La lutte chimique est la principale méthode utilisée pour contrôler les maladies causées par les champignons phytopathogènes. Dans certains cas, desphénomènes de résistance envers les fongicides se développent au sein despopulations, altérant parfois l’efficacité des molécules. La compréhension du moded’action des fongicides et des mécanismes de résistance sous-jacents participe à élaboreret à adapter des stratégies de management anti résistance ; et ainsi permettre depérenniser la durée de vie des molécules. Le fenhexamid est un fongicide récent (BayerCropScience, 2000), avec un mode d’action unique. Il est le seul fongicide commercialisébloquant l’étape de C4-déméthylation de la biosynthèse de l’ergostérol. Plusieurs typesde résistance (naturelle et acquises) ont été détectées dans les vignobles européens chez lecomplexe d’espèces Botrytis spp. responsable de la pourriture grise de la vigne. Lestravaux développés durant la thèse s’inscrivent dans l’objectif de la caractérisation dumode d’action et de l’élucidation des mécanismes de résistance. Le premier axe s’estattaché à la caractérisation fonctionnelle de deux gènes impliqués dans la C-4déméthylation de la biosynthèse de l’ergostérol : le gène erg27 codant la 3-céto réductase,cible du fenhexamid, et le gène erg28 codant une protéine qui interagirait en partie avecla 3-céto réductase. Concernant la résistance au fenhexamid, il a été démontré que, pargénétique inverse, les mutations détectées dans le gène erg27 de différents types d'isolatsrésistants issus du vignoble (phénotypes de résistance HydR3- et HydR3+) conféraient larésistance. Par ailleurs, une analyse de fitness du phénotype le plus préoccupant(phénotype HydR3+) a été réalisée en conditions contrôlées sur des souches isogéniquesartificielles afin d’apporter une réponse sur la persistance possible de ces souches auvignoble. Une méthode fine de quantification moléculaire de ces mêmes isolats aégalement été mise au point pour faciliter le suivi de leur évolution et de la persistancedes populations naturelles à l’échelle des vignobles. Cette nouvelle méthode, nomméeASPPAA PCR, exploite le polymorphisme nucléotidique du gène erg27, à l’origine de larésistance. Enfin, la résistance naturelle au fenhexamid de l’espèce apparentée à Botrytiscinerea, appelée Botrytis pseudocinerea a été élucidée. La résistance au fongicide de cetteespèce a été expliquée par la combinaison de modifications de cible (mécanismeminoritaire) et d’une dégradation du fongicide par un cytochrome P450 nomméCyp68.4 (mécanisme majeur). Il s’agit de la première identification et caractérisationgénétique d’un mécanisme de résistance à un fongicide conférée par un processus dedétoxification chez un champignon phytopathogène. / Chemical control is the main method used to control diseases caused byphytopathogenic fungi. In some cases, the resistance phenomena towardfungicides occur within fungal populations, which might alter practicalefficiency of molecules. Understanding modes of action of fungicides andunderlying resistance mechanisms participate to the development and adaptationof management strategies against resistance, and thus help to sustain the life ofmolecules. Fenhexamid is a recent fungicide (Bayer CropScience, 2000), with aparticular mode of action. It is the only fungicide marketed blocking the C4-demethylation step of ergosterol biosynthesis. Several types of resistance (naturaland acquired) were detected in European vineyards in the Botrytis spp speciescomplex, causing grey mold disease. This work focused on the characterization ofthe mode of action and the elucidation of resistance mechanisms. The first aspectinvestigated the functional characterization of two genes involved in the C4-demethylation of ergosterol biosynthesis. The erg27 gene potentially encoding the3-keto reductase which is the fenhexamid target and the erg28 gene encoding aprotein that interact in part with the 3-ketoreductase. Concerning fenhexamidresistance, we shown by reverse genetics that mutations detected in the erg27 genefrom different resistant isolates from the vineyards (phenotypes HydR3- andHydR3+) confer resistance. Furthermore, a fitness analysis under controlledconditions on the most worrying resistant phenotype (HydR3+) was performed onisogenic artificial strains in order to predict the possible persistence of these strainsin vineyards. A fine molecular method to quantify these isolates was developed tofacilitate the follow-up of evolution and persistence of resistant populations in thevineyard. This new method, named ASPPAA PCR is based on the nucleotidepolymorphism of the erg27 gene, responsible for fenhexamid resistance. Finally,the natural resistance to fenhexamid of the related species to Botrytis cinerea, B.pseudocinerea, was elucidated. Fungicide resistance of this species is explained bythe combination of target site modifications (minor mechanism) and fungicidedegradation mediated by a cytochrome P450 named Cyp68.4 (major mechanism).This is the first characterization of a genetic resistance mechanism to a fungicideconferred by detoxification in a phytopathogenic fungus.

La sélection naturelle constitue un processus clé de l’adaptation des populations à leur environnement, favorisant les variants présentant les meilleures valeurs sélectives. Les champignons présentent généralement des traits biologiques (diversité des modes de reproduction, grandes tailles de populations, fortes capacités de dispersion, entre autres) qui favorisent leur adaptation à des environnements variés. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’évolution de leurs populations sous les contraintes, naturelles et anthropiques, qu’elles subissent constituent donc un enjeu majeur pour la protection des plantes, en particulier dans le contexte actuel de durabilité des méthodes de lutte. Dans cette thèse, nous avons décrit la structure et la diversité des populations Botrytis cinerea à l’aide de marqueurs neutres et sélectionnés et d’un échantillonnage emboîté, et avons proposé des mécanismes pouvant expliquer les résultats observés. Puis nous avons analysé la réponse adaptative des populations de B. cinerea en Champagne, aux applications de fongicides. Premièrement, nous avons montré que la pourriture grise était causée par un complexe de deux espèces cryptiques, vivant en sympatrie sur des hôtes communs. De plus, les populations françaises de B. cinerea sont structurées en cinq dèmes, caractérisés par le système de culture (sélection directionnelle), la plante-hôte (adaptation écologique), et dans une moindre mesure, par la géographie. Sur vigne, nous avons mis en évidence une entité dont l’isolement génétique semble lié à un isolement temporel. Par ailleurs, nous avons montré que l’application de fongicides conduit à la sélection de phénotypes résistants spécifiquement à quasiment tous les modes d’action homologués, selon des proportions variant suivant les vignobles et les usages. Plus particulièrement, la résistance aux fongicides inhibiteurs de la succinate déshydrogénase (SDHI) est causée par au moins sept mutations affectant les gènes encodant la protéine cible de ces fongicides, déterminant ainsi une grande variété de phénotypes. Enfin, nous avons montré que les fongicides ne modifiaient pas la structure neutre des populations mais qu’ils pouvaient conduire à une perte de richesse allélique dans les populations traitées ainsi qu’à un équilibre sélection-migration détectable dans certaines situations sous forme de clines au loci sous pression de sélection contemporaine tels que ceux déterminant la résistance multidrogues. La modélisation de l’évolution des fréquences de résistance hivernale a permis d’estimer le coût de la résistance pour quatre loci déterminant la résistance aux fongicides. Cette thèse a permis d’appréhender le fonctionnement des populations de B. cinerea et de comprendre et quantifier partiellement les mécanismes sélectifs opérant in natura. Ces informations seront utilisées pour raisonner des stratégies anti-résistance adaptées localement et durables. / Natural selection is the most powerful force driving population adaptation to their environment, favoring the variants with the best fitness. Fungi generally exhibit biological traits (diversity of reproduction modes, large population sizes, and intense dispersion) that favor their adaptation to changing environments. Therefore, disentangling the mechanisms that explain their evolution under natural and anthropic constraints constitute a major challenge for plant protection, especially in the actual context of agriculture sustainability. In this thesis, we described Botrytis cinerea population structure and diversity, using neutral and selected markers and a hierarchical sampling, and proposed mechanisms that may explain these observations. We then analyzed the adaptive answer of this species towards fungicide applications. First, we showed that grey mold populations were caused by a complex of two cryptic species, living sympatrically on the same hosts. Second, B. cinerea populations are divided into five demes, according to the cropping system (directional selection), the host-plant (ecological adaptation), and to a lesser extent, by geography. On grapevine, we identified a specific populations exhibiting temporal isolation, as an evidence of extreme exploration of the viticultural conditions. Moreover, fungicide applications select resistance towards all unisite modes of action, with few exceptions, but at varying proportions according to vineyards and fungicide use. More specifically, resistance to succinate dehydrogenase inhibitors (SDHIs) is caused by at least seven mutations altering the target genes of these fungicides, and determines a large variety of phenotypes in the field. At last, we showed that fungicides did not shape population structure but that they could decrease allele richness in treated areas and lead to migration-selection equilibrium, detectable in some situation and for loci under contemporary selective pressures as clines. Modeling the evolution of resistance during winter allowed estimating fitness cost of four loci involved in contemporary fungicide resistance, such as multidrug resistance. As a conclusion, this thesis helped to understand how B. cinerea populations evolve and to detect and quantify selective mechanisms at work in natura. This information will be useful to deign sustainable and locally-adapted anti-resistance strategies.

Thesis (MScAgric)--Stellenbosch University, 2012. / ENGLISH ABSTRACT: Botrytis cinerea Pers. Fr. [teleomorph Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel] causes serious losses of over 200 crops worldwide, including rooibos seedlings and pears. This pathogen is characterized by morphological, physiological and genetic diversity. The genetic diversity and population structure have not been investigated for B. cinerea populations in South Africa. Botrytis cinerea collected from rooibos seedlings and in pear orchards in the Western Cape of South Africa were investigated in the present study. The study was done with the aid of microsatellite markers, the amplification of mating type alleles MAT1-1 and MAT1-2 and determination of resistance towards various fungicides. Population dynamics was inferred and a similar picture emerged in both production systems. Botrytis cinerea annually causes severe losses of rooibos seedlings (Aspalathus linearis) in nurseries situated in the Clanwilliam region. Sampling was done in five nurseries and the cryptic species status of the isolates obtained was determined through restriction enzyme digestion of the Bc-hch gene. All but one (206 out of 207) of the isolates belonged to Group II or B. cinerea ‘sensu stricto’. Analysis of the B. cinerea Group II population, using seven microsatellite loci, was performed to assess the genetic population structure. Total gene diversity (H) was high, with a mean of 0.67. Two of the nurseries populations’ sample sizes were severely limited after clone correction, yet 100 genotypes were discerned among the 206 isolates genotyped. The percentage of maximal genotypic diversity (G) ranged between 16 and 68 for the five populations, with a total value of 17 for the 100 genotypes. One genotype, represented by 27 clones, was isolated from four nurseries. Relatively low but significant population differentiation was observed in total between nurseries (mean FST = 0.030, P = 0.001). The distribution of mating types MAT1-1 and MAT1-2 differed significantly from the ratio of 1:1 for the total population plus two of the nurseries’ populations. Three nursery populations had an equal mating type distribution. The index of association (IA) analyses suggests that the populations are asexually reproducing. Analysis of molecular variance (AMOVA) indicated that 97% of the total genetic variation is distributed within subpopulations. Fungicide resistance frequency against iprodione for 198 of the genotyped isolates displayed highly varying levels of resistance amongst the five nurseries. The mean total incidence of resistance towards iprodione was 43%, ranging from 0% to 81% for the five nurseries. Baseline sensitivity towards pyrimethanil yielded an average EC50 value of 0.096 mg/L. Botrytis cinerea isolates were collected from pear blossoms (Pyrus communis) in four orchards. Two orchards in the Ceres area and two in the Grabouw area were sampled from. A total of 181 isolates were collected from the four orchards. Incidence of blossom infection in the orchards ranged from 3% to 17%. Overall, there was a high incidence of isolates that had only the Boty transposable element (74%) compared to those harbouring both (Boty and Flipper), simultaneously (transposa, 24%). One isolate examined had the Flipper element only. Cryptic species status according to restriction enzyme digestion of the Bc-hch gene indicated that all the isolates belonged to Group II or B. cinerea ‘sensu stricto’. Analysis of the Group II population, through the use of seven microsatellite loci, was performed to assess the genetic population structure. Total gene diversity (H) was high, with a mean of 0.69 across all populations. Although two of the subpopulations displayed a high clonal proportion, overall 91 genotypes were discerned among the 181 isolates. The percentage of maximal genotypic diversity (G) ranged between 18 and 33 for the four populations, with a total value of 14 for the 91 genotypes. One genotype, represented by 27 clones, was isolated from all orchards. Moderate, but significant population differentiation was present in total among orchards (mean FST = 0.118, P = 0.001). The distribution of the mating types, MAT1-1 and MAT1-2, did not differ significantly from a 1:1 ratio for the total population as well as the subpopulations. Index of association (IA) analyses, on the other hand, suggests that the populations reproduce asexually. Analysis of molecular variance (AMOVA) indicated that 88% of the total genetic variation is distributed within subpopulations, 9% between subpopulations and only 3% between production areas. Fungicide resistance frequency against fenhexamid, iprodione and benomyl varied, with the highest levels of resistance present against benomyl and low levels of resistance seen towards iprodione and fenhexamid. In conclusion, this study has shown that there exist within the studied populations of B. cinerea, obtained from rooibos nurseries and pear orchards, an adaptive capacity to overcome current means of control. The use of population genetics to further our understanding of how plant pathogens interact and spread throughout a given environment is of cardinal importance in aiding the development of sustainable and integrated management strategies. Knowledge of the dispersal of B. cinerea in the two studied cropping systems has shed light on the inherent risk that it poses, and this together with knowledge of the levels of resistance that occurs should serve as an early warning to help divert possible loss of control in future. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Botrytis cinerea Pers. Fr. [teleomorf Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel] veroorsaak ernstige verliese van meer as 200 gewasse wêreldwyd, insluitende rooibossaailinge en pere. Hierdie patogeen word deur morfologiese, fisiologiese, asook genetiese diversiteit gekenmerk. Die genetiese diversiteit en populasie-struktuur van B. cinerea populasies wat in Suid-Afrika voorkom, is nog nie ondersoek nie. Botrytis cinerea verkryg vanaf rooibossaailinge en in peerboorde in die Wes-Kaap van Suid-Afrika is ondersoek. Hierdie studie is met behulp van mikrosatellietmerkers, amplifikasie van die twee paringstipe gene (MAT1-1 en MAT1-2), asook die bepaling van weerstandsvlakke teenoor verskeie swamdoders, uitgevoer. Populasie-dinamika is afgelei en ‘n soortgelyke tendens is in beide produksie-sisteme waargeneem. Botrytis cinerea veroorsaak jaarliks ernstige verliese van rooibossaailinge (Aspalathus linearis) in kwekerye in die Clanwilliam-area. Monsters is in vyf kwekerye versamel en die kriptiese spesiestatus van die verkrygde isolate is deur restriksie-ensiemvertering van die Bc-hch geen bepaal. Almal behalwe een (206 uit 207) isolaat het aan Groep II of B. cinerea ‘sensu stricto’ behoort. Analise van die B. cinerea Groep II populasie, deur middel van sewe mikrosatellietmerkers, is uitgevoer om die genetiese populasiestruktuur te bepaal. Totale geendiversiteit (H) was hoog, met ‘n gemiddelde van 0.67. Alhoewel twee van die kwekerye se monstergrootte erg ingeperk is ná kloonverwydering, is daar nogtans 100 genotipes onder die 206 isolate wat geïsoleer is, waargeneem. Die persentasie van maksimale genotipiese diversiteit (G) het tussen 16 en 68, vir die vyf populasies, gewissel, met ‘n totaal van 17 vir die 100 genotipes. Een genotipe, verteenwoordig deur 27 klone, is uit vier kwekerye geïsoleer. Relatief lae dog noemenswaardige populasie-differensiasie is in totaal tussen kwekerye waargeneem (gem. FST = 0.030, P = 0.001). Die verspreiding van die twee paringstipes (MAT1-1 en MAT1-2) het beduidend verskil van ‘n 1:1 verhouding vir die totale populasie, asook twee van die kwekerye se populasies. Die drie oorblywende kwekerye se populasies het egter ‘n gelyke verdeling van die twee paringstipes getoon. Die indeks van assosiasie (IA) analises toon dat die populasies ongeslagtelik voortplant. Analise van molekulêre variasie (AMOVA) het aangedui dat 97% van die totale genetiese variasie binne die subpopulasies versprei is. Hoogs variërende vlakke van weerstand tussen die vyf kwekerye teenoor die swamdoder iprodioon, is vir die 198 isolate wat getoets is, gevind. Die totale gemiddelde frekwensie van weerstand teenoor iprodioon was 43%, wat tussen 0% en 81% vir die vyf kwekerye gevarieer het. Fondasie-vlak-sensitiwiteit vir pyrimethanil het ‘n gemiddelde EC50 waarde van 0.096 mg/L opgelewer. Botrytis cinerea isolate is ook vanuit peerbloeisels (Pyrus communis L.) vanuit vier boorde versamel, twee uit elk van die Ceres- en Grabouw-areas. In totaal is 181 isolate vanuit die vier boorde versamel. Die frekwensie van bloeiselinfeksie het tussen 3% en 17% gewissel. Oor die algemeen was daar ‘n hoë frekwensie van isolate wat slegs die Boty transponeerbare element teenwoordig gehad het (74%) in vergelyking met dié wat tegelykertyd beide (Boty en Flipper) teenwoordig gehad het. Een isolaat het slegs die Flipper element gehad. Bepaling van die kriptiese spesiestatus met behulp van restriksie-ensiemvertering van die Bc-hch geen het aangedui dat alle versamelde isolate tot Groep II of B. cinerea ‘sensu stricto’ behoort het. Analise van die Groep II populasie, deur middel van sewe mikrosatellietmerkers, is uitgevoer om genetiese populasie-struktuur te bepaal. Totale geendiversiteit (H) was hoog, met ‘n gemiddelde van 0.69 oor alle populasies. Alhoewel twee subpopulasies ‘n hoë klonale fraksie getoon het, is 91 genotipes tussen die 181 isolate wat verkry is, onderskei. Die persentasie van maksimale genotipiese diversiteit (G) het tussen 18 en 33 vir die vier populasies gewissel, met ‘n totale waarde van 14 vir die 91 genotipes. Een genotipe, verteenwoordig deur 27 klone, was in al vier boorde teenwoordig. Gematigde dog beduidende populasie differensiasie was in totaal tussen boorde teenwoordig (gem. FST = 0.118, P = 0.001). Die verspreiding van die paringstipes (MAT1-1 en MAT1-2) het nie betekenisvol van ‘n 1:1 verhouding vir die totale populasie, insluitende die subpopulasies, verskil nie. Indeks van assosiasie (IA) analises het egter aangedui dat die populasies ongeslagtelik voortplant. Analise van molekulêre variasie (AMOVA) het aangedui dat 88% van die totale genetiese variasie in subpopulasies te vinde was, 9% tussen subpopulasies en slegs 3% tussen produksie-areas. Frekwensie van swamdoder weerstandbiedendheid vir fenhexamid, iprodioon en benomyl het gewissel, met die hoogste vlakke teenoor benomyl waargeneem, maar baie lae vlakke teenoor fenhexamid en iprodioon. Samevattend het hierdie studie getoon dat die populasies van B. cinerea wat in hierdie twee produksie-sisteme, op rooibossaailinge en in peer boorde, ondersoek is, ‘n aanpasbaarheid toon om huidige metodes van beheer te oorkom. Die gebruik van populasiegenetika as ‘n hulpmiddel om ons kennis van patogeen-interaksies en -verspreiding te verbreed, is van kardinale belang in die ontwikkeling van geïntegreerde en volhoubare beheermaatreëls. Kennis van die verspreiding van B. cinerea in die bestudeerde gewasproduksiestelsels, werp lig op die inherente risiko wat dié patogeen inhou. Dít, tesame met kennis van die weerstandsvlakke wat voorkom, kan as ‘n vroegtydige waarskuwing dien ten einde moontlike verlies van beheer in die toekoms te help teenwerk.

La succinate déshydrogénase (SDH) est à la fois une enzyme clé du cycle de Krebs oxydant le succinate en fumarate et le complexe II de la chaîne respiratoire mitochondriale impliqué dans le transfert des électrons et la réduction de l’ubiquinone. Des inhibiteurs de cette enzyme (SDHI) ont été développés ou sont en cours de développement comme antifongiques. Cette famille de fongicides est notamment utilisée pour lutter contre Botrytis cinerea, champignon phytopathogène responsable de la pourriture grise sur de nombreuses cultures dont la vigne. Des souches résistantes aux SDHI ont été isolées chez B. cinerea et d’autres champignons phytopathogènes. Chez ces isolats résistants, des mutations ont été identifiées dans les gènes codant la SDH. Au cours de cette thèse, nous avons étudié l’impact de mutations affectant la sous-unité B (SdhB) de la succinate déshydrogénase sur l’activité de l’enzyme, la biologie du champignon B. cinerea et la résistance aux inhibiteurs ciblant cette enzyme. Par mutagénèse dirigée du gène sdhB, nous avons obtenu des mutants dits « isogéniques » qui ont permis de confirmer l’implication de ces mutations dans la résistance aux différentes molécules SDHI. Par ailleurs, nos résultats montrent que les modifications de la sous-unité SdhB affectent l’affinité des SDHI pour la SDH et les niveaux d’inhibition de l’activité SDH par les molécules inhibitrices ; ce qui explique - in fine - les spectres de résistance des mutants aux SDHI. Actuellement, tous les mutants sont résistants au boscalid et les mutants les plus fréquemment retrouvés au vignoble, sdhBH272R/Y, sont sensibles au fluopyram. Les travaux réalisés sur les mutants sdhB montrent que les mutations étudiées ont également un impact sur l’activité de l’enzyme et sur le développement du champignon, conséquences dépendantes du résidu substitué et de la substitution. En particulier, les mutations sdhBH272L/R affectent fortement l’activité de l’enzyme et la fitness du champignon alors que le mutant sdhBH272Y est peu affecté. Enfin, l’analyse de populations de pourriture grise de différentes origines (région, plantes hôtes) par rapport à la résistance aux SDHI réalisée sur les années 2009/2010 montre que les mutants sdhBH272R/Y sont toujours les plus fréquents mais leurs fréquences varient en fonction des situations agronomiques. Notamment la fréquence du mutant sdhBH272R augmente avec la pression de sélection exercée par les fongicides. Ce mutant attire particulièrement notre attention du fait de sa relation non linéaire entre fitness et fréquence au champ. / Succinate dehydrogenase is both a key enzyme of the TCA cycle, oxidizing succinate into fumarate and complex II of the mitochondrial respiratory chain involved in electron transfer and ubiquinone reduction. Inhibitors of this enzyme (SDHIs) have been developed or are in the developmental process as fungicides. Actually, SDHIs are registered to deal with Botrytis cinerea, a phytopathogenic fungus responsible for grey mold on many crops including grapevine. Strains of B. cinerea and other pathogenic fungi have been isolated for their resistance to SDHI. They mainly harbor mutations in genes encoding SDH subunits. During this thesis, we studied the impact of mutations modifying subunit B of succinate dehydrogenase on enzyme activity, fungal biology and resistance to SDHIs. “Isogenic” mutants obtained through site-directed mutagenesis and homologous recombination allowed us to confirm the role of sdhB mutations in SDHIs resistance. Our results also show that the substitutions in the SdhB subunit impact respectively the affinity of SDHIs to SDH and the inhibition levels of SDH activity by inhibitors, which explain – in fine – the resistance spectra observed for the mutants. Up to now, all sdhB mutants are resistant to boscalid and the most frequent mutants observed in grapevines, sdhBH272R/Y, are susceptible to fluopyram. Studies on sdhB mutants reveal that the mutations also impact the enzymatic activity and the fungal development depending on the substitution. In particular, sdhBH272L/R mutations have the strongest impact on enzyme activity and the fitness of the fungus, whereas these parameters are almost not altered in the sdhBH272Y mutant. Finally, grey mold populations from different origins (country, plant host) were analyzed for their SDHI resistance pheno- and genotypes. Yet, the sdhBH272R/Y mutants were the most frequent, but these frequencies varied according to the agronomical situation. Interestingly, the frequencies of the sdhBH272R mutant seem to increase with the selective pressure exerted by fungicides. This mutant is of particular interest because of the absence of correlation between the fitness we measured and the frequencies we observed in natura.

The native plant communities of Canterbury, South Island, New Zealand have been severely modified and degraded and the Canterbury Plain (750,000 ha) retains few remnants of its original forest and other ecosystems. The research presented here considers the mutualistic roles of exotic and indigenous species in the process of restoring degraded landscapes. Exotic species may have an important role in the (re) establishment of desired indigenous species, and may influence succession through to a forest dominated by them. One aspect of this work describes indigenous plant community regeneration facilitated by exotic willow (Salix spp.) woodland on the Canterbury Plain. Natural colonisation of the willow woodland by native plants was investigated, with respect to variation in the physical environment in the willow stand. Key factors in the success of willow woodland as a nursery for regeneration of native vegetation include: distance to the nearest seed source, the ability to attract seed dispersers (recruitment only occurred under perch sites), flooding potential (higher recruitment in areas less likely to flood) and possibly light availability. Control of vertebrate (and invertebrate) herbivory is also necessary for successful restoration. A second aspect was a field experiment in open pasture and in a non-native remnant woodland which was then used to investigate the effects of shelter, plant spacing, mulching and fertiliser on growth and survival of planted native woody species. With minimal management, the selected mid-late successional plants established poorly in the open pasture and had low survival rates (e.g.,Dacrycarpus dacrydioides, Pseudopanax arboreus, Aristotelia serrata, Melicytus ramiflorus). Only narrow-leaved species (e.g., Plagianthus reg ius, Hoheria angustifolia, Hebe salicifolia, Cordyline australis) survived this open pasture planting. In contrast, most species (broad and narrow-leaved) established under the sheltered sites. Exotic nursery vegetation and the establishment of native species, which will, in time, act as a seed source, will be important in successfully restoring a sustainable indigenous element in the cultural landscape of Canterbury. Ecological restoration requires an integrated approach, identifying and understanding the component processes of regeneration, and of the particular aspects/characteristics of the sites involved. This research shows that naturally established plants where existing shelter is available (in this case established willows) tend to have higher growth rates than individually planted plants in open situations, and that the availability of a suitable seed source can also contribute to successful establishment and growth rates. The meeting of restoration targets on the Canterbury Plain may be accelerated, and costs reduced, through the utilisation of areas where exotic species occur (for instance, extensive willow stands in riparian areas adjacent to waterways) and more particularly, where a local seed source is also available. The findings of this research can contribute to restoration management in helping identify the best practices, based on research, that can lead to the restoration of original plant and animal communities.

Organic mulches and cover crops mulched in situ were assessed for their effects on B. cinerea primary inoculum and disease levels in inflorescences at flowering and/or bunches at harvest. Organic mulches were used to enhance biological degradation of vine debris to reduce levels of B. cinerea primary inoculum the following season. Four mulch types (anaerobically and aerobically fermented marc (grape pressings), inter-row grass clippings and shredded office paper) were applied under ten-year-old Riesling vines in a ten-replicate randomized block design in New Zealand over two consecutive years. Plastic mesh bags, each containing naturally infected vine debris, were placed under vines on bare ground (control) and at the soil-mulch interface, in winter (July) 2003 and 2004. In each year, half the bags were recovered at flowering (December) and the remainder at leaf plucking (February), for assessment of B. cinerea sporulation from the vine debris and debris degradation rate. Bait lamina probes, which measure soil biological activity, were placed in the soil-mulch interface three weeks before each of the two bag-recovery dates in both years and were then removed and assessed at the same times as were the bags. All mulches led to a reduction in B. cinerea sporulation. This reduction was significantly correlated with elevated rates of vine debris decomposition and increased soil biological activity. Over both years, compared with the controls, all treatments gave a 3-20-fold reduction in B. cinerea sporulation, a 1.6-2.6-fold increase in vine debris degradation and in the two marc and the paper treatments, a 1.8-4-fold increase in activity of soil organisms. The mulches also altered vine characteristics and elevated their resistance to B. cinerea through changes to the soil environment. Functional soil biological activity, as measured by Biolog Ecoplates and bait lamina probes, was increased 2-4 times in the two marc and paper treatments, compared with the control, an effect relating to the elevated soil moisture and reduced temperature fluctuations under these mulches. Soil nutrient levels and the C:N ratios were also affected in these treatments. The mulched paper lowered vine canopy density by up to 1.4 times that of the other treatments, an effect which probably led to elevated light penetration into the canopy and consequent increased canopy temperature, photosynthesis and lowered canopy humidity. These changes to soil and vine characteristics increased grape skin strength by up to 10% in the paper treatment and sugar concentrations by 1.2-1.4 °Brix in the two marc and paper treatments. The severity of B. cinerea infections in the anaerobic marc, aerobic marc and paper treatments were reduced to 12%, 3% and 2.2% of the control, respectively, in field assessments averaged over two consecutive harvests. Cover crops mulched in situ had similar effects to those of the organic mulches, increasing soil biological activity and reducing B. cinerea primary inoculum and the severity of B. cinerea infection in grapes at harvest (2006). Inter-row phacelia and ryegrass were mulched in winter 2005 and compared with a bare ground control, under 10-year-old Chardonnay vines in a ten-replicate randomized block design. Functional soil biological activity increased by 1.5-4.5 times in the two cover crop treatments compared with the control, an effect possibly related to elevated soil moisture in these treatments. This increase in soil moisture and soil biological activity increased vine debris degradation, reduced B. cinerea primary inoculum on the debris and decreased B. cinerea severity at flowering (December 2005) and harvest (April 2006). These results show the potential of organic mulches and cover crops mulched in situ to enhance soil ecosystem services and improve the sustainability of viticultural practices.

The public concern over synthetic pesticides in foods and the environment has created an interest to find effective and safe non-fungicide means of controlling postharvest pathogens. The overall objective of this thesis was to evaluate the effect of potassium silicate, yeast antagonists and hot water dip treatment to control postharvest grey mould and blue mould of pome fruits, caused by Botrytis cinerea and Penicillium expansum, respectively. Botrytis cinerea and Penicillium expansum were isolated from infected strawberry and pear fruits, respectively. These isolates were found to be non-resistant to YieldPlus® (Anchor yeast, Cape Town, South Africa), a biofungicide containing a yeast Cryptococcus albidus. A total of 100 epiphytic yeast isolates were obtained from the fruit surface of “Golden Delicious” apples and “Packham’s Triumph” pears, and screened against B. cinerea and P. expansum. Fifteen yeast isolates reduced grey mould incidence by > 50%, when applied four hours before inoculation with B. cinerea. Similarly, seven yeast isolates reduced blue mould incidence by > 50%, when applied four hours before inoculation with P. expansum. YieldPlus® and yeast Isolate YP25 provided the best control of B. cinerea, while Isolate YP60 and YieldPlus® provided the best control of P. expansum on “Golden Delicious” apples. A mixture of YP25 and YP60 provided complete control of both B. cinerea and P. expansum, when applied to “Golden Delicious” apples before inoculation with either B. cinerea or P. expansum. Electron microscopy studies showed that yeast Isolates YP25 and YP60 inhibited the mycelial growth of B. cinerea and P. expansum, respectively. Preventative and curative application of potassium silicate resulted in reduced incidence of B. cinerea or P. expansum of “Golden Delicious” apples. Electron microscopy studies indicated that potassium silicate inhibited the growth of B. cinerea and P. expansum. Furthermore, treatment of “Golden Delicious” apples with either potassium chloride or potassium hydroxide resulted in reduced incidence of both B. cinerea and P. expansum. In vivo tests showed that the disease incidence of P. expansum and B. cinerea on “Golden Delicious” apples was reduced by hot water dip treatments at 58-60°C for 60 to 120 seconds, compared with the control fruit treated with sterile distilled water, without causing skin damage. The use of potassium silicate, yeasts (Isolates YP25 and YP60), YieldPlus® and the antagonists mixture (YP25+YP60) in combination, resulted in the control of B. cinerea and P. expansum of “Golden Delicious” apples compared with Imazalil® treated fruit. / Thesis (M.Sc.)-University of KwaZulu-Natal, Pietermaritzburg, 2012.

Nitric oxide (NO) regulates a wide range of plant processes from development toenvironmental adaptation. In this study, NO production and its effects were investigated in aplant-pathogen context. The production of NO following Arabidopsis treatment witholigogalacturonides (OGs), an endogenous elicitor of plant defense, was assessed using the NOsensitive probe 4, 5-diamino fluorescein diacetate. Pharmacological and genetic approaches wereused to analyze NO enzymatic sources and its role in the Arabidopsis thaliana /Botrytis cinereainteraction. We showed that NO production involves both a L-arginine- and a nitrate reductase(NR)-pathways. OGs-induced NO production was Ca2+-dependent and modulated RBOHDmediatedROS production. NO production was also regulated by CDPKs activities, but workedindependently of the MAPKs pathway. Using a transcriptomic approach, we further demonstratedthat NO participates to the regulation of genes induced by OGs such as genes encoding diseaserelatedproteins and transcription factors. The over-representation of certain regulatory elements(e.g. W-BOX) in promoter sequences of target genes also suggests the involvement of specifictranscription factors in the NO response. Mutant plants impaired in several selected NOresponsivegenes, as well as Col-0 plants treated with the NO scavenger cPTIO, were moresusceptible to B. cinerea. Taken together, our investigation deciphers part of the mechanismslinking NO production, NO-induced effects and basal resistance to Botrytis cinerea. Moregenerally, our data reinforce the concept that NO is a key mediator of plant defense responses

Certains microorganismes qui coexistent sur la vigne, peuvent avoir des effets bénéfiques sur la qualité du vin alors que d'autres peuvent être à l'origine de déviations organoleptiques. Dans la dernière décennie, dans diverses régions viticoles de France, plusieurs odeurs de moisi ou de terre ont été mises en évidence. La (-)-géosmine a été considérée comme étant le principal composé responsable de ce défaut. Des moisissures comme Botrytis cinerea et d'autres appartenant au genre Penicillium ont été souvent isolées à partir des raisins présentant l'odeur " moisi-terreuse ". Les effets de cette molécule sur la qualité des vins a motivé notre étude sur la caractérisation des moisissures responsables de ce défaut organoleptique. A partir d'échantillons prélevés en 2007 en Bourgogne, on a identifié, par des méthodes morphologiques et moléculaires, les moisissures présentes sur les raisins, Une souche de Penicilium expansum (25.03) et deux souches de Botrytis cinerea (BC1 et BC2) ont été sélectionnées. Sur baies de raisin, la validation d'un modèle prédictif des effets combinés de la température et de l'activité de l'eau, sur la croissance des champignons, a pu être mise en oeuvre. Elle a montré, sur de larges gammes de T°C et d'aw, que les modèles cardinaux avec inflexion peuvent être validés sur les produits agro-alimentaires en utilisant le gamma concept. L'étude de l'effet du cuivre sur le taux de croissance radiale et le temps de latence des moisissures, a été entreprise afin de mieux comprendre les mécanismes de résistance au cuivre des champignons et d'en déduire des résultats pour une meilleure efficacité des fongicides. Les moisissures testées ont montré une grande tolérance au cuivre, jusqu'à 4,7 mM pour P. expansum et jusqu'à 8, 2 mM et 7,3 mM respectivement pour B. cinerea, BC1 et BC2. L'étude des effets combinés des facteurs environnementaux et nutritionnels (T°C, CO2; Cu+2) sur la production de géosmine par P. expansum, a conduit à définir les conditions minimisant la production de géosmine. Ainsi, on a pu déterminer que le cuivre (composant actif de nombreux fongicides) est un facteur clé dans la production de géosmine par P. expansum.

La sélection naturelle constitue un processus clé de l'adaptation des populations à leur environnement, favorisant les variants présentant les meilleures valeurs sélectives. Les champignons présentent généralement des traits biologiques (diversité des modes de reproduction, grandes tailles de populations, fortes capacités de dispersion, entre autres) qui favorisent leur adaptation à des environnements variés. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l'évolution de leurs populations sous les contraintes, naturelles et anthropiques, qu'elles subissent constituent donc un enjeu majeur pour la protection des plantes, en particulier dans le contexte actuel de durabilité des méthodes de lutte. Dans cette thèse, nous avons décrit la structure et la diversité des populations Botrytis cinerea à l'aide de marqueurs neutres et sélectionnés et d'un échantillonnage emboîté, et avons proposé des mécanismes pouvant expliquer les résultats observés. Puis nous avons analysé la réponse adaptative des populations de B. cinerea en Champagne, aux applications de fongicides. Premièrement, nous avons montré que la pourriture grise était causée par un complexe de deux espèces cryptiques, vivant en sympatrie sur des hôtes communs. De plus, les populations françaises de B. cinerea sont structurées en cinq dèmes, caractérisés par le système de culture (sélection directionnelle), la plante-hôte (adaptation écologique), et dans une moindre mesure, par la géographie. Sur vigne, nous avons mis en évidence une entité dont l'isolement génétique semble lié à un isolement temporel. Par ailleurs, nous avons montré que l'application de fongicides conduit à la sélection de phénotypes résistants spécifiquement à quasiment tous les modes d'action homologués, selon des proportions variant suivant les vignobles et les usages. Plus particulièrement, la résistance aux fongicides inhibiteurs de la succinate déshydrogénase (SDHI) est causée par au moins sept mutations affectant les gènes encodant la protéine cible de ces fongicides, déterminant ainsi une grande variété de phénotypes. Enfin, nous avons montré que les fongicides ne modifiaient pas la structure neutre des populations mais qu'ils pouvaient conduire à une perte de richesse allélique dans les populations traitées ainsi qu'à un équilibre sélection-migration détectable dans certaines situations sous forme de clines au loci sous pression de sélection contemporaine tels que ceux déterminant la résistance multidrogues. La modélisation de l'évolution des fréquences de résistance hivernale a permis d'estimer le coût de la résistance pour quatre loci déterminant la résistance aux fongicides. Cette thèse a permis d'appréhender le fonctionnement des populations de B. cinerea et de comprendre et quantifier partiellement les mécanismes sélectifs opérant in natura. Ces informations seront utilisées pour raisonner des stratégies anti-résistance adaptées localement et durables.