Ces dernières années, des progrès remarquables ont été accomplis afin d’élucider la biosynthèse des flavonoïdes. Cependant les dernières étapes menant à la formation des proanthocyanidines ou tannins condensés issus de la vigne, restent à ce jour inconnues. Dans le but de déterminer si une ou plusieurs enzyme(s) spécifique(s) sont impliquées dans cette voie de biosynthèse, nous avons développé une approche de protéomique chimique, impliquant des matrices d’affinité constituées de substrats de type flavanols greffés sur un support solide. La validation de ces outils à l’aide de LDOX, une enzyme issue de Vitis vinifera a pu être menée à bien dans le cadre de ces travaux de thèse. / Remarkable progress toward the complete elucidation of the biosynthesis of flavonoids has been accomplished during the last decade, but the final step leading to proanthocyanidins still remain to be elucidated, in particular, the exact nature of starter and extension units as well as the enzymatic or non enzymatic condensation process. In order to answer whether some specific enzymes are involved in the biosynthesis of grapevine proanthocyanidins, we have developped a chemical proteomics approach, with an affinity chromatography-based tool in which a flavanol type substrate is loaded on an appropriate solid support. The validation of these tools with the LDOX enzyme from Vitis vinifera was developped and performed in this Ph.D work.

Les travaux de recherche présentés dans ce manuscrit ont pour but de développer des procédés industriels pour la production de quatre ingrédients alimentaires infantiles ayant des propriétés hypoallergéniques et des teneurs réduites en phytoestrogènes. Les propriétés nutritionnelles des protéines de riz et de soja en font des sources intéressantes. Néanmoins, plusieurs problématiques liées aux caractéristiques des produits apparaissent aujourd’hui : la présence de phytoestrogènes (isoflavones) dans les isolats protéiques de soja ; la difficulté à solubiliser et isoler les protéines de riz et la forte allergénicité des protéines dans le cas du soja. Ces travaux présentent l’étude du fractionnement des protéines de soja et de riz pour le développement : d’isolat protéique à teneur réduite en isoflavones ; isolat protéique de riz ayant une teneur supérieure à 90% de protéines ; hydrolysats protéiques de soja et de riz dont le profil de poids moléculaire est maitrisé et potentiellement hypoallergénique. Afin d’y parvenir, la réduction de la taille des protéines par des processus enzymatiques puis le contrôle de leur poids moléculaire ont dû être étudiés. Concernant l’élimination des phytoestrogènes (isoflavones), deux méthodes ont permis d’atteindre de hauts rendements d’extractions. En premier lieu, l’étude de l’extraction par éthanol via une optimisation à petite échelle, suivie d’une mise à l’échelle industrielle ont permis de développer un premier produit à teneur résiduelle en isoflavones inférieure à 50 μg/g de produit sec représentant une réduction de près de 98% de la teneur en isoflavones. Le second procédé étudié a été la rétention des isoflavones sur résine d’adsorption à partir d’un hydrolysat protéique de soja préalablement mis au point, et ceci, par l’utilisation de solution aqueuse sans étape préalable d’extraction. Ce procédé a fait l’objet d’une mise à l’échelle industrielle et d’une étude du comportement chromatographique des isoflavones. L’extraction des isoflavones par eau subcritique et CO2 supercritique est aussi présentée dans cette thèse. Elle a permis de mettre en évidence l’influence de la polarité des différents composés et de la teneur en protéines des produits de soja utilisés. Ces travaux de thèse ont aussi permis de définir un nouveau procédé pour la production d’isolat protéique de riz par l’intermédiaire d’enzymes de types cellulolytiques et amylases, à partir de coproduits issus de l’industrie du sirop de glucose. Des études sur des matières moins transformées telles que le son de riz et la farine ont aussi été étudiées pour la concentration des protéines. L’étude de l’hydrolyse des protéines de soja et de riz a été possible par le suivi de différents indicateurs tels que le pH, la solubilité des protéines, le degré d’hydrolyse, le profil de poids moléculaire par électrophorèse et par chromatographie d’exclusion stérique. Ces procédés ont permis la production de quatre nouveaux ingrédients pouvant être testés pour leurs caractéristiques hypoallergéniques avant une éventuelle production industrielle / The objectives of these works were to develop industrial processes for the production of four infant food ingredients with hypoallergenic properties and reduced levels of phytoestrogens. For this purpose, the nutritional properties of the rice and soy protein are promising. However, due to the presence of phytoestrogens (isoflavones) the consumption of soy protein isolates is a big concern for infant food security because the high exposure to these compounds, known to be endocrine disruptors. Consequently, it was first intended to develop a soy protein isolate with reduced content of isoflavones below 50 μg/g following the recommendations of French and European health authorities. Rice protein isolates are either non-existent on the market, or extremely rare. Therefore, the development of rice protein isolate with a minimum content of 90 % protein was another objective. For the sensitive population, such as infants, the aim of this work was also to develop soy and rice protein hydrolysates conferring hypoallergenic properties. To achieve this goal, the reduction of the size of proteins and the control of their molecular weight was studied. Two methods were used to achieve high extractions yields. A study of ethanol extraction ranging from small-scale optimization to industrial scale was used for a final product with a residual content in isoflavones below 50 μg/g. The second method was to retain isoflavones on adsorption resin from a soy protein hydrolysate. This was possible without preliminary extraction step by solvent. This method was also tested in the industrial scale. The chromatographic behavior of different isoflavones was also studied. The extraction of isoflavones with subcritical water and supercritical CO2 is also presented in this thesis even though these methods were not retained. These pressurized extractions showed the influence of the polarity of isoflavones and the protein content of soy products onto the isoflavone extraction. These works also identified a novel process for the production of rice protein isolate by the hydrolysis of polysaccharides with cellulolytic enzymes and amylases from concentrated protein byproducts from the glucose syrup industry. Studies on less processed materials such as rice bran and flour were also studied for protein isolation. The study of the hydrolysis by proteases of soy and rice proteins were monitored by various indicators such as pH, protein solubility, the degree of hydrolysis, the molecular weight profile by electrophoresis, and size exclusion chromatography. These processes are enabled for the production of four new ingredients that will be tested for their hypoallergenic characteristics before a large scale production.

L’objectif de ces travaux est de développer une nouvelle voie de valorisation de différents coproduits agricoles et forestiers. L’étude s’est focalisée sur l’étape de séparation entre les hémicelluloses et les lignines contenues dans des extraits aqueux obtenus par extrusion bi-vis. La technologie bi-vis du fait de sa modularité a été choisie pour évaluer différentes conditions d’extraction. Les essais ont été menés afin de mettre en évidence l’influence des effets mécanique, thermique et chimique sur l’extraction des hémicelluloses à partir des différentes matrices végétales étudiées. Les travaux ont été conduits soit en conditions hydrothermales, eau sous pression et haute température, soit en conditions faiblement alcalines pour extraire des molécules les plus natives possibles. Ceci a permis d’identifier les conditions d’extraction les plus favorables en fonction des caractéristiques de chacune des biomasses. Dans un second temps, les extraits obtenus, contenants des hémicelluloses et des composés phénoliques, ont été purifiés au moyen de méthode de fixation sur résines d’échange d’ions et d’adsorption. Les travaux se sont focalisés sur la compréhension des mécanismes de fixation des molécules avec des solutions modèles contenant un ou plusieurs solutés. La cinétique et les isothermes d’échanges ont été évaluées pour l’acide férulique, l’acide coumarique et la lignine. Les résultats ont ensuite été comparés à ceux obtenus avec les extraits alcalins. Cette étude a permis d’identifier les mécanismes d’échanges qui interviennent lors de la séparation des complexes lignine-polysaccharides. / The objective of this work is to validate a new way of valuing various agricultural and forestry coproducts. Study was devoted on the separation of lignin and hemicelluloses contained in extracts obtained by twin-screw extrusion. Twin-screw technology has been chosen to evaluate different extraction conditions. Trial conditions have been adopted in order to highlight the influence of mechanical, thermal and chemical effects on the extraction performances for various plant matrices. Efforts have been made to give priority to mild extraction conditions in the interest of preserving the integrity of the extracted polymers and limiting the environmental impact. Thus hydro-thermal extraction tests without chemical solvents were compared to more conventional alkaline extraction to evaluate their efficiency. This identified the most favorable extraction conditions according to the characteristics of each biomass. The extracts, with hemicelluloses and phenolic compounds, were purified with ion exchange and adsorption resins. Work focused on mechanisms fixations characterization with model solutions conditions containing one or several molecules. Kinetic and isotherm were determined for lignin, coumaric acid and ferulic acid. Then, results were compared to results obtained with the extracts. This study allowed to identify the mechanisms involved in the separation of the lignin-carbohydrates complex.

Ce manuscrit est consacré à l’élaboration de phases monolithiques à base de dioxyde de titane pour les techniques séparatives appliquées à l’analyse des produits phosphorylés. La partie bibliographique situe d’abord l’intérêt des monolithes pour le développement des techniques séparatives en portant une attention particulière à la problématique de miniaturisation. L’état de l’art sur l’utilisation du dioxyde de titane, dans les sciences séparatives, est ensuite établi. À ce niveau, les principales caractéristiques physico-chimiques et chromatographiques de ce matériau sont revues pour les lits particulaires. Un descriptif de la synthèse des monolithes de dioxyde de titane par le procédé sol-gel est ensuite détaillé avant d’illustrer la mise en oeuvre de ce type de colonnes dans les techniques séparatives. La partie expérimentale est axée d’abord sur la compréhension du comportement du dioxyde de titane particulaire en chromatographie liquide à interaction hydrophile (HILIC). Le travail expérimental est ensuite orienté vers l’élaboration d’un procédé sol-gel répétable, permettant d’obtenir le matériau sous le format monolithique. Dans un premier temps, le support est élaboré sous forme de barreau, dont l’utilisation potentielle après mise en colonne est illustrée dans le cadre de la purification et de l’enrichissement des acides aminés phosphorylés. Des adaptations de protocole sont apportées pour la synthèse in situ de ces monolithes à l’intérieur des capillaires afin de répondre aux contraintes des techniques séparatives miniaturisées. Ces monolithes sont caractérisés en HILIC, par comparaison avec les phases particulaires. Pour terminer, les propriétés chromatographiques originales de ces phases sont mises à profit pour la séparation et le traitement d’échantillons, contenant des produits phosphorylés / This manuscript is dedicated to the development of monolithic titania phases for chromatographic analysis of phosphorylated compounds. The bibliography section first summarizes the interest of monolithic phases for the development of separation techniques while emphasizing on the problem of miniaturization. The state of the art on the use of titanium dioxide in liquid chromatography techniques is established. In this subject, the physico-chemical and chromatographic behaviour of this material are reviewed for particle beds. Then a detailed description of the sol-gel synthesis of monolithic titania is presented with a final illustration of the potential use of this support in separation techniques. The experimental part concentrates first on the analysis of the chromatographic behaviour of particulate titania in the hydrophilic interaction mode (HILIC). The work is then focused on the development of a repeatable sol-gel process that enables the formation of monolithic titania. The monolithic phase is first synthesized at a large scale, and its potential use, after column cladding, is illustrated with the purification and enrichment of phosphorylated amino acids. The elaboration process is also adapted to meet with the miniaturized separation techniques by performing an in situ synthesis route within capillary columns. These columns are characterized in HILIC by comparison with the chromatographic properties observed for titania particulate beds. The original behaviour of native titania observed also for the synthesized monolithic phases is finally applied to the separation and sample treatment of mixtures of phosphorylated products

Afin de pallier aux problèmes dus aux limites de détection des capteurs et des détecteurs usuels, un système de préconcentration est indispensable. Ce microcomposant permet d’accumuler le ou les vapeur(s) à détecter à l’aide d’un adsorbant et permet de les libérer sous l’effet d’une montée brutale de la température vers un détecteur. Une amplification de la concentration et donc du signal est ainsi obtenue.Cette thèse poursuit le développement d’un préconcentrateur pour la détection de vapeurs toxiques et d’explosifs. Ce préconcentrateur sera constitué d’un microcomposant en silicium rempli d’un adsorbant et muni d’une résistance de chauffage sur sa face inférieure. Des capillaires métalliques permettent d’assurer la circulation du gaz dans le dispositif. Différents types de préconcentrateurs ont été développés avec différents adsorbants afin satisfaire les conditions pour des applications concernant les composés organiques volatils (COV) et les explosifs. L’optimisation des phases d’adsorption et de désorption est cruciale pour le procédé.Le couplage entre un micro-chromatographe et un préconcentrateur a été réalisé et a montré l’apport de ce microcomposant pour la chromatographie. L’analyse d’un mélange de COV a pu être réalisée avec des concentrations initiales de l’ordre de 40 ppb alors que la limite de détection de l’appareillage était de quelques ppm. Un facteur d’enrichissement de 800 a été atteint.L’avantage de l’utilisation du silicium poreux a également été mis en évidence pour l’adsorption de gaz avec des faibles pressions de vapeur saturante. Cette propriété est intéressante pour la préconcentration de vapeur d’explosifs. / In order to overcome problems due to the conventional sensors detection limits, a preconcentration system is required. Accumulation of vapor(s) for detection is possible with an adsorbent and allows releasing them toward a detector, under the effect of a sudden rise of the temperature. Amplification of the concentration and the signal are obtained.This thesis continues the development of a preconcentrator for the detection of toxic gas and explosives. This preconcentrator is made of a silicon microcomponent filled with an adsorbent and a heater at its back. Two metal capillary allow ensuring the gas flow into the device. Various designs of preconcentrators were developed with different adsorbents to satisfy the requirements for volatile organic compounds (VOCs) and explosives applications.The optimization of adsorption and desorption phases is very important for the process.The coupling between a micro-chromatograph and a preconcentrator was conducted and showed the contribution of the microcomponent to the chromatography. Analysis of a VOCs mixture was achieved with initial concentrations in the order of 40 ppb, whereas the detection limit was of a few ppm. An enrichment factor of 800 was achieved.The advantage of using porous silicon was also demonstrated for the gas adsorption with low saturation vapor pressure. This result is interesting for explosive vapor préconcentration.

Les tubulines sont des protéines impliquées dans des processus biologiques essentiels à la vie cellulaire. Elles sont polymodifiées en leurs extrémités C-terminales. Différentes techniques ont été utilisées pour caractériser les polymodifications des tubulines. Mais certaines difficultés persistent concernant l’indentification fine de plusieurs structures. Le couplage de spectrométrie de masse à la mobilité ionique représente une avancée technique plus pertinente pour la séparation d’isomères de structures. En effet, la mobilité ionique peut séparer des ions de même rapport m/z en fonction de leur conformation. Dans la première partie de cette thèse, une analyse par mobilité ionique et spectrométrie de masse en tandem a permis la séparation de deux peptides de synthèse mimant des peptides C-terminaux de tubuline α diglycylés. L’hormone de croissance (GH) est une hormone anabolique et un agent dopant pour les sportifs. La disponibilité de la hGH recombinante (rhGH) dans le marché noir a augmenté la fréquence du dopage à la GH. Les tests antidopage approuvés par l’agence mondiale d’antidopage sont confrontés à certaines limites. Dans la deuxième partie de ma thèse, des analyses comparatives de la hGH naturelle et la rhGH ont été réalisées par spectrométrie de masse couplée à la chromatographie liquide en phase inverse pour trouver une différence chimique entre la hGH naturelle et la rhGH. La hGH naturelle extraite des glandes pituitaires de cadavres est glycosylée alors que la rhGH n’est pas modifiée. De manière intéressante, cette glycosylation se trouve sur un peptide protéospécifique de la hGH. Ce travail ouvre une piste pour le développement d’une nouvelle méthodologie pour les tests anti-dopage à la GH. / The tubulins are proteins involved in cellular processes that are essential for cell life. The tubulins are polymodified at their C-terminal extremities. Different techniques have been used to characterize the polymodifications of tubulins. However, some challenges remain in the fine identification of some structures. In fact, mass spectrometry ion mobility can separate ions of the same m/z ratio depending on their conformations. In the first part of this thesis, an ion mobility mass spectrometry analysis allowed the separation of two synthetic peptides that mimic the structure of C-terminal peptides of biglycylated α-tubulins. In order to extrapolate this type of experiment to the C-terminal peptides purified from biological tubulins, we employed an analytical process to analyze these peptides from purified brain tubulins. Growth hormone (GH) is an anabolic hormone and a doping agent used by athletes. The availability of rhGH in the black-market has continuously increased because of doping in sports. The natural and the biosynthetic hGH have identical peptidic sequences. So far, the valid hGH anti-doping tests by the world antidoping agency are based on immunological recognition. However, Immunoassays have their own limitations. Therefore, the next generation analysis of GH has to be more specific and accurate. In the second part of this thesis, mass spectrometry coupled to reversed phase chromatography was used to find chemical differences between the pituitary hGH and the rhGH. The pituitary extracted hGH is glycosylated whereas the biotech product is sugar free. The present work represents an opening towards a novel methodology for a novel hGH anti-doping test.

L’enrichissement préférentiel (PE) est un procédé de brisure de symétrie spontanée non-usuel développé par le groupe du Pr Tamura à la fin des années 90. En commençant avec une solution avec un léger excès énantiomèrique et une haute sursaturation, le système dévie de la cristallisation classique, en conditions stagnantes (hors équilibre) vers une solution très enrichie et des cristaux légèrement enrichis dans le contre énantiomère. L’objectif de cette thèse est d’évaluer le procédé de PE avec le cas d’étude du Fumarate d’Arginine dans un mélange eau/éthanol, pour obtenir une meilleure compréhension de son mécanisme. Les principaux résultats de ce travail peuvent être résumé ainsi :– En réalisant un suivi temporel conduit par l’arrêt d’expérience à 11 différents temps le PE apparaît être un procédé continu ;– Les expériences de diffraction des rayons X montrent que les transitions polymorphiques ne sont pas requises pour le procédé de PE, différentes phases ou successions de phases peuvent conduire à des résultats identiques de PE ;– Des échanges entres énantiomères de la solution mère et des cristaux déposés ont été démontrés par addition de L-Arginine marquée comme contre énantiomère durant des expériences commençant avec un excès de D-Arginine. Pour conclure ce manuscrit un mécanisme révisé du PE comme procédé continu est proposé. Les critères pour faire fonctionner le PE sont réduits à quatre : i) une forte différence de solubilité entre les énantiomères purs et le composé racémique ; ii) le composé racémique doit avoir un domaine de solution solide ; iii) le système doit rester stagnant durant tout le procédé ; iv) la composition initiale doit être dans une zone appropriée du diagramme de phase (pour le cas du Arg-Fum : un e.e. < 12% et un β ≥ 4). / Preferential Enrichment (PE) is an unusual spontaneous symmetry breaking phenomenon developed by Prof. Tamura’s group in the late nineties. Starting with a slightly enriched in one enantiomer, highly supersaturated solution, this out of equilibrium process permits the system to deviate from standard crystallization, in stagnant conditions, in order to obtain a highly enriched mother liquor and deposited crystals slightly enriched in the opposite enantiomer. The objective of this thesis is to assess the process of PE with the case study of Arginine Fumarate in water/ethanol mixture to obtain a better understanding of its mechanism. The main results of this work can be summarized as:– Using time monitoring performed by stopping experiments at 11 different times, PE appeared as a continuous process;– In situ X-Ray powder diffraction experiments showed that polymorphic transitions are not required for PE, different phases or successions of phases can achieve identical results of preferential enrichment;– Exchanges between enantiomers of mother liquor and the deposited crystals were demonstrated by addition of labeled-L-Arginine as counter enantiomer during experiments starting with an excess of D-Arginine.To conclude this work a revised mechanism for PE as a continuous process is proposed. Criteria to achieve PE are reduced to four: i) a strong difference of solubility between pure enantiomers and racemic compound; ii) the racemic compound should crystallize with a solid solution domain; iii) the system should stay stagnant during the complete process; iv) the initial composition should be in the appropriate zone of the phase diagram (e.g. for Arg-Fum system a e.e. < 12% and a β ≥ 4).

Cette thèse vise à démontrer la pertinence de la chromatographie en phase supercritique (SFC) et de son couplage à la spectrométrie de masse tandem haute résolution (HRMS/MS) quant à l’étude de produits naturels en mélange complexe. Pour y parvenir trois projets ont été menés en parallèle.Une méthode d’analyse structurale ciblée sur les acétogénines d’Annonaceae a été développée. Le recours à une cationisation post-colonne par des sels de lithium a permis d’obtenir les informations structurales recherchées. Des études ont également été menées quant à l’influence de la nature du cation sur la conformation de l’adduit formé et les voies de fragmentation observées.Une séparation de composés polaires et ionisables a également été mise au point à travers l’étude des nucléosides modifiés de l’ARN. La SFC-HRMS permet la séparation et l’étude d’un grand nombre de modifications et constitue donc un nouvel outil d’analyse pour le biologiste.Pour finir, une étude en lipidomique globale a également été entreprise. Bien que préliminaires, les premiers résultats semblent très prometteurs avec pour but de développer des méthodes d’analyses non ciblées associés à des outils d’annotation automatique.Pour chaque projet, la pertinence de nos approches a été vérifiée par l’étude d’échantillons réels et complexes permettant de tirer des conclusions réalistes quant aux possibilités de la SFC-HRMS/MS pour l’étude de composés naturels. / This PhD work aims to demonstrate the relevance of supercritical fluid chromatography (SFC) and its hyphenation to high resolution tandem mass spectrometry (HRMS/MS) in the field of natural product analysis. Three different research projects were carried out.A new strategy for structural analysis of Annonaceous acetogenins was developed by SFC and targeted HRMS/MS including post-column lithium cationisation to give access to the relevant structural information. Investigations were conducted to observe the influence of cations onto the gas-phase conformation and fragmentation pathways.A separation of polar and ionisable compounds was also developed using modified nucleosides from RNA as models. The SFC-HRMS method led to the separation and analysis of several tens of modifications and demonstrated to be a new performant analytical tool for biologists.Finally, a global lipidomic approach was optimized. Preliminary results look compatible with the development of untargeted approaches using automatic annotation tools.For each project, the relevance of our work was evaluated analyzing complex samples to obtain a realistic point of view of the capabilities for SFC-HRMS/MS systems for natural product studies.

La protéine Hsp12 est une protéine de choc thermique (12 kDa) exprimée par la levure Saccharomyces cerevisiae et associée à la réponse au stress. En effet, il a été montré que les transcrits du gène HSP12 sont exprimés en réponse à différents stress. De plus, la protéine Hsp12 serait responsable de la sucrosité du vin observée au cours de l’autolyse des levures lors de la vinification. Cependant, le goût sucré pourrait provenir de la protéine Hsp12 entière, ou, d’un ou plusieurs peptides issus de la protéine Hsp12. L’objectif de cette étude était d’obtenir la protéine Hsp12 native pure à partir de culture de Saccharomyces cerevisiae afin de comprendre son rôle, d’une part dans la réponse au stress chez la levure et, d’autre part dans la sucrosité du vin.Des cultures de la souche œnologique Fx10 de Saccharomyces cerevisiae ont été réalisées afin d’étudier la protéine Hsp12 native. La production de la protéine Hsp12 en réponse à différents stress a été étudiée au cours des cultures, grâce à un dosage ELISA développé lors de cette étude. Il a ainsi été mis en évidence que la protéine Hsp12 est produite en quantités significativement supérieures en réponse à des stress thermiques et osmotiques. Le stress éthanolique quant à lui entraine une diminution de la quantité de protéine Hsp12. La protéine Hsp12 native extraite à partir des cultures a été purifiée. Un procédé de purification en 3 étapes a été développé. Plusieurs résines et conditions chromatographiques ont été criblées en microplaques. La résine en mode mixte PPA HyperCel a permis d’éliminer des contaminants majeurs grâce à sa sélectivité. La chromatographie d’exclusion stérique a permis d’éliminer les contaminants restants et ainsi d’obtenir la protéine Hsp12 native avec une pureté de 99%. Différentes techniques biophysiques et calorimétriques ont permis de caractériser la protéine Hsp12 native purifiée, en présence de membranes modèles. Il a ainsi été démontré que la protéine Hsp12 est une protéine intrinsèquement non ordonnée (intrinsically disordered protein - IDP). Elle est caractérisée par l’absence de structures secondaires en solution aqueuse et par la formation d’hélices α en présence de SDS et du phospholipide PiP2. La liaison avec le PiP2 suggère un rôle dans la stabilisation de la membrane plasmique des levures. La protéine Hsp12 pourrait ainsi avoir un rôle de chaperonne de membrane. Une caractérisation organoleptique de la protéine Hsp12 native purifiée a également été réalisée. Il apparait que la protéine Hsp12 entière n’est pas responsable de la sucrosité mais plutôt un ou des peptides issus sa digestion enzymatique. / Hsp12 is a heat shock protein (12 kDa) expressed by the yeast Saccharomyces cerevisiae and associated with the stress response. Indeed, it has been shown that transcripts of the HSP12 gene are expressed in response to different stresses. In addition, the protein Hsp12 would be responsible for the sweetness of wine observed during the autolysis of yeasts during vinification. However, the sweet taste could come from the entire Hsp12, or from one or more peptides derived from Hsp12. The objective of this study was to obtain the pure native Hsp12 protein from Saccharomyces cerevisiae culture in order to understand its role, on the one hand in the stress response in yeast and on the other hand in the sweetness of wine.Cultures of the Saccharomyces cerevisiae Fx10 enological strain were made to study the native Hsp12 protein. The production of the Hsp12 protein in response to different stresses was studied during the cultures, thanks to an ELISA assay developed during this study. It has thus been demonstrated that the Hsp12 protein is produced in significantly greater quantities in response to thermal and osmotic stress. Ethanol stress causes a decrease in the amount of Hsp12 protein. The native Hsp12 protein extracted from the cultures was purified. A 3-step purification process has been developed. Several resins and chromatographic conditions were screened in microplates. PPA HyperCel mixed-mode resin has eliminated major contaminants due to its selectivity. Steric exclusion chromatography allowed the removal of remaining contaminants and thus obtain the native Hsp12 protein with a purity of 99%. Various biophysical and calorimetric techniques were used to characterize the purified native Hsp12 protein in the presence of model membranes. It has thus been demonstrated that the Hsp12 protein is an intrinsically disordered protein (IDP). It is characterized by the absence of secondary structures in aqueous solution and by the formation of α helices in the presence of SDS and phospholipid PiP2. The binding with PiP2 suggests a role in the stabilization of the plasma membrane of yeasts. The Hsp12 protein could thus act as a membrane chaperone. Organoleptic characterization of the purified native Hsp12 protein was also performed. It appears that the entire Hsp12 protein is not responsible for the sweetness but rather one or more peptides resulting from its enzymatic digestion.

Les résidus forestiers et agricoles, également appelés résidus lignocellulosiques, constituent de par leur quantité et leur structure un potentiel unique pour la production d’énergie et de molécules d’origine renouvelable, afin de pallier à la raréfaction des hydrocarbures fossiles ainsi qu’aux problèmes environnementaux liés à l’utilisation de ceux-ci. Les biomasses lignocellulosiques sont constituées principalement de cellulose, hémicelluloses et lignines. Le fractionnement et la purification de ces trois constituants est nécessaire à leur valorisation comme produits de substitution des hydrocarbures fossiles. Cette étude s’est tout d’abord attachée à la description et la compréhension des fractionnements chimiques acides et alcalins de la lignocellulose et aux voies de purification qui leur sont actuellement associées. Les travaux expérimentaux ont été réalisés à partir de deux matières premières : la bagasse de canne à sucre et le tourteau de tournesol. Une caractérisation fine de ces matières premières ainsi que des extraits acides et alcalins obtenus à partir de ces matières a été réalisée. Les étapes de purification se sont focalisées sur l’extrait alcalin de bagasse obtenu en conditions douces. En effet, la bagasse de canne à sucre peut être considérée comme un bon modèle de biomasse lignocellulosique, et la purification d’extraits alcalins lignocellulosiques obtenus en conditions douces a été peu étudiée malgré l’intérêt de ce procédé de fractionnement. La filtration membranaire et la chromatographie d'élution sur résine échangeuse de cation ont été évaluées séparément puis en association, afin de séparer les cinq grandes familles de molécules constitutives de l’extrait : des oligomères de lignines, des oligomères de sucres, des monomères phénoliques, de l’acide acétique et des sels inorganiques. Des essais d’ultrafiltration sur plusieurs membranes en faisant varier divers paramètres de filtration ont permis de déterminer que les oligomères de lignine et de sucres, récupérés dans le rétentat, sont séparés des monomères phénoliques, de l’acide acétique et des sels inorganiques, récupérés dans le perméat. Une membrane en fibres creuses de 10 kDa en polysulfone a présenté les meilleures performances de séparation et a été retenue pour les essais suivant en mode concentration et diafiltration. Des essais de chromatographie d'élution avec de l’eau pour éluant en testant plusieurs résines cationiques fortement acides ont montré qu’une fraction très pure d’oligomères de lignines et de sucres peut être obtenue avec une résine de type macroporeuse, alors qu’une résine de type gel a permis la séparation de monomères phénoliques entre eux en fonction de la présence ou non dans leur structure d’une fonction carboxyle. A partir d’extrait alcalin de bagasse, un procédé intégré de purification a été développé combinant de la filtration membranaire puis de la chromatographie sur le perméat et de la précipitation par ajout d’acide sur le rétentat. Il en a résulté l'obtention de quatre fractions purifiées : les monomères phénoliques avec fonction carboxyle, les sels inorganiques et les monomères phénoliques sans fonction carboxyle, les oligomères de lignine, et les oligomères de sucres. / Agricultural and forestry residues, also known as lignocellulosic residues, have a unique potential based on their quantity and structure for the production of renewable energy and molecules, inorder to solve the issues raised by the increasing scarcity of fossil hydrocarbons and the environmental disorder caused by their use. Lignocellulosic biomasses are essentially made ofcellulose, hemicelluloses and lignin. Fractionation and purification of these three compounds are necessary for their valorization as substitutes of fossil hydrocarbons. In the first place, this studydescribed the chemical fractionation of lignocellulose under acidic and alkaline conditions, and their related purification pathways. The experimental work was carried out on two raw materials:sugarcane bagasse and sunflower oil cake. A thorough characterization of the raw materials as well as the acid and alkaline extracts produced from these materials was performed. The purification steps focused on the sugarcane bagasse mild alkaline extract. Indeed, sugarcane bagasse can be considered a model lignocellulosic biomass and the purification of lignocellulosicmild alkaline extract has not been widely studied despite the numerous assets of this fractionation process. Membrane filtration and elution chromatography on strong acid cationic exchange resins were assessed individually then combined, for the separation of the five main pools of molecules that constitute the extract: lignin oligomers, sugar oligomers, phenolic monomers, acetic acid and inorganic salts. Ultrafiltration trials run on several membranes under various filtration conditions showed that lignin and sugar oligomers, recovered in the retentate, were separated from phenolicmonomers, acetic acid and inorganic salts, recovered in the permeate. A hollow fiber membrane of 10 kDa in polysulfone exhibited the best separation performance and was selected for further trials in concentration and diafiltration modes. Elution chromatography tests using water as eluent and various strong acid cationic exchange resins resulted in the production of a very pure lignin andsugar oligomers fraction with a macroporous-type resin, whereas a gel-type resin led to the separation of phenolic monomers from each other depending on the presence or absence in their structure of a carboxyl group. From a sugarcane bagasse mild alkaline extract, an integrated purification process was developed combining membrane filtration then chromatography on the permeate and precipitation by acid addition on the retentate. It resulted in the production of four purified fractions: phenolic monomers with a carboxyl group, inorganic salts and phenolicmonomers without carboxyl group, lignin oligomers, and sugar oligomers