Orientador: Daniel Carneiro Carrettiero. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2012.

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Resumo: A leishmaniose é uma doença crônica, causada por parasitos flagelados do gênero Leishmania, podendo se apresentar nas formas clínicas, tegumentar (cutânea), mucocutânea e visceral (calazar). A doença é considerada negligenciada pela OMS, pois não existem até o momento métodos eficientes de tratamento e controle para a mesma. Os telômeros desse parasito são um dos potenciais alvos no desenvolvimento de novos fármacos para o combate dessa doença e, para tanto, é necessário o entendimento da biologia desta estrutura. Uma enzima de grande interesse para o estudo dos telômeros é a telomerase que é a responsável pela manutenção e elongação dessas estruturas nos terminais dos cromossomos. A manutenção dos telômeros não é unicamente regulada pelo complexo ribonucleoproteico (RNP) da telomerase, mas também por proteínas que se associam ao complexo e ao DNA telomérico, tornando a ação do complexo mais efetiva e estável. Até o momento, o complexo telomérico de Leishmania amazonensis é o melhor caracterizado dentre os tripanosomatídeos, porém pouco se sabe sobre a biogênese e a composição do complexo RNP telomerase deste parasito. HSP83, ortólogo da HSP90 humana em Leishmania é uma chaperona altamente conservada, dependente de ATP e expressa quando as células são submetidas a diferentes tipos de estresse estando envolvida em transdução de sinal, crescimento, diferenciação celular e sobrevivência. Também é de grande importância para patógenos humanos, em particular aqueles cujo ciclo de v... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Leishmaniasis is a chronic disease, caused by flagellated parasites of the genus Leishmania, which could be present in different clinical forms such as, tegumentar (cutaneous), mucocutaneous and visceral (kalazar). WHO classifies leishmaniasis as a neglected disease since there are no efficient methods for disease treatment and control. Parasites telomeres are one of the potential targets for the development of new anti-parasitic drugs to combat this disease and, thus, it is necessary to understand the biology of this structure. Telomerase is the enzyme responsible for maintaining and replicating these structures at the chromosomes termini. However, telomeres maintenance is not only regulated by the telomerase ribonucleoprotein complex (RNP), but also by proteins that associate with the complex and with telomeric DNA, making the action of the complex more effective and stable. To date, the telomeric complex of Leishmania amazonensis is the best characterized among trypanosomatids, although little is known about the biogenesis and composition of the RNP telomerase complex of this parasite. HSP90 is a highly conserved, ATP dependent chaperone and expressed when cells are subjected to different types of stress. It is also involved in signal transduction, growth, cell differentiation and survival of the chaperonin is of great importance for human pathogens, particularly those transmitted by insects to a mammalian host, and which suffer from environmental changes such as temperatu... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A proteína prion celular (PrPC) consiste em uma glicoproteína de membrana que atua como receptora para diversas moléculas, desencadeando sinais intracelulares. Ao interagir com a co-chaperona STIP1, PrPC promove a autorrenovação e proliferação de células-tronco/progenitoras neurais (NSPCs) durante a fase embrionária. De fato, PrPC tem se destacado por sua participação na neurogênese embrionária e adulta, porém o papel de sua interação com a proteína STIP1 na neurogênese adulta permanece obscuro. Deste modo, o presente trabalho adotou abordagens in vitro para avaliação do complexo PrPC-STIP1 em processos celulares que culminam na neurogênese adulta. Para isso, culturas primárias de NSPCs de camundongos deficientes (Prnp-/-) e tipo-selvagens (Prnp+/+) para PrPC foram realizadas, e a cultura foi devidamente padronizada e caracterizada. Através de ensaios de autorrenovação, proliferação e migração celular sugere-se que PrPC promove estes eventos celulares independentemente de STIP1, e que possivelmente a proteína laminina seja um alvo crítico para migração via PrPC. / Cellular prion protein (PrPC) consists in a membrane glycoprotein that acts as a receptor to several molecules, triggering intracellular signals. By interacting with co-chaperone STIP1, PrPC promotes self-renewal and proliferation of neural stem/progenitor cells (NSPCs) during embryonic stage. Indeed, PrPC has excelled for its participation in embryonic and adult neurogenesis, but the role of its interaction with STIP1 protein in adult neurogenesis remains unclear. Thus, herein it was adopted in vitro approaches in order to evaluate the PrPC-STIP1 complex on cellular processes that culminate in adult neurogenesis. In order to assess that, NSPC primary cultures of PrPC deficient (Prnp-/-) and wild-type (Prnp+/+) mice were performed, and the culture was properly standardized and characterized. Through self-renewal, proliferation and cell migration assays, it was suggested that PrPC promotes these cellular events regardless of STIP1, and possibly the laminin protein is a critical target for migration via PrPC.

As chaperonas moleculares da família Hsp70 desempenham funções cruciais nas células de todos os organismos vivos, de procariotos a eucariotos. Nestes, estão presentes em todos os compartimentos celulares e nas mitocôndrias é expressa uma isoforma própria (mtHsp70), que participa dos processos enovelamento e maturação de proteínas bem como de sua importação para a matriz mitocondrial. Diante da crescente demanda de pesquisa sobre doenças tropicais negligenciadas, foi tomado como objeto de estudo neste trabalho uma Hsp70 mitocondrial de Leishmania braziliensis (LbmtHsp70) com o intuito de caracterizá-la estrutural e funcionalmente em comparação à ortóloga humana com maior identidade: a mtHsp70 também chamada de mortalina, GRP75, HspA9 ou PBP74. A LbmtHsp70 foi purificada em sua forma enovelada, em sistema monodisperso apresentando dados hidrodinâmicos condizentes com a forma monomérica, foi testada sua estabilidade quanto à influência de nucleotídeos de adenosina (ATP e ADP) à sua estrutura e, por fim, foram feitos ensaios para avaliar sua atividade ATPásica e de energia de interação com nucleotídeos. De forma geral, a LbmtHsp70 é bastante similar à mortalina, como pode ser evidenciado pelos resultados obtidos com algumas particularidades. / The molecular chaperones from the Hsp70 family perform critical cell roles in all organisms, from prokaryotes to eukaryotes. In the last ones, they are found in all cell compartments and a particular isoform is expressed in the mitochondria, where it carries out folding and maturation processes as well as the import of proteins to the mitochondrial matrix. In face of the growing demand for research about neglected tropical diseases, in this study a Hsp70 from Leishmania braziliensis\'s mitochondria was taken as object of study for further structural and functional characterization in comparison to the human orthologous which presents the highest identity to LbmtHsp70: the mtHsp70 also known as mortalin, GRP75, HspA9 or PB74. LbmtHsp70 was obtained in folded state in monodisperse system with hydrodynamic data consistent to monomeric conformer, stability and adenosine nucleotides influence to its structure were analyzed, and were performed assays for ATPase activity and nucleotide interaction energy. In a general way LbmtHsp70 is very similar to mortalin as can be shown through the results, but with some peculiarities.

Orientador: Daniel Carneiro Carrettiero. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013

Submitted by JÚLIO HEBER SILVA (julioheber@yahoo.com.br) on 2018-04-19T17:09:39Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Camila Oliveira Barbosa de Morais - 2018.pdf: 2456994 bytes, checksum: d3e60d3fd27acd984ae3a91b457086b5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-04-23T11:47:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Camila Oliveira Barbosa de Morais - 2018.pdf: 2456994 bytes, checksum: d3e60d3fd27acd984ae3a91b457086b5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-23T11:47:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Camila Oliveira Barbosa de Morais - 2018.pdf: 2456994 bytes, checksum: d3e60d3fd27acd984ae3a91b457086b5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-04-13 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Paracoccidioidomycosis (PCM) is an important mycosis of Latin America, caused by thermodymorphic fungi of the genus Paracoccidioides. Homeostasis of metals such as copper, zinc and iron is important for the survival of fungi in the host environment. In this context, copper is an important cofactor for several enzymes, such as as superoxide dismutases and cytochrome c oxidase. The excess free copper in the cell promotes accumulation of reactive oxygen species, causing damage to nucleic acids, lipids and proteins. Thus, organisms shall to maintain cytoplasmic levels of that micronutrient at non-toxic levels, just sufficient for cell growth and vital metabolic processes. The metabolism of that metal is strictly controlled by high and low affinity uptake systems. The objective of this work is to perform heterologous expression of the Atx1 protein, described in the literature as a copper chaperone, and to analyze its cellular location, as well as the protein behavior upon copper deprivation in Paracoccidioides spp. Heterologous expression was performed on electrocompetent cells of Escherichia coli strain BL21. Identity of the recombinant protein was confirmed by LC-MS / MS. BALB/c mice were immunized to obtain anti-Atx1 polyclonal antibodies. After performing immunoblotting the produced antibodies were used in immunofluorescence assays. Analysis by qRT-PCR allowed us to evaluate the levels of the transcript encoding the Atx1 protein during copper deprivation in Paracoccidioides spp. / A paracoccidioidomicose (PCM) é uma importante micose da América Latina, causada por fungos termodimórficos do gênero Paracoccidioides. A homeostase de metais como cobre, zinco e ferro é importante para a sobrevivência dos fungos no ambiente do hospedeiro. Nesse contexto, o cobre é um importante cofator para várias enzimas, como as superóxido dismutases e a citocromo c oxidase. O excesso de cobre livre na célula promove o acúmulo de espécies reativas de oxigênio, causando danos a ácidos nucléicos, lipídeos e proteínas. Assim, os organismos devem manter concentrações citoplasmáticas desses micronutrientes em níveis não tóxicos, apenas suficiente para o crescimento celular e processos metabólicos vitais. O metabolismo desse metal é rigorosamente controlado por sistemas de captação de alta e baixa afinidade. O objetivo do trabalho é realizar a expressão heteróloga da proteína Atx1, descrita na literatura como uma chaperona citosólica de cobre e analisar a sua localização celular, bem como o comportamento diante da privação de cobre em Paracoccidioides spp. A expressão heteróloga foi realizada em células eletrocompetentes de Escherichia coli, cepa BL21. A identidade da proteína recombinante foi confirmada por LC-MS/MS. Camundongos BALB/c foram imunizados para obtenção de anticorpos policlonais anti-Atx1. Após realização de imunoblotting, os anticorpos produzidos foram utilizados para ensaios de imunofluorescência em células leveduriformes. Análise por qRT-PCR nos permitiram avaliar os níveis do transcrito codificante da proteína Atx1 durante a privação de cobre em Paracoccidioides spp.

Aquesta tesi es centra en la caracterització funcional d'una proteïna de xoc de calor de baix pes molecular (Small Heat Shock Protein - sHSP) de classe I de surera pel que fa a la seva capacitat per protegir les cèl·lules de l'estrès i per estabilitzar les membranes. Les sHsps són proteïnes que s'expressen en condicions d'estrès cel·lular. Encara que certs aspectes funcionals de les sHsps són ben coneguts, el nostre treball aporta informacions noves sobre el paper de les diferents regions de la proteïna, especialment de la regió N-terminal.L'objectiu concret d'aquest treball és determinar la funció termoprotectora de QsHsp17.4-CI, una sHsp de classe I oobtinguda a partir de les cèl·lules de fel·lema d'alzina surera, en un model bacterià i analitzar la importància de les diferents regions de la proteïna en aquesta funció. Amb aquesta finalitat s'han dissenyat dues proteïnes parcials derivades de QsHsp17.4-CI: una a la que li falta la regió N-terminal (C105) i una altra amb pràcticament tot el domini -cristal·lí deleccionat (N61), i una tercera, derivada de QsHs10-CI, a la que li falta la meitat del domini -cristal·lí (Hsp10). També s'estudia la possible capacitat estabilitzadora de membranes i la capacitat de modificar l'expressió d'altres Hsps quan s'expressa de forma heteròloga.Els nostres resultats demostren que l'expressió de QsHsp17.4-CI protegeix a les cèl·lules d'E.coli de l'estrès tèrmic alhora que la regió N-terminal i la regió consens II del domini -cristal·lí són imprescindibles per aquesta funció de protecció. En relació a un possible paper en les membranes, els estudis de localització subcel·lular mostren que QsHsp17.4-CI colocalitza amb la fracció membranes i que la regió N-terminal de la proteïna és responsable d'aquesta colocalització. No s'ha pogut demostrar, però, que la localització amb la membrana estigui associada a un efecte protector d'aquesta: en cap cas la sobrexpressió de les proteïnes modifica la composició d'àcids grassos i només N61, que no té acció termoprotectora, altera l'estat fisico-químic de la membrana. En estudis d'expressió de novo en E.coli s'ha observat que, a diferència de les altres proteïnes heteròlogues, N61 activa l'expressió de la majoria de Hsps d'E.coli fent pensar en una possible relació entre l'estat físic de la membrana i l'activació de la resposta a l'estrès.En resum, en aquest treball hem provat la capacitat protectora de QsHsp17.4 i aportem noves dades sobre la importància de la regió N-terminal i la regió consens II del domini -cristal·lí en aquesta funció. Per altra banda, es suggereix que QsHsp17.4 podria interaccionar amb la membrana d'E.coli i que la regió N-terminal seria imprescindible per aquesta interacció. Finalment hem determinat que les proteïnes que provoquen variacions en l'estat de fluïdesa de la membrana poden activar la resposta al xoc de calor per part de la cèl·lula bacteriana. / This thesis is focused in the functional studies of a Small Heat Shock Protein (sHsp). sHsps are expressed under stress conditions. Although some functional aspects of these proteins are known, our work aport new data about the role of the different protein regions, especially the N-terminal region. The aim of this work is to demonstrate a thermotolerance effect of QsHsp17.4-CI in bacterial cells and to analyze the importance of the protein regions in this function. To achieve this objective two deletion mutants derived from QsHsp17.4-CI were designed: a protein lacking the N-terminal region (C105) and a protein where the entire -cristallin domain is missing (N61) and a third mutant, derived from QsHsp10-CI, that bears half of the -cristallin domain (Hsp10). To better understand the functional mechanism of sHsps we study the membrane stabilizing capacity of QsHsp17.4-CI as well as its capacity to modify other Hsps expression.Our results demonstrate that the expression of QsHsp17.4-CI protects E.coli cells from a heat shock and that the N-terminal region and the consensus region II of the -cristallin domain are necessary for this protective function. Related to a possible role in membranes, location studies suggest that QsHsp17.4-CI colocalizes with cell membrane fraction and that N-terminal region is important for this location. However, no relation between membrane localization and a protective effect has been demonstrated: Protein overexpression does not modify membrane fatty acid composition and only N61, which has no thermoprotection, changes membrane physical state. Studies of E.coli de novo synthesis show that, unlike the other recombinant proteins, the overexpression of N61 activates the expression of almost all E.coli Hsps suggesting a possible relation between membrane physical state and the activation of the heat shock response.As summary, in this work we have demonstrated the thermoprotective capacity of QsHsp17.4-CI and we contribute with new data about the importance of N-terminal region and consensus region II of -cristallin domain for this function. On the other hand, we suggest the possibility that QsHsp17.4-CI interacts with membrane and that N-terminal region is important for this interaction. Lastly, we have observed how changes in membranes fluidity state can activate heat shock response in bacterial cells.

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T13:20:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Murakami_LeticiaMariaZanphorlin_D.pdf: 5383539 bytes, checksum: 1a45d203e6e3c5a992791b8ce893aa36 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Chaperonas moleculares e proteínas de choque térmico (Heat shock protein, Hsp) atuam contra a agregação e o enovelamento incorreto de proteínas, que são os agentes causais de doenças neurodegenerativas, como por exemplo, Alzheimer e Parkinson. A Hsp90 é uma das mais importantes chaperonas moleculares, considerada essencial para a viabilidade celular em eucariotos, pois está associada com a maturação de proteínas atuantes na sinalização e ciclo celular. Além disso, foi demonstrado que a Hsp90 está envolvida na estabilização do fenótipo tumoral de diversos tipos de câncer, destacando a sua importância biomédica. A interação com co-chaperonas, proteínas auxiliares das chaperonas, permite que a Hsp90 atue como uma proteína "hub", ou seja, um ponto central de regulação de diversas proteínas. Muitas dessas co-chaperonas possuem um ou mais domínios do tipo TPR (do inglês, tetratricopeptide repeat) que interagem com o C-terminal da Hsp90. No presente projeto de doutorado, investigamos as características estruturais e termodinâmicas da interação entre o domínio C-terminal da Hsp90 (C-Hsp90) e a co-chaperona TPR Tom70 humana, utilizando técnicas de reação-cruzada acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS), calorimetria de titulação isotérmica (ITC), espalhamento de raios-X à baixos ângulos (SAXS) e modelagem molecular. Os resultados de LC-MS/MS e ITC evidenciaram novas regiões na interação do complexo C-Hsp90/Tom70 que envolve a hélice A7 presente na Tom70 e experimentos de SAXS revelaram a estrutura em baixa resolução das proteínas C-Hsp90, Tom70 e do complexo C-Hsp90/Tom70. Além disso, investigamos o efeito do celastrol, um composto com potencial atividade anti-câncer, na conformação e na função da Hsp90. Na presença do composto, a Hsp90 sofre um processo de oligomerização e a natureza dos oligômeros foi determinada por ferramentas bioquímicas e biofísicas, tais como espalhamento dinâmico de luz (DLS), cromatografia de exclusão molecular analítica acoplada a espalhamento de luz em multiângulos (SEC-MALS) e eletroforese em gel nativo. Interessantemente, a oligomerização induzida pelo celastrol não afetou a atividade de proteção da Hsp90 contra a agregação protéica e a capacidade de ligação as co-chaperonas com enovelamento tipo TPR. Este é o primeiro trabalho a apontar um possível mecanismo para a ação do celastrol sobre a Hsp90. Coletivamente, nossos resultados e descobertas contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares relacionados à interação entre chaperonas e co-chaperonas, bem como, chaperonas e potenciais ligantes. / Abstract: Molecular chaperones and heat shock proteins (Hsp) act against protein aggregation and misfolding, which are the causal agents of neurodegenerative diseases such as Alzheimer and Parkinson. Hsp90 is one of the most important molecular chaperones, considered essential for cell viability in eukaryotes, since it is associated with the maturation of proteins involved in cell cycle and signaling. In addition, it was demonstrated that Hsp90 is implicated in the stabilization of the tumor phenotype of various types of cancer, highlighting its biomedical importance. The interaction with co-chaperones, auxiliary proteins of chaperones, allows that Hsp90 acts as a hub, being a central point for regulation of several other proteins. Many of these co-chaperones have one or more TPR domains that interact with the C-terminus of Hsp90. In this PhD project, we investigated structural and thermodynamic characteristics of the interaction between the C-terminus domain of Hsp90 (C-Hsp90) and the TPR co-chaperone human Tom70, using techniques of cross-linking coupled with mass spectrometry (LC-MS/MS), isothermal titration calorimetry (ITC), small angle X-ray scattering (SAXS) and molecular modeling. The results of LC-MS/MS and ITC revealed new regions involved in the interaction of the C-Hsp90 with Tom70, which encompasses the A7 helix from Tom70, and SAXS experiments unveiled the low resolution structure of the proteins C-Hsp90, Tom70 and the C-Hsp90/Tom70 complex. In addition, we investigated the effect of celastrol, a compound with a potential anti-cancer activity, on the conformation and function of Hsp90. In the presence of celastrol, Hsp90 undergoes oligomerization and the nature of the oligomers was determined by biochemical and biophysical tools such as dynamic light scattering (DLS), size-exclusion chromatography coupled to multi-angle light scattering (SEC-MALS) and native gel electrophoresis. Interestingly, the celastrol-induced oligomerization did not affect the protective activities of Hsp90 against protein aggregation or the capacity to bind TPR co-chaperones. This is the first study to point out a possible mechanism for the action of celastrol on Hsp90. Collectively, our findings contribute to a better understanding of the molecular mechanisms associated to the interaction between chaperones and co-chaperones, as well as chaperones and potential ligands / Doutorado / Quimica Organica / Doutora em Ciências

[ES] La biotecnología moderna se basa en la aplicación de una mezcla de herramientas experimentales y computacionales para llevar a cabo de forma dirigida la ingeniería genética. El objetivo es obtener células (re)programadas que implementen nuevas funciones o que sirvan como herramientas para el estudio de sistemas biológicos. En este contexto, el uso de bacterias en biotecnología está muy extendido. Sin embargo, la implementación de circuitos genéticos para el aprovechamiento de estos seres vivos puede verse limitada por procesos biológicos naturales; es decir, los circuitos diseñados (o naturales) pueden verse afectados por el transcurso del tiempo o por cambios en el entorno en el que crecen las bacterias. En esta tesis, nos propusimos seguir un enfoque integrador para estudiar cómo las bacterias responden en el tiempo y el espacio a los cambios genéticos y ambientales, que pueden afectar la funcionalidad de los circuitos de interés biotecnológico. Usamos Escherichia coli como organismo modelo, explotando una variedad de herramientas experimentales para trabajar con él. En primer lugar, estudiamos cómo los cambios ambientales y genéticos afectan la funcionalidad de un circuito genético sintético que implementa un comportamiento lógico sofisticado. Descubrimos que hay amplios rangos de concentración de entrada que el sistema puede procesar correctamente, que el circuito diseñado es bastante sensible a los efectos de la temperatura, que la expresión de pequeños ARN heterólogos es costosa para la célula y que una reorganización genética adecuada del sistema para reducir la cantidad de ADN heterólogo en la célula puede mejorar su estabilidad evolutiva. En segundo lugar, estudiamos el crecimiento bacteriano en entornos en los que existen materiales nanoestructurados. Descubrimos que las poblaciones bacterianas se pueden controlar en gran medida mediante el uso de marcos organometálicos, ya que estos materiales nanoestructurados pueden descomponerse lentamente en medios biológicos liberando agentes antimicrobianos (metales y compuestos orgánicos, incluidos los antibióticos). Analizamos la respuesta bacteriana espaciotemporal siguiendo un enfoque experimental y teórico combinado en un entorno tan complejo y desafiante en medios líquidos y sólidos. Además de las variaciones en el rendimiento debido a cambios ambientales, también se debe considerar que esos circuitos genéticos evolucionarán con el tiempo debido a la acumulación estocástica de mutaciones. Estas mutaciones pueden dar lugar a cambios en la funcionalidad de los circuitos reguladores. Por tanto, en tercer lugar, realizamos un experimento de evolución a largo plazo para estudiar la contribución de un sistema de chaperonas de proteínas en la modulación de la estabilidad evolutiva. En los últimos años, se ha demostrado que los sistemas de chaperonas, como GroES/EL, pueden amortiguar o purgar mutaciones. Realizamos la secuenciación del genoma completo en diferentes líneas con diferentes niveles de expresión de GroEL y también medimos la tasa de crecimiento de las células al principio y al final del experimento evolutivo. Sin embargo, nuestros resultados no fueron concluyentes, por lo que se necesita más investigación para comprender completamente el papel de GroES/EL en la evolución y evaluar su utilidad potencial en biotecnología. En conjunto, esta tesis intenta avanzar en nuestro conocimiento sobre cómo las bacterias, y E. coli en particular, se comportan como se espera cuando el entorno se altera, la fisiología cambia y pasa mucho tiempo, para posibles aplicaciones industriales o (pre)clínicas. / [CA] La biotecnologia moderna es basa en l'aplicació d'una mescla d'eines experimentals i computacionals per a realitzar de forma dirigida l'enginyeria genètica. L'objectiu és obtindre cèl·lules (re)programades que implementen noves funcions o que servisquen com a eines per a l'estudi de sistemes biològics. En aquest context, l'ús de bacteris en biotecnologia està molt estés. No obstant això, la implementació de circuits genètics per a l'aprofitament d'aquests éssers vius pot veure's limitada per processos biològics naturals; és a dir, els circuits dissenyats (o naturals) poden veure's afectats pel transcurs del temps o per canvis en l'entorn en el qual creixen els bacteris. En aquesta tesi, ens vam proposar seguir un enfocament integrador per a estudiar com els bacteris responen en el temps i l'espai als canvis genètics i ambientals, que poden afectar la funcionalitat dels circuits d'interés biotecnològic. Usem Escherichia coli com a organisme model, explotant una varietat d'eines experimentals per a treballar amb ell. En primer lloc, estudiem com els canvis ambientals i genètics afecten la funcionalitat d'un circuit genètic sintètic que implementa un comportament lògic sofisticat. Descobrim que hi ha amplis rangs de concentració d'entrada que el sistema pot processar correctament, que el circuit dissenyat és bastant sensible a l'efecte de la temperatura, que l'expressió de xicotets ARN heteròlegs és costosa per a la cèl·lula i que una reorganització genètica adequada del sistema per a reduir la quantitat d'ADN heteròleg en la cèl·lula pot millorar la seua estabilitat evolutiva. En segon lloc, estudiem el creixement bacterià en entorns en els quals existeixen materials nanoestructurats. Descobrim que les poblacions bacterianes es poden controlar en gran manera mitjançant l'ús de marcs organometàlics, ja que aquests materials nanoestructurats poden descompondre's lentament en medis biològics alliberant agents antimicrobians (metalls i compostos orgànics, inclosos els antibiòtics). Analitzem la resposta bacteriana espai-temporal seguint un enfocament experimental i teòric integrador en un entorn tan complex i desafiador en mitjans líquids i sòlids. A més de les variacions en el rendiment degut a canvis ambientals, també s'ha de considerar que aqueixos circuits genètics evolucionaran amb el temps degut a l'acumulació estocàstica de mutacions. Aquestes mutacions poden donar lloc a canvis en la funcionalitat dels circuits reguladors. Per tant, en tercer lloc, realitzem un experiment d'evolució a llarg termini per a estudiar la contribució d'un sistema de chaperones de proteïnes en la modulació de l'estabilitat evolutiva. En els últims anys, s'ha demostrat que els sistemes de chaperones, com GroES/EL, poden esmorteir o purgar mutacions. Realitzem la seqüenciació del genoma complet en diferents línies amb diferents nivells d'expressió de GroEL i també mesurem la taxa de creixement de les cèl·lules al principi i al final de l'experiment evolutiu. No obstant això, els nostres resultats no van ser concloents, per la qual cosa es necessita més investigació per a comprendre completament el paper de GroES/L en l'evolució i avaluar la seua utilitat potencial en biotecnologia. En conjunt, aquesta tesi intenta avançar en el nostre coneixement sobre com els bacteris, i E. coli en particular, es comporten com s'espera quan l'entorn s'altera, la fisiologia canvia i passa molt temps, per a possibles aplicacions industrials o (pre)clíniques. / [EN] Modern biotechnology is based on applying a mix of experimental and computational tools to perform in a directed way genetic engineering. The aim is to obtain (re)programmed cells that implement new functions or that serve as tools for the study of biological systems. In this context, the use of bacteria in biotechnology is widespread. However, the implementation of genetic circuits for the use of these living beings may be limited due to natural biological processes; that is, the engineered (or natural) circuits may be affected by the course of time or by changes in the environment in which bacteria grow. In this thesis, we proposed to follow an integrative approach to study how bacteria respond in time and space to genetic and environmental changes, which may affect the functionality of the circuits of biotechnological interest. We used Escherichia coli as a model organism, exploiting a variety of experimental tools to work with it. Firstly, we studied how environmental and genetic changes affect the functionality of a synthetic genetic circuit that implements a sophisticated logic behavior. We found that there are wide input concentration ranges that the system can correctly process, that the engineered circuitry is quite sensitive to temperature effects, that the expression of heterologous small RNAs is costly for the cell, and that a proper genetic reorganization of the system to reduce the amount of heterologous DNA in the cell can improve its evolutionary stability. Secondly, we studied of bacterial growth in environments in which there are nanostructured materials. We found that bacterial populations can be greatly controlled through the use of metal-organic frameworks, as these nanostructured materials can slowly decompose in biological media releasing antimicrobials (metals and organic compounds, including antibiotics). We analyzed the spatiotemporal bacterial response following a combined experimental and theoretical approach in a such a complex and challenging environment in both liquid and solid media. In addition to variations in performance due to environmental changes, it must also be considered that those gene circuits will evolve over time due to the stochastic accumulation of mutations. These mutations can lead to changes in the functionality of the regulatory circuits. Then thirdly, we performed an experiment of long-term evolution to study the contribution of a protein chaperone system in modulating evolutionary stability. In recent years, it has been shown that chaperone systems, such as GroES/EL, can buffer or purge mutations. We performed whole-genome sequencing over different lines with varying expression levels of GroEL, and also measured the growth rate of the cells at the beginning and the end of the evolutionary experiment. However, our results were not conclusive, so further research is needed to fully understand the role of GroES/EL in evolution and to assess its potential utility in biotechnology. Taken together, this thesis tries to advance our knowledge on how bacteria, and E. coli in particular, behave as expected when the environment is perturbed, the physiology changes, and long time passes, for potential industrial or (pre)clinical applications. / Montagud Martínez, R. (2023). Study of Spatiotemporal Responses of Bacterial Cells [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193030