Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-08-14T14:08:27Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1978433 bytes, checksum: 32b3bd186716af4ca62da484b2c51474 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-14T14:08:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1978433 bytes, checksum: 32b3bd186716af4ca62da484b2c51474 (MD5) Previous issue date: 2016-07-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A organização, ordem e conteúdo gênico de genomas plastidiais (plastomas) são bastante conservados em angiospermas, porém há exceções a esta regra. Este parece ser o caso do gênero Passiflora, pois há evidências de perdas não usuais de genes plastidiais para espécies deste gênero. Porém, nenhum plastoma de Passiflora foi publicado até o momento, o que dificulta estudos a respeito da evolução do plastoma deste grupo. Da mesma forma, o estudo das causas da incompatibilidade entre o genoma nuclear e plastoma, apresentada por alguns híbridos interespecíficos de Passiflora, tem se mantido obscuro devido à falta de sequências plastidiais disponíveis no banco de dados. Assim, visando começar a preencher estas lacunas e ainda permitir a caracterização de marcadores genéticos plastidiais e a construção de vetores para transformação plastidial em Passiflora, o presente trabalho teve como objetivo o sequenciamento, montagem, análise e caracterização do plastoma de Passiflora cincinnata. Os dados indicam uma massiva perda de genes plastidiais essenciais para a viabilidade celular (infA, rps7, rps16, rpl20, rpl22, ycf1 e ycf2), os quais, muito provavelmente, foram transferidos para o núcleo e seus produtos são importados pelos plastídios. Este genoma mostrou alta taxa de substituição de nucleotídeos para os genes accD e clpP. Apesar da alta divergência, a sequência traduzida destes genes mantém a maioria dos domínios funcionais previstos para as proteínas que codificam e com isso a funcionalidade dos mesmos não pode ser descartada. Além disso, múltiplas inversões também foram detectadas no plastoma de P. cincinnata, mudando a ordem de vários genes. Em conjunto, os dados sugerem uma incomum evolução do plastoma de P. cincinnata, caracterizada por perdas gênicas, inversões no genoma e presença de genes com aceleradas taxas de substituição de nucleotídeos. Assim, é possível sugerir que esta instabilidade do genoma e perda de genes essenciais possa estar relacionada com a incompatibilidade entre núcleo e plastoma observada em híbridos de Passiflora. Por fim, a sequência completa do plastoma de P. cincinnata, obtida neste trabalho torna viável a transformação plastidial nesta espécie, visando aplicações biotecnológicas, além de estudos evolutivos e de genética funcional. / The plastid genome (plastome) organization, gene content and order is well conserved in most angiosperms, but there are some exceptions. The Passiflora genus is one of those exceptions, because there are evidences of some unusual plastid gene losses to species of this genus. However, none plastome of Passiflora has been published to date, making studies related to the evolution and putative high instability of plastome in this group difficult. In parallel, the study of the causes of nucleus-plastome incompatibility, observed in interspecific hybrids of Passiflora, has remained obscure due to the lack of plastid sequences in the database. In the context, starting to fill these gaps and to enable the characterization of plastid genetic markers and the construction of vectors for plastid transformation in Passiflora, the aim of the present study was the sequencing, assembly, analysis and characterization of complete P. cincinnata plastome. The data indicate a massive loss of plastid genes that are essential for cell viability (infA, rps7, rps16, rpl20, rpl22, ycf1 and ycf2), which very likely were functionally transferred to the nucleus and its products are imported into plastid. This genome also showed a high rate of nucleotide substitution in several genes, such as accD and clpP. Despite this high divergence, the translated amino acid sequences of these genes retain most of functional domains predicted indicating that they can still encode functional proteins. In addition, multiple inversions were detected in the P. cincinnata plastome, changing the order of several genes. Taken together, the data suggest a markedly uncommon evolution of P. cincinnata plastome, characterized for gene losses, multiple inversions and genes with accelerated nucleotide substitution rates. Thus, it is possible to suggest that the genomic instability and essential genes losses, observed here, may be related to the genome- plastome incompatibility observed in Passiflora hybrids. This relation can be established and investigated of an accurate manner with the sequencing of other Passiflora plastomes. Finally, the complete plastome sequence of P. cincinnata obtained in this work enables the plastid transformation to this species, aiming biotechnology applications and studies of evolution and functional genetics.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1243805 bytes, checksum: 3c8248afdd915bfc2ff4163ea2ee6cdc (MD5) Previous issue date: 2006-02-21 / Universidade Federal de Minas Gerais / The present study was conducted to evaluate possible interactions between ethylene and polyamines levels upon in vitro morphogenesis of two passion fruit species (Passiflora cincinnata Masters and P. edulis Sims f. flavicarpa Degener, population FB-100). Hypocotyl-derived segments (average 10 mm length) were cultivated in MS-based medium, with B5 vitamin complex, 30 g.L-1 sucrose, 100 mg.L-1 myo-inositol, 10% (v/v) coconut water, 0,5 mg.L-1 6-benzyladenine (BA) ), and solidified with 2.5 g L-1 Phytagel®. Ethylene and polyamines were assayed at different times in culture (3, 6, 9, 12, and 30 d). Aiming to characterize the shoot-buds differentiation histological analyses were performed with previous fixation of the samples in FAA 50%. The effects of ethylene inhibitor, promoter and scavenger (aminoethoxyvinilglycine AVG, silver tiosulfate STS, 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid ACC, and mercury perchlorate- MP, respectively), polyamines (spermine, spermidine and putrescine) and its inhibitor (methylglyoxal-bis-guanylhydrazone - MGBG) were also analysed. A delayed organogenic response occurred in explants of P. edulis f. flavicarpa as compared to P. cincinnata, though coincident with a delayed detection of ethylene and polyamine in cultures of the former. Similar morphogenic responses were observed in explants cultured onto AVG- or MPsupplemented medium, whereas ACC-treated cultures impaired organogenic responses. Polyamine-supplemented cultures displayed morphogenic responses similar to those from control treatment. However, MGBG similarly to ACC lessened the morphogenic responses. Interestingly, explants at redifferentiation stages displayed high expansion and elongation rates, linked to elevated ethylene and polyamine, suggesting that competition between their biosynthetic pathways is highly regulated and plastic, and that these interactions may play a key role in differentiation process. / O presente trabalho teve por objetivo investigar as possíveis interrelações entre etileno e poliaminas sobre a capacidade morfogênica de explantes de hipocótilo de duas espécies de maracujazeiro (Passiflora cincinnata Masters e Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener população FB-100). Explantes de hipocótilo retirados de plântulas germinadas in vitro foram cultivados em meio contendo sais MS, complexo vitamínico B5, 30 g.L-1 de sacarose, 100 mg.L-1 de inositol, 10% (v/v) de água de coco, 0,5 mg.L-1 6-benzilaminopurina (BAP) e solidificado com 2,5 g.L-1 de Phytagel. Os níveis de etileno e poliaminas foram mensurados ao longo do período de indução da organogênese. Concomitantemente, foi realizada a histologia com a fixação do material vegetal em F.A.A. 50% e acompanhamento da ontogênese das gemas adventícias, de forma a se caracterizar os diferentes eventos envolvidos na rediferenciação celular e a regulação dos níveis de poliaminas e etileno. Também foram realizados tratamentos com inibidores (aminoetoxivinilglicina AVG, tiossulfato de prata - STS), seqüestrador (perclorato de mercúrio PM) e promotor da produção de etileno (ácido 1-carboxílico 1-aminociclopropano - ACC), além da adição de poliaminas (putrescina, espermidina e espermina) e de seu inibidor (metilglioxal-bis-guanil hidrazona MGBG) ao meio de cultivo. Foi observado atraso nas respostas morfogênicas em P. edulis f. flavicarpa em comparação com P. cincinnata, sendo coincidente com o atraso observado nas concentrações de poliaminas e etileno mensurados naquela espécie. As respostas morfogênicas dos explantes foram semelhantes nos tratamentos com inibidores e seqüestrador, sendo observado comprometimento da organogênese apenas no meio de cultivo com adição isolada de ACC. Nos tratamentos com poliaminas não foi observada diferença em relação ao tratamento controle. Todavia, o tratamento com MGBG apresentou respostas semelhantes àquele com ACC levando à redução da resposta morfogênica. Observou-se que culturas em estádios de rediferenciação, caracterizadas por apresentarem altas taxas de expansão e alongamento, apresentaram níveis elevados de etileno associados a altos níveis de poliaminas, sugerindo que a competição entre as duas rotas biossintéticas é altamente regulada e plástica, e que a interação seria a peça chave para a definição da diferenciação.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:02:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Espécies de Passiflora podem ter seu desenvolvimento comprometido na ausência da micorrização. Esse trabalho objetivou avaliar a colonização micorrízica (CM) e o número de glomerosporos (NG) na rizosfera de acessos de P. cincinnata em campo e o efeito da inoculação com Glomus etunicatum e da adubação fosfatada no crescimento de P. cincinnata (acessos T03-36, C07-01 e A04-25) e P. setacea. O delineamento experimental para cada espécie foi do tipo inteiramente casualizado com quatro tratamentos (controle, P, FMA e P+FMA) em oito repetições. Avaliou-se quinzenalmente a altura, número de folhas e gavinhas, e ao final do experimento a área foliar (AF), biomassa fresca (BF) e seca (BS) aérea e radicular, teor nutricional, CM e NG. No campo, a CM e a NG diferiram significativamente entre as rizosferas de P. cincinnata, com média de 0,35 % de colonização e ˂ 1glomerosporo/50 g de solo. Em geral, plantas de P. cincinnata (acessos T03-36 e A04-25) micorrizadas, com ou sem adição de P, diferiram significativamente daquelas nos tratamentos controle e com P, na AF, BF, BS e CM. Plantas micorrizadas do acesso C07-01 diferiram das demais quanto à AF, BS, CM e NG. Diferenças na altura e número de folhas foram observadas a partir de 30 dias da inoculação para as duas espécies de Passiflora. Concui-se que P. cincinnata e P. setacea desenvolvem melhor quando micorrizadas e que a adição de P pode reduzir o número de glomerosporos e a colonização micorrízica e não beneficia plenamente o crescimento dessas espécies na ausência de FMA

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 881362 bytes, checksum: 0e498263c87a06e3c091110afa80ddfe (MD5) Previous issue date: 2012-07-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Tissue culture techniques are often associated with the occurrence of somaclonal variation, characterized by a genetic/epigenetic alteration found in cells, embryos, organs or in vitro grown plants, due to stress conditions imposed by the system. The propagation process involving the calogenesis step has a higher susceptibility to variation, because of many cell divisions. Calli are disorganized cell masses, whose cells divide at different rates depending on where they are located in relation to the culture medium, therefore, they are not considered homogeneous materials. Flow cytometry is a tool that has been used to evaluate the competence of somatic embryogenesis in callus, both to identify the different types as possible and to detect early changes in DNA content of their cells. However, there are no reports in the literature of the flow cytometry use to determine the existence of heterogeneity in relation to the DNA content in callus. In this perspective, the present work adapted this methodology for friable Passiflora cincinnata calli in order to verify the existence of vertically regionalized heterogeneity in relation to DNA ploidy level, and relate it to factors inductors of somaclonal variation, such as cultivation time and subculture numbers. Initially, P. cincinnata cotyledonary leaves were inoculated onto semi-solid medium containing 2, 4-D and BA, for friable embryogenic callus induction. The calli were multiplied and subcultured at different times, thus generating three callus types: new, intermediate and old. Twenty calli of each type were subjected to sagittal cuts resulting two layers (I, II) in new calli, and three layers (I, II and III) in intermediate and old calli, totalizing 160 layers, which were analyzed by flow cytometry. Six different DNA ploidy levels and multiploidies were detected in the layers. In new calli, 25% were heterogeneous, i.e. at least one callus layer showed different DNA ploidy level from the others, differently from intermediate and old calli, which 75% and 63% were heterogeneous, respectively. The homogeneous new calli were predominantly diploid. The highest DNA ploidy levels were observed in the layers in contact with the culture medium on intermediate calli, and 4C and 4C/8C cells were more evident in older calli. These observations suggest that the appearance of new DNA ploidy levels between the layers and between the different callus types is related to the exposure time to the medium containing relatively high concentration of 2,4-D. It was also possible to verify that the layer in contact with the culture medium is more proliferative when compared the percentages of the G2 peaks in homogeneous diploid calli. The heterogeneity in DNA ploidy level between the layers was observed, and it implies that parts of a callus cannot infer about a whole callus. This work suggests that time influences the appearance of different DNA ploidy levels in calli induced in vitro. / Técnicas de cultura de tecidos estão frequentemente associadas com a ocorrência de variação somaclonal, caracterizada pela alteração genética e/ou epigenética encontrada em células, embriões, órgãos ou plantas cultivadas in vitro, em decorrência das condições de estresse impostas pelo sistema. O processo de propagação que envolve a etapa de calogênese apresenta maior susceptibilidade à ocorrência de variação, em função das inúmeras divisões celulares. Calos são massas celulares não organizadas, cujas células se dividem a diferentes velocidades dependendo de onde se localizam em relação ao meio de cultura; portanto, não são considerados materiais homogêneos. A citometria de fluxo é uma ferramenta que tem sido utilizada para avaliar a competência da embriogênese somática em calos, tanto para identificar seus diferentes tipos quanto para detectar precocemente possíveis alterações no conteúdo de DNA de suas células. No entanto, não há relatos na literatura da utilização da citometria de fluxo para verificar a existência da heterogeneidade quanto ao conteúdo de DNA em calos. Nesta perspectiva, o presente trabalho adaptou essa metodologia para calos friáveis de Passiflora cincinnata, a fim de verificar a existência de heterogeneidade verticalmente regionalizada, em relação à ploidia de DNA, e relacioná-la com fatores de indução de variação somaclonal, como tempo de cultivo e número de subcultivos. Inicialmente, folhas cotiledonares de P. cincinnata foram inoculadas em meio semissólido contendo 2,4-D e BA, para indução de calos embriogênicos friáveis. Os calos foram multiplicados e subcultivados em diferentes tempos, gerando, assim, três tipos de calos, denominados como novos, intermediários e velhos. Vinte calos de cada tipo foram submetidos a cortes sagitais que resultaram duas camadas (I e II) em calos novos, e três camadas (I, II e III) em calos intermediários e velhos, totalizando 160 amostras que foram analisadas por citometria de fluxo. Seis diferentes ploidias de DNA e multiploidias foram detectadas nas camadas. Em calos novos, 25% deles foram heterogêneos, ou seja, pelo menos uma camada apresentou nível de ploidia de DNA diferente das demais, diferentemente dos calos intermediários e velhos, os quais 75% e 63% foram heterogêneos, respectivamente. Os calos novos homogêneos foram predominantemente diploides. As ploidias de DNA mais altas foram observadas nas camadas em contato com o meio de cultura em calos intermediários, e células 4C e 4C/8C foram mais evidentes em calos velhos. Essas observações sugerem que o surgimento de novos níveis de ploidia entre as camadas e entre os calos de diferentes tipos está relacionado com o tempo de exposição ao meio contendo concentração relativamente alta de 2,4-D. Foi possível, também, verificar que a camada em contato com o meio é mais proliferativa quando se comparou os percentuais dos picos G2 de calos diploides homogêneos. A heterogeneidade quanto ao nível de ploidia de DNA entre as camadas foi constatada e isto implica que partes de um calo não podem inferir sobre um calo inteiro. Esse trabalho sugere que o tempo influenciou o surgimento de diferentes ploidias de DNA em calos induzidos in vitro.

The interest in evaluating the effect of the phytochemical constituents in food and herb teas in attenuating the oxidative stress associated with high intensity physical exercise has increased in the last years. In this context, leaf tea of plants of the Passiflora genus can inhibit the cell damage because of the oxidative stress due to the presence of phenolic compounds. In the present study, the phytochemical profile was investigated by colorimetric or precipitation methods, while the total phenol content was quantified by the Folin-Ciocalteu method. To study the acute and chronic effect of the extract on the oxidative stress, Wistar rats (250-300 g) were divided randomly into groups (n=8 and n=6, respectively) that were treated with the extract and were submitted or not to high intensity physical exercises. The oxidative stress marker levels were analyzed. Because of the high content of phenolic constituents (430.63 ± 46.71 μg EAG.g-1 extract), it was verified a scavenger activity of the free radicals DPPH● and ABTS●+ up of 97%. The extract inhibited also levels of lipid peroxidation induced by AAPH (above 95 %), FeSO4 (up 40.82%) and H2O2 (up62.50%), suggesting the the extract is active against peroxil and hydroxyl radical. The acute administration of the extract protected rats from lipoperoxidation with reductions in levels in plasmatic (70.41%), hepatic (64.1%) and cardiac (20.0 %) samples, and protected liver against protein oxidation (94.08%). Sulfhydryl levels in plasmatic (264.32%), hepatic (261.86%) and cardiac (478.8%) tissues were high. The research showed that physical training used was able to increase lipid oxidation in the urinary tract (201%), blood tissue (123%) and liver (161%), and the protein oxidation rate (226%) rats exercised compared to sedentary control group. In contrast, treatment with the extract , after 8 weeks of treating the rats submitted to high intensity physical exercises with the extract, there was a chronic prevention of the lipoperoxidation in structures of the urinary (50.96%), plasmatic (39.91%), hepatic (83.64%) and cardiac (15.82%) tissues, as well as, oxidative lesion of hepatic proteins (9.62%). Therefore, these results suggest benefits of P. cincinnata leaf ethanol extract to health. / Nos últimos anos, têm aumentado o interesse em avaliar o efeito de constituintes fitoquímicos presentes em alimentos e chás de ervas na atenuação do estresse oxidativo associado ao exercício físico de alta intensidade. Nesse contexto, o chá das folhas de plantas do gênero Passiflora pode inibir o dano celular causado pelo estresse oxidativo devido à presença de componentes fenólicos. No presente estudo, o perfil fitoquímico do extrato etanólico das folhas de P. cincinnata Mast foi investigado através de reações colorimétricas ou de precipitação, enquanto o teor de fenóis totais foi quantificado usando o método de Folin-Ciocalteu. Para estudar o efeito agudo e crônico do extrato sobre o estresse oxidativo, ratos Wistar (250-300g) foram divididos aleatoriamente em grupos (n=8 e n=6, respectivamente) que foram tratados com o extrato (200 mg.kg-1) e submetidos ou não a exercícios físicos de alta intensidade. Os níveis de marcadores do estresse oxidativo foram analisados. Devido ao elevador teor fenólico (430,63 ± 46,71 μg GAEq.g-1 extrato), foi constatada atividade seqüestradora dos radicais DPPH● e ABTS●+ acima de 97%. O extrato inibiu, também, valores elevados da lipoperoxidação in vitro induzida por AAPH (acima 95 %), FeSO4 (até 40,82 %) e H2O2 (até 62,50 %), sugerindo o ação ativo contra radicais peroxil e hidroxil. A administração aguda do extrato protegeu ratos da lipoperoxidação plasmática (70,41%), hepática (64,1%) e cardíaca (20,0%), além de proteger a oxidação protéica (94,08%) hepática. Os níveis de sulfidrila plasmático (264,32%), hepático (261,86%) e cardíaco (478,8%) foram elevados. Constatamos, também, que o treinamento físico utilizado foi capaz de aumentar à oxidação lipídica no aparelho urinário (201 %), tecido sanguíneo (123 %) e hepática (161 %), além de oxidação a proteínas cardíaca (226 %) os animais exercitados (GT) em comparação ao controle sedentário (GC) . Em contrapartida, o tratamento com o extrato, após 8 semanas de tratamento, foi capaz de prevenir a lipoperoxidação de estruturas do aparelho urinário (50,96%), sanguínea (39,91%), hepático (83,64%) e cardíaca (15,82%), bem como, lesões oxidativas a proteínas hepáticas (9,62%) induzidas pelo exercício físico. Desta forma, os resultados sugerem que o consumo diário do extrato etanólico da P. cincinnata pode trazer benefícios à saúde.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-03-10T00:02:16Z No. of bitstreams: 1 LuizEduardoMateusBrandao_DISSERT.pdf: 1459064 bytes, checksum: 761fdf6cac76c33ca0fce5c0da852e03 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-03-16T20:37:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 LuizEduardoMateusBrandao_DISSERT.pdf: 1459064 bytes, checksum: 761fdf6cac76c33ca0fce5c0da852e03 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-16T20:37:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LuizEduardoMateusBrandao_DISSERT.pdf: 1459064 bytes, checksum: 761fdf6cac76c33ca0fce5c0da852e03 (MD5) Previous issue date: 2015-05-22 / Os transtornos de ansiedade e a doen?a de Parkinson s?o patologias que atingem uma grande parcela da popula??o. Grande parte das alternativas terap?uticas para essas patologias n?o contribui para melhora de todos os aspectos cl?nicos e/ou acarreta efeitos colaterais indesej?veis, havendo assim uma grande demanda para o desenvolvimento de novos f?rmacos. A Passiflora cincinnata Mast., planta conhecida popularmente por ?maracuj? do mato?, ?maracuj? tubar?o? ou ?maracuj? mochila?, ? uma esp?cie nativa presente em diversos estados brasileiros. As esp?cies do g?nero Passiflora s?o muito conhecidas por suas flores vistosas, seus frutos comest?veis de sabor marcante e por suas propriedades sedativas, tranquilizantes e ansiol?ticas relatadas pela medicina popular. S?o plantas que apresentam compostos org?nicos importantes como fen?is, glicos?deos cianog?nicos, alcal?ides e flavan?ides, sendo estes respons?veis pelas atividades ansiol?tica, antioxidante, antiinflamat?ria, antihiperglic?mica, entre outras quando testadas em mam?feros. Apesar disto, poucos s?o os estudos realizados no sentido de investigar os poss?veis efeitos biol?gicos in vivo do extrato da esp?cie Passiflora cincinnata Mast. Ent?o, neste estudo avaliamos o efeito do extrato alco?lico desta planta na ansiedade e em um modelo animal da doen?a de Parkinson. O extrato etan?lico de P. cincinnata n?o acarretou altera??es significativas nos par?metros cl?ssicos relacionados com ansiedade no labirinto em cruz elevado, tanto para o tratamento agudo como para o cr?nico. Em rela??o ao potencial neuroprotetor, como demonstrado anteriormente por nosso grupo, a administra??o de inje??es repetidas de reserpina induz preju?zos motores progressivos, como o aumento no tempo de catalepsia em barra, aumento da frequ?ncia de tremor de mand?bula e mastiga??o no v?cuo, e redu??o na velocidade m?dia dos animais no campo aberto, bem como inibiu a produ??o de tirosina hidroxilase em c?lulas do SNpc. Al?m disso, este tratamento promoveu preju?zo na evoca??o da mem?ria aversiva nos camundongos submetidos a esquiva discriminativa no labirinto em cruz elevado. De forma inesperada, a administra??o de passiflora tamb?m acarretou preju?zo na evoca??o da mem?ria. Em contrapartida, a inje??o concomitantemente com extrato etan?lico de P. cincinnata, foi capaz de retardar o surgimento de d?ficits motores avaliados pela catalepsia em barra, e mais, reverteu o d?ficit na produ??o de TH na SNpc. / Anxiety disorders and Parkinson?s disease (PD) affect a large portion of the world population. Indeed, therapeutic alternatives available do not contribute to improve most clinical conditions and/or are linked with undesirable side effects. Thus, there is a great demand for the development of new drugs to treatment of these diseases. Passiflora cincinnata Mast. is a native species present in several Brazilian states, popularly known as ?maracuj? do mato?, ?maracuj? tubar?o? or ?maracuj? mochila?. Additionally, species of Passiflora genus are traditionally known for their exotic flowers, edible fruits with pronounced flavor and for their sedative, tranquilizer and anxiolytic properties reported by folk medicine. These plants possess important organic compounds such as phenols, cyanogenic glycosides, flavonoids and alkaloids, which are responsible for the anxiolytic, antioxidant, anti-inflammatory, antihyperglycemic, among others activities when tested in mammals. Despite this fact, only a few studies have been conducted to investigate the possible in vivo biological effects of Passiflora cincinnata Mast extracts. Thereby, in this study we evaluated the effects of the alcoholic extract of this plant in anxiety and PD animal model. Mice acutely or chronically administered with ethanolic extract of P. cincinnata do not showed any anxiogenic- or anxyolitic-like effect in elevated plus maze (EPM). In order to reproduce PD symptom?s in mice, we administered repeated injections of reserpine which progressively induced motor impairments such as increase in catalepsy, oral movements, and reduction of the average speed of the animals in the open field, as well as depleted dopamine prodution in SNpc cells. Furthermore, this treatment resulted in the loss of aversive memory recall in mice when undergoing PMDAT. Yet, passiflora group also show this amnesic profile. However, animals treated concomitantly with the alcoholic extract of Passiflora cincinnata Mast. showed higher latency for the onset of motor impairment evaluated by catalepsy. Thus, our results shows that the alcoholic extract of the plant P. cincinnata was able to delay the onset of the catalepsy induced by reserpine administration, plus reverted the depletion of dopamine production in SNpc cells.

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Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-04-27T08:33:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3736622 bytes, checksum: 39fd593857e319e4d9577fd3428a7f25 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T08:33:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3736622 bytes, checksum: 39fd593857e319e4d9577fd3428a7f25 (MD5) Previous issue date: 2015-03-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A aquisição de competência embriogênica por células somáticas é um processo intrigante e necessita da junção de dados genético-moleculares e citológicos para melhor compreensão dos mecanismos e mudanças celulares envolvidas. À vista disso, os objetivos desse trabalho foram isolar e caracterizar o padrão de expressão dos genes SERK e BBM por hibridização in situ durante o processo de embriogênese somática em Passiflora cincinnata, avaliar a responsividade morfogênica in vitro de P. setacea e P. cincinnata submetidas a condições de indução de embriogênese somática, bem como, acompanhar a mobilização de reservas e a expressão dos genes supracitados durante a embriogênese somática. Para tal, a partir de calos embriogênicos de P. cincinnata, com 20 dias em meio de indução (MI), extraiu-se o RNA total e obteve-se o cDNA, o qual serviu como molde para amplificação da sequência codante utilizando-se primers degenerados para SERK e BBM. A responsividade de embriões zigóticos maduros de P. setacea e P. cincinnata foi avaliada mediante o cultivo em meio de indução alternativo constituído por sais MS suplementado com 31,06 μM de Picloram + 2,22 μM de BA + 2,27 μM de TDZ (MIP) + 500 mg L -1 de Extrato de Malte (EM) + 13,77 μM de Espermidina (Spd). Após 30 dias as culturas foram transferidas ao meio de maturação (MM) composto de meio MS acrescido de 1,0% de carvão ativado e ausência de reguladores de crescimento. Amostras com 0, 10, 20 e 30 dias foram coletadas para microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, testes histoquímicos e hibridização in situ, todas seguindo protocolos específicos. Para visualização da expressão dos genes SERK e BBM foi gerada uma sonda de RNA a partir de um clone sequenciado de P. cincinnata. Para P. setacea utilizou-se uma sonda heteróloga sense e antisense de P. cincinnata. O relacionamento filogenético das sequências isoladas de P. cincinnata comparadas às de outras espécies apontou que as funções das proteínas podem ser conservadas na espécie. Em SERK, o Pc contig1 agrupou-se com membros de SERK1 e SERK2, enquanto o Pc contig2 agrupou-se com membros de SERK3/BAK1. Por sua vez, o Pc contig1 de BBM, agrupou-se com membros de BBM1 e BBM2. A expressão do gene SERK foi constatada em embriões zigóticos e gradualmente diminuída até os 20 dias em MI. Aos 30 dias em MI, embriões somáticos globulares foram intensamente marcados, assim como em embriões com 5 e 40 dias em MM. Transcritos do BBM foram observados em embriões zigóticos, no entanto, a expressão foi cessada no decorrer do desenvolvimento dos embriões somáticos. A expressão foi retomada em embriões somáticos cotiledonares após 40 dias em MM, assemelhando-se ao observado no embrião zigótico. Observou-se que em P. setacea, durante o processo embriogênico, houve formação de protuberâncias que deram origem a zonas pró-embriogênicas, as quais se desenvolveram em embriões somáticos. Já em P. cincinnata houve proliferação das células do meristema fundamental e formação de meristemoides, caracterizando regiões organogênicas. Quando transferidos ao meio de maturação não houve regeneração de plantas a partir de embriões somáticos em P. setacea. Em P. cincinnata houve intumescimento das regiões calejadas e, em alguns casos, formação de primórdios foliares. Quanto à expressão gênica, em P. setacea foi constatada expressão de BBM e SERK em todas as fases analisadas, especialmente em protuberâncias e embriões somáticos formados. P. cincinnata, por sua vez, também apresentou transcritos dos genes BBM e SERK em todas as fases analisadas, sendo intensificado o sinal de hibridização na periferia dos explantes e regiões meristemáticas após 20 dias em MI. P. setacea apresentou corpos proteicos com decréscimo gradativo até os 30 dias em meio de indução. Houve presença de carboidratos e amido no explante e seu decréscimo após 10 dias, e verificou-se a síntese de novo de amido aos 30 dias de indução, quando há formação de embriões somáticos. Não foi verificada a presença de corpos lipídicos durante o processo embriogênico. Já em P. cincinnata, constatou-se corpos proteicos e amido de forma moderada em todas as etapas de desenvolvimento e a presença de carboidratos totais e corpos lipídicos foi averiguada nas fases iniciais de indução. Após 20 dias, houve mobilização dessas substâncias de reserva concomitantemente com a formação e desenvolvimento de meristemoides. Deste modo, sugere-se que a expressão desses genes está associada aos processos de aquisição de competência embriogênica e podem servir como marcadores moleculares desse processo. Os resultados do isolamento e expressão dos genes SERK e BBM em P. cincinnata são inéditos e contribuem para o melhor entendimento dos processos que envolvem a embriogênese somática na espécie. Nosso trabalho apresenta dados inéditos da indução de embriões somáticos em P. setacea e como as espécies estudadas apresentam respostas morfogênicas divergentes quando submetidas ao mesmo meio de indução. E ainda, relatamos à expressão dos genes BBM e SERK e a mobilização de compostos de reserva no decorrer dos eventos morfogênicos in vitro em P. setacea e P. cincinnata. / The acquisition of embryogenic competence in somatic cells is intriguing process and requires both molecular-genetic and cytological knowledge to better understand the mechanisms and cellular changes involved. Based on this, the aim of this study was to isolate and characterize the expression of SERK and BBM genes in somatic embryos of Passiflora cincinnata, as well as to evaluate the morphogenic in vitro response of Passiflora setacea and P. cincinnata somatic embryogenesis inducted and monitoring the reserve mobilization and expression of the these genes during embryogenesis. For this, RNA was extracted and cDNA was obtained from embryogenic calli of P. cincinnata after 20 days in induction medium (IM), which was used as template for the coding sequence amplification with degenerate primers of SERK and BBM. Mature zygotic embryos of P. setacea and P. cincinnata were inoculated on MS medium supplemented with 31.06 μM of picloram + 2.22 μM of benzyladenine + 2.27 μM of thidizuron + 500mg L -1 of malt extract + 13.77 μM of spermidine. After 30 days, the cultures were transferred to the maturation medium (MM), composed of MS medium supplemented with 1 % of activated charcoal without growth regulators. Samples with 0, 10, 20 and 30 days were collected for light microscopy, scanning electron microscopy, histochemical analyzes and in situ hybridization, following specific protocols. A RNA probe from P. cincinnata cDNA was generated to figure out the expression of SERK and BBM genes, whereas to P. setacea a heterologous sense and antisense probe of P. cincinnata was used. The phylogenetic relationship of P. cincinnata isolated sequences compared with other species suggests that the functions of the proteins are preserved. In SERK, the Pc contig1 grouped up with SERK1 and SERK2 members, while the Pc contig2 grouped with SERK3/BAK1 members. On the other hand, the BBM Pc contig1 was grouped with BBM1 and BBM2 members. The expression of SERK gene was found in zygotic embryos and gradually decreased until 20 days in the IM. After 30 days in the IM, globular somatic embryos were intensely marked with the hybridization signal, as well as embryos with 5 and 40 days in the MM. BBM transcripts were observed in zygotic embryos, but the expression was stopped during the somatic embryos development. The expression was resumed in somatic globular embryos after 40 days in the MM, similar to that observed in zygotic embryos. In the second chapter, in P. setacea embryogenesis process, it was observed the formation of lumps that originate pro-embryogenic zones, which developed into somatic embryos. In P. cincinnata a proliferation of the ground meristem cells and meristemoids formation occurred, emphasizing organogenic regions. When transferred to MM, there was no plant regeneration from somatic embryos of P. setacea. In P. cincinnata, swelling of callus regions and, in some cases, formation of leaf primordia was observed. Regarding the gene expression, in P. setacea there was BBM and SERK expression in all stages, especially in lumps and somatic embryos. Also P. cincinnata showed transcripts of BBM and SERK genes in all stages, with intensification of the hybridization signal at the explants edges and meristematic regions after 20 days in the IM. Protein bodies were found in P. setacea, decreasing gradually until 30 days in the IM. Carbohydrate and starch levels decreased after 10 days, but there was de novo synthesis of starch at 30 days of induction, coupled with the somatic embryos formation. No lipid bodies during the embryogenic process were verified. In P. cincinnata protein bodies and starch were moderately present in all development stages whereas carbohydrates and lipid bodies were present only at the early stages of induction. After 20 days, these reserve substances were mobilized, along with the meristemoids formation and development. Therefore, it is suggested that the expression of these genes is associated with embryogenic competence acquisition process and can be a molecular marker of this process. These results of isolation and expression of SERK and BBM genes in P. cincinnata are original and contribute to a better understanding of the processes involving somatic embryogenesis in this species. This work brings a new approach for somatic embryogenesis induction in P. setacea and highlights how these two species show different responses when submitted to the IM. In addition, the expression of the genes BBM and SERK as well as the mobilization of reserve compounds during in vitro morphogenic events in P. setacea and P. cincinnata were related.

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2016-10-06T13:31:22Z No. of bitstreams: 1 Tiago Vinicius Batista do Carmo.pdf: 833536 bytes, checksum: 6f420d513b278867c960dacc4bea24ac (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-06T13:31:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tiago Vinicius Batista do Carmo.pdf: 833536 bytes, checksum: 6f420d513b278867c960dacc4bea24ac (MD5) Previous issue date: 2014-01-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The Passiflora cincinnata Mast. species is gaining popularity in the market and it has been considered a wild species that has great potential to contribute to the genetic improvement of commercial passion fruit. This study aims to evaluate the genotypes of wild passion fruit (P. cincinnata) by using morphological descriptors, agronomic traits and molecular markers ISSR. The experimental was randomized blocks in simple scheme with five replications and two plants per plot. For morphoagronomic characterization were evaluated 22 quantitative traits and 13 qualitative characteristics. For molecular characterization 12 ISSR primers were tested. Ac cording to the mean squares obtained from the analyzes of the variance to 21 traits evaluated, it can be highlighted that the significant differences (p <0.01) among the means of the genotypes for all traits. It was found that for the 21 morphological traits measured, which contributed most to the diversity was the MI (internode mean) with 43.12%, followed by DH5 (diameter stems to 5 cm of soil) and LS (spread sepal). The average similarity found was 68%. UBC 887 and UBC 841 primers stood out with the highest values for the attributes of the markers observed, demonstrating suitability to use in researches of different types of P. cincinnata. It was diagnosed low genetic variability among genotypes. The genotypes have potential to be used in breeding programs, especially those exploiting obtaining ornamental passiflora. / A espécie Passiflora cincinnata Mast. vem se popularizando no mercado e tem sido considerada uma das espécies silvestres que possuem grande potencial para contribuir com o melhoramento genético do maracujazeiro comercial. Diante do exposto, este trabalho tem como objetivo avaliar genótipos de maracujá-do-mato (P. cincinnata) por meio de descritores morfológicos e descritores agronômicos, além de marcadores moleculares do tipo ISSR, visando identificar variabilidade genética. O delineamento experimental foi em blocos casualizados em esquema simples com cinco repetições, com duas plantas por parcela. Para caracterização morfoagronômica foram avaliadas 22 características quantitativas e 13 características qualitativas. Para caracterização molecular foram testados 12 primers de ISSR. De acordo com os quadrados médios obtidos das análises de variância para as 21 características avaliadas pode-se ressaltar as diferenças significativas (p<0,01) entre as médias dos genótipos para todos os caracteres avaliados. Verificou-se que para os 21 descritores morfológicos avaliados, o que mais contribuiu para a diversidade foi o MI (média internódio) com 43,12%, seguido por DH5 (diâmetro das hastes a 5 centímetros do solo) e LS (largura da sépala). A similaridade média encontrada foi 68%. Os primers UBC 887 e UBC 841 se destacaram com os valores mais altos para os atributos dos marcadores observados, demonstrando aptidão para serem utilizados em pesquisas de diversidade em P. cincinnata. Foi diagnosticada baixa variabilidade genética entre os genótipos avaliados. Os genótipos possuem potencial para serem utilizados em programas de melhoramento, principalmente os que exploram a obtenção de passifloras ornamentais.

Much is known about how organs acquire their identity, yet we are only beginning to learn how their shape is regulated. Recent work has elucidated the role of coordinated cell division & expansion in determining plant organ shape. For instance, in Antirrhinum, leaf shape is affected in the cincinnata (cin) mutant because of an alteration in the cell division pattern. CIN codes for a TCP transcription factor and controls cell proliferation. It is unclear how exactly CIN-like genes regulate leaf morphogenesis. We have taken biochemical and genetic approach to understand the TCP function in general and the role of CIN-like genes in leaf morphogenesis in Antirrhinum and Arabidopsis. Targets of CINCINNATA To understand how CIN controls Antirrhinum leaf shape, we first determined the consensus target site of CIN as GTGGTCCC by carrying out RBSS assay. Mutating each of this target sequence, we determined the core binding sequence as TGGNCC. Hence, all potential direct targets of CIN are expected to contain a TGGNCC sequence. Earlier studies suggested that CIN activates certain target genes that in turn repress cell proliferation. To identify these targets, we compared global transcripts of WT and cin leaves by differential display PCR and have identified 18 unique, differentially expressed transcripts. To screen the entire repertoire of differentially expressed transcripts, we have carried out extensive micro-array analysis using 44K Arabidopsis chips as well as 13K custom-made Antirrhinum chips. Combining the RBSS data with the results obtained from the micro-array experiments, we identified several targets of CIN. In short, CIN controls expression of the differentiation-specific genes from tip to base in a gradient manner. In cin, such gradient is delayed, thereby delaying differentiation. We also find that gibberellic acid, cytokinin and auxin play important role in controlling leaf growth. Genetic characterization of CIN-homologues in Arabidopsis Arabidopsis has 24 TCP genes. Our work and reports from other groups have shown that TCP2, 4 and 10 are likely to be involved in leaf morphogenesis. These genes are controlled by a micro RNA miR319. To study the role of TCP4, the likely orthologue of CIN, we generated both stable and inducible RNAi lines. Down-regulation of TCP4 transcript resulted in crinkly leaves, establishing the role of TCP4 in leaf shape. To study the function of TCP2, 4 & 10 in more detail, we isolated insertion mutants in these loci. The strongest allele of TCP4 showed embryonic lethal phenotype, indicating a role for TCP4 in embryo growth. All other mutants showed mild effect on leaf shape, suggesting their redundant role. Therefore, we generated and studied various combinations of double and triple mutants to learn the concerted role of these genes on leaf morphogenesis. To further study the role of TCP4 in leaf development, we generated inducible RNAi and miRNA-resistant TCP4 transgenic lines and carried out studies with transient down-regulation and up-regulation of TCP4 function. Upon induction, leaf size increased in RNAi transgenic plants whereas reduced drastically in miR319 resistant lines, suggesting that both temporal & spatial regulation of TCP4 is required for leaf development. Biochemical characterization of TCP domain To study the DNA-binding properties of TCP4, random binding site selection assay (RBSS) was carried out and it was found that TCP4 binds to a consensus sequence of GTGGTCCC. By patmatch search and RT-PCR analysis, we have shown that one among 74 putative targets, EEL (a gene involved in embryo development), was down regulated in the RNAi lines of TCP4. This suggests that EEL could be the direct target of TCP4. We have tested this possibility in planta by generating transgenic lines in which GUS reporter gene is driven by EEL upstream region with either wild type or mutated TCP4 binding site. GUS analysis of embryos shows that transgenic with mutated upstream region had significantly reduced reporter activity in comparison to wild type, suggesting that EEL is a direct target of TCP4. We have further shown that TCP4 also binds to the upstream region of LOX2, a gene involved in Jasmonic acid (JA) biosynthesis (in collaboration with D. Weigel, MPI, Tubingen, Germany). TCP domain has a stretch of basic residues followed by a predicted helix-loop-helix region (bHLH), although it has little sequence homology with canonical bHLH proteins. This suggests that TCP is a novel and uncharacterized bHLH domain. We have characterized DNA-binding specificities of TCP4 domain. We show that TCP domain binds to the major groove of DNA with binding specificity comparable to that of bHLH proteins. We also show that helical structure is induced in the basic region upon DNA binding. To determine the amino acid residues important for DNA binding, we have generated point mutants of TCP domain that bind to the DNA with varied strength. Our analysis shows that the basic region is important for DNA binding whereas the helix-loop-helix region is involved in dimerization. Based on these results, we have generated a molecular model for TCP domain bound to DNA (in Collaboration with Prof. N. Srinivasan, IISc, Bangalore). This model was validated by further site-directed mutagenesis of key residues and in vitro assay. Functional analysis of TCP4 in budding yeast To assess TCP4 function in regulation of eukaryotic cell division, we have introduced TCP4 in S. cerevisiae under the GAL inducible promoter. TCP4 induction in yeast cells always slowed down its growth, indicative of its detrimental effect on yeast cell division. Flow cytometry analysis of synchronized cells revealed that TCP4 arrests yeast cell division specifically at G1→S boundary. Moreover, induced cells showed distorted cell morphology resembling shmoo phenotype. Shmooing is a developmental process which usually happened when the haploid cells get exposed to the cells of opposite mating type and get arrested at late G1 phase due to the inhibition of cdc28-cln2 complex. This suggested that TCP4-induced yeast cells are arrested at late G1 phase probably by the inhibition of cdc28-cln2 complex. To further investigate how TCP4 induce G1→S arrest, we carried out microarray analysis and found expression of several cell cycle markers significantly altered in TCP4-induced yeast cells. Studies on crinkly1, a novel leaf mutant in Arabidopsis To identify new genes involved in leaf morphogenesis, we have identified crinkly1 (crk1), a mutant where leaf shape and size are altered. We observed that crk1 also makes more number of leaves compared to wild type. Phenotypic analysis showed that crk1 leaf size is ~5 times smaller than that of wild type. Scanning electron microscopy (SEM) showed that both cell size and number are reduced in the mutant leaf, which explains its smaller size. We have mapped CRK1 within 3 cM on IV chromosome.