaz de gerar menor impacto negativo ao ambiente. Ensaios de pré-tratamento hidrotérmico (160, 170 e 180 oC) foram realizados visando à remoção da hemicelulose da fibra de caroá. Com base nos resultados, o material pré-tratado em banho hidrotérmico a 160 oC foi deslignificado com NaOH 1%, para obtenção da polpa de celulose. O método organossolve com o uso da relação de água/etanol (50/50) a 180 oC também foi testado. A eficiência desses processos foi avaliada por meio da caracterização química (teor de celulose, hemicelulose e lignina) e da difração de raios-X (DRX). Por ter fornecido o melhor rendimento de polpa de celulose, o pré-tratamento com banho a 160 oC e deslignificado com NaOH 1% foi o método selecionado. Esse material foi submetido a análises de termogravimetria (TG) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Por meio dessas técnicas, notou-se que houve a remoção da hemicelulose e da lignina da fibra de caroá. Em uma segunda etapa, a endoglucanase comercial E-CELTM foi utilizada para hidrolisar a polpa celulósica e gerar nanoestruturas de celuloses. A nanocelulose obtida foi caracterizada por microscopia de força atômica (AFM). Os dados de AFM evidenciaram a pr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The fiber of caroa plants has a high quantity of cellulose (≈ 65%) that can be used as a renewable energy source to produce nanocellulose and second-generation ethanol (2G). The aim of this research was to obtain nanocellulose and ethanol from caroa fiber using methods with minimal detrimental effects on the environment. Hydrothermal pretreatment trials (160, 170 and 180 oC) were carried out to remove the hemicellulose from caroa fiber. Based on the results, the pre-treated material at 160 °C in liquid hot water was delignified with 1% NaOH to obtain cellulose pulp. The organosolv method using water/ethanol ratio (50/50) at 180 oC was also studied. The efficiency of these processes was assessed by chemical characterization (content of cellulose, hemicellulose, and lignin) and by X-ray diffraction (XRD). The best yield of cellulose pulp was obtained from the pre-treated material using liquid hot water at 160 °C and delignified with 1% NaOH and was selected for further analysis. This material was submitted to thermogravimetric analysis (TGA) and scanning electron microscopy (SEM). After the material was pretreated a second process, commercial endoglucanase E-CELTM, was used to hydrolyze the cellulosic pulp and to produce cellulose nanostructures. The nanocellulose obtained was characterized by atomic force microscopy (AFM). The AFM data shows the presence of nanocellulose crystal with aspect ratio of 16 ± 5. The residual of these materials was used for a new hydrolysis with the... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O esgotamento das reservas, especialmente do petróleo mais fino, aliado à crescente demanda energética e à necessidade inadiável de reduzir as emissões de carbono para a atmosfera, sinalizam para a necessidade da busca de novas fontes de energia renováveis e limpas. As preocupações com o aquecimento global têm feito crescer o interesse mundial pelos biocombustíveis. O novo conceito de biocombustíveis de segunda geração corresponde à produção de etanol combustível a partir de biomassa lignocelulósica como matéria-prima. No entanto, para tornar possível a utilização da biomassa é necessária a conversão das moléculas constituintes da parede celular em açúcares fermentáveis. A tecnologia mais promissora para a conversão dessa biomassa lignocelulósica à etanol combustível é com base na hidrólise enzimática da celulose usando celulases. Alguns microrganismos como o fungo Trichoderma SSP. secretam um eficiente complexo enzimático de celulases. Tendo as celobiohidrolases, elevada importância na hidrólise primária da celulose, o objetivo desse trabalho foi realizar a caracterização bioquímica e biofísica a celobiohidrolase II (CBHII) do complexo de celulases do fungo filamentoso Trichoderma harzianum IOC 3844. A enzima depois de purificada mostrou uma melhor atividade contra o substrato pNPC a 60°C em pH 4,8. Estudos de eletroforese capilar mostraram apenas moléculas com uma unidade de glicose para um substrato simples inicial contendo 5 glicoses. Análises de dicroísmo circular mostraram um padrão de estrutura secundária predominante em alfa hélice, e na análise da estrutura terciária, o espectro de emissão da CBHII mostrou um comprimento de onda de fluorescência máxima a 333nm em pH5,0, indicando que os triptofanos estão parcialmente expostos ao solvente. Ensaios utilizando a técnica de espalhamento de luz a baixo ângulo, permitiram a geração de um modelo tridimensional o qual mostrou-se domínios globulares unidos por um linker, e as posições relativas entre eles, demonstrando grande similaridade com enzimas CBHII já descritas na literatura, e sendo assim, de grande interesse biotecnológico para hidrólises de biomassas. / The depletion of reserves, especially of refined oil , with increased energy demands and the urgent need to reduce the carbon emissions on the atmosphere, signals the necessity to search for new sources of energy renewable and clean. Concerns about global warming have led to an increased world interest in biofuels. The new concept of second generation biofuels corresponds to fuel ethanol production from biomass lignocellulosic feedstock. However, to make possible the use of biomass is necessary the conversion of cell-wall molecules into fermentable sugars. The most promising technology for the conversion of lignocellulosic biomass to ethanol fuel is based on the enzymatic degradation of cellulose using cellulase. Some microorganisms such Trichoderma ssp. secretes an efficient enzymatic complex of cellulase. Since the cellobiohydrolases are highly importance in the primary hydrolysis of cellulose, the objective of this study was to perform the biochemical and biophysical characterization of cellobiohydrolase II (CBHII) present into the cellulase complex from the Trichoderma harzianum IOC 3844. The enzyme showed its better activity against pNPC at 60°C and pH 4,8. Capillary electrophoresis showed only glucose molecules as the final product of C5 oligosaccharide hydrolysis. Circular dichroism analysis showed a pattern of secondary structure mainly composed of alpha helix, and the tertiary structure analysis by the emission spectrum of the CBHII showed a wavelength of maximum fluorescence at 33nm at pH 5, indicating that the tryptophans are exposed to solvent. The three dimensional model generated by SAXS showed a structure with two globular domains joined by a linker, and the relative positions among them exhibited great similarity with CBHII described on the literature, and thus, presenting a great biotechnological interest for hydrolysis of biomass.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-26Bitstream added on 2014-06-13T19:43:44Z : No. of bitstreams: 1 000737414.pdf: 5776352 bytes, checksum: ced7625209f623d0db1611507a9d22cc (MD5) / A comunidade microbiana presente no solo sob ação antropogênica representa um rico ambiente a ser explorado. O potencial enzimático engloba genes como as celulases que atuam na desconstrução do arcabouço celulósico da parede celular da cana-de-açúcar disponibilizando glicose podendo ser aplicada na produção de etanol de segunda geração. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial funcional e biotecnológico da comunidade microbiana por meio da metagenômica WGS (whole genome sequencing) e caracterizar os principais grupos presentes no solo através da WGA (whole genome amplification). O domínio de maior destaque foram as Proteobacteria, apontada como atuante principal dos diversos processos ecológicos. Construímos uma árvore de distância genética dos principais gêneros de bactérias, o que possibilitou estimar a relação dos grupos procarióticos obtidos. A biblioteca metagenômica construída possui pouco mais de 17 mil clones, sendo identificados 3 clones com atividade hidrolítica em meio contendo carboximetilcelulose como única fonte de carbono. A análise da estrutura química da palhada confirmou a importância da mesma na permanência do solo, contendo alto teor de carbono, influenciando do sequestro de carbono pela microbiota do solo. A análise por meio da plataforma Illumina possibilitou identificar diversas categorias funcionais presentes nas sequencias de DNA metagenômico dos micro-organismos do solo sob cultivo de cana-de-açúcar. Foram identificados diversos genes dentre eles várias ATP binding, hidrolases, oxidoredutases e outros tabelados no material suplementar deste trabalho. Os resultados foram promissores e abrem novas perspectivas para ampliar os estudos na elucidação dos grupos funcionais identificados. / The microbial community in the soil under anthropogenic represents a rich environment to be explored. The enzymatic potential involves genes that act as cellulases in deconstructing the framework cellulosic cell wall of sugar cane delivering glucose can be applied in the production of second generation ethanol. The aim of this study was to evaluate the functional and biotechnological potential of the microbial community by metagenomic WGS (whole genome sequencing) and characterize the main groups in the soil through the WGA (whole genome amplification). The domain most prominent were the Proteobacteria, appointed as acting chief of several ecological processes. Build a tree of genetic distance of the main genera of bacteria, allowing to estimate the relationship of prokaryotic groups obtained. The metagenomic library constructed have little over 17 thousand clones, three clones were identified with hydrolytic activity in media containing carboxymethyl cellulose as the sole carbon source. The analysis of the chemical structure of stubble confirmed the importance of staying in the same soil, containing high-carbon, influencing carbon sequestration by soil microbes. The analysis by Illumina platform highlighted several functional categories present in the metagenomic DNA sequences of micro-organisms in the soil under cultivation of cane sugar. We identified several genes among them several ATP binding, hydrolases, oxidoreductases and other supplementary material tabulated in this work. The results are promising and open new perspectives for larger studies to elucidate the functional groups identified.

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-12. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:39Z : No. of bitstreams: 1 000837967_20170212.pdf: 232550 bytes, checksum: a1094395aeb571a1e335ad7f2c585852 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-02-17T11:23:26Z: 000837967_20170212.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-02-17T11:24:29Z : No. of bitstreams: 1 000837967.pdf: 3734694 bytes, checksum: 58e85e2f06e28ba5f8c69ee9e98eefee (MD5) / O clone metagenômico B5pl37 (inserto de 23 Kb) foi obtido por meio de uma prospecção por PCR para o conjunto gênico de Policetídeos Sintases tipo II (PKSII) em uma biblioteca cosmidial de amostra de solo de bosque de eucaliptos (S.E.). As PKSII são responsáveis pela produção de inúmeras moléculas bioativas, dentre os quais se destacam os antibióticos policetídicos. Parte da sequência do inserto (cobertura de 27-43%) apresentou similaridade de 77-78% com bactérias da família Streptomycetaceae (ferramenta BlastN, Genbank). Além da PKS II, a anotação gênica permitiu identificar genes relacionados à degradação de compostos lignocelulósicos importantes para a produção de combustíveis de segunda geração (2G): uma β- glicosidase, uma celulase e uma Multicopper oxidase (MCO). Considerando a importância industrial destes genes, este trabalho teve como objetivo a caracterização in silico e in vitro/vivo dos mesmos. As análises in silico auxiliaram a identificar a arquitetura do sítio ativo (modelo de estrutura proteica obtida por homologia) e famílias enzimáticas (com base em agrupamentos fenéticos com sequências de enzimas de atividade conhecida). Quanto às análises in vitro/vivo, foram realizados experimentos de expressão em vetor pET28a em Escherichia coli para as enzimas celulase (linhagens de E.coli BL21; C41 e Artics) e β-glicosidase (E.coli BL21), enquanto o gene MCO foi submetido à síntese in vitro para um estudo posterior. Foi feita a caracterização cinética da β-glicosidase (melhor rendimento na expressão e purificação), que obteve os parâmetros catalíticos: Vmax de 0,79 μM/min; km de 0,46 mM.. Os respectivos valores de temperatura e pH ótimos para a enzima foram 37°C e pH7-7,5; e a enzima foi capaz de manter uma atividade acima de 80% para uma faixa de pH 6,5-8,0 e temperatura 35- 40°C. Com relação à PKSII, foram iniciados os processos preparatórios para a... / The Clone metagenomic B5pl37 (insert of 23kb length) was obtained by a PCR prospect for gene set Polyketide Synthases type II (PKSII) in a library cosmidial eucalyptus grove soil sample (SE). The PKSII are responsible for producing many bioactive molecules, among which the antibiotics were noticeable. Part of the sequence of the insert (27-43% coverage) showed similarity of 77-78% with bacteria Streptomycetaceae family (BLASTN tool, Genbank). In PKS II gene annotation was possible to identify genes related to the degradation of lignocellulosic important compounds for the production of second generation biofuel (2G): A β-glucosidase, a cellulose and a Multicopper oxidase (MCO). Considering the industrial importance of these genes, this study aimed to characterize in silico and in vitro /in vivo thereof. The in silico analyzes helped identify the architecture of the active site (protein structure obtained by homology) and enzyme families (based on phenetic groups with sequences of known enzyme activity). The in vitro / vivo experiments were performed in pET28a expression vector in Escherichia coli for cellulase (E. coli strains BL21; Artics and C41) and β-glucosidase (E. coli BL21), while the gene MCO in vitro synthesis for a subsequent study it was submitted. We had done the kinetic characterization of β- glucosidase (best performance in the expression and purification), which obtained the catalytic parameters: Vmax 0.79 uM / min; km from 0.46 mM. The respective temperature and the pH optimum for the enzyme was 37 ° C and pH7-7,5; and the enzyme was able to maintain an activity above 80% at a pH of 6.5-8.0 and temperature range 35-40 ° C. With respect to PKSII, the preparatory processes have been started to insert the expression in the same host specialized for expression of Streptomyces coelicolor antibiotic M1152 (courtesy of Juan P. Gomez-Escribano, John Innes Centre, Norwich, UK). Cosmidial exchange vector was carried out ...

Submitted by NAIANI TARTARINE (naiani_tartarine@hotmail.com) on 2018-08-08T16:35:25Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Naiani Tartarine. Versão Final. 08-08-2018.pdf: 1927524 bytes, checksum: 255d76b50d4bdc679889756ec1ed3f76 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-08-09T17:51:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 tartarine_n_me_araiq_int.pdf: 1924939 bytes, checksum: 1ba7b3053894e906ae5c9f93a64cd9ba (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-09T17:51:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tartarine_n_me_araiq_int.pdf: 1924939 bytes, checksum: 1ba7b3053894e906ae5c9f93a64cd9ba (MD5) Previous issue date: 2018-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Celulases microbianas têm sido empregadas na sacarificação de materiais lignocelulósicos para a obtenção de glicose, visando a produção de etanol celulósico. Entretanto, o custo dessas enzimas encarece o processo, e por isso a produção das mesmas a partir de fungos filamentosos cultivados em materiais lignocelulósicos, substratos de baixo custo, amplamente disponíveis e indutores da síntese enzimática, torna-se uma boa opção. Neste trabalho, com o objetivo de melhorar a produção de celulases através de metodologias de planejamento de experimentos, foram utilizados dois fungos endofíticos, cultivados por fermentação submersa (FSbm), usando como substratos o farelo de soja e a palha de cana de açúcar pré-tratada hidrotermicamente, cedida pela empresa GranBio, em cultivos isolados e co-cultivos, agitados. As atividades máximas obtidas nos extratos enzimáticos produzidos por planejamento experimental foram de 3,77 U/mL e 3,66 U/mL de endoglucanase, e 18,8 U/mL e 17,5 U/mL de β-glicosidase, no co-cultivo dos fungos Botryosphaeria sp. AM01 e Saccharicola sp. EJC04, e no cultivo isolado de Botryosphaeria sp. AM01, respectivamente. As condições ótimas de atividade das enzimas endoglucanase e β-glicosidase do melhor extrato foram pH 5,5 e 60 ºC. Estas enzimas foram estáveis quando incubadas por 24 horas em pH 5,0 e 5,5, e menos de 20% da atividade de ambas foi perdida entre 35 e 55 ºC. Os ensaios de inibição por glicose mostraram que a β-glicosidase tem sua atividade reduzida proporcionalmente ao fornecimento deste açúcar, porém, mesmo com a máxima quantidade de glicose fornecida (12 mmol/L), a atividade relativa mostrou-se mediana (64 %). Em relação à influência do etanol, a presença de 5 e 10% deste álcool aumentou em 4 e 5 %, respectivamente, a atividade enzimática de β-glicosidase, ocorrendo inibição em concentrações superiores. Em relação à sacarificação das palhas de cana, as maiores concentrações de glicose foram obtidas quando utilizaram-se a palha submetida a pré-tratamento hidrotérmico ácido seguido de alcalino (3,29 mg/mL) e a palha pré-tratada hidrotermicamente cedida pela empresa GranBio (2,66 mg/mL). / Microbial cellulases have been used in the saccharification of lignocellulosic materials to obtain glucose, aiming to produce cellulosic ethanol. However, the cost of these enzymes makes the process expensive, so their production from filamentous fungi grown in lignocellulosic materials, low-cost and widely available substrates and inducers of enzymatic synthesis, is a good option. In order to improve cellulase production through experiment planning methodologies, two endophytic fungi, were cultivated by submerged fermentation (FSbm). Soybean meal and hydrothermally pretreated sugarcane straw, provided by GranBio, were used as substrate, in agitated isolated cultures and co-cultivations. The maximal activities obtained in the enzymatic extracts produced by the experimental design were 3.77 U/mL and 3.66 U/mL endoglucanase and 18.8 U/mL and 17.5 U/mL β-glycosidase in the co-cultivation of the fungi Botryosphaeria sp. AM01 and Saccharicola sp. EJC04, and in the isolated cultivation of Botryosphaeria sp. AM01, respectively.. The optimal activity conditions of the endoglucanase and β-glucosidase enzymes from the best selected extract were pH 5.5 and 60 ° C. These enzymes were stable when incubated for 24 hours at pH 5.0 and 5.5, and less than 20% of the activity of both of them was lost at 35-55 °C. The glucose-inhibition assays showed that β-glucosidase activity was reduced proportionally to the supply of this sugar, but even with the maximum amount of glucose supply (12 mmol/L), the relative activity was shown to be median (64 %). Regarding the influence of ethanol, the presence of 5 and 10% of this alcohol increased in 4 and 5%, respectively, the enzymatic activity of β-glucosidase, occurring inhibition in higher concentrations. Regarding the saccharification of sugarcane straw, the highest glucose concentrations were obtained with the straws that were submitted to the acid hydrothermal treatment followed by the alkaline treatment (3.29 mg/mL) and the hydrothermally pretreated straw provided by the company GranBio (2.66 mg/mL).