Diese Arbeit verdeutlicht die Wirkung von Chondroitinsulfat auf die Synthese von Prostaglandin E2 in humanen mesenchymalen Stromazellen in Abhängigkeit ihres Sulfatierungsgrades. MSC zeichnen sich durch ihre antiinflammatorischen Eigenschaften aus und haben damit einen modulierenden Effekt auf Wundheilungsprozesse. Als Vorläuferzellen von Osteoblasten sind sie direkt an der Knochenneubildung beteiligt. Eine persistierende Entzündung hat eine kontinuierliche Freisetzung von Zytokinen, wie IL-1 zur Folge. Es konnte gezeigt werden, dass IL-1 in hMSC zu einer Freisetzung von PGE2 führt. Unter kurzzeitiger Wirkung stimuliert PGE2 die Knochenneubildung. Eine langanhaltende Präsenz leitet dagegen die Bildung des Faktors RANKL, einen die Osteoklastogenese stimulierenden Faktor, ein. Seit langem ist der positive Effekt von Chondroitinsulfat in chronischen Entzündungsprozessen, wie Rheumatoider Arthritis, bekannt. Zudem werden sie in aktuellen Studien als Beschichtungsbestandteile von Knochenimplantaten verwendet. Sie führten hier zu einer besseren Bioinduktivität und Biokonduktivität. Bisher ist dennoch der molekulare Wirkmechanismus nicht genau beschrieben. Die Schwierigkeit besteht darin, dass die molekularen Signalkaskaden für die einzelnen Kulturmoldelle Unterschiede aufweisen und kein ubiquitärer Mechanismus dargestellt wird. In hMSC führte die Stimulation mit IL-1 unter vorheriger Zugabe von Chondroitinsulfat zu einer Reduktion der PGE2 Freisetzung. Der Effekt des hochsulfatierten sCS3 war gegenüber dem nativen C4S verstärkt. Die reduzierende Wirkung von C4S setzte verzögert ein. Es ist bereits bekannt, dass die negative Ladung der CS zu einer Bindung von Zytokinen führt. Dadurch wird eventuell die Konzentration der Zytokine, wie IL-1 im Bereich der Zellrezeptoren erniedrigt und führt zu einer verringerten Stimulation der Zelle. Denkbar ist auch die Beeinflussung der intrazellulären Signaltransduktionskaskade durch die Bindung der CS an einen speziellen, bisher unbekannten, Membranrezeptor. Die entscheidenden Enzyme der PGE2 Synthese sind die Cyclooxygenase-2 (Cox-2) und die mikrosomale Prostaglandin E Synthase 1 (mPGES1). Die mRNA beider Enzyme war unabhängig vom Sulfatierungsgrad der CS reduziert. Dieser Effekt konnte auf Protein-ebene nicht belegt werden. Die produzierte Proteinmenge an mPGES1 wird durch IL-1 induziert, bleibt aber auch durch Zugabe von CS unverändert. Somit kann von einer erhöhten Translationseffizient und mRNA Stabilität der mPGES1 RNA ausgegangen werden. MAPK Kinasen sind entscheidende Schnittstellen bei der Regulation der mRNA Stabilität als auch der Aktivität von Transkriptionsfaktoren. In dieser Studie konnte die MAPK p38 als entscheidendes Enzym bei der Wirkung von CS auf die PGE2 Synthese ermittelt werden. Dabei führten sowohl das natürliche C4S als auch das hochsulfatierte sCS3 zu einer verringerten Aktivierung. Der Transkriptionsfaktor NfkB ist einer von mehreren, die an den Promotorbereichen der beiden induzierbaren PGE2 Enzyme, Cox-2 und mPGES1, binden. Es ist anzunehmen, dass die hier aufgezeigte verringerte Aktivität von NfkB als auch die verhinderte Translokation in den Zellkern eine reduzierte Transkription der jeweiligen mRNA bedingten. Abhängig vom untersuchten Modell und den verwendeten Kulturbedingungen können diese Prozesse moduliert sein. Die Erkenntnisse dieser experimentellen Arbeit liefern einen weiteren wichtigen Baustein zum Verständnis der molekularbiologischen Abläufe während entzündlicher Prozesse. Die Verwendung von Chondroitinsulfat, insbesondere hochsulfatiertes CS, in Kombination mit hMSC kann gezielt zu einer Verringerung der Entzündungsreaktion während der Implantateinheilung führen. Die durch PGE2 hervorgerufenen Symptome, wie erhöhte Gefäßpermeabilität, Schwellung und verstärktes Schmerzempfinden begründen diese positiven Effekte.

Tauopathien wie u.a. die Alzheimer-Demenz sind eine Gruppe neurodegenerativer Erkrankungen mit intrazellulärer Ablagerung des hyperphosphorylierten Tau-Proteins. Perineuronale Netze sind eine spezialisierte Form der extrazellulären Matrix im Zentralen Nervensystem. Sie bestehen u.a. aus Chondroitinsulfat-Proteoglykanen und Tenascin-R. Ziel der vorliegenden Arbeit war der Nachweis einer Protektion perineuronaler Netze vor Tau-Protein-Einlagerung. Zu Beginn wurde die Verteilung des Tau-Proteins und die verschiedenen Arten perineuonaler Netze in der Mauslinie C57Bl6 (Wildtyp) und deren Tenascin-R-Knockout beschrieben. Die Darstellung der Komponenten erfolgte mithilfe von Gefrierschnitten und Immunhistochemie. Um die Ausbreitung von Tau-Protein zu untersuchen, wurden organotypische Hirnschnittkulturen angelegt und markiertes Tau-Protein zugesetzt. Es wurden verschiedene Antikörper genutzt, welche bestimmte Seitenketten von Chondroitinsulfat-Proteoglykanen darstellen. Die Chondroitinsulfat-Seitenketten wurden mit dem Enzym Chondroitinase ABC entfernt, um deren Funktion zu untersuchen. Die Ergebnisse der Arbeit zeigten deutliche Unterschiede in der Verteilung von Tau-Protein. Es reicherte sich bei den Wildtypen und den Tenascin-R-Knockout-Mäusen diffus extrazellulär um Neuronen mit perineuronalen Netzen an. Im Unterschied dazu verteilte sich Tau-Protein nach der Abspaltung der Chondroitinsulfat-Seitenketten vom perineuronalen Netz gleichmäßig über die Schnittkultur ohne sich an perineuronalen Netzen anzureichern. Die vorliegende Arbeit stellt die neuroprotektive Funktion der perineuronalen Netze und insbesondere ihrer Chondroitinsulfat-Seitenketten gegenüber zugegebenem Tau-Protein heraus. Weiterhin weist sie den Verlust der neuroprotektiven Funktion gegenüber zugegebenem Tau-Protein nach Behandlung mit Chondroitinase ABC nach.

Diese Arbeit verdeutlicht die Wirkung von Chondroitinsulfat auf die Synthese von Prostaglandin E2 in humanen mesenchymalen Stromazellen in Abhängigkeit ihres Sulfatierungsgrades. MSC zeichnen sich durch ihre antiinflammatorischen Eigenschaften aus und haben damit einen modulierenden Effekt auf Wundheilungsprozesse. Als Vorläuferzellen von Osteoblasten sind sie direkt an der Knochenneubildung beteiligt. Eine persistierende Entzündung hat eine kontinuierliche Freisetzung von Zytokinen, wie IL-1 zur Folge. Es konnte gezeigt werden, dass IL-1 in hMSC zu einer Freisetzung von PGE2 führt. Unter kurzzeitiger Wirkung stimuliert PGE2 die Knochenneubildung. Eine langanhaltende Präsenz leitet dagegen die Bildung des Faktors RANKL, einen die Osteoklastogenese stimulierenden Faktor, ein. Seit langem ist der positive Effekt von Chondroitinsulfat in chronischen Entzündungsprozessen, wie Rheumatoider Arthritis, bekannt. Zudem werden sie in aktuellen Studien als Beschichtungsbestandteile von Knochenimplantaten verwendet. Sie führten hier zu einer besseren Bioinduktivität und Biokonduktivität. Bisher ist dennoch der molekulare Wirkmechanismus nicht genau beschrieben. Die Schwierigkeit besteht darin, dass die molekularen Signalkaskaden für die einzelnen Kulturmoldelle Unterschiede aufweisen und kein ubiquitärer Mechanismus dargestellt wird. In hMSC führte die Stimulation mit IL-1 unter vorheriger Zugabe von Chondroitinsulfat zu einer Reduktion der PGE2 Freisetzung. Der Effekt des hochsulfatierten sCS3 war gegenüber dem nativen C4S verstärkt. Die reduzierende Wirkung von C4S setzte verzögert ein. Es ist bereits bekannt, dass die negative Ladung der CS zu einer Bindung von Zytokinen führt. Dadurch wird eventuell die Konzentration der Zytokine, wie IL-1 im Bereich der Zellrezeptoren erniedrigt und führt zu einer verringerten Stimulation der Zelle. Denkbar ist auch die Beeinflussung der intrazellulären Signaltransduktionskaskade durch die Bindung der CS an einen speziellen, bisher unbekannten, Membranrezeptor. Die entscheidenden Enzyme der PGE2 Synthese sind die Cyclooxygenase-2 (Cox-2) und die mikrosomale Prostaglandin E Synthase 1 (mPGES1). Die mRNA beider Enzyme war unabhängig vom Sulfatierungsgrad der CS reduziert. Dieser Effekt konnte auf Protein-ebene nicht belegt werden. Die produzierte Proteinmenge an mPGES1 wird durch IL-1 induziert, bleibt aber auch durch Zugabe von CS unverändert. Somit kann von einer erhöhten Translationseffizient und mRNA Stabilität der mPGES1 RNA ausgegangen werden. MAPK Kinasen sind entscheidende Schnittstellen bei der Regulation der mRNA Stabilität als auch der Aktivität von Transkriptionsfaktoren. In dieser Studie konnte die MAPK p38 als entscheidendes Enzym bei der Wirkung von CS auf die PGE2 Synthese ermittelt werden. Dabei führten sowohl das natürliche C4S als auch das hochsulfatierte sCS3 zu einer verringerten Aktivierung. Der Transkriptionsfaktor NfkB ist einer von mehreren, die an den Promotorbereichen der beiden induzierbaren PGE2 Enzyme, Cox-2 und mPGES1, binden. Es ist anzunehmen, dass die hier aufgezeigte verringerte Aktivität von NfkB als auch die verhinderte Translokation in den Zellkern eine reduzierte Transkription der jeweiligen mRNA bedingten. Abhängig vom untersuchten Modell und den verwendeten Kulturbedingungen können diese Prozesse moduliert sein. Die Erkenntnisse dieser experimentellen Arbeit liefern einen weiteren wichtigen Baustein zum Verständnis der molekularbiologischen Abläufe während entzündlicher Prozesse. Die Verwendung von Chondroitinsulfat, insbesondere hochsulfatiertes CS, in Kombination mit hMSC kann gezielt zu einer Verringerung der Entzündungsreaktion während der Implantateinheilung führen. Die durch PGE2 hervorgerufenen Symptome, wie erhöhte Gefäßpermeabilität, Schwellung und verstärktes Schmerzempfinden begründen diese positiven Effekte.

Eine bevorzugte Zellquelle für den Einsatz im Tissue Engineering sind mesenchymale Stammzellen (MSZ). Diese besitzen, neben einer hohen Proliferationsrate, die Fähigkeit, sich in verschiedene Zellen des mesodermen Ursprungs und in die entsprechenden Gewebetypen zu entwickeln. Um ein funktionales Gewebe zu erhalten ist es Ziel, sich bereits in vitro den in vivo Bedingungen anzunähern. Hierbei spielen neben der dreidimensionalen Struktur der Scaffolds auch die biochemische Mikroumgebung der Zellen in Form der unlöslichen extrazellulären Matrix (EZM) und den löslichen Mediatorproteinen wie Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, sowie die physikalische Stimulation der Zellen eine wichtige Rolle. Während sich gegenwärtige Untersuchungen im TE vorwiegend mit den alleinigen Einflussfaktoren beschäftigen, verfolgt die vorliegende Arbeit das Ziel, die Auswirkungen kombinierter Stimuli durch Verwendung einer artifiziellen EZM, bestehend aus definierten Komponenten der nativen EZM, und physikalischer Stimuli durch elektrische Felder zu untersuchen. Letzteres erfolgte mit einem innerhalb der Arbeitsgruppe neu entwickelten System, dass die Stimulation von Zellen mit ausschließlich elektrischen Feldern, ohne störende Nebeneinflüsse, erlaubt.

Eine bevorzugte Zellquelle für den Einsatz im Tissue Engineering sind mesenchymale Stammzellen (MSZ). Diese besitzen, neben einer hohen Proliferationsrate, die Fähigkeit, sich in verschiedene Zellen des mesodermen Ursprungs und in die entsprechenden Gewebetypen zu entwickeln. Um ein funktionales Gewebe zu erhalten ist es Ziel, sich bereits in vitro den in vivo Bedingungen anzunähern. Hierbei spielen neben der dreidimensionalen Struktur der Scaffolds auch die biochemische Mikroumgebung der Zellen in Form der unlöslichen extrazellulären Matrix (EZM) und den löslichen Mediatorproteinen wie Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, sowie die physikalische Stimulation der Zellen eine wichtige Rolle. Während sich gegenwärtige Untersuchungen im TE vorwiegend mit den alleinigen Einflussfaktoren beschäftigen, verfolgt die vorliegende Arbeit das Ziel, die Auswirkungen kombinierter Stimuli durch Verwendung einer artifiziellen EZM, bestehend aus definierten Komponenten der nativen EZM, und physikalischer Stimuli durch elektrische Felder zu untersuchen. Letzteres erfolgte mit einem innerhalb der Arbeitsgruppe neu entwickelten System, dass die Stimulation von Zellen mit ausschließlich elektrischen Feldern, ohne störende Nebeneinflüsse, erlaubt.:1 Einleitung und Zielstellung 2 Theoretische Grundlagen 2.1 Der Knochen 2.1.1 Allgemeine Biologie und Physiologie des Knochengewebes 2.1.2 Knochenersatzmaterialien 2.2 Tissue Engineering von Knochengewebe 2.2.1 Trägermaterialien für das TE von Knochen 2.2.2 Zellen für das TE von Knochen 2.2.3 Artifizielle extrazelluläre Matrizes für das TE von Knochen 2.3 Einfluss elektrischer Felder auf Knochenumbauprozesse 2.3.1 Methoden zur Applikation von elektrischen Feldern 2.3.2 In vitro Untersuchungen zum Einfluss elektrischer Felder 2.3.3 Methode der Transformator-ähnlichen Einkopplung (TC) 3 Materialien 3.1 Technische Hilfsmittel und Geräte 3.2 Verbrauchsmaterialien 3.3 Chemikalien, Reagenzien und Kits 3.4 Antikörper 3.5 Oligonukleotide 3.6 Puffer-, Medien- und Lösungszusammensetzungen 3.7 Zellen 4 Methoden 4.1 Polycaprolacton-Co-Lactid (PCL)-Scaffolds 4.1.1 Präparation und Hydrophilisierung der PCL-Scaffolds 4.1.2 Beschichtung der PCL-Scaffolds 4.1.3 Charakterisierung der Beschichtung auf den PCL-Scaffolds 4.2 Zellkulturtechniken 4.2.1 Auftauen und Subkultivierung 4.2.2 Einfrieren 4.2.3 Induktion der osteogenen Differenzierung 4.2.4 Induktion der adipogenen Differenzierung 4.2.5 Induktion der chondrogenen Differenzierung 4.2.6 Besiedlung und Kultivierung der Zell-Matrix-Konstrukte 4.2.7 Elektrische Stimulation der Zell-Matrix-Konstrukte 4.2.8 Blockierung definierter Signaltransduktionswege 4.3 Mikroskopische Analytik der Zellen 4.3.1 Darstellung der Zellverteilung mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) 4.3.2 Qualitative Bestimmung von Fetttröpfchen mittels Oil-Red-O Färbung 4.3.3 Qualitative Bestimmung der Mineralisierung mittels vonKossa- Färbung 4.4 Durchflusszytometrie 4.5 Biochemische Analytik der Zellen 4.5.1 Bestimmung der Zellzahl mittels Lactatdehydrogenase (LDH)- Aktivität 4.5.2 Bestimmung der alkalische Phosphatase (ALP)-Aktivität 4.5.3 Quantitative Bestimmung des Kalziumgehaltes 4.6 Molekularbiologische Analytik / Genexpressionsanalyse 4.6.1 RNA Extraktion 4.6.2 cDNA-Synthese / Reverse Transkriptase PCR (RT-PCR) 4.6.3 Amplifikation von cDNA mittels quantitativer Real-Time PCR (qPCR) 4.7 Statistische Auswertung 5 Weiterentwicklung der Kammer zur TC-Einkopplung 5.1 Grundlegende theoretische Betrachtungen zur TC-Einkopplung 5.1.1 Ersatzschaltbild der TC-Einkopplung 5.1.2 Abschätzung des Eisenkernquerschnitts 5.1.3 Einfluss der Primärwindungszahl 5.2 Neudimensionierung und Aufbau der Stimulationseinrichtung 5.3 Verlauf der elektrischen Größen 5.3.1 Simulation 5.3.2 Messung 5.3.3 Abschätzung des magnetischen Feldes in der Kammer 5.4 Zusammenfassung 6 Zellexperimentelle Ergebnisse 6.1 Charakterisierung der humanen MSZ nach in vitro Kultivierung 6.1.1 Morphologie 6.1.2 Phänotypische Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie 6.1.3 Multipotentes Differenzierungspotential 6.2 Zellverhalten auf den unbeschichteten PCL-Scaffolds 6.2.1 Ermittlung eines geeigneten Besiedlungsregimes 6.2.2 Zellverteilung und Proliferation der MSZ 6.2.3 Osteogene Differenzierung der MSZ 6.3 Einfluss der aEZM auf das Zellverhalten von MSZ 6.3.1 Quantitative Bestimmung der aEZM-Komponenten 6.3.2 Einfluss der aEZM auf die Adhärenz und Proliferation von MSZ 6.3.3 Einfluss der aEZM auf die osteogene Differenzierung von MSZ 6.4 Einfluss elektrischer Felder auf das Zellverhalten von MSZ 6.4.1 Einfluss der elektrischen Felder auf die Proliferation und osteogene Differenzierung von MSZ 6.4.2 Einfluss elektrischer Felder in Kombination mit Koll/sHya enthaltenden aEZM auf die Proliferation und osteogene Differenzierung von MSZ 6.4.3 Untersuchungen zu möglichen Signaltransduktionswegen 7 Diskussion der Ergebnisse 7.1 Charakterisierung der humanen MSZ nach in vitro Kultivierung 7.2 Zellverhalten auf den unbeschichteten PCL-Scaffolds 7.3 Einfluss der aEZM auf das Zellverhalten von MSZ 7.4 Einfluss elektrischer Felder auf das Zellverhalten von MSZ 8 Zusammenfassung und Ausblick Literaturverzeichnis Danksagung Eigene Publikationen und Mitautorschaften A Zusatzinformationen für die quantitative RT-PCR A.1 Versuchsdesign der Genexpressionsanalysen A.2 Qualitätskontrolle der isolierten RNA

In drei inhaltlich abgeschlossen Teilen werden Fragestellungen bearbeitet, die sich mit dem Einsatz von Polyhydroxybutyraten als Scaffoldmaterialien für das Tissue Engioneering von Knochen beschäftigen. Zunächst wird ein Prozess optimiert, in dem mittels Verpressen und Auslösen von Platzhaltern (Porogen) poröse Träger (Scaffolds) aus Poly-3-hydroxybuttersäure (P3HB) sowie aus P3co4HB hergestellt werden. Diese Scaffolds werden in der Folge mechanisch und strukturell charakterisiert, wobei Druckfestigkeit, Dauerfestigkeit und Viskoelastizität untersucht werden. Im Ergebnis finden sich mehrere Kandidaten, die für die weitere Testung im Tierversuch in Frage kommen. Weiter wird das Abbauverhalten von schmelzgeponnenen P3HB-Fäden untersucht. Dabei wird ein beschleunigtes Modellsystem gewählt, das noch möglichst nahe am physiologischen Fall aber ohne biologisch aktive Komponente (zB. Enzyme) definiert wurde. Die Charakterisierung bedient sich hier der Gelpermeationschromatographie (GPC), des gasgestützten Elektronenrastermikroskops (ESEM), der differentiellen Thermoanalyse (DSC) und der Rasterkraftmikroskopie. Als Ergebnis zeichnete sich ab, dass neben der hydrolytischen Degradation im Gegensatz zu PHB mit kleinerer spezifischer Oberfläche bei den Fäden auch Erosion zum Abbau beiträgt. Eine partikuläre Freisetzung wird nicht beobachtet. Im dritten Teil werden textile Scaffolds aus P3HB mit einer künstlichen extrazellulären Matrix aus Chondroitinsulfaten (CS) und Kollagen versehen. Dem CS kann hier ein positiver Einfluss auf die osteogene Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) nachgewiesen werden. Dies wird zum einen durch die verstärkte Expression der alkalischen Phosphatase (ALP) sowie durch die Hochregulation von Proteinen ersichtlich, die bei der osteogenen Differenzierung essentiell sind. In wenigen Gene-Arrays lässt sich ebenfalls erkennen, dass die osteogene Differenzierung durch CS positiv beeinflusst wird. Insbesondere frühe Marker wie ZBTB16 und IGFBPs werden hier identifiziert. Basierend auf den Teilergebnissen wird am Ende ein Beitrag geliefert, der das Tissue Engineering insbesondere für überkritische Röhrenknochendefekte als Methode interessant erscheinen lässt. Dabei werden mechanische Lasten durch konventionelle Fixateure aufgenommen und der Defektraum durch den mehrfachen Einsatz von bio-funktionalisierten flachen Scaffolds gefüllt.

In drei inhaltlich abgeschlossen Teilen werden Fragestellungen bearbeitet, die sich mit dem Einsatz von Polyhydroxybutyraten als Scaffoldmaterialien für das Tissue Engioneering von Knochen beschäftigen. Zunächst wird ein Prozess optimiert, in dem mittels Verpressen und Auslösen von Platzhaltern (Porogen) poröse Träger (Scaffolds) aus Poly-3-hydroxybuttersäure (P3HB) sowie aus P3co4HB hergestellt werden. Diese Scaffolds werden in der Folge mechanisch und strukturell charakterisiert, wobei Druckfestigkeit, Dauerfestigkeit und Viskoelastizität untersucht werden. Im Ergebnis finden sich mehrere Kandidaten, die für die weitere Testung im Tierversuch in Frage kommen. Weiter wird das Abbauverhalten von schmelzgeponnenen P3HB-Fäden untersucht. Dabei wird ein beschleunigtes Modellsystem gewählt, das noch möglichst nahe am physiologischen Fall aber ohne biologisch aktive Komponente (zB. Enzyme) definiert wurde. Die Charakterisierung bedient sich hier der Gelpermeationschromatographie (GPC), des gasgestützten Elektronenrastermikroskops (ESEM), der differentiellen Thermoanalyse (DSC) und der Rasterkraftmikroskopie. Als Ergebnis zeichnete sich ab, dass neben der hydrolytischen Degradation im Gegensatz zu PHB mit kleinerer spezifischer Oberfläche bei den Fäden auch Erosion zum Abbau beiträgt. Eine partikuläre Freisetzung wird nicht beobachtet. Im dritten Teil werden textile Scaffolds aus P3HB mit einer künstlichen extrazellulären Matrix aus Chondroitinsulfaten (CS) und Kollagen versehen. Dem CS kann hier ein positiver Einfluss auf die osteogene Differenzierung von humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) nachgewiesen werden. Dies wird zum einen durch die verstärkte Expression der alkalischen Phosphatase (ALP) sowie durch die Hochregulation von Proteinen ersichtlich, die bei der osteogenen Differenzierung essentiell sind. In wenigen Gene-Arrays lässt sich ebenfalls erkennen, dass die osteogene Differenzierung durch CS positiv beeinflusst wird. Insbesondere frühe Marker wie ZBTB16 und IGFBPs werden hier identifiziert. Basierend auf den Teilergebnissen wird am Ende ein Beitrag geliefert, der das Tissue Engineering insbesondere für überkritische Röhrenknochendefekte als Methode interessant erscheinen lässt. Dabei werden mechanische Lasten durch konventionelle Fixateure aufgenommen und der Defektraum durch den mehrfachen Einsatz von bio-funktionalisierten flachen Scaffolds gefüllt.:1. Vorwort 3 2. Allgemeine Einführung 5 2.1 Der Knochen 5 2.1.1 Die Knochenbildung 5 2.1.2 Zur Anatomie und Physiologie des Knochens 7 2.2 Tissue Engineering 11 2.2.1 Zelltypen für das Tissue Engineering von Knochen 12 2.2.2 Scaffold Design im Tissue Engineering von Knochen 13 2.3 Polyhydroxyalkanoate 13 2.4 Tissue Engineering am Röhrenknochen 16 2.4.1 Poly(3-hydroxybutyrat)-Scaffolds für das Tissue Engineering von Knochenersatz 17 2.4.2 Matrix Engineering 18 2.5 Ziel der Arbeit 19 3. Mechanik poröser PHB-Scaffolds 21 3.1 Einleitung 21 3.2 Materialien und Methoden 23 3.2.1 Polyhydroxybutyrate und Porogene 23 3.2.2 Uniaxiales Heißpressen 24 3.2.3 Mikrographie 26 3.2.4 Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) 26 3.2.5 Mechanische Druckversuche 26 3.2.6 Mikrocomputertomographie (μCT) 27 3.2.7 Zellviabilität auf den Scaffolds 28 3.3 Ergebnisse 29 3.3.1 Mikrographie 29 3.3.2 Mikrocomputertomographie (μCT) 33 3.3.3 Druckversuche 37 3.3.4 Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) 40 3.3.5 Zellviabilität 40 3.4 Diskussion 40 3.5 Schlussfolgernde Zusammenfassung 46 4. Degradation von P3HB-Fasern 47 4.1 Degradation von Polyhydroxyalkanoaten 47 4.2 Materialien und Methoden 49 4.2.1 Herstellung und Vorbehandlung textiler P3HB-Konstrukte 49 4.2.2 Mechanische Prüfung 50 4.2.3 Beschleunigte Degradation 50 4.2.4 Untersuchung der Oberfläche 50 4.2.5 Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) 51 4.2.6 Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) 51 4.3 Ergebnisse 52 4.3.1 Mechanische Tests 52 4.3.2 Die Charakterisierung der Oberfläche 52 4.3.3 Thermische Fasereigenschaften.55 4.3.4 Untersuchung der Molekulargewichte in der GPC 58 4.4 Diskussion 60 4.5 Schlussfolgernde Zusammenfassung 64 5. hMSC auf textilen Scaffolds 67 5.1 Einleitung 67 5.2 Material und Methoden 68 5.2.1 Erzeugung der P3HB-Scaffolds 68 5.2.2 Die Immobilisierung der EZM-Komponenten auf den Scaffolds 69 5.2.3 Isolation, Vorkultur, Besiedlung und Kultur der humanen mesenchymalen Vorläuferzellen 69 5.2.4 Kombinierte Bestimmung von ALP, MTT und Proteingehalt 71 5.2.5 Mikroskopische Untersuchungen 72 5.2.6 Nachweis der Kalziummineralisierung 73 5.2.7 Quantitative real time reverse transcribing polymerase chain reaction (rt-PCR) 73 5.2.8 cRNA Microarray-Untersuchung 74 5.2.9 Zusätzliche Experimente 75 5.3 Ergebnisse 76 5.3.1 Vorhergehende Untersuchung 76 5.3.2 Rasterelektronen-Mikroskopie 77 5.3.3 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie 79 5.3.4 ALP-Aktivität, SDH-Aktivität und Proteingehalt 82 5.3.5 Mineralisierende Kalziumabscheidung 86 5.3.6 rt-PCR 87 5.3.7 cRNA Microarray-Untersuchung 90 5.3.8 Kulturen von hMSC mit Chondroitinsulfat als gelöstem Zusatz 93 5.4 Diskussion 93 5.5 Schlussfolgernde Zusammenfassung 98 6. Zusammenfassung 101

The aim of this pilot study was to evaluate the bioactive, surface-coated polycaprolactone-co-lactide scaffolds as bone implants in a tibia critical size defect model. Polycaprolactone-co-lactide scaffolds were coated with collagen type I and chondroitin sulfate and 30 piled up polycaprolactone-co-lactide scaffolds were implanted into a 3 cm sheep tibia critical size defect for 3 or 12 months (n¼5 each). Bone healing was estimated by quantification of bone volume in the defects on computer tomography and microcomputer tomography scans, plain radiographs, biomechanical testing as well as by histological evaluations. New bone formation occurred at the proximal and distal ends of the tibia in both groups. The current pilot study revealed a mean new bone formation of 63% and 172% after 3 and 12 months, respectively. The bioactive, surface coated, highly porous three-dimensional polycaprolactone-co-lactide scaffold stack itself acted as a guide rail for new bone formation along and into the implant. These preliminary data are encouraging for future experiments with a larger group of animals.

Collagen and glycosaminoglycans, such as hyaluronan and chondroitin sulfate, are the major components of bone extracellular matrix, and extracellular matrix composites are being evaluated for a wide range of clinical applications. The molecular and cellular effects of native and sulfatemodified glycosaminoglycans on osteocytes were investigated as critical regulators of bone remodeling. The effects of glycosaminoglycans on viability, necrosis, apoptosis, and regulation of gene expression were tested in two osteocyte-like cell lines, the murine MLO-Y4 and the rat UMR 106-01 cells. Glycosaminoglycans were non-toxic and incorporated by osteocytic cells. In MLO-Y4 cells, sulfation of glycosaminoglycans led to a significant inhibition of osteocyte apoptosis, 42% inhibition for highly sulfated chondroitin sulfate and 58% for highly sulfated hyaluronan, respectively. Cell proliferation was not affected. While treatment with highly sulfated chondroitin sulfate increased cell viability by 20% compared to the native chondroitin sulfate. In UMR 106- 01 cells, treatment with highly sulfated hyaluronan reduced the receptor activator of nuclear factor-κB ligand/osteoprotegerin ratio by 58% compared to the non-sulfated form, whereas highly sulfated chondroitin sulfate led to 60% reduction in the receptor activator of nuclear factor-κB ligand/osteoprotegerin ratio in comparison to the native chondroitin sulfate. The expression of SOST, the gene encoding sclerostin, was reduced by 50% and 45% by highly sulfated hyaluronan and chondroitin sulfate, respectively, compared to their native forms. The expression of BMP- 2, a marker of osteoblast differentiation, was doubled after treatment with the highly sulfated hyaluronan in comparison to its native form. In conclusion, highly sulfated glycosaminoglycans inhibit osteocyte apoptosis in vitro and promote an osteoblast-supporting gene expression profile.