Les carcinomes spinocellulaires cutanés (cSCCs) sont le deuxième type de cancer par ordre de fréquence et sont responsables de 25% des décès dus aux cancers de la peau. Il est donc essentiel de caractériser les mécanismes responsables de la cancérisation de l'épiderme afin de développer de nouveaux traitements. Dans ce contexte, les miRNAs apparaissent comme des cibles de choix pour le développement de futures thérapies anti-tumorales. Toutefois, leur implication dans la physiopathologie des cSCCs est encore peu documentée. Au cours de cette étude, j’ai identifié, par séquençage à haut débit, 112 miRNAs dont l’expression est altérée au cours du développement tumoral dans un modèle murin de carcinogénèse chimique cutanée. J’ai ensuite focalisé mon attention sur le cluster miR-193b/365a et sur miR-708 dont les niveaux diminuent au cours de la progression tumorale, suggérant des fonctions de suppresseurs de tumeur. En accord avec cette hypothèse, l’expression ectopique de ces miRNAs inhibe la prolifération, la survie et la migration de cellules tumorales, alors que le blocage de leur action par des anti-sens stimule ces fonctions cellulaires dans des kératinocytes normaux. L’association d’approches in silico et d’analyses du transcriptome de cellules de cSCC sur-exprimant ces miRNAs m’a permis d’identifier leurs gènes cibles potentiels. J’ai validé KRAS et MAX comme cibles communes de miR-193b et miR-365a, et montré par l’utilisation de siRNAs que la répression de ces cibles mime les effets de ces miRNAs. Ces résultats suggérent que le ciblage de ces gènes pourrait médier en partie les effets suppresseurs de tumeur de miR-193b et de miR-365a dans les cSCCs. / Cutaneous squamous cell carcinomas (cSCCs) are the second most common cancer and are responsible for up to 25% of all skin cancer deaths. It is therefore essential to characterize the mechanisms responsible for epidermis carcinogenesis to develop new treatments. In this context, miRNAs appear to be prime targets for the development of future anti-tumor therapies. However, their involvement in the pathophysiology of cSCCs is still poorly documented. In this study, I identified using Small RNA sequencing, 112 miRNAs whose expression is altered during tumor development in a mouse model of cutaneous two-stage chemical carcinogenesis. Then, I focused my attention on the miR-193b/365a cluster and on miR-708, that are down-regulated during tumorigenesis, suggesting tumor suppressor functions. Consistent with this hypothesis, the ectopic expression of these miRNAs inhibit the proliferation, survival and migration of tumor cells, while blocking their action with antisense oligonucleotides stimulates these cellular functions in normal keratinocytes. Combining in silico target-prediction approaches and transcriptome analyzes of cSCC cells over-expressing these miRNAs, I identified their potential target genes. I validated KRAS and MAX as direct targets of miR-193b and miR-365a, and I showed that repression of these genes using siRNAs mimics the effects of these miRNAs. These results suggest that targeting these genes might mediate, at least in part, the tumor suppressor action of miR-193b and miR-365a in cSCCs.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A proteína óxido nítrico sintase induzível (iNOS) é a mais importante proteína da família das óxido nítrico sintases, a qual é capaz de produzir grandes quantidades de óxido nítrico. A indução permanente de iNOS foi levantada como potencialmente mutagênica, apresentando um papel central na biologia tumoral. O objetivo deste estudo é investigar o papel da iNOS no desenvolvimento de carcinomas de células escamosas bucais (CCEB), usando um modelo experimental de carcinogênese lingual em camundongos knockouts para NOS2 e amostras humanas derivadas da mucosa normal, leucoplasia bucal e CCEB. Camundongos selvagens (iNOS+/+) e knockout (iNOS-/-) para iNOS foram desafiados com 4-nitroquinolina-1-óxido (4NQO) diluída em água potável por 16 semanas e sacrificados após 0, 8 e 16 semanas de acompanhamento. As línguas foram removidas e o número de displasias e carcinomas foram contados. Sangue periférico destes camundongos foram analisados, por citometria de fluxo, em busca de células tumorais circulantes. Amostras humanas derivadas da mucosa normal, leucoplasia e CCEB, foram utilizadas para quantificar o RNA mensageiro (mRNA) de NOS2. As amostras humanas também foram imuno-coradas com anticorpos anti-iNOS e anti-nitrotirosina. Em ambos os grupos, foram observadas uma redução no número de displasias e um aumento de carcinomas da 16 semana até a 32 semanas. Camundongos iNOS-/- demonstraram menor número de lesões displásicas e neoplásicas em todos os períodos de avaliação, sendo menores e menos invasivas, quando comparados aos animais selvagens. Aparentemente, há uma tendência em ascensão nos níveis do mRNA e da proteína iNOS durante a carcinogênese bucal humana. Dados similares foram obtidos com a imuno-detecção de nitrotirosina. Além disso, as imuno-marcações de iNOS e nitrotirosina foram associadas a várias características clínicopatológicas dos CCEB (tamanho, presença de metástase, estadiamento e recidiva). Nossos resultados demonstraram que iNOS afeta o processo de carcinogênese bucal experimental e humana, estando associada com a gênese e progressão dos CCEB. Mais estudos devem ser feitos, para nos fornecer, uma compreensão profunda das funções de iNOS no desenvolvimento de câncer bucal. / Inducible nitric oxide synthase (iNOS) is most important protein of nitric oxide synthases family, which is capable to produce huge amounts of nitric oxide. Permanent induction of iNOS has been raised as potentially mutagenic; presenting pivotal roles in tumor biology. The aim of this study is to investigate the role of iNOS in the development of oral squamous cells carcinomas (OSCC), using a mouse model of oral carcinogenesis in NOS2 knockout animals and human samples derived from normal mucosa, leukoplakia and OSCC. Wild-type (iNOS+/+) and NOS2-knockout (iNOS-/-) mices, were challenged with 4- nitroquinoline- 1-oxide (4NQO) in drinking water for 16 weeks and killed after 0, 8 and 16 weeks of after treatment. Tongues were removed and the number of dysplasias and carcinomas was counted. Mice’s peripheral blood were analyzed by flux cytometry in search of circulating tumor cells. Human samples derived from normal mucosa, leukoplakia and OSCC, were utilized to relative quantify the amount of NOS2-mRNA. The human samples were also immune-stained with anti-iNOS and anti- Nitrotyrosine antibodies. In both groups, a reduction of dysplasias and an increase of carcinomas from week 16 to week 32 were observed. iNOS-/- mices had shown a small number of dysplastic and neoplastic lesion in all evaluated periods, moreover these lesions were usually smaller and less invasive when compared to wild type animals. Apparently, there is a rising tendency in the iNOS mRNA and protein levels during human oral carcinogenesis. Similar findings were obtained in the nitrotyrosine staining. Furthermore, iNOS and nitrotyrosine imuno-stained is associated with several clinic-pathological features of OSCC (site, presence of metastasis, staging and recidive). Our results shows that, iNOS affects the process of experimental and human oral carcinogenesis, being associated with OSCC genesis and progression. More studies should be done to provide us a deep understanding of the iNOS functions in oral cancer development. / Tese (Doutorado)

O composto estudado neste trabalho foi o corante comercial CI Disperse Blue 291 (DB291), que contém o aminoazobenzeno 2-[(2-bromo-4,6-dinitrofenil)azo]-5-(dietilamino)-4-metoxiacetanilida. Esse produto é um azo-corante disperso usado largamente pelas indústrias têxteis para o tingimento de poliéster e pode ser encontrado em ambientes aquáticos oriundo da descarga de efluentes industriais, podendo levar à exposição de humanos por meio da ingestão de água ou alimentos contaminados. Portanto, faz-se importante a avaliação toxicológica do DB291. Este produto apresentou atividade mutagênica para linhagens de Salmonella typhimurium que possuem alta expressão das enzimas nitrorredutase e Ο-acetiltransferase. Tais enzimas também são expressas pelas bactérias da flora intestinal humana e de roedores e, desempenham importante papel na biotransformação de substâncias presentes na luz intestinal. O objetivo deste trabalho foi investigar a atividade do corante DB291 na indução de lesões pré-neoplásicas no cólon de ratos, avaliada pelo teste do cometa e pelo desenvolvimento de focos de criptas aberrantes (FCAs). Resultados com 2, 8, 16 e 24 semanas de tratamento demonstraram que o DB291 não foi capaz de induzir FCAs em ratos tratados por gavage com a dose de 50mg/kg de peso corpóreo, três vezes por semana em dias alternados. Entretanto, resultados com o teste do cometa demonstraram que o corante foi capaz de causar danos ao DNA das células da mucosa do cólon de ratos tratados por via intra-retal. Estes resultados sugerem que o DB291 possui atividade genotóxica in vivo. Considerando a resposta genotóxica para o teste do cometa, a alta atividade mutagênica no teste Salmonella microssoma e o recente relato de que o DP291 causou danos em células de fígado humano (HepG2), faz-se necessário a realização de testes de carcinogênese de longa duração para avaliação segura do seu potencial carcinogênico, não somente em cólon, mas em outros órgãos tais como fígado e bexiga. / The commercial disperse dye product CI Disperse Blue 291 , which contain the aminoazobenzene 2-[(2-bromo-4,6-dinitrophenyl)azo]-5-(diethylamino)-4-methoxyacetanilide (CAS registry no. 56548-64-2) is used for polyester fibers dyeing. It can be released in the aquatic environment through the discharge of industrial effluents. Humans can be exposed through the consumption of water and food contaminated with this product therefore its toxicological properties are important to be evaluated. This product showed elevated mutagenic activity with nitroreductase and Ο-acetyltransferase overproducing Salmonella strains. These enzymes are also expressed by human intestinal microflora, making intestines a possible target organ to the development of cancer after exposure to this product. The aim of this study was to investigate the effects of the commercial disperse dye product containing the CI Disperse Blue 291 on rat colon carcinogenesis, evaluated by the single cell gel assay (comet assay) and by aberrant crypt foci development. Results within different experimental periods showed the DB291 were not able to induce preneoplastic lesions in the colon of rats orally treated with 50mg/kg b.w., three times a week. The DB291 induced damages in the DNA of the rats colon mucosa, evaluated by the comet assay. These data indicate that the OB291 showed genotoxic activity in the colon mucosa cells. Considering these results, the mutagenic activity with Salmonella test and the recent data that the OB291 presents toxicity to human liver cells (HepG2), further long time carcinogenesis assays are needed to security evaluation of its carcinogenic potential, not only in colon, but also another organs like liver and kidney.