Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la moelle osseuse ont été intensivement étudiées pour leur capacité de régénération et leurs propriétés immunomodulatrices. Beaucoup d’études ont montré que la thérapie qui utilise les CSM améliore les fonctions de tissu ostéo-articulaire particulièrement le cartilage en vue de leur capacité de différenciation en chondrocytes. Les CSM présentent un certain nombre d'avantages pour la médecine régénérative, ces cellules peuvent être facilement isolées et multipliées en culture pour obtenir un nombre approprié pour la thérapie cellulaire. De plus, elles ont une faible immunogénicité, ce que les rende aptes à la transplantation allogénique. Depuis les années 1960, de nombreuses études ont souligné les propriétés médicinales des polysaccharides notamment les β-glucanes qui ont une place particulière du fait de leurs effets immunostimulants. L’objectif de notre travail était de mettre en évidence les capacités d’un β-glucane particulier, la laminarine, sur la prolifération et la différenciation des CSM dans la perspective d’applications dans l’arthrose. Les CSM ont été cultivés dans les milieux de croissance et de différenciation chondrocytaire. La viabilité et l'apoptose des cellules ont été explorées par le comptage, les tests MTT et la coloration à l'annexine V. En outre, l'analyse des protéines spécifiques de la prolifération a été effectuée par le western blott. De plus, l'expression des marqueurs spécifiques des CSM et des chondrocytes a été étudiée à l'aide de la RT-qPCR et de l’immunofluorescence. Nos résultats ont démontré que la stimulation des CSM à la laminarine avec la dose de 1 mg/ml soit en condition de culture de croissance basique ou en chondrogenèse a inhibé la prolifération des cellules sans induire leur apoptose. Encore, dans les conditions de culture chondrogénique, la laminarine à une dose similaire a empêché la différenciation des CSM en chondrocytes. / Mesenchymal stems cells (MSCs) are a population of multipotent cells residing in several readily available adult tissue compartments, thus allowing for their ex vivo expansion. MSCs have a reliable potential for differentiation (plasticity) into cells of the mesodermal lineage (chondrocytes, osteoblasts, adipocytes). Bone marrow-derived MSCs have been a focus of stem cell research in light of their relative ease of isolation and expansion and of their high potential for differentiation. Herein, the aim of the present PhD is to explore the potential of a β-glucan (laminarin) on Mesenchymal stem cell proliferation and differentiation for future benefit for osteoarthritis treatment. MSCs were cultured in MSC growth and chondrogenic differentiation mediums. Cells viability and apoptosis were explored by cell count, MTT assays and Annexin V staining. In addition, Analysis of the specific protein of cell proliferation was performed by western blott. Furthermore, mRNA and protein expression of specifics markers for MSCs and chondrocytes were studied using qPCR and immunofluorescence. Our results demonstrated that stimulation of MSC with laminarin at a dose of 1 mg/ml in either basic growth culture or chondrogenesis inhibited cell proliferation without inducing their apoptosis. Furthermore, under chondrogenic culture conditions, laminarin at a similar dose prevented the differentiation of MSC into chondrocytes.

Cartilage est un tissu unique, caractérisé par la matrice extracellulaire abondante et un seul type de cellule, le chondrocytes. Les modifications du phénotype chondrocytes, tels que la prolifération et de l'hypertrophie, sont des événements physiologiques survenant au cours du développement squelettique et cartilage articulaire adulte. Dans la plaque de croissance, la division active et l'expansion des chondrocytes est le mécanisme principal lors du processus de l’ossification endochondrale. Les chondrocytes jouent un rôle essentiel dans ce processus. Le comportement et les caractéristiques cellulaires des chondrocytes de la plaque de croissance sont régulées à tous les stades de l'ossification endochondrale par un réseau complexe d'interactions entre les hormones circulantes, les facteurs de croissance produits localement et la matrice extracellulaire sécrétée par les chondrocytes. Dans le cartilage articulaire, les chondrocytes forment des régions morphologiquement distinctes et maintiennent l'équilibre entre production et dégradation des composants de la matrice extracellulaire. Cependant, l'altération pathologique du phénotype des chondrocytes pourrait entraîner de nombreuses maladies squelettiques et articulaires humaines, y compris les chondrodysplasies et l'arthrose. Dans ce contexte, mon projet de doctorat a été conçu pour étudier I) les modifications des phénotypes chondrocytaires déclenchés par les déterminants génétiques et le stress métabolique et par conséquent II) la participation des deux conditions pathologiques au développement de la maladie et/ou à la progression / Cartilage is a unique tissue characterized by abundant extracellular matrix and a single cell type, the chondrocyte. Modifications of chondrocyte phenotype, such as proliferation and hypertrophy, are physiological events occuring during skeletal development and in adult articular cartilage. In growth plate cartilage, the active division and expansion of chondrocytes is the primary mechanism during the process of endochondral bone formation. Chondrocytes play a central role in this process, through a combination of proliferation, extracellular matrix secretion and hypertrophy. The behaviour and cellular features of growth plate chondrocytes are regulated at all stages of endochondral ossification by a complex network of interactions between circulating hormones, locally produced growth factors and the extracellular matrix secreted by the chondrocytes. In articular cartilage, the chondrocytes form morphologically distinct regions, including a superficial region of flattened cells, a sparsely populated middle layer, and a deep zone of hypertrophic chondrocytes. In mature articular cartilage, these chondrocytes maintain the balance of production and degradation of extracellular matrix components. However, pathological alteration of chondrocyte phenotype could lead to numerous human skeletal and articular diseases, including chondrodysplasias and osteoarthritis. In this context, my PhD project was designed to study I) the modifications of chondrocyte phenotypes triggered by genetic determinants and metabolic stress and consequently II) the participation of both pathologic conditions to disease development and/or progression

La « semicarbazide-sensitive amine oxidase » (SSAO) catalyse la déamination oxydative des amines primaires en aldéhyde, peroxyde d’hydrogène et ammoniac. Elle participe à la différenciation cellulaires, l’inflammation et la transmigration leucocytaire à travers l’endothélium lymphatique. Nos objectifs ont été d’étudier le rôle de la SSAO (i) dans la différenciation chondrocytaire hypertrophique, en relation avec le développement de l’arthrose en utilisant des chondrocytes de rat en culture primaire et des genoux arthrosiques de patients (ii) dans le développement de l’athérosclérose en invalidant des souris ApoE-/- qui développent naturellement l’athérosclérose pour le gène de la SSAO. Au niveau articulaire, la SSAO a été détectée dans le cartilage de rat et humain. In vitro, la SSAO (activité et expression) augmentent au cours de la différenciation terminale de chondrocytes de rat. Son inhibition par le LJP1586 entraîne un retard de différenciation chondrocytaire. La SSAO augmente également dans les zones arthrosiques du cartilage humain parallèlement à l’augmentation de l’hypertrophie. La SSAO jouerait donc un rôle dans la différenciation terminale des chondrocytes (hypertrophie) possiblement via le transport de glucose et dans le développement de la maladie. Au niveau vasculaire, les souris femelles ApoE-/-SSAO-/- de 25 semaines présentent une augmentation de la surface des plaques d’athérome par rapport aux ApoE-/-. Ceci est associée à une diminution de l’expression d’α-actine dans le média sous les plaques et de smMHC dans l’aorte abdominale (AA) sans modification ni de l’infiltration des lymphocytes T; ni des monocytes/ macrophages dans la paroi artérielle, ni du profil cytokinique pro-/anti-inflammatoire dans la rate. A 15 semaines, les souris femelles ApoE-/-SSAO-/-, sm-MHC a diminué dans les AA de ces souris par rapport aux ApoE-/- ainsi qu’une réorientation du trafic des cellules immunitaires vers la paroi aortique sans modification significative de la surface des plaques a été détecté. La SSAO jouerait donc un rôle précoce dans le développement de l’athérosclérose via une modification du trafic des cellules immunitaires et du phénotype des CML dans la paroi / The semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) catalyzes the oxidative deamination of primary amines into aldehydes, hydrogen peroxide and ammonia. The SSAO was implicated in cellular differentiation, inflammation and transmigration of leukocyte through the lymphatic. The objectives of this work were to study the role of SSAO (i) in chondrocyte differentiation and in the development of osteoarthritis using rat chondrocyte primary cell culture and osteroarthritic samples from patients. (ii) in the development of atherosclerosis using ApoE-/- mice, which develop naturally atherosclerosis, invalidated for the SSAO gene. Concerning the articulation, the SSAO (expression and activity) was detected in the rat and human cartilage. In vitro, SSAO increases during chondrocyte terminal differentiation (hypertrophy) and the inhibition of its activity by LJP1586, decreases the level of differentiation. In human arthritic cartilage, SSAO was higher that in healthy cartilage, in association with an increase in hypertrophic markers. The SSAO plays a role in the terminal differentiation of chondrocytes and might be involved in the development of osteoarthritis. At the vascular level, 25 week-old female ApoE-/-SSAO-/- mice presented a 50% increase in plaque surface associated with an 80% decrease in α-actin expression in the media of aortic sinus and a decrease in sm-MCH in abdominal aortas (AA) compared to ApoE-/- mice. These results were not due neither to a modification of monocytes/ macrophages, Tcell infiltration in the plaque nor in a pro- or anti-inflammatory cytokine change in spleen. In 15 week-old ApoE-/-SSAO-/- mice, even if no modification of plaque surface was found, a decrease in sm-MHC was noticed in the AA from ApoE-/-SSAO-/- compare to ApoE-/- mice. More over, the immune cell trafficking was increased in the aortic wall of ApoE-/-SSAO-/- compared to ApoE-/- mice. Thus, SSAO is involved in the early development of atherosclerosis in changing the immune cell trafficking and the VSMC phenotype

Ce travail a pour objet de déterminer les conditions optimales de production de substituts allogéniques capables de combler les lésions cartilagineuses dans le cadre du traitement de l’arthrose. Il s’oriente particulièrement sur la composante cellulaire de ces substituts. L’usage de cellules souches mésenchymateuses issues de cordons ombilicaux (CSM-GW) implique de déterminer quels facteurs obstétricaux, liés à l’environnement direct et indirect des CSM-GW, peuvent influencer leur prolifération ainsi que leur différenciation chondrocytaire. Dans une première partie de ce travail, trois types de facteurs ont été étudiés : les facteurs liés à l’enfant donneur, au déroulement de l’accouchement et de la délivrance, à la grossesse et à la mère. Nos données montrent que les CSM-GW ont des capacités prolifératives améliorées lorsque l’accouchement s’est déroulé à terme et sans complication, avec utilisation de Syntocinon® pendant le travail. Sur la base de ces résultats, nous avons utilisé les CSM-GW les plus efficaces dans le cadre de l’ingénierie du cartilage. Il a ensuite été essentiel d’élucider le profil d’action des CSM-GW dans un contexte allogénique. Le deuxième temps de ce travail a donc consisté à chercher le profil de stimulation le plus performant, au regard de la viabilité des cellules et de l’évolution de la sécrétion des facteurs solubles responsables des propriétés immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la différenciation chondrocytaire. Nous avons alors mimé, in vitro et en biomatériaux d’Alginate/Acide hyaluronique (Alg/HA) une telle situation en stimulant les CSM-GW avec différentes doses d’IFN-γ et de TNF-α. Selon nos résultats, la stimulation par IFN-γ et TNF-α sur les CSM-GW en biomatériaux d’Alg/HA est plus efficace lorsque ces deux cytokines sont utilisées conjointement et n’est pas délétère pour la viabilité cellulaire aux concentrations respectives de 20 et 30 ng/mL. Cette double stimulation induit une augmentation de la sécrétion d’IL-6 et de PGE-2 par les CSM-GW, ne modifie pas leur sécrétion de TGF-β, et diminue la sécrétion de VEGF. Nous avons confirmé ces données lors d’une mise en situation fonctionnelle : des cocultures avec des cellules mononucléées de sang périphérique (PBMC) de donneurs sains nous ont permis d’évaluer la réponse des CSM-GW lors d’une situation allogénique. Ces mises en situations allogéniques ont été étudiées à différents temps afin d’évaluer les propriétés immunologiques des CSM-GW au cours du temps passé en biomatériaux. Nos résultats montrent que les CSM-GW peuvent exprimer des molécules HLA-G ainsi qu’IDO, mais ces expressions sont limitées en biomatériaux d’Alg//HA. Les CSM-GW en biomatériaux d’Alg/HA en situation allogénique ne sont pas immunogènes, quel que soit le temps de différenciation. En revanche, leurs capacités immunomodulatrices décroissent au cours du temps et sont plus fortes à J0 et J3 de la différenciation chondrocytaire, ce qui oriente vers une utilisation précoce de ces cellules. Les conclusions de ce travail permettent de (i) sélectionner les cordons idoines à l’ingénierie cellulaire et l’ingénierie du cartilage, (ii) définir les conditions permettant de mimer une situation allogénique in vitro, (iii) connaitre les propriétés immunomodulatrices des CSM-GW au cours de la culture en biomatériaux d’Alg/HA, y compris en situation allogénique / The purpose of this work is to determine the optimal conditions for allogeneic substitutes production, adapted to filling the cartilaginous lesions in osteoarthritis treatment. It focuses on the cellular component of these substitutes. The use of mesenchymal stem cells from umbilical cords (WJ-MSC) involves determining which factors, related to direct and indirect environment of the WJ-MSC, can influence their proliferation and chondrogenic differentiation. In a first part of our work, three types of factors were studied: related to the donor child, the course of labor and delivery, pregnancy and the mother. Our results show that WJ-MSC have enhanced proliferative capacities when coming from full-term birth and without complications, with the use of Syntocinon® during labor. On this basis, we used the most effective WJ-MSC for cartilage engineering. It was then essential to elucidate their action profile in allogeneic context. We stimulated WJ-MSC embedded in Alginate/Hyaluronic Acid (Alg/HA) scaffolds with different concentrations of IFN-γ and TNF-α in order to determine the most effective stimulation profile, with regard to viability of the cells and evolution of immunomodulatory soluble factors secretion. According to our results, the stimulation by IFN-γ and TNF-α on WJ-MSC in Alg/HA scaffolds is more effective when these two cytokines are used together and is not deleterious for cell viability at the concentrations of 20 and 30 ng/mL, respectively. This double stimulation induces an increase in the secretion of IL-6 and PGE-2 by the WJ-MSC, a decrease in the secretion of VEGF and does not modify the secretion of TGF-β. We confirmed these data during a functional study: cocultures with peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors allowed us to evaluate the response of WJ-MSC in an allogeneic situation. These allogeneic situations have been studied at different times to evaluate the immunological properties of WJ-MSC during the time of chondrogenic differentiation. Our results show that WJ-MSC can express HLA-G molecules as well as IDO, but these expressions are limited in Alg/HA biomaterials. Finally, the WJ-MSC in Alg/HA biomaterials in allogeneic conditions are not immunogenic, regardless of the time of differentiation. On the other hand, their immunomodulatory capacities decrease over time and are stronger at day 0 and day 3 of chondrogenic differentiation, which leads to an early use of these cells. Finally, this work allows us to (i) select the umbilical cords suitable for cellular and cartilage engineering, (ii) define the conditions mimicking in vitro an allogeneic situation, (iii) elucidate the immunomodulatory properties of WJ-MSC during Alg/HA biomaterials chondrogenic differentiation, including allogeneic situations

Chez le fœtus de rat, en fin de gestation, le taux de glucocorticoïdes (GC) fœtal présente un pic de secrétion entre le 16ème et le 20ème jour de la vie embryonnaire, phénomène concomitant à l'apparition des centres d'ossification du 17ème au 19ème jour de gestation pour le calvaria et pour le septum nasal, respectivement. Dans le cartilage, les GC modulent l'effet des facteurs insulino-mimétiques (IGF-I et -II) par des mécanismes complexes et mal définis, auxquels nous nous sommes intéressés. Nos résultats montrent que les GC, en concentrations physiologiques, peuvent induire la biominéralisation des matrices extracellulaires des chondrocytes de septum nasal et des ostéoblastes du calvaria de fœtus du rat en culture primaire (augmentation de la phosphatase alcaline, du dépôt minéral, des GAG et du Co I). Dans le septum nasal, cette induction est liée à une régulation différentielle des IGFBP et de leurs fragments de dégradation. Les mécanismes moléculaires gouvernant la différenciation des structures craniofaciales par les GC, en particulier, la régulation des homéogènes de la famille Msx et Dlx par cette hormone, sont peu connus. Une partie de notre travail a donc consisté à décrypter l'effet des GC sur l'expression des gènes Msx-2, Dlx-5 et Runx-2 au cours de la minéralisation de calvaria de fœtus du rat. Nos résultats indiquent que les GC induisent, in vitro et in vivo, dans le calvaria de fœtus de rat, l'expression des homéogènes Msx-2, Dlx5 et du gène maître Runx-2, nécessaires à l'induction d'un marqueur fonctionnel de la biominéralisation, l'ostéocalcine. Dans notre laboratoire, l'implication du gène Msx-1 lors de l'amélogenèse et de la dentinogenèse ainsi que la présence d'un ARN antisens naturel de ce gène ont été montrées chez la souris. Nous avons mis en évidence un homologue de cet ARN AS chez le rat. Nos résultats montrent que ce dernier est exprimé au cours de la biominéralisation du calvaria de fœtus de rat, et permettront d'une part de poursuivre l'étude du rôle de cet ARN AS dans des modèles in vitro et in vivo, et d'autre part, d'aborder les mécanismes d'action de cet ARN AS.

Dans le domaine de l'ingénierie du cartilage, les hydrogels à base d'alginate (Alg) et de cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont utilisés comme biomatériaux pouvant être utilisés pour combler des lésions cartilagineuses plus ou moins profondes. Cependant, pour reproduire l’organisation zonale du cartilage, des biomatériaux multiphasiques sont nécessaires. Afin de guider la différenciation des CSM dans les différentes strates du biomatériau, sans apports de facteurs de croissance, des composants naturels du cartilage (acide hyaluronique, HA) ou de la matrice osseuse (hydroxyapatite, Hap) peuvent être ajoutés à l’alginate. L’objectif de ce travail de thèse consiste à analyser l’impact de la composition de biomatériaux à base d’alginate enrichi soit en HA soit en Hap sur le comportement des CSM. La première partie de notre travail à consister à évaluer le comportement des CSM issues de la gelée de Wharton dans ces hydrogels. Nos résultats mettent en évidence que les hydrogels d’Alg/Hap possèdent non seulement de meilleures propriétés mécaniques que les hydrogels Alg/HA et favorisent la viabilité des CSM ainsi que leur différenciation par rapport aux CSM ensemencées dans un hydrogel d’Alg/HA. La méthode de stérilisation du biomatériau représente une étape incontournable, dont on doit impérativement évaluer les multiples effets, en particulier pour ce qui touche au comportement des cellules, mais aussi au maintien de l’intégrité des propriétés physicochimiques de l'hydrogel. Ainsi, dans une seconde partie du travail, nous avons montré que le traitement de stérilisation par autoclave induisait un effet négatif sur les caractéristiques initiales de l'hydrogel à base d'alginate. Il ressort également de cette investigation sur les modes de stérilisation, que la stérilisation des hydrogels avec des UV est plus efficace et permet de préserver au mieux les propriétés spécifiques de l'hydrogel, notamment de l’Alg/HA. Enfin, dans une troisième partie de notre travail, nous avons évalué l’évolution des propriétés mécaniques au cours de la différenciation et l’impact de celles-ci sur la différenciation des CSM ainsi que sur leurs propriétés immunomodulatrices. À partir de ces résultats, nous avons montré que les caractéristiques physico-chimiques des hydrogels d’Alg/ha et Alg/hap influençaient non seulement le potentiel de différenciation des CSM-GW mais également la sécrétion des facteurs solubles impliqués dans l’immunomodulation. Ces propriétés physico-chimiques étant influencées dès le procédé de stérilisation, il est alors conseillé de les prendre en compte dans toutes les étapes de l’ingénierie tissulaire / In the field of cartilage engineering, alginate (Alg)-based hydrogels and mesenchymal stem cells (MSC) are widely used as raw biomaterials and stem cells which can be used to fill cartilage lesions of varying depth. However, to reproduce the zonal organization of articular cartilage, a graft multilayer is necessary. In order to guide the differentiation of MSCs in different strata of the biomaterials, without input of growth factors, natural cartilage components (hyaluronic acid, HA) or bone matrix (hydroxyapatite, Hap) can be added into the alginate. The aim of this work is to analyze the impact of the composition of alginate enriched either in HA or in Hap on the behavior of MSCs. The first part of our work is to evaluate the behavior of WJ-MSCs into these hydrogels. Our results have shown that Alg/ Hap hydrogels not only possess better mechanical properties than Alg/HA hydrogels, but also promote the viability of MSCs and their differentiation from MSC seeded into the Alg/HA hydrogel. The sterilization method of biomaterial is an essential step, the multiple effects of which must be evaluated, in particular as regards the behavior of the cells, but also to maintain the integrity of the physicochemical properties of hydrogel. Thus, in a second part of this work, we showed that the autoclave sterilization treatment induced a negative effect on the initial characteristics of alginate hydrogel. It is also apparent from this investigation of the sterilization modes that the sterilization of hydrogels with UV is more efficient and makes it possible to preserve the specific properties of the hydrogel as best as possible, in particular Alg/HA. Finally, in a third part of our work, we also evaluated the evolution of the mechanical properties during the differentiation and the impact of these on the differentiation of MSCs and their immunomodulatory properties. From these results, we have shown that the physico-chemical characteristics of Alg / ha and Alg/hap hydrogels influence not only the differentiation potential of WJ-MSC but also the secretion of soluble factors involved in immunomodulation. Since these physicochemical properties are influenced by the sterilization process, it is advisable to take them into account in all stages of tissue engineering