Made available in DSpace on 2013-08-07T19:04:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000383317-Texto+Completo-0.pdf: 533302 bytes, checksum: d1c54ea34e0bdbcdd31f54bbce98b274 (MD5) Previous issue date: 2006 / Theoretical basis – Severe obstructive carotid artery disease is related to atherosclerosis (ATC). Mechanisms of inflammation and self-immunity may have influence on the occurrence of ATC. This includes antiphospholipid antibodies (AAP), antiphospholipid syndrome markers (APS) and antibodies against heat shock proteins (anti-Hsp). A beta 2-glycoprotein I (beta2-gpI) and the 60 and 65 kilodaltons (kDa) Hsp are molecules present in atherosclerotic plaques. This is the first report including research on IgA anticardiolipin (aCL), IgG/IgM/IgA anti-beta2- glycoprotein I and anti-HSP in severe obstructive carotid artery disease cases. Objective – To determine the association, if any, between the presence of AAP/anti-Hsp and the occurrence of severe obstructive carotid artery disease. Patients and Methods – In our control case study the cases consisted of patients with either symptomatic or asymptomatic severe obstructive carotid artery disease. The presence of the disease was determined by anamnesis, physical examination, MR angiography (MRA) and carotid endarterectomy. The control group consisted of patients admitted to orthopedic wards. Both groups were assessed for risk factors: age, sex, race, hypertension, smoking, diabetes mellitus (DM) and hypercholesterolemy. IgG/IgM/IgA aCL, IgG/IgM/IgA anti-beta2-gpI, IgG anti-Hsp 60 kDa recombinant human and IgG anti-Hsp 65 kDa of Mycobacterium bovis antibodies were detected by enzymatic test. In order to assess the degree of association between antibodies with severe obstructive carotid artery disease, (odds ratios, OR) were calculated with their respective confidence intervals (IC 95%).Logistic regression was used to adjust the confusion factors. Results – 57 case patients and 93 control patients were studied and the average age was 66 + 8. 7 years for case patients and 47. 5 + 18. 8 years for control patients (P<0. 001). There was a predominance of black race individuals in the control group. Most case patients were male individuals (61. 4%), but there were less male individuals (49. 5%) among control patients. The presence of hypertension (OR=21. 0; IC 95% 8. 0 to 57. 1; P<0. 001) and hypercholesterolemy (OR=25. 5; IC 95% 9. 5 to 70. 9; P<0,001) determined the strongest associations between the risk factors already known and severe obstructive carotid artery disease. IgA antibeta2-gpI antibodies were detected in 33. 3% of the case patients and in 9. 7% of the control patients (OR adjusted 4. 7; IC 95% 1. 0 to 23. 7; P=0. 06). The frequency of other non-tested antibodies was not significantly different in cases and controls. Conclusion – No association was found between the presence of aCL, IgG/IgM antibeta2-gpI, anti-Hsp and the occurrence of severe obstructive carotid artery disease. The presence of IgA antibeta2-gpI antibodies was found to be an independent risk factor for severe obstructive carotid artery disease (OR adjusted 4. 7), although with borderline significance (P=0,06). The association of IgA antibeta2-gpI with severe obstructive carotid artery disease may be one of the links between auto-immunity and carotid. / Base teórica - A doença obstrutiva severa de artérias carótidas (DOSAC) está relacionada à aterosclerose (ATC). Mecanismos de inflamação e auto-imunidade podem influenciar o deflagramento da ATC. Neste contexto, incluem-se anticorpos antifosfolípides (AAF), marcadores da síndrome antifosfolipídica (SAF) e anticorpos contra proteínas de choque térmico (anti-Hsp). A beta2-glicoproteína I (beta2-gpI) e as Hsp de 60 e 65 kilodaltons (kDa) são moléculas encontradas em ateromas. O relato é o primeiro a incluir a pesquisa de IgA anticardiolipina (aCL), IgG/IgM/IgA antibeta2-gpI e anti-HSP em casuísticas de DOSAC. Objetivo - Avaliar a associação, se alguma, entre ocorrência de AAF/anti-Hsp e DOSAC. Pacientes e Métodos - Neste estudo de caso-controle, os casos consistiram de uma população de pacientes com DOSAC (sintomática ou assintomática). A presença de DOSAC foi definida pela anamnese, exame físico, angiografia por ressonância nuclear magnética (ARM) e endarterectomia de carótida. Os controles foram selecionados de enfermarias de ortopedia. Ambos os grupos foram avaliados quanto aos fatores de risco: idade, sexo, raça, hipertensão arterial sistêmica (HAS), tabagismo, diabete mellitus (DM) e hipercolesterolemia. Anticorpos IgG/IgM/IgA aCL, IgG/IgM/IgA antibeta2-gpI, IgG anti-Hsp 60 kDa humana recombinante e IgG anti-Hsp 65 kDa de Mycobacterium bovis foram detectados através de ensaio enzimático. Para estimar o grau de associação dos anticorpos com DOSAC, razão de chances (odds ratios, OR) foram calculadas com seus respectivos IC 95%.Regressão logística foi utilizada para ajuste de fatores de confusão. Resultados - Entre os 57 casos e 93 controles estudados, a média de idade foi de 66 + 8,7 anos nos casos e de 47,5 + 18,8 anos nos controles (P<0,001). A raça negra predominou no grupo controle. O sexo masculino foi mais freqüente nos casos (61,4%), situação que se inverteu nos controles (49,5%). As presenças de HAS (OR=21,0; IC95% 8,0 a 57,1; P<0,001) e de hipercolesterolemia (OR=25,5; IC95% 9,5 a 70,9; P<0,001) determinaram, entre os fatores de risco conhecidos, as mais fortes associações com DOSAC. Anticorpos IgA antibeta2-gpI foram detectados em 33,3% dos casos e em 9,7% dos controles (OR ajustado 4,7; IC95% 1,0 a 23,7; P=0,06). A freqüência dos outros anticorpos testados não diferiu significantemente em casos e controles. Conclusão - Não houve associação entre ocorrência de aCL, IgG/IgM antibeta2- gpI, anti-Hsp e desfecho DOSAC. A presença de anticorpos IgA antibeta2-gpI se configurou como fator de risco independente para DOSAC (OR ajustado 4,7), embora com significância limítrofe (P=0,06). A associação de IgA antibeta2-gpI com DOSAC pode representar um dos elos na relação auto-imunidade e aterosclerose carotídea.

Situações de estresse metabólico e térmico deflagram a expressão celular e liberação para o plasma, de proteínas de choque térmico da família de 70 kDa (HSP70) para desempenhar função de defesa-chave em um processo conhecido como resposta ao choque térmico ou ao estresse, que as caracterizam como proteína citoprotetora. Estudos indicam a ocorrência de HSP70 extracelular (eHSP70) na circulação por até 24 h após desafios como o exercício físico, cuja liberação dá-se por tecidos do território hepatoesplâncnico, em uma resposta mediada por receptores α-adrenérgicos. Esta liberação de HSP70 para o plasma é atenuada pela ingestão de glicose. Estas evidências levaram-nos a supor que a liberação de eHSP70 em resposta ao estresse possa ter um papel fisiológico na regulação da glicemia, a qual é afetada por estímulo simpático. Neste trabalho, os resultados dos experimentos in silico indicaram a possibilidade de ancoragem e interação estável entre a HSP70 e a molécula de insulina. Ensaios de imunoprecipitação de insulina com amostras de plasma de animais submetidos ao tratamento de insulina Regular e Detemir revelaram HSP70 coimunoprecipitada especialmente em situação de jejum severo. Parte destas amostras foi submetida à quantificação de glicemia, insulinemia e HSP72 circulante, cujos resultados evidenciam elevada concentração desta proteína de choque térmico por ocasião de hipoglicemia induzida por insulina. Parte dos estudos in vivo deste trabalho foram desenvolvidos com ratos submetidos ao choque térmico agudo (uma sessão de 15 minutos) com hipertermia induzida (41,5 °C) ou com injeção de HSP70 (HSPA1A) exógena, com grupos experimentais organizados em grupos Controle (C) e Choque Térmico (HS) e, em tempos experimentais: imediatamente (tempo zero), 6, 12 e 24 h pós-choque. Foi observada a ocorrência das formas constitutiva e induzível de eHSP70 no plasma de animais submetidos ao choque térmico com valor maior nos períodos de 12 e 24 h pós-choque. Nossos estudos mostram que, in vivo, a eHSP70 plasmática produz alteração na tolerância à glicose, com maior hiperglicemia, quando o teste é realizado 12 h após o choque térmico. Este efeito foi bloqueado pela administração (i.p.) de anticorpo anti-HSP70 e se mostrou independente da síntese de novo de HSP70. Ainda, a presença de eHSP70 plasmática (induzida por choque térmico ou administrada via endovenosa) causa menor captação de glicose pelo músculo esquelético. Ensaios com músculo isolado indicam que o efeito inibidor da eHSP70 sobre a captação de glicose é dependente de insulina. Apesar das evidências de que a ligação HSP70-insulina no plasma tenha implicação sobre a oferta de glicose, não se pode descartar também a possibilidade de que as ações da eHSP70 estejam ocorrendo pela sua ligação a receptores específicos, e/ou de que sejam parte de uma resposta ao estresse na qual estejam implicados os hormônios contrarregulatórios. Em suma, os resultados indicam que a eHSP70 plasmática é capaz de se ligar- à insulina, provocar tolerância alterada à glicose e diminuir a captação de glicose pelo músculo esquelético, aumentando a disponibilidade de glicose circulante. / Metabolically stressful situations trigger the expression and release of the 70 kDa (HSP70) as an essential protective response, in a process known as heat shock (HS) response or stress response. HSP70 is characterized as cytoprotector entities. Previous studies indicate the occurrence of extracellular HSP70 (eHSP70) in the circulation up to 24 h after stressful challenges, such as physical exercise, and that such eHSP70 liberation comes from hepatosplancnic tissues, in an 1-adrenergic dependent response, which is attenuated by glucose ingestion. The above findings led us to suppose that stress-elicited eHSP70 release could play a physiological role on glycemic control, which are affected by sympathetic stimuli. In this work, in silico experiments indicated the possibility of docking and stable interaction between HSP70 and the insulin molecule. Immunoprecipitation of plasma samples revealed that HSP70 co-immunoprecipitates with insulin, especially under severe fast. Part of these samples was subjected to quantification of glucose, insulin and circulating HSP72, whose results show high concentration of heat shock protein during severe hypoglycemia induced by insulin. Part of the in vivo studies from this work were also carried out in healthy rats submitted to an acute (15 min) HS (41.5 °C) session or in HSP70 (HSPA1A)-injected rats, assigned into control (C) and HS groups which were observed immediately and after 6, 12 and 24 h post-shock. Both the constitutive (predominantly) and the inducible forms of eHSP70 were observed in the plasma of heat shocked animals, being the times 12 and 24 h those in which the highest concentrations were noted. Our studies suggest that in vivo produces eHSP70 change in plasma glucose tolerance, greater hyperglycemia when glucose tolerance test is performed 12 h after heat shock, and this effect was abrogated by anti-HSP70 antibody administration (i.p.) and independent of de novo synthesis of HSP70. Moreover, the presence of eHSP70 (HS-induced or injected) in the plasma or in soleus muscle incubations elicits lower glucose uptake from the skeletal muscle. Isolated muscle studies indicate that eHSP70 inhibiting effect over glucose uptake is insulin-dependent. However, although evidence suggests a role for HSP70 binding to insulin over glucose offering, it cannot be discarded the possibility that eHSP70 actions are due to their binding to specific HSP70 membrane receptors within the muscle cell, and/or that are part of a stress response in which the counter-regulatory hormone are involved. In short, the results indicate that eHSP70 plasma is able to bind to insulin, causing impaired glucose tolerance and decrease glucose uptake by skeletal muscle, increasing blood glucose availability.

A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores e situações onde é comum que proteínas sofram ação de agentes oxidantes. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Para investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. Uma vez que estes resultados não concordam com as vias de sinalização ativadas classicamente por HSP70, via receptor TLR4, observamos uma nova interação com o receptor dos produtos finais de glicação avançada em um modelo de cultura de células A549 através de sondas fluorescentes. A quantificação do experimento mostrou um maior número de interações quando as células são tratadas com HSP70 na sua conformação ligada à ATP em comparação com o tratamento com HSP70 na sua conformação ligada à ADP; e, através de sucessivos experimentos de docking molecular propusemos um modelo putativo para a interação. Além disso, mostramos que na conformação ligada à ADP, a HSP70 interage preferencialmente com TLR4, de forma similar ao peptídeo MD-2, necessário para o reconhecimento de LPS, sugerindo que a chaperona atue como uma molécula acessória ou como citocina, dependendo do receptor e da situação patológica ou fisiológica. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli and conditions where is common to proteins to suffer the action of oxidative agents. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70. We observed that the Oxidation of HSP70 altered its protein structure; and that macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability. As these results do not concur with the signaling pathways classically activated by HSP70, via TLR4, we observed a new interaction with the receptor for advanced glycation end products through fluorescent probes in a A549 cell culture model. Quantification of the experiment showed a higher number of interactions when cells are treated with HSP70 bound to ATP when compared to the treatment with HSP70 in the conformation ADP-bound; and, by successive molecular docking experiments, we proposed a putative model for such interaction. Moreover, we showed that on its ADP-bound conformation, HSP70 binds preferentially to TLR4, in a similar way as the peptide MD-2, necessary for the recognizing of LPS, suggesting that the chaperone could act as an accessory molecule or as a cytokine, depending on the receptor and physiological or pathological situation.

A proteína de choque térmico de 70kDa (HSP70) é uma chaperona fundamental nos processos de reparo celular, não apenas em condição de hipertermia como também em outras alterações metabólicas. O exercício físico é capaz de induzir a síntese de HSP70 uma vez que estimula o metabolismo oxidativo aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio. O presente estudo teve como objetivo avaliar o perfil antropométrico e nutricional de mulheres atletas de handebol, além de investigar se existe correlação entre os níveis de estradiol e o estado redox com o imunoconteúdo de HSP70 em linfócitos do plasma, no decorrer de um ano de treinamento físico. O estudo iniciou com a participação de 47 jogadoras, sendo que trinta atletas (entre 12 e 24 anos) cumpriram todas as etapas e foram incluídas na análise. As coletas foram realizadas em três períodos distintos: início, metade (após 4 meses de treino) e final da temporada de treinos. As atletas foram divididas em dois grupos de acordo com os níveis de estradiol: Estradiol Baixo (EB) (≥30 pg·mL-1) e Estradiol Normal (EN) (30–330 pg·mL-1). Neste estudo não observamos diferença na atividade da superóxido dismutase (SOD), no conteúdo de proteínas oxidadas, nem nos níveis de HSP70 extracelular (eHSP70), em nenhum período do estudo. A atividade da catalase (CAT) aumentou na metade da temporada no grupo EN. Foram observados menores níveis de grupamentos tiós reduzidos (SH) no grupo EN e menores níveis de peroxidação lipídica (TBARS) na metade e no final da temporada em ambos os grupos, havendo uma correlação inversa significativa entre o consumo de vitamina C e os níveis de dano oxidativo a lipídios. O imunoconteúdo de HSP70 intracelular (iHSP70) no grupo EN aumentou na metade e no final da temporada, enquanto que no grupo EB o conteúdo de iHSP70 mostrou-se elevado desde o início da temporada. Nossos resultados sugerem que o estradiol plasmático pode ter um importante papel na proteção ao dano oxidativo, e que os níveis de iHSP70, proteína considerada um biomarcador de inflamação, pode ser alterado tanto pelo estradiol, quanto pelo estresse oxidativo induzido pelo exercício. / The heat shock protein of 70kDa (HSP70) is a chaperone essential for cellular repair processes, not only on the condition of hyperthermia, but also in other metabolic challenges. Physical exercise is capable to induce an increase in the HSP70 synthesis once it augments oxidative metabolism increasing production of reactive oxygen species. In the current study we investigated whether a relationship between estradiol levels and parameters related to the redox environment and the immunocontent of HSP70 in lymphocytes and plasma of women handball players throughout 1 year a year of physical training, as well as anthropometric profile and nutritional status. Forty-seven female handball athletes (12 – 24 years old) started participating in the study and thirty completed all stages of the research, and were included in the study. The samples were taken at three different periods: Season beginning, mead-season (after four months of training) and season end. The athletes were divided into two groups according to levels of estradiol: low estradiol (≥30 pg·mL-1) (LE) and normal estradiol (30–330 pg·mL-1) (NE). In this study no changes were detected in SOD activity, protein carbonyl and extracellular HSP70 (eHSP70) in any study period. Catalase (CAT) activity increased in the middle of the season in NE group. Lower levels of reduced thiol (SH) were observed in the NE group and lower levels of uric acid in both groups (LE and NE) at the end of the season. The levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS) were lower in the middle and end of the season in both groups, e found a significant inverse correlation between the consumption of vitamin C and lipid peroxidation (TBARS). The immunocontent of intracellular HSP70 (iHSP70) in the NE group increased in the middle and the end of the season, whereas in group LE, iHSP70 was higher since the beginning of the season. Our results suggest that estradiol plasma levels can play an important role throughout the exercise training season and that the iHSP70, a biomarker of inflammation, is affected by both estradiol and oxidative stress induced by exercise.

Situações de estresse metabólico e térmico deflagram a expressão celular e liberação para o plasma, de proteínas de choque térmico da família de 70 kDa (HSP70) para desempenhar função de defesa-chave em um processo conhecido como resposta ao choque térmico ou ao estresse, que as caracterizam como proteína citoprotetora. Estudos indicam a ocorrência de HSP70 extracelular (eHSP70) na circulação por até 24 h após desafios como o exercício físico, cuja liberação dá-se por tecidos do território hepatoesplâncnico, em uma resposta mediada por receptores α-adrenérgicos. Esta liberação de HSP70 para o plasma é atenuada pela ingestão de glicose. Estas evidências levaram-nos a supor que a liberação de eHSP70 em resposta ao estresse possa ter um papel fisiológico na regulação da glicemia, a qual é afetada por estímulo simpático. Neste trabalho, os resultados dos experimentos in silico indicaram a possibilidade de ancoragem e interação estável entre a HSP70 e a molécula de insulina. Ensaios de imunoprecipitação de insulina com amostras de plasma de animais submetidos ao tratamento de insulina Regular e Detemir revelaram HSP70 coimunoprecipitada especialmente em situação de jejum severo. Parte destas amostras foi submetida à quantificação de glicemia, insulinemia e HSP72 circulante, cujos resultados evidenciam elevada concentração desta proteína de choque térmico por ocasião de hipoglicemia induzida por insulina. Parte dos estudos in vivo deste trabalho foram desenvolvidos com ratos submetidos ao choque térmico agudo (uma sessão de 15 minutos) com hipertermia induzida (41,5 °C) ou com injeção de HSP70 (HSPA1A) exógena, com grupos experimentais organizados em grupos Controle (C) e Choque Térmico (HS) e, em tempos experimentais: imediatamente (tempo zero), 6, 12 e 24 h pós-choque. Foi observada a ocorrência das formas constitutiva e induzível de eHSP70 no plasma de animais submetidos ao choque térmico com valor maior nos períodos de 12 e 24 h pós-choque. Nossos estudos mostram que, in vivo, a eHSP70 plasmática produz alteração na tolerância à glicose, com maior hiperglicemia, quando o teste é realizado 12 h após o choque térmico. Este efeito foi bloqueado pela administração (i.p.) de anticorpo anti-HSP70 e se mostrou independente da síntese de novo de HSP70. Ainda, a presença de eHSP70 plasmática (induzida por choque térmico ou administrada via endovenosa) causa menor captação de glicose pelo músculo esquelético. Ensaios com músculo isolado indicam que o efeito inibidor da eHSP70 sobre a captação de glicose é dependente de insulina. Apesar das evidências de que a ligação HSP70-insulina no plasma tenha implicação sobre a oferta de glicose, não se pode descartar também a possibilidade de que as ações da eHSP70 estejam ocorrendo pela sua ligação a receptores específicos, e/ou de que sejam parte de uma resposta ao estresse na qual estejam implicados os hormônios contrarregulatórios. Em suma, os resultados indicam que a eHSP70 plasmática é capaz de se ligar- à insulina, provocar tolerância alterada à glicose e diminuir a captação de glicose pelo músculo esquelético, aumentando a disponibilidade de glicose circulante. / Metabolically stressful situations trigger the expression and release of the 70 kDa (HSP70) as an essential protective response, in a process known as heat shock (HS) response or stress response. HSP70 is characterized as cytoprotector entities. Previous studies indicate the occurrence of extracellular HSP70 (eHSP70) in the circulation up to 24 h after stressful challenges, such as physical exercise, and that such eHSP70 liberation comes from hepatosplancnic tissues, in an 1-adrenergic dependent response, which is attenuated by glucose ingestion. The above findings led us to suppose that stress-elicited eHSP70 release could play a physiological role on glycemic control, which are affected by sympathetic stimuli. In this work, in silico experiments indicated the possibility of docking and stable interaction between HSP70 and the insulin molecule. Immunoprecipitation of plasma samples revealed that HSP70 co-immunoprecipitates with insulin, especially under severe fast. Part of these samples was subjected to quantification of glucose, insulin and circulating HSP72, whose results show high concentration of heat shock protein during severe hypoglycemia induced by insulin. Part of the in vivo studies from this work were also carried out in healthy rats submitted to an acute (15 min) HS (41.5 °C) session or in HSP70 (HSPA1A)-injected rats, assigned into control (C) and HS groups which were observed immediately and after 6, 12 and 24 h post-shock. Both the constitutive (predominantly) and the inducible forms of eHSP70 were observed in the plasma of heat shocked animals, being the times 12 and 24 h those in which the highest concentrations were noted. Our studies suggest that in vivo produces eHSP70 change in plasma glucose tolerance, greater hyperglycemia when glucose tolerance test is performed 12 h after heat shock, and this effect was abrogated by anti-HSP70 antibody administration (i.p.) and independent of de novo synthesis of HSP70. Moreover, the presence of eHSP70 (HS-induced or injected) in the plasma or in soleus muscle incubations elicits lower glucose uptake from the skeletal muscle. Isolated muscle studies indicate that eHSP70 inhibiting effect over glucose uptake is insulin-dependent. However, although evidence suggests a role for HSP70 binding to insulin over glucose offering, it cannot be discarded the possibility that eHSP70 actions are due to their binding to specific HSP70 membrane receptors within the muscle cell, and/or that are part of a stress response in which the counter-regulatory hormone are involved. In short, the results indicate that eHSP70 plasma is able to bind to insulin, causing impaired glucose tolerance and decrease glucose uptake by skeletal muscle, increasing blood glucose availability.

A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores e situações onde é comum que proteínas sofram ação de agentes oxidantes. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Para investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. Uma vez que estes resultados não concordam com as vias de sinalização ativadas classicamente por HSP70, via receptor TLR4, observamos uma nova interação com o receptor dos produtos finais de glicação avançada em um modelo de cultura de células A549 através de sondas fluorescentes. A quantificação do experimento mostrou um maior número de interações quando as células são tratadas com HSP70 na sua conformação ligada à ATP em comparação com o tratamento com HSP70 na sua conformação ligada à ADP; e, através de sucessivos experimentos de docking molecular propusemos um modelo putativo para a interação. Além disso, mostramos que na conformação ligada à ADP, a HSP70 interage preferencialmente com TLR4, de forma similar ao peptídeo MD-2, necessário para o reconhecimento de LPS, sugerindo que a chaperona atue como uma molécula acessória ou como citocina, dependendo do receptor e da situação patológica ou fisiológica. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli and conditions where is common to proteins to suffer the action of oxidative agents. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70. We observed that the Oxidation of HSP70 altered its protein structure; and that macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability. As these results do not concur with the signaling pathways classically activated by HSP70, via TLR4, we observed a new interaction with the receptor for advanced glycation end products through fluorescent probes in a A549 cell culture model. Quantification of the experiment showed a higher number of interactions when cells are treated with HSP70 bound to ATP when compared to the treatment with HSP70 in the conformation ADP-bound; and, by successive molecular docking experiments, we proposed a putative model for such interaction. Moreover, we showed that on its ADP-bound conformation, HSP70 binds preferentially to TLR4, in a similar way as the peptide MD-2, necessary for the recognizing of LPS, suggesting that the chaperone could act as an accessory molecule or as a cytokine, depending on the receptor and physiological or pathological situation.

Os genes de choque térmico groES e groEL de Caulobacter crescentus foram isolados utilizando-se os genes homólogos de E.coli como sonda e por sequenciamento demonstrou-se que estes genes estão organizados na forma de um operon em um fragmento de DNA de aproximadamente 2,5 kb, contendo também sua região regulatória. \"Northern blots\" de RNA total de células crescidas a 300C ou submetidas a choque térmico mostraram a presença de um único RNA de tamanho aproximado de 2,3kb, altamente induzido por choque térmico, permanecendo em altos níveis mesmo após longos períodos de choque térmico. Amostras de RNA total de células sincronizadas, de diferentes estágios do ciclo celular de Caulobacter, foram também analisadas mostrando que os níveis do mRNA groESL variam durante o ciclo, apresentando um máximo na célula prédivisional. Análises através de \"Western blot\" mostraram uma pequena variação nos níveis da proteína GroEL ao longo do ciclo celular, sendo os tempos 60 e 120 minutos, respectivamente, os pontos de mínimo e máximo acúmulo da proteína concordando com os resultados obtidos em \"N orthern blots\". O mesmo tipo de análise foi feito com extratos totais obtidos a partir uma população mista de células crescidas a 300C e submetidas a choque térmico, observando-se o acúmulo da proteína até 60 minutos depois do choque térmico, com aumento da ordem de 5 vezes nos níveis de GroEL, níveis estes que diminuem lentamente a partir deste ponto. Os inícios de transcrição foram determinados em experimentos de \"primer extension\" utilizando-se RNA total de células incubadas 300C e de células submetidas a diferentes condições de choque térmico. Dois possíveis sítios de início de transcrição foram determinados nas posições -119 e -88 do ATG da metionina iniciadora de groES, sendo as regiões -10 e -35 dos promotores correspondentes (P 1 e P2) identificadas. Somente a transcrição iniciando a partir de P2, que apresenta características de um promotor transcrito pelo &#963;32, aumenta durante o choque térmico. Fusões de transcrição com o vetor repórte placZ/290 e a região 5\' regulatória do operon groESL foram construídas para identificar as sequências responsáveis pelo controle por choque térmico e pelo controle temporal. Fusões de transcrição contendo deleções na região 5\' do operon mostraram que sequências a montante do promotor P2 não são necessárias para a indução por choque térmico ou para o controle temporal. Fusões de transcrição contendo mutações sítio-dirigidas na repetição invertida, encontrada a 3\' do promotor P2, antes do gene groES, revelaram que este elemento, conhecido como CIRCE, regula negativamente a expressão de groESL a 300C e mutações neste elemento levam à perda do controle temporal deste operon. / The heat shock genes groES and groEL of Caulobacter crescentus were isolated using the homologous genes of E.colí as a probe. DNA sequence analysis has shown that these genes are organized as an operan in a fragment of about 2.5kb, which includes the 5\' regulatory region. Northern blot analysis of total RNA from cells grown at 300C or heat shocked treated has shown the presence of a single mRNA species for groESL, of approximately 2.3kb in size, which presented increased leveis even after long periods of heat shock. Samples of total RNA from synchronized cells, corresponding to different stages of the Caulobaaer cell cycle, were also analysed, showing that the amount of groESL mRNA varies during the cycle, with maximum leveis in predivisional cells. Western blot analysis of GroEL leveis in Caulobaaer has shown that the amount of the protein decreases during the first 60 minutes of C.crescentus cell cycle and then starts to increase again. These results corroborate the data obtained with Northern blot analysis. A similar experiment was performed after exposing a mixed population of C.crescentus cells to different times of heat shock at 400C. Western blot of extracts of these cells showed a fivefold increase in the leveis of GroEL after 60 minutes of heat shock, which then begins to decrease. Primer extension experiments were performed using total RNA from cells incubated at normal growth temperature or after heat shock treatment. Two possible transcription start sites were determined at positions -119 and -88 from the ATG of the groES initiator methionine and the -10 and -35 regions of the corresponding promoters (P 1 and P2) were identified. Only trancription initiating from the P2 promoter, which has caracteristics of a &#963;32 promoter, I ncreases during heat shock .Transcription fusions with the reporter vector placZ/290 and the 5\' regulatory region of the groESL operan were contructed in order to identify the sequences responsible for heat shock and cell cycle contral. Deletion analysis in the 5\' region of the operon showed that no sequences upstream of the P2 promoter are necessary for heat shock induction or for temporal contral. Site-directed mutagenesis in the inverted repeat found 3\' of the P2 promoter, in front of the groES gene, revealed that this element, also known as CIRCE, negatively regulates groESL expression at 300C and mutations in it lead to loss of temporal control of this heat shock operon.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:07:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000442103-Texto+Completo-0.pdf: 1045106 bytes, checksum: c41cb173539d408ecd0b051fca78598e (MD5) Previous issue date: 2012 / Introduction: Heat shock proteins like mycobacterial HSP70 has a protective and anti-inflamatory activity in several animals models diseases, like arthritis and skin allograft. This protein can modulates both the innate and adaptative immune system. Objective: The aim of this study was evaluate the effect of HSP70 from M. tuberculosis on development of pulmonary allergic reponse in a mice model. Methods: Female BALBc mice with ovalbumin induced pulmonary disease received intraperitoneal inject or intranasal instillation of mycobacterium HSP70. Treg cell in lung tissue, inflammatory cells profiles and cytokines levels in broncalveolar lavage fluid was measured. Results: HSP70 show an inhibitory effect on pulmonary allergic response on mice. Eosinophils, IL-5 and IFN-ϒ levels was reduced in broncoalveolar lavage fluid in animals that received intranasal instillation of mycobacterial HSP70.Conclusion: Mycobacterial HSP70 can be efficiently used to treat airway allergic disorders. / Introdução: Algumas proteínas de choque térmico, como a HSP 70 micobacteriana, apresentam propriedades anti-inflamatórias e protetoras em modelos experimentais de doenças como artrite e aloenxertos cutâneos. Essa proteína pode modular tanto o sistema imune inato quanto o adaptativo. Objetivo: O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da proteína HSP70 de M. tuberculosis no desenvolvimento da resposta pulmonar alérgica em um modelo experimental de asma alérgica em camundongos.Métodos: camundongos BALB/c fêmeas submetidos a um protocolo de indução de asma por ovalbumina foram expostos a proteína HSP70 de M. tuberculosis através de diferentes vias de administração (intraperitoneal e intranasal). Foram analisados parâmetros inflamatórios (leucócitos e citocinas IFN, IL-4, IL-5 e IL-10) no fluido do lavado broncoalveolar. Resultados: A administração de MtHSP70 intranasal reduziu significativamente o infiltrado inflamatório e os níveis de IL-5 e IFN-ϒ no lavado broncoalveolar. Conclusão: A proteína HSP70 micobacteriana pode apresentar potencial aplicação no tratamento da asma alérgica.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:11:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000389286-Texto+Completo-0.pdf: 1859740 bytes, checksum: 5056bcedea79433eb88e0c64523c9659 (MD5) Previous issue date: 2007 / Abdominal angiostrongyliasis is a zoonotic infection caused by Angiostrongylus costaricensis, a nematode with an intra-vascular location in the mesentery. The diagnosis is only achieved with a pathological examination of tissue fragments ressected during surgical treatment in complicated clinical courses (intestinal perforation and/or obstruction). Immunodiagnostic test show many difficulties with cross-reacting antibodies and diversity of the humoral reactivity. Therefore, efforts have been directed towards identification and purification of parasite specific antigens for development of serodiagnosis methods. In the present study we analized the use of recombinant A. costaricensis heat shock protein (HSP) 20 in ELISA for the serodiagnosis. One of the cDNA clones, obtained and expressed a small heat shock protein HSP 20 with 147 amino acids, which had high sequence identity with other nematode small heat shock proteins. The gene enconding the HSP 20 was sub-cloned using PCR technique. The sequence corresponding was subcloned in the pET-23a-d (+) expression vector, to construct a recombinant HSP 20 protein containing six histidine residues at the Nterminal. High level expression of the HSP 20 by Escherichia coli BL21 (DE3) harbouring the HSP 20 gene and containing its expression vector was observed upon induction with 1 mM IPTG at 37 °C. One-step purification of the recombinant HSP 20 was achieved with Ni-NTA resin. Western blot analysis, using sera from patients with confirmed angiostrongyliasis abdominal, indicated that the purified HSP 20 expression product was immunogenic. Sensitivity of ELISA-HSP 20 was 33%. However, 100% specificity of this recombinant protein suggests its usefullness in combination with other antigen molecules, in an approach of multiple screening tests for the most accurate serodiagnosis of abdominal angiostrongyliasis. / Angiostrongilíase abdominal é uma infecção zoonótica causada por Angiostrongylus costaricensis, um nematódeo com uma localização intra-vascular no mesentério. O diagnóstico é realizado somente com exame patológico de fragmentos do tecido ressecado, durante o tratamento cirúrgico de curso clínico complicado (perfuração intestinal e/ou obstrução). Métodos de imunodiagnóstico mostram muitas dificuldades com reação cruzada de anticorpos e a diversidade de resposta humoral. Esforços têm sido direcionados para uma contribuição na identificação e purificação de antígenos específicos de parasitos no desenvolvimento de métodos sorodiagnósticos. No presente estudo, foi analisado o uso de uma proteína recombinante de A. costaricensis, a proteína de choque térmico (HSP 20), em ELISA como sorodiagnóstico. Um dos clones de cDNA, obtido e expresso como uma pequena proteína de choque térmico HSP 20 com 147 aminoácidos, apresentou identidade com seqüências de pequenas proteínas de choque térmico de outros nematódeos. A seqüência correspondente foi sub-clonada no vetor de expressão pET-23a-d (+), utilizando a técnica de PCR para a construção da proteína recombinante HSP 20. O alto nível de expressão de HSP 20 em Escherichia coli BL 21 (DE3), clonado no vetor de expressão, foi observado após indução com 1 mM de IPTG a 37 ºC. A etapa da purificação do recombinante HSP 20 foi realizada com a resina de Ni-NTA. Análise do Western blot utilizando soro de um paciente com diagnóstico confirmado para angiostrongilíase abdominal, indicou que o produto de expressão purificado foi imunogênico. A sensibilidade da HSP 20 foi de 33%. Entretanto, 100% de especificidade da proteína recombinante sugere o uso de um painel de antígenos, na tentativa de múltiplos testes de varredura, para um sorodiagnóstico melhor e preciso da angiostrongilíase abdominal.

A proteína de choque térmico de 70kDa (HSP70) é uma chaperona fundamental nos processos de reparo celular, não apenas em condição de hipertermia como também em outras alterações metabólicas. O exercício físico é capaz de induzir a síntese de HSP70 uma vez que estimula o metabolismo oxidativo aumentando a produção de espécies reativas de oxigênio. O presente estudo teve como objetivo avaliar o perfil antropométrico e nutricional de mulheres atletas de handebol, além de investigar se existe correlação entre os níveis de estradiol e o estado redox com o imunoconteúdo de HSP70 em linfócitos do plasma, no decorrer de um ano de treinamento físico. O estudo iniciou com a participação de 47 jogadoras, sendo que trinta atletas (entre 12 e 24 anos) cumpriram todas as etapas e foram incluídas na análise. As coletas foram realizadas em três períodos distintos: início, metade (após 4 meses de treino) e final da temporada de treinos. As atletas foram divididas em dois grupos de acordo com os níveis de estradiol: Estradiol Baixo (EB) (≥30 pg·mL-1) e Estradiol Normal (EN) (30–330 pg·mL-1). Neste estudo não observamos diferença na atividade da superóxido dismutase (SOD), no conteúdo de proteínas oxidadas, nem nos níveis de HSP70 extracelular (eHSP70), em nenhum período do estudo. A atividade da catalase (CAT) aumentou na metade da temporada no grupo EN. Foram observados menores níveis de grupamentos tiós reduzidos (SH) no grupo EN e menores níveis de peroxidação lipídica (TBARS) na metade e no final da temporada em ambos os grupos, havendo uma correlação inversa significativa entre o consumo de vitamina C e os níveis de dano oxidativo a lipídios. O imunoconteúdo de HSP70 intracelular (iHSP70) no grupo EN aumentou na metade e no final da temporada, enquanto que no grupo EB o conteúdo de iHSP70 mostrou-se elevado desde o início da temporada. Nossos resultados sugerem que o estradiol plasmático pode ter um importante papel na proteção ao dano oxidativo, e que os níveis de iHSP70, proteína considerada um biomarcador de inflamação, pode ser alterado tanto pelo estradiol, quanto pelo estresse oxidativo induzido pelo exercício. / The heat shock protein of 70kDa (HSP70) is a chaperone essential for cellular repair processes, not only on the condition of hyperthermia, but also in other metabolic challenges. Physical exercise is capable to induce an increase in the HSP70 synthesis once it augments oxidative metabolism increasing production of reactive oxygen species. In the current study we investigated whether a relationship between estradiol levels and parameters related to the redox environment and the immunocontent of HSP70 in lymphocytes and plasma of women handball players throughout 1 year a year of physical training, as well as anthropometric profile and nutritional status. Forty-seven female handball athletes (12 – 24 years old) started participating in the study and thirty completed all stages of the research, and were included in the study. The samples were taken at three different periods: Season beginning, mead-season (after four months of training) and season end. The athletes were divided into two groups according to levels of estradiol: low estradiol (≥30 pg·mL-1) (LE) and normal estradiol (30–330 pg·mL-1) (NE). In this study no changes were detected in SOD activity, protein carbonyl and extracellular HSP70 (eHSP70) in any study period. Catalase (CAT) activity increased in the middle of the season in NE group. Lower levels of reduced thiol (SH) were observed in the NE group and lower levels of uric acid in both groups (LE and NE) at the end of the season. The levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS) were lower in the middle and end of the season in both groups, e found a significant inverse correlation between the consumption of vitamin C and lipid peroxidation (TBARS). The immunocontent of intracellular HSP70 (iHSP70) in the NE group increased in the middle and the end of the season, whereas in group LE, iHSP70 was higher since the beginning of the season. Our results suggest that estradiol plasma levels can play an important role throughout the exercise training season and that the iHSP70, a biomarker of inflammation, is affected by both estradiol and oxidative stress induced by exercise.