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Expressão, purificação e estudos estruturais da chaperona molecular Hsp65 de Mycobacterium leprae & caracterização da proteína NUDEL - nuclear distribuition element-likeCamargo, Flávia Barboza [UNESP] 18 April 2008 (has links) (PDF)
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camargo_fb_me_sjrp.pdf: 735046 bytes, checksum: 0006322f87ae9a50e39b65b0a2d314c9 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A tuberculose é uma doença infecciosa que representa um dos principais problemas sociais, econômicos e de saúde pública do mundo. Muitos antígenos potentes demonstraram proteção contra tuberculose nos modelos experimentais e o mais recentemente estudado é a heat shock protein Hsp65 kDa de Mycobacterium leprae. Situações como altas temperaturas, presença de radicais livres e deficiências nutricionais levam ao aumento da produção das Heat Shock Proteins (Hsp´s). A principal função das Hsp´s é manter a estrutura e função das proteínas e, conseqüentemente, preservar as funções celulares essenciais, agindo como chaperonas moleculares. A Hsp65 de Mycobacterium leprae é altamente imunogênica, acarretando em infecções micobacterianas, reações humorais e celulares por parte do hospedeiro. Além disso, foi evidenciada que a Hsp65 de M. leprae apresenta uma possível atividade de oligopeptidase. Dessa forma, esse projeto teve como alvo principal a expressão e purificação da Hsp65 de M. leprae em grau de pureza e quantidade adequada para realizar estudos estruturais. Devido ao uso de condições desnaturantes para a solubilização da proteína, o espectro de Dicroísmo Circular (CD) foi utilizado para analisar a presença de estrutura secundária. Com o objetivo de investigar a estrutura terciária da Hsp65 (Cpn 60-2), a técnica de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) foi realizada tendo sido observado que a solução apresenta-se monodispersa com um raio hidrodinâmico médio de 10 nm, caracterizando um estado trimérico. A tentativa de cristalização dessa amostra está em andamento e sob intensa observação. Algumas outras condições estão em fase de refinamento na tentativa de se conseguir cristais difratáveis para os estudos estruturais. Além do projeto principal,... / Tuberculosis is an infectious disease that represents one of the most important social, economic and health problems in the world. Many antigens have demonstrated strong protection against tuberculosis in experimental models and the most recent antigen studied for the development of a vaccine againt tuberculosis is the Hsp65 kDa heat shock protein from Mycobacterium leprae.The production of heat shock proteins (Hsp) is greatly enhanced by stress stimuli such as high temperatures, presence of free radicals and nutricional deficiencies. The main function of Hsp's is to preserve the structure and function of proteins and, consequently, the essential cellular functions, acting as molecular chaperones. The M. leprae Hsp65 has been identified as a remarkable immunodominant antigen, since it estimulates humoral immune response and activation of T cells in the host during this bacterial infection. In addition, it was demonstrated that this protein presents a possible enzymatic activity. This project aims at expression, purification and further structural studies of the M. leprae Hsp65. During this project, pure protein was obtained in high amounts. Due to the use of chaotropic agent for resolubilization of the protein present in inclusion bodies far-UV CD studies were accomplished aiming to observe the presence of secondary structures. DLS studies were also carried out to determine the oligomeric state of this Hsp65 (Cpn 60-2), showing that the protein solution was monodisperse with an approximate radius of 10 nm (trimer). Attempts to obtain mono crystals of this sample are currently in progress and under intense observation. Some other refinement conditions are in process in order to obtain crystals suitable for structural studies. The work conducted in parallel with the NUDEL protein (nuclear distribution element-like) was...(Complete abstract click electronic access below)
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Caracterização da chaperona Hsp100 de Leishmania braziliensis: estudos estruturais e funcionais / Characterization of the Hsp100 chaperone of Leishmania braziliensis: structural and functional studiesRamos Junior, Sergio Luiz 03 August 2018 (has links)
A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada que afeta milhares de pessoas podendo até levar a óbito em sua forma visceral. Durante o seu ciclo de vida, o parasita passa por diversas mudanças ambientais como mudança de temperatura e pH, principalmente quando da transfecção do inseto vetor para o hospedeiro mamífero. Tais mudanças geram estresse celular que pode levar proteínas ao enovelamento incorreto assim como a processos agregativos, sendo necessários sistemas de controle de qualidade proteico para manter a homeostase celular, do qual fazem parte as chaperonas moleculares. Chaperonas como a Hsp100, ajudam a manter a homeostase celular e a adaptação desempenhando um papel importante para protozoários como a Leishmania braziliensis, causador da leishmaniose. A Hsp100 tem papel desagregase, atuando com outras chaperonas moleculares para a extração de polipeptídios de agregados proteicos possibilitando seu desenovelamento e posterior reenovelamento, evitando seu efeito tóxico sobre a célula. A Hsp100 parece ser essencial para esses microrganismos, no entanto não há muito dados disponíveis para Hsp100 em Leishmania sp. e Plasmodium sp. Neste trabalho está descrito o protocolo para expressão e purificação da Hsp100 recombinante de L. braziliensis (rLbHsp100), assim como sua caracterização estrutural e funcional inicial in vitro. A proteína foi analisada por espectropolarimetria de dicroísmo circular, apresentando estrutura típica de proteínas ricas em hélices α, a fluorescência estática de triptofano demonstrou que a proteína possui estrutura terciária local com seus triptofanos parcialmente expostos ao solvente. Por cromatografia de exclusão molecular analítica, observou-se que a LbHsp100 se comporta como um oligômero cujo estado é influenciado tanto pela concentração proteica como pela presença de nucleotídeos adenosina. Análises por ultracentrifugação analítica evidenciaram que a rLbHsp100 em solução apresenta um equilíbrio de diversas espécies havendo deslocamento para um hexâmero de maneira concentração dependente. Análises de SAXS confirmaram a estrutura hexamérica e proporcionaram a obtenção de um modelo ab initio da proteína. Através de microscopia eletrônica de transmissão pode-se observar a forma toróide e a dispersividade do sistema. Por fim, atestou-se que a proteína foi obtida funcional com fraca atividade ATPásica, apresentando também interações com nucleotídeos adenosina (ATP e ADP) assim como com a suramina. / Leishmaniasis is a neglected tropical disease that affects thousands of people and may even lead to death in its visceral form. During its life cycle, the parasite undergoes several environmental changes such as temperature and pH changes, especially when transfecting from the vector insect into the mammalian host. Such changes generate a cellular stress that can lead to misfolding as well as to aggregative processes, therefore a protein quality control system is necessary to maintain cell homeostasis, which includes molecular chaperones. Chaperones such as Hsp100 can help maintain cellular homeostasis and adaptation playing an important role for protozoa such as Leishmania braziliensis, which causes leishmaniasis. The Hsp100 has a disaggregase action, acting with other proteins of the chaperone system to extract polypeptides from protein aggregates, allowing their unfolding and subsequent refolding, avoiding their toxic effect on the cell. Hsp100 appears to be essential for these microorganisms, however there is not much data available for Hsp100 in Leishmania sp. and Plasmodium sp. This work describes the protocol for expression and purification of the recombinant Hsp100 of Leishmania braziliensis (rLbHsp100), as well as its initial in vitro characterization. The protein was analyzed by circular dichroism spectropolarimetry, presenting a typical structure of ?-helix rich protein as well as a concentration-dependent structure gain, static fluorescence of tryptophan demonstrated that the protein has local tertiary structure with its tryptophans partially exposed to the solvent. Analytical size exclusion chromatography showed that LbHsp100 behaves as an oligomer whose state is influenced by both the concentration and the presence of adenosine nucleotides. Analysis by analytical ultracentrifugation has shown that the rLbHsp100 in solution exhibits an equilibrium of several species shifting towards a hexamer in a concentration dependent manner. SAXS analyzes confirm the hexameric structure and had provide an ab initio model for the protein. Transmission electron microscopy shows the toroidal form and dispersivity of the system. Finally, the obtained protein had showed catalytic function, and also interacted with adenosine nucleotides (ATP and ADP) as well as suramine.
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Caracterização da chaperona Hsp100 de Leishmania braziliensis: estudos estruturais e funcionais / Characterization of the Hsp100 chaperone of Leishmania braziliensis: structural and functional studiesSergio Luiz Ramos Junior 03 August 2018 (has links)
A leishmaniose é uma doença tropical negligenciada que afeta milhares de pessoas podendo até levar a óbito em sua forma visceral. Durante o seu ciclo de vida, o parasita passa por diversas mudanças ambientais como mudança de temperatura e pH, principalmente quando da transfecção do inseto vetor para o hospedeiro mamífero. Tais mudanças geram estresse celular que pode levar proteínas ao enovelamento incorreto assim como a processos agregativos, sendo necessários sistemas de controle de qualidade proteico para manter a homeostase celular, do qual fazem parte as chaperonas moleculares. Chaperonas como a Hsp100, ajudam a manter a homeostase celular e a adaptação desempenhando um papel importante para protozoários como a Leishmania braziliensis, causador da leishmaniose. A Hsp100 tem papel desagregase, atuando com outras chaperonas moleculares para a extração de polipeptídios de agregados proteicos possibilitando seu desenovelamento e posterior reenovelamento, evitando seu efeito tóxico sobre a célula. A Hsp100 parece ser essencial para esses microrganismos, no entanto não há muito dados disponíveis para Hsp100 em Leishmania sp. e Plasmodium sp. Neste trabalho está descrito o protocolo para expressão e purificação da Hsp100 recombinante de L. braziliensis (rLbHsp100), assim como sua caracterização estrutural e funcional inicial in vitro. A proteína foi analisada por espectropolarimetria de dicroísmo circular, apresentando estrutura típica de proteínas ricas em hélices α, a fluorescência estática de triptofano demonstrou que a proteína possui estrutura terciária local com seus triptofanos parcialmente expostos ao solvente. Por cromatografia de exclusão molecular analítica, observou-se que a LbHsp100 se comporta como um oligômero cujo estado é influenciado tanto pela concentração proteica como pela presença de nucleotídeos adenosina. Análises por ultracentrifugação analítica evidenciaram que a rLbHsp100 em solução apresenta um equilíbrio de diversas espécies havendo deslocamento para um hexâmero de maneira concentração dependente. Análises de SAXS confirmaram a estrutura hexamérica e proporcionaram a obtenção de um modelo ab initio da proteína. Através de microscopia eletrônica de transmissão pode-se observar a forma toróide e a dispersividade do sistema. Por fim, atestou-se que a proteína foi obtida funcional com fraca atividade ATPásica, apresentando também interações com nucleotídeos adenosina (ATP e ADP) assim como com a suramina. / Leishmaniasis is a neglected tropical disease that affects thousands of people and may even lead to death in its visceral form. During its life cycle, the parasite undergoes several environmental changes such as temperature and pH changes, especially when transfecting from the vector insect into the mammalian host. Such changes generate a cellular stress that can lead to misfolding as well as to aggregative processes, therefore a protein quality control system is necessary to maintain cell homeostasis, which includes molecular chaperones. Chaperones such as Hsp100 can help maintain cellular homeostasis and adaptation playing an important role for protozoa such as Leishmania braziliensis, which causes leishmaniasis. The Hsp100 has a disaggregase action, acting with other proteins of the chaperone system to extract polypeptides from protein aggregates, allowing their unfolding and subsequent refolding, avoiding their toxic effect on the cell. Hsp100 appears to be essential for these microorganisms, however there is not much data available for Hsp100 in Leishmania sp. and Plasmodium sp. This work describes the protocol for expression and purification of the recombinant Hsp100 of Leishmania braziliensis (rLbHsp100), as well as its initial in vitro characterization. The protein was analyzed by circular dichroism spectropolarimetry, presenting a typical structure of ?-helix rich protein as well as a concentration-dependent structure gain, static fluorescence of tryptophan demonstrated that the protein has local tertiary structure with its tryptophans partially exposed to the solvent. Analytical size exclusion chromatography showed that LbHsp100 behaves as an oligomer whose state is influenced by both the concentration and the presence of adenosine nucleotides. Analysis by analytical ultracentrifugation has shown that the rLbHsp100 in solution exhibits an equilibrium of several species shifting towards a hexamer in a concentration dependent manner. SAXS analyzes confirm the hexameric structure and had provide an ab initio model for the protein. Transmission electron microscopy shows the toroidal form and dispersivity of the system. Finally, the obtained protein had showed catalytic function, and also interacted with adenosine nucleotides (ATP and ADP) as well as suramine.
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Estudo funcional comparativo das co-chaperonas moleculares p23A e p23B da Hsp90 de Leishmania braziliensisAlmeida, Glessler Silva 03 June 2014 (has links)
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6071.pdf: 2789101 bytes, checksum: 91e27d4de2c662fb669682eb6d3013b3 (MD5)
Previous issue date: 2014-06-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / Protein folding is essential for proteins proper biological function. Failures in this process can lead to the formation of poorly unfolded proteins and/or protein aggregates. In order to avoid this problem, the cells express a family of proteins known as molecular chaperones. The molecular chaperones are proteins that assist the correct folding of other proteins, and other important functions in the cells. The Hsp90 family is important for protein folding and it assists in preventing protein aggregation. Hsp90 is regulated by several co-chaperones, for example, p23. The p23 is a small acidic protein that regulates the ATPase activity of Hsp90. It has a structured N-terminal beta-sheet and an unstructured C-terminal domain. In addition to the regulatory role, as an inhibitor of ATPase activity of Hsp90, it also has chaperone activity in itself. Thus, the aim of this study was to investigate comparatively two p23 identified in the Leishmania braziliensis (Lbp23A and Lbp23B) genome. The proteins were expressed, purified and structurally and functionally characterized. Furthermore, functional assays such as intrinsic chaperone activity and inhibition of ATPase activity of Hsp90 L. braziliensis (LbHsp90) and identifying in vivo by western blotting were developed. The results indicate that these two proteins are structurally similar, however, demonstrated significant differences in chemical and thermal stability. The Lbp23 also differ in relation to chaperone activity and inhibition of ATPase activity of LbHsp90. The in vivo identification revealed the presence of both Lbp23 in extracts of L. braziliensis; besides suggesting possible post-translational modifications in Lbp23B. The results indicate that both Lbp23 are undoubtedly p23, since they show p23-like function and structural signs. / O enovelamento proteico é essencial para a correta função biológica das proteínas. Falhas nesse processo podem levar à formação de proteínas mal enoveladas e/ou agregados proteicos. Para tentar evitar esse problema, a célula expressa uma família de proteínas denominadas de chaperonas moleculares ou proteínas de choque térmico (Hsp). As chaperonas moleculares auxiliam no enovelamento correto de outras proteínas, entre outras funções importantes para as células. A família das Hsp90 são chaperonas importantes por auxiliarem no enovelamento proteico e prevenirem a agregação de proteínas. A Hsp90 é regulada por diversas co-chaperonas, como, por exemplo, a p23. A p23 é uma pequena proteína ácida que regula a atividade ATPásica da Hsp90. Ela possui um domínio N-terminal estruturado em folhas-beta e um domínio C-terminal desestruturado. Além do papel regulatório, inibindo a atividade ATPásica da Hsp90, ela possui atividade chaperona. Desta forma, o objetivo desse trabalho foi estudar comparativamente as duas p23 identificadas no genoma do protozoário Leishmania braziliensis (Lbp23A e Lbp23B). As proteínas foram expressas, purificadas e caracterizadas estrutural e funcionalmente. Além disso, foram desenvolvidos experimentos funcionais como: atividade chaperona; inibição da atividade ATPásica da Hsp90 de L. braziliensis (LbHsp90) e identificação in vivo por western blotting. Os resultados indicam que essas duas proteínas são similares estruturalmente, porém, possuem estabilidade química e térmica notavelmente diferente. Ambas Lbp23 apresentam diferenças em relação à atividade chaperona e inibição da atividade ATPásica da LbHsp90. A identificação in vivo mostrou a presença das duas Lbp23 em extratos de L. braziliensis; além de sugerir possíveis modificações pós-traducionais na Lbp23B. Os resultados indicam que ambas as Lbp23 de L. braziliensis são inequivocamente p23, pois possuem sinais estruturais e função desta co-chaperona.
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Caracterização da distribuição subcelular e tecidual da proteína KIAA0090 e estudos de seu envolvimento em câncer e resposta a estresses / Characterization of the subcellular and tissue distribution of KIAA0090 protein and studies on its involvement in cancer and stress responseMolina, Roberto Augusto Silva 07 June 2010 (has links)
O gene humano KIAA0090 mapeia uma região cromossômica (1p36.13) com freqüentes aberrações em cânceres humanos e é superexpresso em muitos tipos de tumores. É um gene altamente complexo cujas seqüências de cDNA oriundas de bases de dados públicas apóiam a existência de mais de 20 transcritos alternativos. Sua RefSeq prediz a codificação de uma proteína altamente conservada com 993aa, cujo ortólogo em S. cerevisae (ECM1) foi proposto recentemente atuar no enovelamento de proteínas transmembrana no retículo endoplasmático (RE). O objetivo deste trabalho foi adquirir conhecimento sobre a localização e função da proteína KIAA0090, em células e tecidos normais e tumorais, bem como em células expostas a estresse. Geramos anticorpos policlonais (anti-K2) contra a metade C-terminal da proteína e comparamos seu padrão ao tratamento obtido com o anticorpo (anti-K1), previamente gerado contra a metade N-terminal. A proteína endógena foi localizada primariamente no Golgi e na mitocôndria, dependendo se o anticorpo utilizado foi contra a região N- ou C-terminal, respectivamente. Observamos também, embora menos notável, uma marcação sobreposta com a rede do RE e na margem celular, e variáveis graus de marcação dentro do núcleo e associada a pequenas partículas citoplasmáticas. A análise imunohistoquímica forneceu evidências que a KIAA0090 é ubiquamente epressa. O anti-K2 marcou estruturas semelhantes a Golgi em todo tipo celular, predominando assim naquelas com Golgi mais visíveis, como células secretórias. Observamos para a maioria dos tecidos uma marcação leve a moderada para o anti-K1, mas uma forte marcação foi encontrada em grupos restritos de células, como as células reticulares do timo, epitélio ductal das glândulas da língua e na lâmina basal do epitélio escamoso na zona de transição esôfago-gástrica. Em cortes histológicos de melanoma primário, observamos uma forte marcação para o anti-K1, principalmente em vasos e em células invasoras na margem do tumor, enquanto o anti-K2 mostrou um padrão sugestivo de infiltrado inflamatório e/ou células mesenquimais. Em tecidos de câncer de mama, vimos uma forte marcação nas células de carcinoma ductal em comparação ao epitélio ductal normal para o anti-K2, ao passo que o anti-K1, marcou fortemente vasos e células basais no epitélio de revestimento glandular, tanto no tecido normal como no tumoral. Utilizando uma matriz com amostras teciduais de câncer de mama obtidas de 96 pacientes, observamos uma marcação forte a moderada para o anti-K1 em 84% dos casos, enquanto 16% dos casos não apresentaram marcação. Notamos que os casos positivos para o anti-K1 estavam 100, 85 e 71% entre os casos de grade 1, 2 e 3, respectivamente, sugerindo uma tendência de perda da KIAA0090 associada à progressão do câncer de mama. Foi interessante notar que a brefeldina A e MG132 alteraram os níveis de RNAm da KIAA0090 e levaram à redistribuição da proteína endógena. Outros tratamentos de estresse, incluindo tunicamicina, complexo de rutênio doador de óxido nítrico e etoposídeo, também alteraram o padrão de distribuição da proteína. Este estudo fornece evidências preliminares que corroboram os resultados obtidos de estudos de expressão gênica em larga escala, fortalecendo os indícios de que a KIAA0090 desenvolve um papel na homeostase celular e está envolvida no câncer. / Human KIAA0090 gene maps to a chromosomal region (1p36.13) with frequent aberrations in cancer and is overexpressed in many tumor types. It is a highly complex gene with cDNA sequences in databases supporting the occurrence of more than 20 alternative transcripts. The RefSeq transcript is predicted to encode a highly conserved 993 aa transmembrane protein whose S. cerevisiae ortolog (EMC1) was recently proposed to function on transmembrane protein folding in the endoplasmic reticulum (ER). The aim of this work was to gain insight into the localization and function of KIAA0090 protein, in normal and tumor cells and tissues, as well as in cells exposed to stress treatments. We raised a polyclonal antibody (anti-K2) to the C-terminal half of the protein and compared its pattern of staining with an antibody (anti-K1) previously generated in our laboratory to the N-terminal half. The endogenous protein was primarily localized either to mitochondria or Golgi, depending whether the antibody used was to the N- or C-terminal, respectively. Also, less conspicuous staining overlapped with the ER network and cell margin, and variable degrees of labeling was observed within the nucleus and associated to small cytoplasmic particles. Immunohistochemistry survey provided evidence that the KIAA0090 protein is ubiquitously expressed. Anti-K2 labeled in a Golgi-like pattern in every cell type, predominating in those with more conspicuous Golgi, such as secretory cells. Faint to moderate anti-K1 staining was found in most tissues, but very strong staining was seen in restricted groups of cells, such as thymus reticular cells, ductal epithelium of salivary lingual glands and the basal layer of the squamous epithelium in the esophagus-gastric transition zone. In histological sections of primary melanomas, we observed a strong staining for the anti-K1, mostly in vessels and at the invasive tumor margin, while the anti-K2 showed a staining pattern suggestive of infiltrating inflammatory and mesenchymal cells. In breast tissues, stronger staining was seen in ductal carcinoma cells in comparison to normal ductal epithelium for anti-K2 antibody, whereas anti-K1 strongly marked vessels and basal cells in epithelia lining glandular ducts both in normal and tumor tissues. Using a tissue array of breast cancer samples obtained from 96 patients, we observed strong to moderate staining for anti-K1 in 84% of the samples and lack of staining in 16%, interestingly anti-K1 positive cases were 100, 85 and 71% among cases of grades 1, 2 and 3, respectively, suggesting a tendency of KIAA0090 loss associated with breast cancer progression. A positive correlation was found with estrogen receptor expression and the opposite for HER2. Interestingly, Brefeldin A and MG132 altered KIAA0090 mRNA levels and caused endogenous KIAA0090 protein to redistribute. Other stress treatments, including tunicamycin, a ruthenium complex nitric oxide donor and etoposide, also altered KIAA0090 distribution. This study supports the notion that KIAA0090 play a role in cellular homeostasis and is involved in cancer.
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Caracterização de domínios da Hsp90 de Plasmodium falciparum e mapeamento da interação com a sua co-chaperona Aha4 / Characterization of Hsp90 domains of Plasmodium falciparum and mapping of the interaction with its co-chaperone Aha4Torricillas, Marcela da Silva 27 February 2019 (has links)
A malária é a doença parasitária mais comum no mundo e é causada por protozoários do gênero Plasmodium spp., sendo transmitida por dípteros do gênero Anopheles spp. para hospedeiros vertebrados. Ambos, parasitas e vetores, têm desenvolvido resistência aos tratamentos e medidas profiláticas, respectivamente, indicando a necessidade de novas formas de controle. Chaperonas moleculares e co-chaperonas são interessantes alvos de estudo para desenvolvimento de terapias mais eficazes, uma vez que estas biomoléculas desempenham papel importante no processo de adaptação e sobrevivência do protozoário. As chaperonas da família Hsp90 participam de vários processos fisiológicos, que não somente auxiliar o enovelamento de proteínas clientes. Cada protômero da Hsp90 é composto por três domínios denominados N, M e C, e a proteína se organiza na forma de homodímeros flexíveis. As co-chaperonas são proteínas auxiliares, essenciais para modulação do ciclo funcional da Hsp90. A co-chaperona Aha1 (do inglês Activator of the Hsp90-ATPase activity 1) estabiliza a Hsp90 em um estado conformacional intermediário e estimula a atividade ATPásica da mesma. Neste contexto, é usual a busca por inibidores potenciais diretos e indiretos para Hsp90 e por respostas sobre seu mecanismo de inibição. O objetivo deste trabalho foi a obtenção e caracterização bioquímica e biofísica da proteína Hsp90 recombinante de Plasmodium falciparum (PfHsp90) e construções PfHsp90NM e PfHsp90M, além do mapeamento da interação com a co-chaperona Aha4 de P. falciparum (PfAha4). Os experimentos de caracterização estrutural revelam que o domínio N é menos estável termicamente do que o domínio M e também é o mais rico em estrutura secundária do tipo hélice α. A PfHsp90 comporta-se majoritariamente como homodímero alongado e flexível em solução, sendo o domínio C essencial para a dimerização, todavia as construções PfHsp90NM e PfHsp90M comportam-se como monômeros. Ensaios de fluorescência revelaram que as construções exibem diferenças na estabilidade química e que possuem estrutura terciária local com seus triptofanos parcialmente expostos ao solvente. A atividade ATPásica da PfHsp90 foi estimulada por PfAha4, e a interação entre elas foi resolvida com estequiometria de duas moléculas de PfAha4 por dímero de PfHsp90. Tal interação foi entalpicamente dirigida, ocorrendo liberação de moléculas de água, com interação mediada principalmente por contatos hidrofóbicos. O mapeamento das regiões de contato sugere que o cerne da interação ocorra entre a PfAha4 e o domínio M da PfHsp90. As diferenças exibidas pela PfHsp90 com relação as propriedades de proteínas ortólogas podem ter relação com os resíduos de aminoácidos que conectam os domínios N e M em sua estrutura, devido a sua flexibilidade, tamanho e composição. / Malaria is the most common parasitic disease in the world and is caused by protozoa of the genus Plasmodium spp., and transmitted by dipterans of the genus Anopheles spp. for vertebrate hosts. Both parasites and vectors have developed resistance to treatments and prophylactic measures, respectively, indicating the need for new forms of control. Molecular chaperones and co-chaperones are interesting targets for the development of more effective therapies, since these biomolecules play an important role in the process of adaptation and survival of the protozoan. The chaperones of the Hsp90 family participate in several physiological processes, which not only aid in the folding of client proteins. Each Hsp90 protomer have three domains called N, M and C, and the protein is organized as flexible homodimers. Co-chaperones are assistant proteins, they are essential for modulating the functional cycle of Hsp90. The Aha1 (Activator of the Hsp90-ATPase activity 1) co-chaperone stabilizes Hsp90 in an intermediate conformational state and stimulates the ATPase activity thereof. In this context, it is usual the search for direct and indirect potential inhibitors for Hsp90 and for responses about its inhibition mechanism. The objective of this work was the biochemical and biophysical characterization of the Hsp90 recombinant protein of Plasmodium falciparum (PfHsp90) and PfHsp90NM and PfHsp90M constructions, as well as to map interactions with the Aha4 co-chaperone of P falciparum (PfAha4). Structural characterization experiments show that the N domain is less thermally stable than the M domain and is also the richest in α-helix secondary structure. PfHsp90 behaves mostly as elongated and flexible homodimer in solution, domain C is essential for dimerization, on the other hand the constructs PfHsp90NM and PfHsp90M behave as monomers. Fluorescence assays revealed that the constructs exhibit differences in chemical stability and that have local tertiary structure with their tryptophans partially exposed to the solvent. The ATPase activity of PfHsp90 was stimulated by PfAha4, and the interaction between them was resolved with stoichiometry of two molecules of PfAha4 by PfHsp90 dimer. Such interaction was enthalpically driven, releasing of water molecules, with interaction mediated mainly by hydrophobic contacts. The mapping of contact regions suggests that the core of the interaction occurs between PfAha4 and the M domain of PfHsp90. The differences exhibited by PfHsp90 concerning the properties of orthologous proteins, may be related to the amino acid residues that connect the N and M domains in its structure, due to its flexibility, size and composition.
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Caracterização da distribuição subcelular e tecidual da proteína KIAA0090 e estudos de seu envolvimento em câncer e resposta a estresses / Characterization of the subcellular and tissue distribution of KIAA0090 protein and studies on its involvement in cancer and stress responseRoberto Augusto Silva Molina 07 June 2010 (has links)
O gene humano KIAA0090 mapeia uma região cromossômica (1p36.13) com freqüentes aberrações em cânceres humanos e é superexpresso em muitos tipos de tumores. É um gene altamente complexo cujas seqüências de cDNA oriundas de bases de dados públicas apóiam a existência de mais de 20 transcritos alternativos. Sua RefSeq prediz a codificação de uma proteína altamente conservada com 993aa, cujo ortólogo em S. cerevisae (ECM1) foi proposto recentemente atuar no enovelamento de proteínas transmembrana no retículo endoplasmático (RE). O objetivo deste trabalho foi adquirir conhecimento sobre a localização e função da proteína KIAA0090, em células e tecidos normais e tumorais, bem como em células expostas a estresse. Geramos anticorpos policlonais (anti-K2) contra a metade C-terminal da proteína e comparamos seu padrão ao tratamento obtido com o anticorpo (anti-K1), previamente gerado contra a metade N-terminal. A proteína endógena foi localizada primariamente no Golgi e na mitocôndria, dependendo se o anticorpo utilizado foi contra a região N- ou C-terminal, respectivamente. Observamos também, embora menos notável, uma marcação sobreposta com a rede do RE e na margem celular, e variáveis graus de marcação dentro do núcleo e associada a pequenas partículas citoplasmáticas. A análise imunohistoquímica forneceu evidências que a KIAA0090 é ubiquamente epressa. O anti-K2 marcou estruturas semelhantes a Golgi em todo tipo celular, predominando assim naquelas com Golgi mais visíveis, como células secretórias. Observamos para a maioria dos tecidos uma marcação leve a moderada para o anti-K1, mas uma forte marcação foi encontrada em grupos restritos de células, como as células reticulares do timo, epitélio ductal das glândulas da língua e na lâmina basal do epitélio escamoso na zona de transição esôfago-gástrica. Em cortes histológicos de melanoma primário, observamos uma forte marcação para o anti-K1, principalmente em vasos e em células invasoras na margem do tumor, enquanto o anti-K2 mostrou um padrão sugestivo de infiltrado inflamatório e/ou células mesenquimais. Em tecidos de câncer de mama, vimos uma forte marcação nas células de carcinoma ductal em comparação ao epitélio ductal normal para o anti-K2, ao passo que o anti-K1, marcou fortemente vasos e células basais no epitélio de revestimento glandular, tanto no tecido normal como no tumoral. Utilizando uma matriz com amostras teciduais de câncer de mama obtidas de 96 pacientes, observamos uma marcação forte a moderada para o anti-K1 em 84% dos casos, enquanto 16% dos casos não apresentaram marcação. Notamos que os casos positivos para o anti-K1 estavam 100, 85 e 71% entre os casos de grade 1, 2 e 3, respectivamente, sugerindo uma tendência de perda da KIAA0090 associada à progressão do câncer de mama. Foi interessante notar que a brefeldina A e MG132 alteraram os níveis de RNAm da KIAA0090 e levaram à redistribuição da proteína endógena. Outros tratamentos de estresse, incluindo tunicamicina, complexo de rutênio doador de óxido nítrico e etoposídeo, também alteraram o padrão de distribuição da proteína. Este estudo fornece evidências preliminares que corroboram os resultados obtidos de estudos de expressão gênica em larga escala, fortalecendo os indícios de que a KIAA0090 desenvolve um papel na homeostase celular e está envolvida no câncer. / Human KIAA0090 gene maps to a chromosomal region (1p36.13) with frequent aberrations in cancer and is overexpressed in many tumor types. It is a highly complex gene with cDNA sequences in databases supporting the occurrence of more than 20 alternative transcripts. The RefSeq transcript is predicted to encode a highly conserved 993 aa transmembrane protein whose S. cerevisiae ortolog (EMC1) was recently proposed to function on transmembrane protein folding in the endoplasmic reticulum (ER). The aim of this work was to gain insight into the localization and function of KIAA0090 protein, in normal and tumor cells and tissues, as well as in cells exposed to stress treatments. We raised a polyclonal antibody (anti-K2) to the C-terminal half of the protein and compared its pattern of staining with an antibody (anti-K1) previously generated in our laboratory to the N-terminal half. The endogenous protein was primarily localized either to mitochondria or Golgi, depending whether the antibody used was to the N- or C-terminal, respectively. Also, less conspicuous staining overlapped with the ER network and cell margin, and variable degrees of labeling was observed within the nucleus and associated to small cytoplasmic particles. Immunohistochemistry survey provided evidence that the KIAA0090 protein is ubiquitously expressed. Anti-K2 labeled in a Golgi-like pattern in every cell type, predominating in those with more conspicuous Golgi, such as secretory cells. Faint to moderate anti-K1 staining was found in most tissues, but very strong staining was seen in restricted groups of cells, such as thymus reticular cells, ductal epithelium of salivary lingual glands and the basal layer of the squamous epithelium in the esophagus-gastric transition zone. In histological sections of primary melanomas, we observed a strong staining for the anti-K1, mostly in vessels and at the invasive tumor margin, while the anti-K2 showed a staining pattern suggestive of infiltrating inflammatory and mesenchymal cells. In breast tissues, stronger staining was seen in ductal carcinoma cells in comparison to normal ductal epithelium for anti-K2 antibody, whereas anti-K1 strongly marked vessels and basal cells in epithelia lining glandular ducts both in normal and tumor tissues. Using a tissue array of breast cancer samples obtained from 96 patients, we observed strong to moderate staining for anti-K1 in 84% of the samples and lack of staining in 16%, interestingly anti-K1 positive cases were 100, 85 and 71% among cases of grades 1, 2 and 3, respectively, suggesting a tendency of KIAA0090 loss associated with breast cancer progression. A positive correlation was found with estrogen receptor expression and the opposite for HER2. Interestingly, Brefeldin A and MG132 altered KIAA0090 mRNA levels and caused endogenous KIAA0090 protein to redistribute. Other stress treatments, including tunicamycin, a ruthenium complex nitric oxide donor and etoposide, also altered KIAA0090 distribution. This study supports the notion that KIAA0090 play a role in cellular homeostasis and is involved in cancer.
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Expressão e caracterização estrutural da chaperona Hsp70 mitocondrial de Leishmania braziliensis / Leishmania braziliensis\'s mitochondrial Hsp70 chaperone: expression and structural characterizationNishimura, Letícia Sayuri 19 May 2017 (has links)
As chaperonas moleculares da família Hsp70 desempenham funções cruciais nas células de todos os organismos vivos, de procariotos a eucariotos. Nestes, estão presentes em todos os compartimentos celulares e nas mitocôndrias é expressa uma isoforma própria (mtHsp70), que participa dos processos enovelamento e maturação de proteínas bem como de sua importação para a matriz mitocondrial. Diante da crescente demanda de pesquisa sobre doenças tropicais negligenciadas, foi tomado como objeto de estudo neste trabalho uma Hsp70 mitocondrial de Leishmania braziliensis (LbmtHsp70) com o intuito de caracterizá-la estrutural e funcionalmente em comparação à ortóloga humana com maior identidade: a mtHsp70 também chamada de mortalina, GRP75, HspA9 ou PBP74. A LbmtHsp70 foi purificada em sua forma enovelada, em sistema monodisperso apresentando dados hidrodinâmicos condizentes com a forma monomérica, foi testada sua estabilidade quanto à influência de nucleotídeos de adenosina (ATP e ADP) à sua estrutura e, por fim, foram feitos ensaios para avaliar sua atividade ATPásica e de energia de interação com nucleotídeos. De forma geral, a LbmtHsp70 é bastante similar à mortalina, como pode ser evidenciado pelos resultados obtidos com algumas particularidades. / The molecular chaperones from the Hsp70 family perform critical cell roles in all organisms, from prokaryotes to eukaryotes. In the last ones, they are found in all cell compartments and a particular isoform is expressed in the mitochondria, where it carries out folding and maturation processes as well as the import of proteins to the mitochondrial matrix. In face of the growing demand for research about neglected tropical diseases, in this study a Hsp70 from Leishmania braziliensis\'s mitochondria was taken as object of study for further structural and functional characterization in comparison to the human orthologous which presents the highest identity to LbmtHsp70: the mtHsp70 also known as mortalin, GRP75, HspA9 or PB74. LbmtHsp70 was obtained in folded state in monodisperse system with hydrodynamic data consistent to monomeric conformer, stability and adenosine nucleotides influence to its structure were analyzed, and were performed assays for ATPase activity and nucleotide interaction energy. In a general way LbmtHsp70 is very similar to mortalin as can be shown through the results, but with some peculiarities.
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Efeito da curcumina na secreção de fator H mutante em paciente deficiente desta proteína reguladora do sistema complemento. / Effect of curcumin on mutant H-factor secretion in a deficient patient of this complement regulatory system protein.Macedo, Ana Catarina Lunz 30 January 2018 (has links)
Nosso grupo estudou paciente com antecedente de infecções graves e deficiência homozigota Fator H (mutação CG453T→CA453T). Esta mutação leva a troca de códon Arg127His na molécula de Fator H (FH) resultando em acúmulo deste no retículo endoplasmático. Quando tratada a cultura de fibroblastos do paciente com curcumina in vitro, estes apresentaram aumento de secreção do FH, que mesmo mutado, apresentava função reguladora preservada. Neste protocolo, foi utilizado Theracurmin® (curcumina nanopartículada) para tratar a deficiência de FH deste paciente. Em avaliação prévia ao tratamento, foi diagnosticado lúpus com grau de atividade SLEDAI 4/105. No tratamento experimental, foram avaliados nível plasmático de curcumina e tetrahidrocurcumina. O paciente não apresentou sintomas adversos. Foi possível identificar que os níveis de curcumina e seus metabólitos se relacionaram a discreto aumento de FH detectado por Western Blot, porém sem normalização do FH e C3. O grau de atividade do lúpus se manteve estável ao longo de todo o tratamento. / Our group investigated a patient with a past of severe infections and homozygous deficiency Factor H (mutation CG453T → CA453T). This mutation leads to Arg127His codon exchange in the Factor H (FH) molecule resulting in accumulation of this protein in the endoplasmic reticulum. Once the culture of fibroblasts of the patient was treated with curcumin in vitro, they presented increased secretion of FH, which had his regulatory function. In this protocol, Theracurmin® (nanoparticle curcumin) was used to treat the FH deficiency of this patient. In pre-treatment evaluation, the pacient was diagnosed lupus with SLEDAI grade of activity 4/105. In the experimental treatment, plasma levels of curcumin and tetrahydrocurcumin were evaluated. The patient hasn\'t had adverse symptoms. It was possible to identify that the levels of curcumin and its metabolites were related to the discrete increase of FH detected by Western Blot, but without normalization of FH and C3. The degree of lupus activity remained stable throughout the treatment.
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Papel da proteína prion celular e seu ligante, stip1, na neurogênese adulta. / Role of cellular prion protein and its ligand, stip1, in the adult neurogenesis.Silva, Cainã Max Couto da 30 March 2016 (has links)
A proteína prion celular (PrPC) consiste em uma glicoproteína de membrana que atua como receptora para diversas moléculas, desencadeando sinais intracelulares. Ao interagir com a co-chaperona STIP1, PrPC promove a autorrenovação e proliferação de células-tronco/progenitoras neurais (NSPCs) durante a fase embrionária. De fato, PrPC tem se destacado por sua participação na neurogênese embrionária e adulta, porém o papel de sua interação com a proteína STIP1 na neurogênese adulta permanece obscuro. Deste modo, o presente trabalho adotou abordagens in vitro para avaliação do complexo PrPC-STIP1 em processos celulares que culminam na neurogênese adulta. Para isso, culturas primárias de NSPCs de camundongos deficientes (Prnp-/-) e tipo-selvagens (Prnp+/+) para PrPC foram realizadas, e a cultura foi devidamente padronizada e caracterizada. Através de ensaios de autorrenovação, proliferação e migração celular sugere-se que PrPC promove estes eventos celulares independentemente de STIP1, e que possivelmente a proteína laminina seja um alvo crítico para migração via PrPC. / Cellular prion protein (PrPC) consists in a membrane glycoprotein that acts as a receptor to several molecules, triggering intracellular signals. By interacting with co-chaperone STIP1, PrPC promotes self-renewal and proliferation of neural stem/progenitor cells (NSPCs) during embryonic stage. Indeed, PrPC has excelled for its participation in embryonic and adult neurogenesis, but the role of its interaction with STIP1 protein in adult neurogenesis remains unclear. Thus, herein it was adopted in vitro approaches in order to evaluate the PrPC-STIP1 complex on cellular processes that culminate in adult neurogenesis. In order to assess that, NSPC primary cultures of PrPC deficient (Prnp-/-) and wild-type (Prnp+/+) mice were performed, and the culture was properly standardized and characterized. Through self-renewal, proliferation and cell migration assays, it was suggested that PrPC promotes these cellular events regardless of STIP1, and possibly the laminin protein is a critical target for migration via PrPC.
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