De par leur diversité de mécanismes de déterminisme du sexe et de chromosomes sexuels, les poissons téléostéens représentent d’excellents modèles pour mieux comprendre les bases moléculaires et évolutives du contrôle du développement sexuel chez les vertébrés. Grâce à l’analyse de chromosomes artificiels bactériens couvrant les chromosomes sexuels du platy Xiphophorus maculatus, trois copies d’un nouveau gène nommé teximY ont été découvertes dans la région de déterminisme du sexe du chromosome Y mais pas du chromosome X. Un gène texim1 très apparenté à teximY ainsi que trois gènes plus divergents ont été identifiés sur les autosomes. Les gènes teximY sont préférentiellement exprimés dans les testicules, au niveau des cellules germinales lors des étapes tardives de la spermatogénèse, alors que texim1 est également transcrit dans les gonades femelles. Des gènes texim ont été détectés chez d'autres poissons téléostéens mais pas chez le poisson-zèbre, ainsi que chez des céphalocordés, des urocordés et des échinodermes mais pas chez les tétrapodes. Les gènes texim codent pour des estérases putatives à domaine SGNH apparentées à des protéines cellulaires procaryotes et eucaryotes ou codées par des retrotransposons animaux. Les gènes texim sont associés à des transposons Helitron chez les poissons mais pas chez les autres animaux, suggérant capture et mobilisation du gène ancestral texim par un transposon à la base de la radiation des téléostéens. TeximY pourrait jouer un rôle dans la transposition du transposon Helitron dans la lignée germinale mâle, ou correspondre à un gène de spermatogenèse mobilisé par le transposon Helitron sur les nouveaux chromosomes sexuels de poissons. / The molecular and evolutionary basis of sex determination in vertebrates needs to be unveiled via comparison of different systems. Fish exhibit hypervariability of sex determination mechanisms. Thanks to the analysis of the Bacterial Artificial Chromosome (BAC) library covering the sex chromosomes of the platyfish Xiphophorus maculatus (Rio Jamapa population, XX /XY), three copies of a new gene have been identified in the sex-determining region of the Y but not the X chromosome, and named teximY. Four autosomal counterparts of teximY have been also detected in the genome of the platyfish with one of them, texim1 presenting 95% of cDNA sequence identity with the Y-linked copies. RT-qPCR expression analyses have been performed for each copy in male and female tissues. Two Y-linked teximY copies were preferentially expressed in testis, whereas the autosomal copy texim1 showed preferential expression in male and female gonads. In situ hybridizations with a teximY/1 probe revealed expression in late spermatids and spermatozeugmata. Texim sequences were detected in several fish species, but not in zebrafish, as well as in cephalochordates, urochordates and sea echinoderms but not in tetrapods. Predicted Texim proteins are related to proteins from different origins. Interestingly, texim genes are associated with a Helitron transposon in fish but neither in cephalochordates nor in echinoderms, suggesting capture and mobilization of an ancestral texim gene at the base of the bony fish lineage. TeximY proteins may play a role in Helitron transposition in the male germ line in fish, or texim genes are spermatogenesis genes mobilized and spread by transposable elements in fish genomes.

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A inativação do cromossomo X (ICX) em fêmeas é um exemplo de regulação epigenética. O silenciamento de um dos cromossomos X leva à formação estável da heterocromatina facultativa através da aquisição de múltiplas modificações na cromatina que são mantidas nas subsequentes divisões celulares. Atualmente, algumas características epigenéticas associadas à manutenção da ICX têm sido descritas, contudo os mecanismos de ação e a identidade dos diferentes fatores envolvidos na manutenção da ICX ainda são desconhecidos ou pouco compreendidos. Nosso laboratório realizou uma triagem funcional genômica por bibliotecas de shRNAs (short harpin RNAs) para encontrar genes envolvidos na manutenção da ICX em humanos. A partir deste estudo foram identificados 20 novos genes candidatos a estarem envolvidos na manutenção da ICX. Assim, o objetivo deste trabalho foi validar o grau de envolvimento de dois destes genes candidatos (H3F3B e ASF1A) no processo de controle epigenético do cromossomo X. Para isto, foi realizado o silenciamento dos genes candidatos através da utilização de partículas lentivirais portando shRNAs específicos em fibroblastos primários femininos heterozigotos para uma mutação no gene HPRT e com desvio total de ICX, onde o único alelo normal do gene HPRT está no Xi. A reativação do Xi nestas células foi avaliada por cultivo das mesmas em meio HAT, que seleciona células HPRT+. Só sobreviveram os fibroblastos que foram silenciados para o gene H3F3B. Nestes, as células transduzidas com o shH3F3B.2 expressam o alelo selvagem do gene, presente no Xi, além do gene mutante. Ensaios de RNA-FISH e trimetilação de histonas foram feitos nessas células para avaliar a perda das marcas de cromatina inativa. Foi observada uma perda da nuvem de XIST nas células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionadas em HAT em passagens altas. Por último, análises de expressão alelo-específica de genes ligados ao X comprovaram que dois genes que são submetidos à ICX apresentaram expressão do alelo inativado (FLNA e FHL1). Porém, também foi observada uma mudança no padrão de expressão alelo-específica em genes autossômicos. Finalmente, as análises de expressão geral do cromossomo X mostraram que as células transduzidas com o shH3F3B.2 e selecionada em HAT tinham uma expressão gênica aumentada em relação ao controle. Em conclusão, nossos resultados sugerem uma descondensação da cromatina no cromossomo Xi e portanto um provável envolvimento do gene H3F3B na manutenção da ICX. / The X chromosome Inactivation (XCI) in females is an example of epigenetic regulation. Silencing of one of the X chromosomes leads to the stable formation of the facultative heterochromatin through the acquisition of multiple modifications in the chromatin that are maintained in the subsequent cell divisions. Currently, some epigenetic features associated with the maintenance of XCI have been described. Nonetheless, the mechanisms of action and the identity of the different factors involved in the maintenance of XCI are still unknown or poorly understood. Our laboratory performed a genomic functional screening by shRNA (short harpin RNAs) libraries to find genes involved in the maintenance of XCI in humans. From this study, we identified 20 new candidate genes to be involved in the maintenance of XCI. Thus, the objective of this work was to validate the degree of involvement of two of these candidate genes (H3F3B and ASF1A) in the epigenetic process control of the X chromosome. For this, the silencing of the candidate genes was performed in female heterozygous primary fibroblasts for a mutation of the HPRT gene and with a total XCI shift through the use of lentiviral particles carrying specific shRNAs, where the only normal allele of the HPRT gene is in the Xi (inactivated X). Xi reactivation was evaluated in these cells by culturing them in HAT medium, which selects HPRT + cells. Only the fibroblasts that were silenced for the H3F3B gene survived. Furthermore, the cells transduced with shH3F3B.2 express the HPRT wild gene allele, present in Xi, in addition to the mutant gene. RNA-FISH and histone trimethylation assays were performed on these cells to evaluate the loss of inactive chromatin marks. A loss of the XIST cloud was observed in cells transduced with shH3F3B.2 and selected in HAT at high passages. Finally, allele-specific expression analyzes of X-linked genes showed that two genes that undergo XCI showed expression of the inactivated allele (FLNA and FHL1). However, a change in allele-specific expression pattern was also observed in autosomal genes. Finally, the X chromosome general expression analyses showed that cells transduced with shH3F3B.2 and selected on HAT had increased gene expression relative to the control. In conclusion, our results suggest a decondensation of the chromatin in the Xi chromosome and therefore a probable involvement of the H3F3B gene in the maintenance of ICX.

Entre le XIème et le XVIème siècle, la Mer des Indes fut le théâtre de nombreux mouvements populationnels aux fins essentiellement commerciales ou coloniales. Madagascar se trouve à la croisée des mondes asiatiques et africains. La côte sud-est malgache a vu l'arrivée de plusieurs migrations : la dernière, probablement vers la fin du XVème siècle, serait celle des Antemoro dont une partie d'entre eux se réclame d'une origine arabe et se rattache à La Mecque. L'éthnie des Antemoro a fait l'objet de nombreuses études anthropologiques et linguistiques. Néanmoins, le débat sur l'origine des migrants fait toujours l'objet d'hypothèses contradictoires. Leurs origines génétiques pourraient ainsi être l'Arabie, l'Afrique de l'Est, l'Inde ou encore l'Asie du Sud-Est à une époque où ces régions étaient déjà islamisées. Ce travail a consisté à étudier la diversité génétique d'une population Antemoro afin d'apporter des éléments de réponse à la question de leur origine biologique. Ce projet interdisciplinaire a pour objectif de mettre en relation l'anthropologie culturelle et sociale avec l'anthropologie biologique. Le polymorphisme du chromosome Y a été étudié afin de rechercher les origines des lignées paternelles par l'analyse de 17 marqueurs microsatellites ainsi que des mutations ponctuelles de l'ADN de la partie non recombinante du chromosome Y. De même, la variabilité génétique des lignées maternelles a été analysée par séquençage des régions hypervariables I et II de l'ADN mitochondrial, et par la définition de polymorphismes bialléliques dans sa région codante. Nous avons mis en évidence la présence de deux haplogroupes du chromosome Y chez certains groupes Antemoro, qui les différencient de la diversité habituellement rencontrée dans les populations malgaches. Bien que la majeure partie des Antemoro entre dans la diversité observée en Afrique sub-Saharienne et en Asie du Sud-Est, quelques haplotypes, des lignées paternelles, les lieraient au Moyen-Orient. Les lignées maternelles, quant à elles, ne les différencient pas de celles des autres populations malgaches. L'isolat génétique formé par certaines « pseudo-castes » Antemoro confirme bien l'isolat culturel. Ce travail apporte une nouvelle vision de la diversité génétique humaine à Madagascar. / Between the 11th and 16th century, the Indian Ocean was the scene of many population movements notably for commercial and colonial purposes. Madagascar is located at the crossroads of the Asian and African continents. Several migrations have occurred in this region; the last one during the late 15th century involved the Antemoro population who claimed an Arabian origin in Mecca. Many anthropological and linguistic studies have been carried out on this ethnic group, but the origin of these migrants remains contentious. It is uncertain whether their origins were in Arabia, East Africa, India or Southeast Asia, when these regions were Islamized. In this study we assessed the genetic diversity of an Antemoro population from villages between Manakara and Vohipeno, to determine their biological origin. The aim of our interdisciplinary study was to link cultural and social anthropology with biological anthropology. Y-chromosome polymorphisms were studied by analyzing 17 microsatellites markers and some SNPs in the non-recombining region of the Y-chromosome to determine the biological origins of the paternal lineages. In addition, genetic variability of maternal lineages was analyzed by sequencing hypervariables regions I and II, and by defining bi-allelic polymorphisms in the coding region of mitochondrial DNA. We found two Y-chromosome haplogroups in some Antemoro groups that differentiated them from the typical genetic variability found in other Malagasy populations. Although most of the Antemoro showed a genetic diversity similar to that observed in sub-Saharan Africa and Southeast Asia, few haplotypes associated to paternal lineages linked them to the Middle East. Maternal lineages did not differ from those found in other Malagasy populations. The genetic isolate formed by some Antemoro groups confirmed their cultural isolation. This study provides a new view of the human genetic diversity in Madagascar.

Les cellules déficientes pour la recombinaison homologue (RH) présentent un ralentissement des fourches de réplication, un nombre aberrant de centrosomes et une aneuploïdie même en absence de stress exogène (Bertrand P 2003, Daboussi F 2005, 2008, Deng 1999, 2002, Griffin 2000, Kraakman-van der Zwet 2002). De plus, la fréquence des mitoses présentant des chromosomes surnuméraires est plus élevée dans ces cellules.L’ensemble des ces résultats suggéraient que le ralentissement des fourches de réplication dans les cellules déficientes pour la RH pourrait avoir un impact direct sur la formation de centrosomes surnuméraires. De plus, nous voulions savoir si cela pouvait également influencer la ségrégation des chromosomes au cours de la mitose. Les résultats que nous avons obtenus sont rassemblés dans l’article intitulé : “Homologous Recombination protects against mitotic defects and unbalanced chromosome segregation caused by spontaneous replication stress”.Le traitement des cellules compétentes pour la RH avec 5µM d’hydroxyurée (HU), un inhibiteur de l’enzyme de synthèse des dNTPs, induit un ralentissement des fourches de réplication parfaitement comparable à celui observé dans les cellules déficientes pour la RH. Après traitement à l’HU des cellules compétentes pour la RH, la fréquence de mitoses présentant des chromosomes surnuméraires augmente et devient similaire à la fréquence de mitoses avec des chromosomes surnuméraires pour les cellules déficientes pour la HR non traitées à l’HU. Nous avons mesuré l’impact de l’HU sur l’apparition des ponts anaphasiques et sur des défauts de ségrégation des chromosomes lors de la mitose. En l’absence de traitement, nous observons une fréquence plus élevée de ponts anaphasiques et de défauts de ségrégation dans des cellules déficientes pour la RH. Des traitements avec 5µM d’HU augmentent la fréquence des ponts anaphasiques et des erreurs de ségrégation dans les cellules compétentes pour la RH, pour atteindre un niveau comparable aux cellules déficientes pour la RH. Ainsi, une altération de la dynamique de réplication consécutive à une déficience de RH ou à un traitment avec de faibles doses d’HU induit des défauts au cours de la mitose. Un lien direct entre une dynamique de réplication anormale et l’apparition d’un nombre aberrant de centrosomes pourrait être la persistance en mitose d’ADN non répliqué ou endommagé.  Comme l’ADN non répliqué ou les fourches bloquées induisent la formation d’ADN simple brin couvert par RPA, nous avons compté le nombre de cellules en G2/M présentant des foyers de RPA, et observé que la fraction de cellules ayant plus de 5 foyers de RPA augmente dans des cellules déficientes pour Brca2. En conclusion, nous proposons un lien direct entre des altérations de la cinétique de réplication, l’apparition de centrosomes surnuméraires et des défauts de ségrégation des chromosomes en mitose dans les cellules déficientes pour la RH même non soumises à un stress exogène. L’utilisation de faibles doses d’HU dans des cellules compétentes pour la RH mime les phénotypes observés dans les cellules déficientes pour la RH et confirme notre modèle.Nous avons également cherché à comprendre les causes du ralentissement des fourches de réplication observé dans les cellules déficientes pour la RH. Il est ainsi possible que les arrêts de fourches spontanés soient une conséquence d’un stress oxydatif endogène. Dans les cellules compétentes pour la RH, le redémarrage des fourches bloquées est possible et assure une progression normale de la réplication de l’ADN. Ceci favorise une ségrégation équilibrée des chromosomes, le maintien de la diploïdie et la stabilité du génome. Dans des cellules déficientes pour la RH, les blocages de fourches devraient être délétères puisque les principaux mécanismes de redémarrage des fourches ne sont pas fonctionnels. De plus, l’arrêt prolongé des fourches ainsi que les cassures double brin générées par l’effondrement des fourches devraient activer des voies de signalisation. Nous avons néanmoins observé que les cellules ne sont pas bloquées dans le cycle cellulaire, ce qui suggère qu’un seuil supérieur de dommages doive être atteint pour induire l’arrêt du cycle. Les stress endogènes ne semblent donc pas suffisamment élevés pour atteindre ce seuil : même si l’ensemble des fourches parcourant le génome sont ralenties, l’activation d’origines cryptiques permet de compenser et ainsi de maintenir la progression dans le cycle. Mais puisque les cellules ne sont pas arrêtées dans le cycle, des fourches bloquées, de l’ADN endommagé ou non répliqué pourraient persister jusqu’à la transition G2/M et in fine perturber le déroulement de la mitose. Des centrosomes multipolaires provoquent la formation de fuseaux multipolaires et favorisent la ségrégation déséquilibrée des chromosomes, entraînant l’aneuploïdie, la déstabilisation du génome et le développement de cancers. / HR deficient cells show slow replication kinetics, aberrant centrosome number and aneuploidy even in the absence of any exogenous stress (Bertrand P 2003, Daboussi F 2005, 2008, Deng 1999, 2002, Griffin 2000, Kraakman-van der Zwet 2002). Frequency of mitosis with extra centrosomes is elevated and replication kinetics decreased in HR deficient compared to HR proficient cells, in the absence of exogenous stress. Thus the question arose, if replication slowing down in HR deficient cells has direct impact on the appearance of supernumerary centrosomes. Furthermore we wanted to know if this might directly impact chromosome segregation. The results we gained are brought together in the paper “Homologous recombination suppression causes spontaneous mitotic alterations through endogenous replication stress”. By treating our HR proficient cells with 5µM HU we found the perfect concentration to mimic replication dynamics of HR deficient cells in an HR proficient background. This concentration was applied to HR proficient cells. After HU treatment the frequency of mitosis with extra centrosomes was elevated in HR proficient cells. Now they showed the same frequency of mitosis with extra centrosomes, than unchallenged HR deficient cells. We measured the impact of HU treatment on occurrence of anaphase bridges or aberrant mitotic segregation. In the absence of treatment higher frequency of anaphase bridges and aberrant mitotic segregation was detected for HR deficient cells. With 5µM HU the frequency of anaphase bridges and aberrant mitosis could be elevated in HR proficient cells. Now they showed aberrant mitotic features with the same frequency than unchallenged HR deficient cells. A direct link between abnormal replication kinetics and aberrant centrosomes might be unreplicated or damaged DNA, that enter mitosis. Unreplicated or blocked DNA might harbour ss DNA bound RPA. Thus we counted G2/M cells with RPA foci. Indeed the fraction of cells that harbour more than 5 RPA foci was elevated in Brca2 deficient in comparison to Brca2 proficient cells. In conclusion we propose a direct link between delayed replication, supernumerary centrosomes and aberrant chromosome segregation in unchallenged HR deficient cells. If we mimicked replication kinetics of HR deficient cells in an HR proficient background, we also mimicked frequency of mitosis with extra centrosome number and aberrant chromosome segregation. Furthermore we investigated the causes of replication slowing down in HR deficient cells. It can be hypothesized that endogenous oxidative stress is implicated in spontaneous fork arrest. In HR proficient cells, reactivation of stalled replication forks and therefore normal replication progression is assured. This favours balanced chromosome segregation, diploidy and genetic stability.In HR deficient cells, replication fork blockage might be detrimental as the main restart mechanism for blocked forks is absent. Prolonged fork blockage or DSB’s arising by fork collapse or resolution of blocked replication forks might activate signalling pathways. However cells are not arrested in cell cycle progression, suggesting that a threshold should be reached to activate cell cycle arrest. Endogenous stress is not sufficient high to reach this threshold. Replication is genome wide slowed down. In this context, the activation of cryptic origins compensates at least partly the slow replication velocity. However, because cells were not arrested in cell cycle progression, some blocked replication forks and damaged or unreplicated DNA regions might persist until G2/M phase and affect centrosome duplication and chromosome segregation. Multipolar centrosomes cause multipolar spindles and favour unbalanced chromosome segregation leading to aneuploidy, genetic instability and cancer development.

Chez les bactéries, la ségrégation du chromosome est initiée durant la phase de réplication. Des expériences de time lapse, utilisées pour observer que la dynamique des loci frères durant le cycle cellulaire, montrent que, chez Escherichia coli, les régions sœurs restent colocalisées pour une période significative dans les régions des macrodomaines du chromosome et pour une courte période dans les régions non-structurées. Nous nous sommes posés la question suivante: est ce que l’étape de colocalisation révèle une réelle cohésion entre les chromatides sœurs ? Pour y répondre, nous avons développé un outil génétique, alternatif aux outils de biologie cellulaire, permettant de mesurer la distance entre les chromatides sœurs de manière directe. La fréquence de recombinaison intermoléculaire médiée par la recombinase Cre entre les sites loxP positionnés sur les chromatides sœurs est mesurée pour différentes positions. De cette fréquence, nous avons pu déduire la proximité entre les chromatides sœurs. Nous révélons que les loci frères restent proche l’un de l’autre pour une courte période après la réplication. Nous appelons cette étape la cohésion moléculaire, celle-ci est dépendante du locus considéré. Nous montrons que les facteurs qui favorisent la colocalisation des foci frères n’augmentent pas nécessairement l’habilité des loci frères à recombiner. En effet, la protéine MatP, un acteur de la colocalisation des macrodomaines Ter, n’affecte pas la cohésion entre les deux copies de cette région. La Topoisomérase IV est un facteur essentiel à la ségrégation des chromosomes. En son absence, les chromosomes ne peuvent se ségréger et restent colocalisés dans la cellule. Nous révélons par le test de recombinaison que l’absence de Topoisométase IV dans les cellules provoque une augmentation des interactions entre chromatides sœurs. Au final, nous avons montré que l’étape de cohésion est différente de la colocalisation, que les mécanismes moléculaires diffèrent d’une étape à l’autre et que les liens de précaténation moduleraient la cohésion post-réplicative entre chromatides sœurs. / In bacteria, the segregation of the chromosome is initiated during the replication phase. Time lapse experiments, used to watch the dynamic of loci during cell cycle, showed, in Escherichia coli, that the sister loci remain colocalized for a significant amount of time in the macrodomain regions of the chromosome and for shorter period in the Non Structured regions. We asked the following question: does this colocalization step reveal a real cohesion between the sister chromatids? To answer, we have developed a genetic tool, alternative to cell biology tools, to measure the distance between sister chromatids directly. The frequency of intermolecular recombination mediated by Cre recombinase loxP sites located on sister chromatids was measured for various loci. From this frequency we were able to deduce the proximity of sister chromatids. We revealed that sister loci remained in close proximity for a short period following replication. We called this step molecular cohesion, it is dependent on the considered locus. We showed that factors that promote colocalisation of sister foci do not necessarily increase the ability of sister loci to recombine. Indeed, the MatP protein, an actor of macrodomain Ter colocalisation, does not affect the cohesion between the two copies of this region. The TopoIV is essential for the segregation of chromosomes. In its absence, the chromosomes can not segregate and remain colocalized in the cell. We reveal by recombinaison assy that the absence of Topoisomerase IV revealed an increase of interactions between sister chromatids. To conclude, we have shown that the cohesion step is different from the colocalisation step, the molecular mechanisms differ from one stage to another and précaténation links take part in the post-replicative cohesion between sister chromatids

Les habitats sur le substrat de serpentine représentent un environnement hostile pour le développement des plantes. Ils sont caractérisés par un faible nombre d’espèces mais un haut niveau d’endémisme. Cette étude présente pour la première fois une série des données sur la taille du génome, du nombre chromosomique, du niveau de ploïdie, de l’affinité pour le substrat, du cycle de vie, du type et de la forme de croissance des serpentinophytes dans l’extrême nord-ouest de la zone de serpentine dans les Balkans. Les 308 taxons des plantes étudiées comprennent appartenant à 213 genres, dont la taille du génome est donnée pour la première fois pour 28 genres et 99 espèces. En utilisant les critères de Leitch, plus de la moitié des taxons (55.63%) appartiennent au groupe des très petits génomes, 22.19% aux petits, 18.75% aux moyens, 3.13% aux grands, et seulement 0.31% aux très grands génomes. Concernant l'affinité au substrat, la majorité d’espèces (171) sont indifférentes ou des serpentinophytes facultatives (103). Selon le type de cycle de vie, ~ 4% des espèces sont annuelles, 88.31% pérennes, dont 57% possèdent de très petits génomes. Les hémicryptophytes représentent une forme de vie dominante (48.38%), tandis que les phanérophytes représentent 17%, les chaméphytes 15%, les thérophyte 9% et les géophytes 9%. Il est évident que le stress hydrique, les températures élevées et la présence de métaux lourds dans les habitats sur la serpentine jouent une haute pression sélective et favorisent des espèces pérennes à très petits génomes.Le Narcissus poeticus (Amaryllidaceae), serpentinophyte facultative, est l’ancêtre des narcisses cultivés. C'est la première étude de N. poeticus et de sa rhizosphère dans les populations naturelles. Il montre une tolérance au pH du sol qui varie du 4.64 à 7.85. Les concentrations totales de nickel, de cobalt et de magnésium sont plus élevées dans les sols sur serpentine que dans ceux sur calcaires. Narcissus poeticus est caractérisé par une plus grande accumulation de manganèse, de nickel et de magnésium dans ses parties aériennes. Le cobalt, par contre, a une concentration totale uniforme dans toutes les parties de la plante. Une autre caractéristique inhabituelle de N. poeticus est son plus grand rapport molaire Ca/Mg dans les parties souterraines, probablement dû à sa forme de vie (géophytes) et une dormance estivale. Il est évident que, même si N. poeticus accumule certaines quantités de métaux lourds estimés (Mn, Ni, Co, Fe), il n'est pas pour autant un hyperaccumulateur.Une partie importante de ce travail concerne la variabilité de la structure chromosomique, la taille du génome, le niveau de ploïdie et la présence de chromosomes B dans 13 populations naturelles de N. poeticus poussant sur différents substrats géologiques et dans différentes conditions environnementales. La technique de la cytométrie en flux a été utilisée pour estimer la taille du génome, l’hybridation in situ fluorescente (FISH) pour la cartographie physique de l'ADNr, le fluorochrome banding pour l'organisation de l’hétérochromatine et la coloration au nitrate d’argent pour estimer l'activité des gènes ribosomiques. L’organisation des gènes ribosomiques et l’existence des triploïdes naturels ont été rapportés ici pour la première fois. Présence des individus portant de chromosomes B (dans 9 populations sur 13) et de translocations chromosomiques a été détectée. Un système particulier de chromosomes B présente trois différents morphotypes. Le submétacentrique type, le plus fréquent, possède quatre paternes différents dans l’organisation de l’hétérochromatine et de l'ADNr. La coloration à l’AgNO3 a montré que le nombre de nucléoles formés augmente en présence des chromosomes B portant des gènes ribosomiques, dont l’activité est ainsi prouvée. Les résultats obtenus démontrent que N. poeticus possède un génome dynamique avec la quantité d’ADN variable en raison de la présence de polyploïdie, de chromosomes B et de réarrangements chromosomiques. Il semble que les modifications observées reflètent la réponse du génome à différentes conditions environnementales où les individus portant les chromosomes B pourraient avoir des avantages sélectifs. / Habitats on serpentine substrate present a hostile environment for the plants development. They are characterized by a small number of species, but high levels of endemism. This study shows for the first time a series of data on genome size, chromosome number, ploidy level, the affinity to the substrate, the life cycle, the type and form of growth in the extreme northwest region of serpentine area in the Balkans. The sample includes 308 taxa belonging to 213 genera, with new values recorded for 28 genera and 99 species. Using Leitch’s criteria, more than half of estimated taxa (55.63%) belong to the group of very small genomes, 22.19% small, 18.75% intermediary, 3.13% large and only 0.31% to very large genomes. Regarding the affinity to the substrate, the majority of species (171) were indifferent or facultative serpentinophytes (103). Concerning the life cycle, ~ 4% of species are annuals and 88.31% perennials, and 57% had very small genomes. Hemicryptophytes represent a dominant life form (48.38%), phanerophytes 17%, 1chamaephytes5%, therophytes 9% and geophytes 9%. It is clear that the water stress, high temperatures and presence of heavy metals in serpentine habitats have the high selective pressure and favor perennial species with very small genome.The Narcissus poeticus (Amaryllidaceae), facultative serpentinophyte, is the ancestor of cultivated daffodils. This is the first study of N. poeticus and its rhizosphere in natural populations. It shows tolerance to soil pH ranging from 4.64 to 7.85. Serpentine soils have total concentrations of nickel, cobalt and magnesium highest, compared with calcareous soils. Narcissus poeticus is characterized by the greater accumulation of manganese, nickel and magnesium in the aerial parts of plant. Against the cobalt has a uniform total concentration in all parts of the plant. Another unusual feature of N. poeticus is the highest molar ratio Ca / Mg in the underground parts, probably du to his life form (geophytes) and summer dormancy. It is obvious that although N. poeticus accumulate certain amounts of estimated heavy metals (Mn, Ni, Co, Fe), it does not a hyperaccumulator.An important part of this work concerns the variability of the chromosome structure, genome size, the ploidy level and the presence of B chromosomes in 13 natural populations growing on different soils and under different environmental conditions. The technique of flow cytometry was used to estimate the genome size, fluorescent in situ hybridization (FISH) for the physical mapping of rDNA, the fluorochrome banding for the organization of heterochromatin and silver staining to estimate the activity of ribosomal genes. Organization of ribosomal genes and natural triploids have been reported here for the first time. Presence of individuals carrying B chromosomes (in 9 / 13 populations) and chromosomal translocations were detected. A particular system of B chromosomes presents three different morphotypes. The most common submetacentric type shows four different patterns in the organization of heterochromatin and rDNA. The AgNO3 staining showed that the number of nucleoli formed increases in the presence of B chromosomes carrying ribosomal genes, which proved their activity. The obtained results show that N. poeticus has a dynamic genome with the variable amount of DNA due to the presence of polyploidy, B chromosomes and chromosomal rearrangements. It seems that the observed changes reflect the response of the genome to different environmental conditions in which individuals carrying B chromosomes may have some selective advantages / Habitati na serpentinskim substratima predstavljaju nepovoljne uvjete za razvoj biljaka. Karakteriziraju se sa malim brojem vrsta, ali prisustvom velikog broja endema. U ovoj studiji se po prvi put prezentira serija podataka o veličini genoma serpentinofita, njihovom hromosomskom broju, nivou ploidije, sklonosti ka supstratu, tipu životnog ciklusa i životne forme na krajnjem sjeverozapadnom dijelu serpentinskog područja Balkanskog poluostrva. Uzorak je obuhvatao 308 svojti iz 213 rodova, sa novim vrijednostima za 28 rodova i 99 vrsta. Prema Leitch-evim kriterijima, više od polovine analiziranih svojti (55.63%) pripadale su grupi vrlo malih genoma, 22.19% malim, 18.75% srednjim, 3.13% velikim i samo 0.31% vrlo velikim genomima. U odnosu na sklonost ka supstratu, glavnina vrsta (171) su bile indiferentne ili fakultativne serpentinofite (103). U zavisnosti od životnog ciklusa, ~ 4% vrsta su bile jednogodišnje, a 88.31% višegodišnje, od kojih je 57% imalo vrlo male genome. Hemikriptofite su predstavljale dominantnu životnu formu (48.38%), koju slijede fanerofite (17%), hamefite (15%), terofite (9%) i geofite (9%). Iz dobivenih rezultata proizilazi da vodni stres, visoke temperature i prisustvo teških metala u serpentinskim habitatima imaju visok selektivni pritisak i favoriziraju višegodišnje vrste sa vrlo malim genomom.Narcissus poeticus (Amaryllidaceae), fakultativna serpentinofita, je predak kultiviranih narcisa. Ovo je prva studija o N. poeticus i njegovoj rizosferi u prirodnim populacijama. Ova vrsta pokazuje toleranciju na promjene pH vrijednosti u dijapazonu od 4.64 do 7.85. Totalne koncentracije nikla, kobalta i magnezija u serpenitnskim tlima su bile veće nego u krečnjačkim. Narcissus poeticus se karakterizirao većom akumulacijom mangana, nikla i magnezija u nadzemnim dijelovima biljke. Suprotno, kobalt je imao skoro istu totalnu koncentraciju u svim dijelovima biljke. Druga neuobičajena karakteristika N. poeticus je najveći iskazani molarni odnos Ca/Mg u podzemnim dijelovima, vjerovatno zbog njegove životne forme (geofita) i ljetne dormancije. Očito je da iako N. poeticus akumulira određene količine istraživanih teških metala (Mn, Ni, Co, Fe) on se ne moze smatrati nije njihovim hiperakumulatorom.Važan dio ove studije se odnosi na varijabilnost hromosomske strukture, veličine genoma, nivoa ploidije i prisustva B-hromosoma u 13 prirodnih populacija N. poeticus koje rastu na različitim geološkim supstratima i pod različitim okolišnim uslovima. Korištena je tehnika protočne citometrije za određivanje veličine genoma, fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) za fizicko mapiranje rDNK, fluorohrom banding za organizaciju heterohromatina i bojenje srebrenim nitratom za utvrđivanje aktivnosti ribozomalnih gena. Organizacija ribosomalnih gena i prisustvo prirodnih triploida su u ovoj studiji saopćeni po prvi put. Uočeno je prisustvo individua koje nose B-hromosome (u 9 od 13 populacija) i hromosomske translokacije. Poseban sistem B-hromosoma je predstavljen sa tri različita morfotipa. Najčešći submetacentrični tip pokazuje četiri različita obrasca u organizaciji heterohromatina i rDNK. Bojenje s AgNO3 je pokazalo da se formirani broj nukleolusa povećava u prisustvu B-hromosoma koji nose ribosomalne gene, što potvrđuje njihovu aktivnost. Dobiveni rezultati pokazuju da N. poeticus ima dinamičan genom sa različitom količinom DNK usljed prisustva poliploidije, B-hromosoma i hromosomskih rearanžmana. Uočene promjene najvjerovatnije odražavaju odgovor genoma na različite okolišne uslove u kojima individue koje posjeduju B-hromosome imaju izvjesnu selektivnu prednost.

Des épisodes climatiques de sècheresse et/ou de hautes températures peuvent engendrer de fortes pertes de rendement pour les cultures de céréales au champ. Un QTL associé au rendement et à ses composantes a été détecté dans quatre populations de blé (Triticum aestivum L.) sur le bras long du chromosome 3B « qYDH.3BL ». Deux populations d’haploïdes doublés (RAC875/Kukri et Excalibur/Kukri) et deux populations de lignées recombinantes (RAC875/Kukri et Gladius/Drysdale) ont été utilisées pour cartographier finement le QTL, au même titre que l’identification de gènes candidats. Ces quatre populations ont été testées sous des conditions environnementales variées, incluant des périodes de sécheresse et/ou hautes températures en Australie et au Mexique. Des modèles statistiques mixtes et linéaires décomposant les variations génétiques et non-génétiques ont été utilisés pour la détection de QTL en considérant dans un premier temps chaque environnement unique, puis en considérant les environnements multiples dans une analyse commune. Les allèles de RAC875, Drysdale et Excalibur à ce locus ont montré une hausse du rendement de 5 à 12.5 % comparées à celles de Gladius ou Kukri. Un total de trente-sept marqueurs moléculaires a été cartographié dans la région du QTL. Les marqueurs moléculaires ont été sélectionnés (i) par comparaison avec une carte génétique publiée du chromosome 3B, ou (ii) en désignant de nouveaux marqueurs moléculaires sur les séquences de BAC-end, de contig ou de gènes provenant du projet de séquençage du chromosome 3B (3BSEQ, http://urgi.versailles.inra.fr/, cv. Chinese Spring). Ceci a permis la construction d’une carte génétique consensus du locus qYDH.3BL . A ce jour, aucun QTL associé au rendement ou ses composantes en condition de sécheresse et/ou de hautes températures n’a encore été cloné positionellement chez le blé tendre. Les marqueurs moléculaires de la région d’intérêt ont été utilisés pour cartographier physiquement des contigs, soit par PCR, soit par comparaison de séquences in silico. La région du QTL inclus un total de huit contigs physiques comprenant 85 gènes annotés. L’utilisation de base de données de transcris biologiques publiques ou internes ont été utilisées pour détecter la présence de ces gènes, réduisant la liste à soixante-cinq gènes. Sur les contigs ayant une confiance élevée, aucun des vingt gènes n’a été exprimé différentiellement entre RAC875 et Kukri. Cependant, un gène présentant du polymorphisme dans sa séquence ainsi qu’une délétion/insertion d’un segment portant 12 gènes ont été découvert permettant ainsi de continuer à affiner la liste de gènes candidats. Les trois lignées parentales (RAC875, Drysdale et Excalibur) qui ont l’allèle liée au haut rendement ont le même haplotype pour ce gène, et la même délétion/insertion en opposition au deux autres lignées parentales Gladius et Kukri. Ainsi, dans ce travail de thèse nous avons pu confirmer la présence d’un QTL répondant aux stresses environnementaux sur le chromosome 3BL dans différentes populations et différents environnements, identifier des gènes candidats sous le QTL, et proposer une liste restreinte pour de futures analyses sur la base de données d’expression et de polymorphismes entre les parents des populations de cartographie. / Drought and heat can occur during the growth cycle of crops and severely reduce yield. A QTL associated with yield and yield-related component was found in four wheat populations (Triticum aestivum L.) on the long arm of chromosome 3B “qYDH.3BL”. The four populations were grown under various climatic conditions including drought, heat and combinations of both in a number of different areas (Australia and Mexico). Linear mixed models that partition and account for genetic and non-genetic or extraneous variation were used to detect loci in single-environment and/or multi-environment QTL analysis using ASReml-R. The alleles carried by RAC875, Excalibur or Drysdale improved grain yield by between 5% and 12.5%. Two doubled haploid populations (RAC875/Kukri and Excalibur/Kukri) and two recombinant inbred line populations (RAC875/Kukri and Gladius/Drysdale) were used to fine map qYDH.3BL and identify candidate gene(s). A total of thirty-seven molecular markers were mapped on one or both genetic maps of chromosome 3B enabling development of a consensus genetic map of the qYDH.3BL region. The markers were selected based on comparisons with a published “neighbour map” of chromosome 3B or designed using either BAC-end, contig or gene sequences from the chromosome 3B sequencing project; 3BSEQ http://urgi.versailles.inra.fr/ (cv. Chinese Spring). A positional cloning approach was used to identify candidate genes for qYDH.3BL. Molecular markers from the targeted region were assigned to physical contigs by screening the chromosome 3B BAC library experimentally using PCR or in silico by sequence comparison. A total of eight physical contigs containing 85 genes, were anchored to the qYDH.3BL region. Public and in-house resources of wheat transcript sequences were used to restrict the gene list to 65 expressed genes. Based on comparison of the 65 gene sequences to gene probes in a drought transcriptomic database, three genes were found to be differentially expressed between RAC875 and Kukri under drought conditions. Short genomic sequence reads (10× coverage) from each of the five parental lines (RAC875, Kukri, Excalibur, Gladius and Drysdale) were mapped against the 65 genes for polymorphism discovery. One gene exhibited sequence polymorphism between the drought tolerant parents (RAC875, Excalibur and Drysdale) and the drought-sensitive parents (Gladius and Kukri). In addition, presence/absence polymorphisms were consistently detected throughout a region containing 12 genes, indicating that the drought tolerant parents may have a deletion (or alien introgression) in this region. Thus, in this work, we confirmed the genetic effect of qYDH.3BL in multiple environments and multiple populations, saturated the target region with new molecular markers and defined a preliminary list of genes located in the qYDH.3BL region and selected candidate genes for further investigations.

Summary : The wild diploïd species Gossypium australe carry interesting agronomic characters such as resistance to wilt fusarium and "delay of the gossypol glands morphogenesis in the seed " that makes it an important source of variability for the genetic improvement of the main cultivated cotton species G. hirsutum. One of the approach to introgress these characters is to isolate and exploit monosomic alien addition lines (MAAL). In order to isolate new MAAL of G. australe in G. hirsutum, the [2(G.hirsutum x G.australe)x G.hirsutum] pentaploid was backcrossed as male parent to G. hirsutum. Among the 253 BC1 derivatives obtained, 106 plants (42%) presented morphological alterations attributed to presence of G. australe chromatin. To define an SSR linkage group for each of the 13 G. australe chromosomes, 42 plants representative of the phenotypic variability observed in the BC1 generation and seven alien addition lines already isolated in our laboratory were analyzed using SSR markers developed from the G. hirsutum species. Out of the 150 SSR markers used, 100 % amplified G. australe DNA and 84 (56 %) generated 89 polymorphic loci. All these loci but two have been assigned, by means of an cluster algorithm, to 13 linkage groups assumed to match up to the 13 chromosomes of the diploid species. On this basis, about 60% of the analyzed plants were multisomic addition lines, 20%, MAAL while 20 % carrying no markers were supposed to be euploid. The newly isolated MAAL appeared to be the same as those already available. Five disomic alien addition plants carrying at least one additional chromosome different from the chromosomes of G. australe previously isolated in a monosomic addition configuration were selfed and the BC1S1 progenies obtained have been analyzed with SSR markers and GISH. Five new MAAL of G. australe in G. hirsutum have thus been isolated. In order to monitor the potentialities of using MAAL for the transfer of genetic material from the additional chromosome to the genetic background, the transmission frequency and integrity of the supernumerary chromosome have been analyzed with SSR markers in the self-progeny of five MAAL. Three of them revealed a transmission frequency significantly lower than the 3:1 expected ratio, one MAAL presented an exclusive preferential transmission of the additional chromosome. In these four MAAL the alien chromosome was transmitted almost unaltered. With the fifth MAAL the alien chromosome was normally transmitted but was altered in half of the plants containing G. australe chromatin. One of the investigated MAAL characterized by its brown fiber produced few plants carrying also white fibers. It has been shown that this mosaicism was due to the loss of the alien supernumerary chromosome. The complete loss of this chromosome seems to be linked to its fragmentation. Résumé : L'espèce diploïde sauvage Gossypium australe possède des caractères agronomiques d'intérêt tels que la résistance au fusarium et le "retard à la morphogenèse des glandes à gossypol" qui en font une importante source de variabilité pour l'amélioration génétique de la principale espèce de cotonnier cultivé G. hirsutum. Une des approches pour l'introgression de ces caractères est la production et l'exploitation de lignées monosomiques d'addition (LMA). Pour isoler les LMA de G. australe sur G. hirsutum, le pentaploïde [2(G.hirsutum x G.australe)x G.hirsutum] a été rétrocroisé comme parent mâle avec l'espèce tétraploïde. Sur les 253 graines obtenues, 106 (42%) ont donné des plantes présentant une morphologie nettement distincte de celle de G. hirsutum. Cette différence a été attribuée à la présence de chromosomes de G. australe. Afin de définir des groupes de liaison pour chacun des chromosomes de G. australe, 42 plantes représentatives de la variabilité phénotypique observée ainsi que 7 lignées d'addition déjà isolées ont été sélectionnées et analysées avec des marqueurs SSR développés sur l'espèce tétraploïde. Tous les 150 marqueurs utilisés ont amplifié l'ADN de G. australe et 84 (56%) ont généré 89 loci polymorphes. Tous ces loci, sauf deux, ont pu être assignés, par classification numérique, à 13 groupes de liaison supposés correspondre aux 13 chromosomes de l'espèce diploïde. Sur cette base, 60% des plantes analysées sont des plurisomiques d'addition; 20%, des LMA tandis que 20 % ne portant aucun marqueur ont été supposées euploïdes. Les nouvelles LMA isolées s'étant révélées être identiques à celles déjà isolées, 5 plantes disomiques d'addition portant au moins un chromosome non-encore isolé à l'état monosomique d'addition ont été autofécondées et leur descendance analysée avec des marqueurs SSR et par la GISH. Cinq nouvelles LMA ont pu ainsi être isolées. Afin d'étudier les potentialités d'utilisation de la méthode des LMA pour le transfert de matériel génétique de l'espèce sauvage vers l'espèce cultivée, la fréquence de transmission et l'intégrité du chromosome surnuméraire, a été analysée avec des marqueurs SSR dans une génération autofécondée de cinq LMA. Trois lignées ont donné un taux de transmission inférieur au ratio attendu de 3:1, chez la quatrième lignée le chromosome surnuméraire a été transmis à toute la descendance. Pour ces quatre lignées le chromosome additionnel a été transmis presque inaltéré. Avec la cinquième lignée, le chromosome additionnel a été transmis suivant le taux attendu mais a été altéré dans la moitié des plantes contenant de la chromatine de G. australe. Une des lignées analysées caractérisée par la couleur brune de ses fibres a produit quelques plantes portant également des fibres blanches. Il a été montré que ce mosaïcisme de la couleur des fibres était dû à la perte du chromosome additionnel. Cette perte semble être liée à une fragmentation du chromosome.

The transcription in the eukaryotic cells involves epigenetic regulatory mechanisms that control local and higher-order chromatin remodelling. In the skin, keratinocyte-specific genes are organized into distinct loci including Epidermal Differentiation Complex (EDC) and Keratin type I/II loci. This thesis introduces bioinformatics approaches to analyze multi-level regulatory mechanisms that control skin development and keratinocyte-specific differentiation. Firstly, integration of gene expression data with analyses of linear genome organization showed dramatic downregulation of the genes that comprise large genomic domains in the sweat glands including EDC locus, compared to ii hair follicles, suggesting substantial differences in global genome rearrangement during development of these two distinct skin appendages. Secondly, comparative analysis of the genetic programmes regulated in keratinocytes by Lhx2 transcription factor and chromatin remodeler Satb1 revealed that significant number of their target genes is clustered in the genome. Furthermore, it was shown in this study that Satb1 target genes are lineage-specific. Thirdly, analysis of the topological interactomes of Loricrin and Keratin 5 in hair follicle steam cells revealed presence of the cis- and trans-interactions and lineage specific genes (Wnt, TGF-beta/activin, Notch, etc.). Expression levels of the genes that comprise interactomes show correlation with their histone modification status. This study demonstrates the crucial role for integration of transcription factormediated and epigenetic regulatory mechanisms in establishing a proper balance of gene expression in keratinocytes during development and differentiation into distinct cell lineages and provides an integrated bioinformatics platform for further analyses of the changes in global organization of keratinocyte-specific genomic loci in normal and diseased skin.