Durant les dernières décennies, de nombreux cas d'interactions pharmacocinétiques drogue-drogue ont été répertoriés, menant parfois à des pathologies sérieuses et permanentes. Pour l'industrie pharmaceutique, il s'est alors avéré essentiel de bien caractériser l'activité métabolique de composés en phase clinique. Un des outils développé et utilisé en première ligne lors de la caractérisation des voies impliquées dans la métabolisation d'une drogue est l'essai in-vitro du cytochrome P450. Cet essai, utilisant une préparation hépatique, permet entre autres d'identifier la ou les enzymes responsables lors de la biotransformation d'un médicament. Parmi les différentes techniques d'analyse impliquées lors de la quantitatification de l'activité des enzymes du cytochrome P450, la chromatographie liquide avec détection en spectrométrie de masse demeure certes la plus utilisée et la mieux documentée. Toutefois, une grande diversité de paramètres d'analyse recensés dans la littérature rend la tâche ardue à l'analyste non aguerri. De plus, aucune méthode simple et standardisée, permettant d'évaluer l'activité de l'ensemble des neuf enzymes responsables de la métabolisation de la majorité des médicaments, n'est répertoriée. Dans cette optique, l'objectif du présent projet de maîtrise consistait au développement de stratégies analytiques en chromatographie liquide avec détection par spectrométrie de masse, pouvant être appliquées dans n'importe quel laboratoire possédant des instruments d'ancienne ou de nouvelle génération. Pour ce faire, une séparation tant en chromatographie liquide haute performance (HPLC) qu'en chromatographie liquide ultra performance (UPLC) a été mise au point. De surcroît, l'utilisation de spectromètres de masse à simple (MS) ou à triple quadripole (MS/MS) a été étudiée, dans le but de quantifier les metabolites des différents essais.

L'avancement de différentes sphères d'analyse moléculaire demande toujours un plus grand pouvoir d'identification de la matière. Par exemple, l'analyse en LDTD-MS peut être difficile lorsqu'un échantillon contient différentes molécules ayant la même masse (isobares & isomères). La mobilité ionique différentielle est une méthode de séparation de molécules ionisées qui s'avère être un outil additionnel dans le domaine de la spectrométrie de masse pour aider à repousser et/ou augmenter la spécificité et les limites de détection. Ce projet a eu pour but la conception et la caractérisation d'un instrument de mobilité ionique différentielle ayant une géométrie originale et qui est couplé à un système LDTD-MS/MS. L'objectif final est d'améliorer la résolution d'interférences de masses dans un système LDTD-MS/MS. Les configurations planes et coaxiales usuelles produisent la séparation des différentes molécules dans un plan perpendiculaire à l'axe de propagation et nécessitent deux électrodes pour y parvenir. Le concept original mis de l'avant dans ce travail sépare les molécules parallèlement à l'axe de propagation. Toutefois, ceci nécessite l'utilisation d'au moins trois électrodes pour y parvenir plutôt que 2 électrodes pour les configurations planes ou coaxiales. Cette approche a été prise dans l'optique de prolonger le parcours des ions dans les conditions optimales de séparation, tout en limitant les pertes par diffusion. Des simulations numériques ont été réalisées pour concevoir et caractériser une configuration à électrodes multiples. La configuration proposée produit la séparation caractéristique des FAIMS et DMS dans deux régions de dérive distinctes. Ce principe de fonctionnement nécessite des tensions de compensation indépendantes sur la première et la troisième électrodes. La fonction asymétrique (tension de dispersion) est appliquée sur la seconde électrode. Selon la polarité de la tension de dispersion, chaque région bloquera plus facilement des ions ayant un différentiel de mobilité ionique soit positif (∆K+) ou négatif (∆K-). Le mécanisme de séparation est différent de ce qui est réalisé lorsque la séparation est perpendiculaire à l'axe de propagation. Ainsi, un effort particulier a été mis sur la description et l'interprétation des courbes de transmission obtenues. Les concepts de résolution et de pouvoir de résolution, nécessaires à l'évaluation de la performance instrumentale, ont du être redéfinis pour pouvoir s'appliquer aux résultats obtenus. Un montage expérimental empruntant l'électronique d'un FAIMS commercial a été réalisé pour expérimenter la configuration novatrice. Les performances instrumentales ont été évaluées sous deux aspects : la séparation ciblée et la filtration d'interférences non ciblées. Des phtalates ayant des structures chimiques similaires ont été infusés et séparés par l'instrument. Les observations expérimentales concordent avec les résultats obtenus en simulation. Le mécanisme de séparation fonctionne tel que décrit théoriquement. La quantification de la quetiapine dans le plasma est limitée par un interférent sur la transition la plus sensible. Une courbe de calibration a comparé la limite de quantification d'un système LDTD-MS/MS et LDTD-FAIMS-MS/MS. La séparation de cet interférent non-ciblé a permis d'abaisser la limite de quantification d'un facteur 10 par rapport au système LDTD-MS/MS. Cette limite de quantification s'avère à un niveau qui plus bas que ce qui est répertorié dans littérature. / The advancement of different spheres of molecular analysis always requires greater power to identify the material. For example, LDTD-MS analysis can be difficult when a sample contains different molecules with the same mass (isobars & isomers). Differential ion mobility is a method for separating ionized molecules that is proving to be an additional tool in the field of mass spectrometry to help increase specificity and detection limits. The aim of this project was to design and characterize a differential ion mobility instrument with an original geometry that is coupled to an LDTD-MS/MS system. The final objective is to improve the resolution of mass interferences in an LDTD-MS/MS system. The usual planar and coaxial configurations produce the separation of different molecules in a plane perpendicular to the propagation axis and require two electrodes to achieve this. The original concept put forward in this work separates the molecules parallel to the propagation axis. However, this requires the use of at least three electrodes to achieve this rather than 2 electrodes for planar or coaxial configurations. This approach was taken in order to extend the ion path under optimal separation conditions, while limiting diffusion losses. Numerical simulations were performed to design and characterize a multiple electrode configuration. The proposed configuration produces the characteristic separation of FAIMS and DMS in two distinct drift regions. This operating principle requires independent compensation voltages on the first and third electrodes. The asymmetric function (dispersion voltage) is applied on the second electrode. Depending on the polarity of the dispersion voltage, each region will more easily block ions with either a positive (∆K+) or negative (∆K-) ion mobility differential. The separation mechanism is different from what is achieved when the separation is perpendicular to the propagation axis. Thus, a particular effort has been put on the description and interpretation of the transmission curves obtained. The concepts of resolution and resolving power, necessary for the evaluation of the instrumental performance, had to be redefined in order to be applied to the obtained results. An experimental set-up borrowing the electronics of a commercial FAIMS has been realized to experiment the innovative configuration. The instrumental performances were evaluated under two aspects: targeted separation and filtration of untargeted interferences. Phthalates with similar chemical structures were infused and separated by the instrument. The experimental observations are in agreement with the results obtained in simulation. The separation mechanism works as theoretically described. Quantification of quetiapine in plasma is limited by an interferent on the most sensitive transition. A calibration curve compared the limit of quantification of an LDTD-MS/MS and LDTD-FAIMS-MS/MS system. The separation of this untargeted interferent lowered the limit of quantification by an order of 10 compared to the LDTD-MS/MS system. This limit of quantification was found to be at a level that is lower than what is reported in the literature.

La dissolution acide est une technique efficace et communément utilisée pour dissoudre des échantillons environnementaux. En revanche, cette technique possède de nombreux problèmes, incluant sa vitesse d'exécution, l'utilisation d'acides potentiellement dangereux et sa digestion incomplète de composés réfractaires comme les oxydes d'actinides. Une méthodologie améliorée basée sur la dissolution par fusion automatisée suivie par de la chromatographie d'extraction pour la détection et la quantification des actinides dans des échantillons environnementaux a été développée. Un protocole de fusion pour la calcination complète et la dissolution de divers échantillons a été optimisé. La contamination croisée entre les échantillons a été étudiée et les résultats démontrent qu'un tel phénomène est négligeable, et ce, même sans le lavage des creusets entre les échantillons. L'unité de fusion automatisée améliore aussi la répétabilité dans la préparation des échantillons comparativement à des fusions dites manuelles. Les problèmes instrumentaux dus à la présence d'une haute concentration en lithium dans les solutions après la fusion au métaborate de lithium ont aussi été examinés. Conséquemment, une méthode utilisant la chromatographie d'extraction a été développée pour réduire la charge en métaborate de lithium et minimiser la matrice environnementale tout en conservant tous les actinides en solution. La méthode globale a été validée à l'aide de plusieurs échantillons de référence certifiés de nature différente. La possibilité d'appliquer cette technique à d'autres éléments a aussi été tentée. Cette méthodologie a aussi été appliquée à la détection d'uranium aéroporté dans trois villes québécoises : Kuujjuurapik, Montréal et Québec.

Les travaux de cette thèse portent sur le développement de nouvelles méthodologies de purification des peptides pharmaceutiques par chromatographie de partage centrifuge (CPC) dans le but de l'introduction de cette technique comme outil de R&D mais surtout de production en milieu industriel. Le caractère original de ces travaux porte essentiellement sur l'introduction de nouveaux systèmes de solvants et la mise au point de nouveaux procédés de purification en mode CPC co-courant. Les différents aspects liés à l'industrialisation des différents procédés de purification ont également été étudiés.La première partie des travaux a consisté en l'étude de quelques nouveaux aspects de l'intérêt de l'application du mode co-courant en chromatographie de partage centrifuge. Une méthodologie originale de purification des peptides tensioactifs non ioniques en mode CPC co-courant a été mise au point. Cette méthodologie a permis de résoudre les problèmes de perturbations hydrodynamiques et de perte de phase stationnaire engendrés par le caractère tensioactif de ces molécules et a été appliquée avec succès à la purification d'une cyclosporine modifiée douée d'une activité anti-virale et faiblement soluble dans les solvants usuellement utilisés en CLHP. Une étude fondamentale de l'effet du peptide sur le comportement hydrodynamique des deux phases lors de la séparation et la visualisation des modèles d'écoulement au sein de la colonne CPC a permis la mise en évidence du role de la ciclosporine modifiée dans la perturbation de la composition des phases du système chromatographique. D'autres aspects de l'intérêt du mode co-courant en CPC ont été étudiés lors de cette étude, notamment l'amélioration de la robustesse et de la résolution de la séparation.La seconde partie des travaux a porté sur le développement de nouveaux systèmes biphasiques de solvants particulièrement adaptés à la purification des peptides hydrophobes non-ioniques, notamment les intermédiaires de synthèse protégés, qui sont très faiblement solubles dans la plupart des solvants communs utilisés en chromatographie. Deux gammes quaternaire et quinaire de systèmes biphasiques de solvants, ainsi qu'un système biphasique ternaire ont été introduits. L'originalité de ces systèmes porte sur l'usage de solvants verts à fort caractère solvatant tel que le Methyl-THF et le cyclopentyl methyl ether (CPME). Les systèmes développés ont été efficacement utilisés pour la purification en CPC d'une exénatide protégée de 39 acides aminés et d'un peptide protégé de 8 acides aminés intermédiaire de la synthèse de la bivalirudine. Ces systèmes devraient être utiles pour une utilisation générale en CPC pour la séparation des peptides synthétiques hydrophobes libres ou protégés. / The work presented in this thesis deals with the development of new methodologies for the purification of pharmaceutical peptides by centrifugal partition chromatography (CPC) in order to introduce this technique as a tool for R & D but also in industrial production. The original character of this work relies on the introduction of new solvent systems and the development of new purification processes based on the co-current CPC mode. The different aspects of the process intensification and industrialization have also been studied.In the first part of the work, a study of some new aspects of the interest of the application of the stationary phase co-current mode in CPC is described. An original method for the purification of non-ionic tensioactive peptides in the co-current CPC mode was developed. This method has been successfully applied to the purification of a modified cyclosporine showing a therapeutic interest. This particular elution mode, taking advantage of the liquid nature of the stationary phase, appears to be an efficient solution to get round some hydrodynamic instabilities that sometimes appears during a purification intensification by CPC. A fundamental study of the effect of the peptide on the hydrodynamic behavior of the two phases in the separation and visualization of flow patterns within the CPC column allowed highlighting the role of the peptide in the disruption of phases composition of the chromatographic system. Other aspects of the interest of the co-current mode in CPC were investigated in this study, including the improvement of the efficiency and the resolution of the separation.The second part of the work focused on the development of new biphasic solvent systems particularly suitable for the purification of hydrophobic non-ionic peptides, including protected intermediates, which are very poorly soluble in the most common solvents used in chromatography. Two new scales of biphasic solvent systems showing a wide range of polarity and a ternary biphasic system were introduced to overcome solubility problems often encountered with synthetic hydrophobic protected peptides. The originality of these systems relies on the use of green solvents with high solvating character such as Methyl-THF and cyclopentyl methyl ether (CPME). The developed systems have been effectively used for the purification in CPC of a 39mer protected exenatide and and a 8mer protected peptide intermediate of bivalirudin synthesis.

Différentes techniques de chromatographie liquide des polymères ont été étudiées selon leur principe d’élution et le comportement conformationnel des polymères suscité au sein de la phase stationnaire. De part leur capacité à caractériser des copolymères à blocs, la Chromatographie Liquide aux Conditions Critiques (LC CC) et la Chromatographie Liquide aux Conditions Limites de Désorption (LC LCD) ont été utilisées pour déterminer la composition chimique de copolymères à blocs à base de poly(oxyde d’éthylène) et de polystyrène. La LC LCD s’est distinguée par sa capacité à séparer de manière efficace les copolymères à blocs de leurs homopolymères parents. Cette méthode chromatographique a ensuite été optimisée afin d’être appliquée à une plus large gamme de masses molaires. / Several advanced techniques of liquid chromatography of polymers were studied according to their elution principle and the conformational behaviour of polymers along the stationary phase. Because of their potential to characterize block copolymers, Liquid Chromatography under Critical Conditions (LC CC) and Liquid Chromatography under Limiting Conditions of Desorption (LC LCD) were employed to determine the chemical composition of Poly(ethylene oxide) and Polystyrene based block copolymers. Interestingly, LC LCD was proved to be particularly efficiently to separate block copolymers from both their parent homopolymers. LC LCD method was then optimized to extend the applicable molar masses ranges.

La mise au point de techniques de fractionnement des moûts de Sauvignon blanc par chromatographie de partage centrifuge et par chromatographie Flash, a permis de mettre en évidence la présence de deux « nouvelles » formes précurseurs du 3SH (le S-3-(hexan-1-al)-glutathion et l'acide S-3-glutathionyl-hydroxyhexanesulfonique). L’ensemble de ces résultats a permis de confirmer la contribution majeure des S-conjugués au potentiel en 3SH des moûts. Le S-3-(hexan-1-ol)-L-cystéine, le S-3-(hexan-1-ol)-glutathion ainsi que les deux nouvelles formes identifiées, permettent d’expliquer près de 65% du 3SH libéré dans les vins. Par ailleurs, nous avons montré que l’ensemble des formes précurseurs appartenait à la même voie d’assimilation de la levure et que le S-3-(hexan-1-ol)-L-cystéine est un intermédiaire indispensable à la biotransformation des S-conjugués au glutathion, précurseurs du 3-sulfanylhexanol. De plus, le pourcentage de biotransformation des différents S-conjugués en 3SH semble directement lié à leur position dans le flux métabolique. / The development of fractionation techniques in Sauvignon Blanc musts such as centrifugal partition chromatography and flash chromatography, permitted to identify two precursor forms of 3-sulfanylhexanol : the S-3-(hexan-1-al)-glutathione, and the S-3-glutathionyl-hydroxy hexanesulfonic acid. These results confirmed the major contribution of S-conjugates in the potential liberation of 3-sulfanylhexanol in musts. The two newly identified forms along with S-3-(hexan-1-ol)-L-cysteine and S-3-(hexan-1-ol)-glutathione, explain up to 65% of the total release of 3-sulfanylhexanol. Futhermore, we showed that all precursor forms belonged to the same assimilation pathway of yeast and the S-3-(hexan-1-ol)-L-cysteine is an essential intermediate in the metabolism of S-glutathione conjugates, which is a precursor of 3-sulfanylhexanol . Finally, the biotransformation percentage of different S-conjugates of 3-sulfanylhexanol seems directly related to their position in the metabolic flow.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

En recherche clinique ou environnementale, les biomarqueurs protéiques présentent un intérêt croissant. Bien que les immuno-dosages restent les méthodes de référence pour leur quantification, les récentes avancées en spectrométrie de masse (MS) font de cette technique une alternative crédible à l’ELISA. Ce travail apporte quelques éléments méthodologiques pour repousser certaines limitations de la MS. D’abord, deux dosages ont été proposés. Celui réalisé chez G. fossarum représente le premier exemple de dosage de la Vitellogénine chez un invertébré par LC-MS/MS. L’un des défis de la méthode présentée est de doser spécifiquement une protéine dans un organisme dont le génome est majoritairement inconnu. Le second dosage concerne les peptides contenant une méthionine. Nous avons développé un protocole d’oxydation des méthionines afin de s’affranchir du biais lié à leur oxydation partielle. Cette méthode a ensuite été appliquée à une protéine impliquée dans la maladie d’Alzheimer (l’Apolipoprotéine E4) dans une cohorte de 673 plasmas. Ce dosage est à ce jour l’une des plus grandes études réalisées par LC-MS/MS et montre toute la robustesse de cette approche. Enfin, l’influence de la phase mobile sur la sensibilité des dosages de peptides a été étudiée : d’abord en phase inverse, où le méthanol est une bonne alternative à l’acétonitrile ; ensuite en HILIC, où les difficultés liées à l’étude d’ions multichargés en milieu majoritairement organique ont été abordées. Les problèmes liés à la capacité de charge des colonnes ont également été soulevés. La chromatographie HILIC reste prometteuse pour la quantification de peptides puisqu’un facteur dix en sensibilité peut être apporté. / Both in clinical and environmental research, protein biomarkers are of growing interest. Although immunoassays are the gold standard for their quantification, recent advances in mass spectrometry (MS) make this technique a viable alternative to ELISA. This work provides some methodological elements to eliminate some limitations of the MS approach. First, two assays have been proposed. The first one achieved for G. fossarum represents the first example of quantification of vitellogenin in an invertebrate by LC-MS/MS. One of the challenges of the presented method is to specifically assay a protein in an organism whose genome is largely unknown. The second assay relates to methionine-containing peptides. A protocol was developped for total oxidation of methionines in order to overcome the bias due to their partial oxidation. This method was then applied to a protein involved in Alzheimer's disease (Apolipoprotein E4) in a cohort of 673 plasma samples. This assay is to date one of the largest study carried out by LC-MS/MS and shows all the robustness of this approach. Lastly, the influence of the mobile phase on the sensitivity of peptides assays was studied: first in reversed phase, where methanol is a good alternative to acetonitrile; then in HILIC, where the difficulties associated with the study of multicharged ions in a mainly organic content were discussed. Problems related to the carrying capacity of the columns were also raised.

La demande sociétale en protéines végétales a augmenté d’environ 50% durant la dernière décennie. Les nouvelles tendances alimentaires et l’intérêt pour leurs propriétés font de ces protéines une alternative intéressante dans de nombreux secteurs industriels à moyenne et haute valeur ajoutée. L'objet de cette thèse est de progresser dans l'étude d’un procédé simple et robuste permettant la mise au point d'une éco-filière de production de protéine. L’objectif est d’étudier l’extraction et le procédé de purification de la protéine, à partir des plantes sélectionnées, afin de garantir la conservation de ses propriétés technologiques moussantes, émulsifiantes et gélifiantes. / Social requirements for vegetal proteins increased almost by 50% in last decade. New food trends and their interesting functional properties make these proteins a preferential choice for industrial sectors of middle and high added-value. The aim of this PhD Thesis is to contribute to the analysis of a simple and robust process able to favour an eco-industry for protein production. The objective is to study the extraction and the purification of the protein, from selected green-plants, in order to guarantee techno-functional properties such as foaming, emulsifying and gelling powers

Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stehen Untersuchungen zur Analytik, Stabilität und Metabolisierung von Nitroxylradikalen, unter besonderer Berücksichtigung Ihrer Anwendung als ESR-Spinsonden im Rahmen der Bearbeitung pharmazeutisch-technologischer und biopharmazeutischer Fragestellungen. Neben der Entwicklung und Adaptierung geeigneter analytischer Methoden waren dabei Stabilitätsfragen unter den Bedingungen ihres Einsatzes, die Stabilität von Reaktionsprodukten und Metaboliten, das elektrochemische und chemische Reduktionsverhalten sowie die Biotransformation du rch Mikroorganismen, in subzellulären Fraktionen der Leber und in humanen Zellkulturen von besonderem Interesse. Als wichtigste Ergebnisse dieser Arbeit sind: (i) bisher unbekannte Metaboliten (wie z.B. sekundäreAmine) identifiziert, (ii) der Erkenntnisstand zu den Mechanismen der Biotransformation dieser stabilen Radikale erweitert, (iii) methodische Fortschritte wie die Entwicklung einer On-line HPLC-ESR-Kopplung und bei der Anwendung der Festphasenmikroextraktion (SPME) erreicht, (iv) die ESR als Methode für nichtinvasive Messungen des pH-Wertes und für die Erfassung der Stabilität und Hautpenetration von Liposomen erschlossen worden. / The present thesis was focused on the investigation of analytic, stability and metabolism of nitroxyl radicals used as esr spin probes in pharmaceutical, technological and biopharmaceutical applications. New analytical methods were developed and adapted for nitroxides and diamagnetic products. The stability of nitroxides was analysed and reaction products were cleared up. Furthermore there were in vestigated the electrochemical and chemical behaviour of reduction as well as the biotransformation by microorganisms, in subcellular liver fractions and in human cell cultures. The main results of this document are presented in the following: (i) the appearance of new dia- and paramagnetic metabolites (e.g. secondary amines), (ii) the latest findings about metabolic mechanisms of stable nitroxyl radicals, (iii) the development of online HPLC-ESR-couppling technique and the application of solid phase microextraction (SPME) as the greatest acquisition, (iv) the advantage of ESR technique for noninvasive measurement of pH and to register the stability and penetration of liposomes through skin layers.