Le glioblastome constitue la tumeur primitive maligne la plus fréquente et la plus agressive du système nerveux central, caractérisée par un pronostic sombre. L’infusion locale dans le parenchyme cérébral du cisplatine a présenté des résultats encourageants sur des modèles précliniques. La nanovectorisation permet de concentrer l’efficacité thérapeutique d’agents anticancéreux à leur cible. Leur fonctionnalisation par des unités d’imagerie offre la possibilité de suivre de façon non invasive par imagerie par résonance magnétique (IRM) leur biodistribution au sein du tissu lésé. Dans cette optique, un copolymère tribloc amphiphile biocompatible a été synthétisé par polymérisations par ouverture de cycle successives à partir d’un oxyde de polyéthylène (PEO). Après micellisation dans l’eau, des complexes de gadolinium ont été greffés sur la couronne de PEO et les fonctions carboxylates situées en périphérie du coeur micellaire se sont réticulées sur le cisplatine, conduisant à la formation d’une prodrogue macromoléculaire de taille nanométrique stable dans le temps. Le potentiel de ces nanoparticules bifonctionnelles comme agents de contraste IRM a été exploré à haut champ magnétique. Une telle vectorisation du cisplatine a en outre permis d’augmenter de façon significative l’accumulation du platine dans deux lignées humaines de glioblastome ainsi que la formation d’adduits à l’ADN par rapport à la drogue libre. L’implication de mécanismes biologiques sous-jacents à cette étude pose la question de l’existence d’autres cibles alternatives critiques des dérivés du platine, remettant en cause le paradigme établi depuis un demi-siècle définissant l’ADN comme la cible ultime du cisplatine. / Glioblastoma is the most frequent and aggressive primary malignant tumor of the central nervous system with a gloomy prognosis. Local infusion of cisplatin within the brain parenchyma exhibited promising results in preclinical models. Nanovectorization of anticancer agents even promotes the concentration of their therapeutic efficiency on their target. Anchorage ofimaging moieties on such smart drug delivery systems further enables the non-invasive monitoring of their biodistribution within the damaged tissue by magnetic resonance imaging (MRI). From this perspective, a biocompatible amphiphilic triblock copolymer was synthesized by successive ring-opening polymerizations from a polyethylene oxide (PEO). After micellization in water, gadolinium complexes were grafted to the PEO corona and the carboxylate functions located at the surface of the micelle’s core were able to cross-link with cisplatin. A stable nano-sized macromolecular prodrug was therefore recovered. Relaxomety measurements at a high magnetic field confirmed the intrinsic potential of these hybrid nanoparticles as alternative MRI contrast agents. Besides, cisplatin vectorization allowed for substantially increasing the accumulation of platinum compounds in two human glioblastoma cell lines as well as the subsequent formation of DNA adducts in comparison with the free drug. Biological mechanisms below this study raise the question whether critical alternative targets of platinum derivatives might exist, thus undermining the old-established paradigm that defines DNA as the ultimate target of cisplatin.

Le cisplatine est l’un des trois agents anticancéreux les plus utilisés en chimiothérapie contre les tumeurs solides. Cependant, les doses utilisées sont limitées par des effets secondaires importants et l’existence des résistances innées ou acquises vis-à-vis de cette drogue. Ce travail vise à augmenter l’index thérapeutique du cisplatine (réduire ses effets secondaires et augmenter son activité anti-tumorale). Pour cela des nanoparticules hautement chargées en cisplatine en couche par couche à base de nucléolipides ont été préparées. Les études physico-chimiques (TEM, DLS, XPS, microscopie à fluorescence, ICP-optique) ont révélé que les nanoparticules à double couche étaient plus stables en milieu biologique par rapport aux formulations en mono-couche. Les études biologiques réalisées sur deux lignées tumorales ovariennes (IGROV1 et SKOV3) ont montré que cette formulation améliore l’activité cytotoxique du cisplatine et inhibe le développement des résistances. L’étude du mécanisme d’action (internalisation, apoptose, génotoxicité, réplication de l’ADN) a confirmé que les nanoparticules à double couche augmentent le taux de cisplatine internalisé qui, une fois libéré dans les cellules, arrête la réplication de l’ADN et induit la mort cellulaire par apoptose. Aucune toxicité intrinsèque aux nano-objets n’est observée. Les études in vivo de ces nanoparticules à double couche après injection en intraveineuse de 5, 7 et 9 mg/Kg ont révélé que cette formulation augmente la dose maximale tolérée et présente une activité anti-tumorale vis-à-vis des lignées cellulaires PROb et GV1A1. Cette stratégie d’élaboration des nanoparticules en couche par couche de nucléolipides nous a permis d’insérer des PEG avec ou sans acide folique pour le ciblage et d’introduire une deuxième drogue lipophile, le paclitaxel. Les tests in vitro (cytotoxicité, internalisation) ont montré l’intérêt de ces modifications. / Cisplatin is one of the three most commonly used anticancer drugs in chemotherapy against solid tumors. However, the doses used are limited by significant side effects and the existence of resistance. The aim of this work is to increase the therapeutic index of cisplatin. For this purpose, highly charged nucleolipids nanoparticles “layer-by-layer” of cisplatin were prepared. The physico-chemical studies (TEM, DLS, XPS, ICP, Fluorescence microscopy) revealed that the bilayer nanoparticles were more stable in biological environment compared with mono-layer formulations. Biological studies carried in two ovarian carcinoma cells lines (IGROV1 and SKOV3) showed that this formulation enhances the cytotoxic activity of cisplatin and inhibits the development of resistance. The study of the mechanism of action (internalization, apoptosis, genotoxicity, DNA replication) demonstrated the nanoparticles with double layer increases the rate of cisplatin internalized then released into the cells, stops the replication of DNA and induces cell death by apoptosis. No intrinsic toxicity of nano-objects is observed. In vivo studies of these nanoparticles double layer after intravenous injection of 5, 7 and 9 mg/Kg in the rats showed this formulation increases the maximum tolerated dose and has an antitumor activity against PROb en GV1A1 cells lines. This strategy of developing layer-by-layer nucleolipids nanoparticles allows to insert PEG with or without folic acid for targeting and introducing second drug, a lipophilic paclitaxel. In vitro study (cytotoxicity, internalization) have shown the benefits of both modification.

Malgré les progrès réalisées en matière de traitement et de diagnostic, le cancer du poumon demeure le plus répandu et le plus mortel dans le monde. La chimiothérapie conventionnelle, associant un composé de platine (cisplatine ou carboplatine) à un autre agent antinéoplasique est utilisée à quasiment tous les stades. Comme celle-ci est administrée par voie intraveineuse (IV), elle entraîne des effets secondaires systémiques importants dont certains sont dose- limitant (DLT) comme la néphrotoxicité pour le cisplatine ou la myélotoxicité pour le doublet carboplatine-paclitaxel. Par conséquent, ces agents sont administrés selon des cycles bien espacés pendant lesquels les tissus se rétablissent, et ce incluant la tumeur ;conduisant à une repopulation tumorale. En effet, une corrélation significative a été établie entre la concentration de platine dans les tumeurs pulmonaires et l’efficacité du traitement. Le but de ce travail était d’évaluer le potentiel de combiner une poudre sèche pour inhalation (CIS-DPI-50) avec le traitement de chimiothérapie IV, afin d’exposer la tumeur à l’agent cytotoxique de manière continue.La première partie de ce travail a permis de développer le CIS-DPI-50. Afin d’éviter qu’une haute concentration en cisplatine ne soit complètement solubilisée une fois dans les poumons, et afin d’assurer une exposition suffisante, il était essentiel de développer des formulations à libération contrôlée et à rétention pulmonaire suffisante. Ceci consistait en l’optimisation d’une formulation à base de microparticules lipidiques solides (CIS-DPI-TS) préalablement développée par Levet et al. Cette formulation a été reproduite afin d’évaluer son efficacité chez des souris greffées avec le modèle M109-HiFR (0.5 mg/kg, trois fois par cycle pendant deux cycles) et a démontré une survie similaire au CIS-IV (1.5 mg/kg, une fois par cycle pendant deux cycles). Cela a été effectué en (i) utilisant des excipients de grade pharmaceutique, reconnus comme sûrs (GRAS) (49,5 % (w/w) d’HCO et 0,5 % (w/w) de TPGS) selon un processus facilement transposable, et (ii) en augmentant la libération initiale afin d’améliorer la réponse antitumorale. Le CIS-DPI-50 a montré une performance aérodynamique prometteuse à des débits d’air différents (100 et 40 L/min) avec une fraction de particules fines par rapport à la dose délivrée (FPF_d) de 86 ± 1 % et de 74 ± 1 %, respectivement. La reproductibilité du procédé a été démontrée sur 3 lots différents et la stabilité maintenue pendant les 6 mois de stockage avec une FPF_d variant de 81,0 ± 0,6 % au T0 à 81 ± 2 % après 6 mois. Ceci était lié à (i) la stabilisation de la forme β de HCO et de l’état cristallin du cisplatine, et (ii) à la faible teneur en solvant résiduel (< 0,2 % w/w). De plus, cette formulation était caractérisée par une libération initiale plus marquée qu’avec CIS-DPI-TS ainsi que par des propriétés de libération contrôlée in vitro puisque 48 ± 2% ont été dissous en 2 h, vs. 35 ± 11 % pour CIS-DPI-TS et 76 ± 5 % pour les microcristaux de cisplatine non enrobés. Cela a été confirmé in vivo et a prouvé que le changement vers HCO a diminué le Tmax dans le sang de 120 min pour CIS-DPI- TS à 1 min pour le CIS-DPI-50. De plus, la rétention pulmonaire a été maintenue pendant 4 heures avec une aire sous la courbe (AUC) dans les poumons de 4 611 ± 932 ng.min.mg1 vs. 6 072 ng.min.mg-1 pour CIS-DPI-TS. Par conséquent, cette formulation a été choisie pour la suite des investigations.La deuxième partie de ce travail visait tout d’abord à évaluer la biodistribution après l’administration de CIS-DPI-50 à 0.5 mg/kg chez des souris greffées avec le modèle LLC1- Luc. Suite à cette administration, une exposition plus soutenue et dix fois plus élevée a été retrouvée dans les tumeurs par rapport au tissu sain (AUC0-∞ de 10 683 ± 5 826 ng.min.mg-1, vs. 1 071 ± 825 ng.min.mg-1, respectivement). Le deuxième objectif était de sélectionner le schéma d’administration du CIS-DPI-50 le plus adapté à sa combinaison avec la chimiothérapie IV. Le CIS-DPI-50 a été administrée 5 fois par cycle pendant deux cycles à 0,3, 0,5 et 1 mg/kg, ou à 0,5 mg/kg 3 fois par cycle pendant deux cycles. Après le premier cycle de traitement, aucune différence en termes de concentrations en platine n’a été observée dans les tumeurs ou dans les organes sains entre les groupes traités de manière répétée et ceux administrés une seule fois. Cependant, un cycle plus tard, toutes les concentrations en platine ont augmenté dans les organes sains et diminué dans les tumeurs. Ceci était lié à une augmentation de la taille tumorale d’un facteur de 23 entre les deux cycles (533 ± 23 mg vs. 23 ± 3 mg), ainsi qu’à la dégradation de l’état général des animaux. De plus, aucun des schémas n’a démontré une toxicité pulmonaire ou une efficacité. Cette efficacité limitée était liée à la faible sensibilité du modèle LLC1-Luc au cisplatine. Par conséquent, les schémas caractérisés par la plus faible dose cumulée (0,5 mg/kg trois fois par cycle et 0,3 mg/kg cinq fois par cycle) ont été sélectionnés afin d’évaluer leur efficacité chez des souris greffées avec le modèle M109-HiFR-Luc2. Une réduction significative de la taille tumorale dans les groupes traités (p < 0,0001) par rapport au groupe non traité a été observée ;confirmant la réponse de ce modèle au cisplatine. Cependant, aucune différence en termes de croissance tumorale (tendances similaires), de proportion de répondeurs (33 % pour les deux groupes) ou de survie (31 jours pour les groupes traités vs. 23 jours pour le groupe non traité) n’a été rapportée entre ces deux groupes. Par conséquent, le schéma le moins fréquent a été choisi pour éviter une éventuelle accumulation de platine et une atteinte rénale aigue (AKI).La troisième partie de ce travail avait pour but d’étudier la tolérance pulmonaire et rénale du CIS-DPI-50, du CIS-IV et de leurs combinaisons. Les résultats de quantification des cytokines pro-inflammatoires (TNF-α, IL-6, IL-1β) dans le fluide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) ont montré une meilleure tolérance pour le CIS-DPI-50 par rapport au CIS-IV. Les neutrophiles granulocytes (NT-GRA) ont augmenté proportionnellement à la dose pour tous les groupes traités avec le CIS-DPI-50. Ces augmentations étaient réversibles une semaine plus tard uniquement pour les monothérapies et le groupe combiné, dont les administrations ont été espacées de 24h. Compte tenu des résultats d’inflammation et de cytotoxicité, l’ajout de CIS- DPI-50 au CIS-IV à sa dose maximale tolérée (MTD) semblait avoir un plus grand impact que si CIS-DPI-50 était ajouté à une dose IV réduite de 25%. Les résultats de quantification des biomarqueurs AKI plasmatiques (NGAL, cystatine C et créatinine) ont augmentés lorsque les deux monothérapies ont été administrées à leur DMT le même jour ou 24 heures plus tard. Par conséquent, la MTD du CIS-IV devait être réduite de 25% et les administrations séparées de 24h pour préserver la tolérance. L’efficacité de ce schéma a été évaluée sur des souris greffées avec le modèle M109-HiFR-Luc2 en combinant le CIS-DPI-50 au doublet IV cisplatine- paclitaxel. Malgré le fait que ces résultats n’étaient pas significativement différents, des tendances intéressantes en termes de réduction de la croissance tumorale, de survie (31 jours pour le groupe combiné vs. 26 pour le doublet IV, vs. 21 jours pour le groupe non traité) et de proportion de répondeurs (67 % pour le groupe combiné, vs. 50 % pour le doublet IV) ont été observés pour le groupe combiné.Comme les différentes adaptations ont probablement pu entraver le potentiel des combinaisons, il était intéressant d’étudier l’association de CIS-DPI-50 avec un doublet moins néphrotoxique (carboplatine-paclitaxel), et qui nécessiterait éventuellement moins d’ajustements. Compte tenu de la DLT du carboplatine et du paclitaxel, l’évaluation de la myélotoxicité était incluse dans cette étude. Les résultats ont montré que l’ajout de CIS-DPI-50 au doublet carboplatine- paclitaxel IV le même jour à leur MTD ont induit une augmentation du nombre de globules blancs et de cellules totales dans le BALF, une proportion plus élevée de NT-GRA dans le BALF et une anémie régénérative plus précoce qu’avec le doublet IV. Ces effets étaient réversibles. La stratégie de réduction de la dose IV de 25 % et la séparation des administrations par 24h ont permis d’éviter le développement d’une anémie régénérative et/ou l’augmentation de globules blancs ou du nombre de cellules totales dans le BALF par rapport aux doublets IV. De plus, toutes les combinaisons ont induit une cytotoxicité non réversible tout en étant mieux tolérées que celles avec le CIS-IV. Leurs efficacités devraient donc être testées sur des modèles de cancer pulmonaire murin seuls ou en combinaison avec l’immunothérapie (inhibiteurs de checkpoint).Ce travail a démontré la faisabilité de combiner une modalité de traitement locorégionale avec les traitements de chimiothérapie conventionnelle par voie IV à base de cisplatine et de carboplatine contre les tumeurs pulmonaires. Ceci a été effectué en optimisant les combinaisons afin d’éviter des toxicités pulmonaire, rénale et hématologique (pour la chimiothérapie à base de carboplatine) tout en démontrant une tendance vers une efficacité (pour le doublet cisplatine- paclitaxel) dans un modèle préclinique agressif. Par conséquent, ces résultats ouvrent la voie à plusieurs autres possibilités de combinaisons (traitements localisés et inhibiteurs de checkpoint) qui doivent être investiguées afin de sélectionner les indications pour lesquelles ce traitement serait le plus efficace. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Lung cancer is the deadliest cancer in the world, with a global 5-year survival rate of about 15%. Despite a notable impact of the latest improvements in prevention, screening, detection and staging, the efficacy of conventional treatments is not sufficient and has reached a therapeutic plateau. These conventional treatments involve a combination of surgery, radiotherapy (RT) and chemotherapy (CT). CT is used in almost all stages: in operable and inoperable stages to limit tumour cell invasion and in latest stages as a palliative treatment. Cisplatin is one of the most frequently used and most potent drugs available. It is administered by parenteral route at doses limited by its high and cumulative nephrotoxicity but also by other systemic toxicities (e.g. ototoxicity). Its administration therefore requires many precautions (long hydration procedure, surveillance of the renal function), which mobilize medical personnel. A major limitation of parental CT is the low concentration of drug that successfully reaches the tumour or the metastases. A potential additional modality could be aerosolized CT to localize lung cancer treatment. It has shown a relative local tolerance for cisplatin through preclinical and clinical studies in humans by means of nebulized solutions or liposomal formulations. As a local treatment, aerosolized CT has a clear pharmacokinetic (PK) advantage, as it can increase local exposure while decreasing systemic exposure. However, because CT drugs, such as cisplatin, are active at rather high doses (in the mg range), the duration of administration from nebulizers is very long as it depends on the drug solubility or on drug encapsulation into liposomes. They also pose a high risk of environmental contamination and require HEPA-filtrated hoods during the nebulization procedure. Of all the inhalation devices available to deliver high drug doses, dry powder inhalers (DPIs) were chosen in this work. These were chosen to circumvent the above issues by providing higher deposited doses, in very short timeframes, using a patient-driven device that could help limit environmental exposure to only very low levels of drug. DPI in general also have the advantage of being applicable to both poorly-water-soluble and to water-soluble anticancer drugs. However, because direct deposition of high quantities of anticancer drugs to the lung parenchyma could pose a high risk of local irritation and pulmonary adverse effects, controlled release (CR) of cisplatin from deposited particles in the lung parenchyma was needed. However, in the lungs, foreign undissolved particles are rapidly eliminated by means of naturally occurring clearance mechanisms, in particular macrophage uptake in the alveoli. Therefore, formulation strategies able to limit the particles clearance are needed to assure high lung residence of these CR particles. The formulation strategy of this work was to develop DPI formulation based on solid-lipid microparticles (SLM) able to (i) be deposited into the lung, (ii) control the release of cisplatin and (iii) escape macrophage uptake in order to remain in the lung long enough and at a concentration able to optimize the therapeutic index (i.e. increase the potential therapeutic effect and decrease the potential side effects).The primary objectives of the SLM-based DPI formulations were to (i) exhibit aerodynamic properties compatible with lung cancer patients abilities and cisplatin requirements (e.g. a high deposited fraction, high deagglomeration abilities under low airflow within a low-resistance DPI, deposition in the mg range), (ii) provide a CR matrix for cisplatin in vitro, (iii) be able to be retained into the lung long enough in vivo, (iv) using scalable production techniques and (v) using only potentially well-tolerated excipients.Cisplatin was initially reduced to microcrystals under high-pressure homogenization (HPH) cycles up to 20 000 psi. This procedure permitted uncoated particles with mean diameters below 1.0 μm to be obtained. To assess the cisplatin release abilities of the DPI formulations on the deposited fraction only, a new dissolution test was adapted. This test used a classical paddle apparatus from the pharmacopoeia and a Fast Screening Impactor (FSI). An excipient-free formulation, obtained from the spray dried suspension of cisplatin microcrystals (100% cisplatin) was initially produced. It was compared to a 95:5 cisplatin/tocopheryl polyethylene glycol succinate (TPGS) formulation, which exhibited a higher deposition ability (fine particle fraction (FPF) of 24.2 vs. 51.5% of the nominal dose, respectively). Both exhibited immediate release (IR), with 90% dissolved under 10 minutes.Solid lipid microparticle (SLM)-based formulations were then produced using the cisplatin microcrystalline suspension and various lipid excipients. Those had previously been screened for their ability to be spray dried following their solubilisation in heated isopropanol. The addition of a triglyceride, tristearin (TS), as the main lipid component and if necessary a polyethylene glycol (PEG) excipient-comprising fraction with TPGS or distearoyl phosphoethanolamine polyethylene glycol 2000 (DSPE-mPEG-2000) as a surface modifier, provided spray dried particles with interesting characteristics. These formulations, comprised of at least 50% cisplatin, exhibited high CR abilities in simulated lung fluid at 37°C for more than 24 h (as low as 56% released after 24 h) and a low burst-effect (as low as 24% and 16% after 10 minutes with and without PEGylated excipients, respectively). They also showed high aerodynamic properties, with a high FPF ranging from 37.3 to 50.3% w/w of the nominal dose and a low median mass aerodynamic diameter (MMAD) between 2.0 and 2.4 μm. The process also offered high production yields (> 60%).The best IR DPI formulation (evaluated on the FPF, i.e. cisplatin/TPGS 95:5) and the most promising CR formulations without (i.e. cisplatin/TS 50:50) and with PEGylated excipients (evaluated on CR abilities, i.e. cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5) were then administered to CD 1 mice, concurrently to endotracheal nebulization (EN) of a cisplatin solution. This was done using specific endotracheal devices, the Penn-Century Inc. DP-4M© Dry Powder Insufflatorn and for the cisplatin solution, the Microsprayer™ IA-1C©. They were compared to intravenous (IV) injection during a PK study over 48 hours. The administration of DPI formulations required the development of a spray dried diluent (Mannitol:Leucine 10:1) and specific dilution method (3D mixing for 4 hours and double-sieving) to be able to deliver precise and repeatable quantities of powder into the lungs of mice at 1.25 mg/kg dose. A PK study was carried out of the lungs, blood, kidneys, liver, mediastinum and spleen of the mice. The study used a developed and validated electrothermal atomic absorption spectrometry (ETAAS) method. Results showed that endotracheal administration of DPI formulations permitted the exposure of the lungs to cisplatin, expressed as the area under the curve (AUC) to be greatly increased while decreasing the systemic exposure. More precisely, the only formulation that exhibited prolonged lung retention was the one comprising PEGylated excipient (cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5), which was observed for ~7 hours. This lung retention was associated with smoother concentration vs. time profiles in blood (higher tmax and lower Cmax), which also confirmed its CR abilities in vivo as dissolved cisplatin is a highly permeable drug. The overall exposure, established by the AUC, helped calculate the target efficiency (Te: the ratio of AUC in the lungs to the sum of AUC in non-target organs) and the target advantage (Ta: ratio of AUC in the lungs by the tested route to the AUC in the lungs by the IV route). For instance, the Ta of the aforementioned formulation (cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5) was of 10.9, as compared to 1 for IV, 3.3 for EN, 2.6 for the IR DPI formulation (cisplatin/TPGS 95:5) and 3.7 for the non-PEGylated CR DPI formulation (cisplatin/TS 50:50). In the meantime, the Te for the same formulations were 1.6, 0.09, 1.1, 0.4 and 0.9, respectively, showing again the great efficiency of the inhaled route vs. the IV route in targeting the lungs. More importantly, it showed the added efficiency of the CR DPI formulation with lung retention abilities, provided by the addition of PEGylated excipients. In the last part of the work, maximum tolerated doses (MTD) of formulations were established. These showed that the best candidate, selected based on the PK results (CR DPI with lung retention abilities composed of cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5) had better overall tolerance than IR approaches (DPI formulation at cisplatin/TPGS 95:5 and EN of a cisplatin solution). More precisely, it was possible to double the administered dosage for the CR formulation (1.0 mg/kg) vs. the IR DPI and EN (both at 0.5 mg/kg) under a repeated administration scheme (3 times a week for 2 weeks).Moreover, an assessment of the lung tolerance of this best candidate was realized and compared to the IR DPI, EN and the IV route. It was done through analysis of the broncho-alveolar lavage fluid (BALF) 24 hours following a single administration at the pre-determined MTD. IL-1β, IL-6 and TNF-α cytokines were not increased following the administrations. No evidence of tissue damage or cytotoxicity could be observed through quantification of the protein content and of lactate dehydrogenase (LDH) activity. The only observations were a decrease in total cells and an increase in polynuclear neutrophils (PN) cells in the BALF, which was not observed by IV or following the administration of the vehicle of the CR formulation alone (i.e. PEGylated SLM and dry diluent). This increase was not directly linked to the formulation but rather to cisplatin, as it was observed in each cisplatin inhalation experiments, and not with the vehicle of the CR formulation, which was comparable to the non-treated mice.In parallel, we realized a survival study following the administration of the best DPI formulation candidate (cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5) vs. the IR DPI candidate (cisplatin/TPGS 95:5), both at their respective MTD under the aforementioned repeated dosing scheme. Cisplatin was administered to mice bearing a grafted orthotopic M109-HiFR lung tumour model, previously developed in the laboratory. The DPI formulations were evaluated against IV administration at each dose (0.5 and 1.0 mg/kg, respectively). This study first confirmed the lower toxicity of the CR approach, as the IR DPI formulation caused a much higher number of deaths during treatment of the grafted mice. The CR formulation administered at 1.0 mg/kg showed a higher survival than the negative control but a tumour response comparable to IV administered at half this dose (0.5 mg/kg). This unexpected outcome with regard to the PK results is explained by the fact that the tumour model is highly metastatic. Mice treated with inhaled formulations died due to distant tumour involvement, while those treated systemically died due to pulmonary tumour involvement. This led us to believe that this kind of treatment may have greater potential in combination, adjuvant to the parenteral route.This work helped establish the proof-of-concept of a cisplatin CR DPI formulation with an up-scalable process. The SLM approach confirmed that encapsulation of drugs exhibiting low solubility, such as cisplatin, was possible using highly hydrophobic excipients and that surface modification was mandatory to provide notable lung retention in vivo. The SLM approach showed good signs of tolerance during the exploratory study but still needs to be confirmed under a chronic scheme using other determinants such as histopathological analyses of the lung tissue. Moreover, comparison of the nephrotoxicity of formulations against that of the IV route should be conducted with appropriate and sensitive methods. Finally, the survival study of the CR DPI formulation showed mitigated results, partly because of the orthotopic model characteristics. This could be proof that inhaled CT has a role to play combined with classical systemic CT. This needs to be assessed in a further study.Le cancer du poumon est le cancer ayant le taux de mortalité le plus élevé au monde, avec un taux de survie global à 5 ans d'environ 15%. Malgré un impact notable des dernières améliorations en matière de prévention, de dépistage, et de classification du cancer du poumon, l'efficacité des traitements classiques n'est toujours pas suffisante et semble avoir atteint un plateau thérapeutique. Ces traitements classiques comprennent de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie, le plus souvent en combinaison. La chimiothérapie est utilisée à presque tous les stades: dans les stades opérables et inopérables afin de limiter l'invasion par les cellules tumorales jusqu’aux derniers stades en tant que traitement palliatif. Le cisplatine est l'un des médicaments anticancéreux les plus fréquemment utilisés et les plus puissants actuellement disponibles. Il est administré par voie parentérale à des doses qui sont limitées par sa néphrotoxicité élevée et cumulative mais également par d'autres toxicités systémiques (par exemple, de l'ototoxicité). Son administration nécessite donc de nombreuses précautions (longue procédure d'hydratation, surveillance de la fonction rénale), ce qui mobilise fortement le personnel médical. Une limitation importante de la chimiothérapie parentérale est la faible concentration d’actif qui atteint avec succès la tumeur ou les métastases. Une autre voie d’accès potentielle pourrait être la chimiothérapie inhalée pour traiter le cancer du poumon. Cette approche a montré une relativement bonne tolérance locale pour le cisplatine à travers différentes études précliniques et cliniques chez l'homme au moyen de solutions ou de formulations liposomales nébulisées. En tant que traitement via la voie pulmonaire, la chimiothérapie inhalée présente un avantage pharmacocinétique évident, car elle permet d’augmenter l'exposition locale tout en diminuant l'exposition systémique. Cependant, du fait que les médicaments chimiothérapeutiques, tels que le cisplatine, soient actifs à des doses relativement élevées (dans la gamme du mg), la durée d'administration à partir des nébuliseurs s’avère en pratique très longue car elle dépend principalement de la solubilité de l’actif ou de son encapsulation dans les liposomes. Les nébuliseurs présentent également un risque élevé de contamination de l'environnement et nécessitent de lourds appareillages (hottes filtrantes en particulier) pendant la procédure d’administration.Parmi tous les dispositifs d'inhalation existants, capables de délivrer des doses élevées de médicaments, les inhalateurs de poudre sèche (DPI) semblent être de bons candidats. Ceux-ci ont été choisis dans ce travail afin de contourner les problèmes énumérés ci-dessus, en fournissant des doses pulmonaires plus élevées, dans des délais très courts. De plus, ces dispositifs sont activés par le flux inspiratoire du patient, ce qui pourrait aider à limiter l'exposition environnementale à des niveaux très faibles. Les inhalateurs à poudre sèche présentent également l'avantage d'être utilisables à la fois avec des médicaments solubles et des médicaments peu solubles dans l’eau. Malgré tout, étant donné que la déposition directe de quantités élevées de médicaments chimiothérapeutiques dans le parenchyme pulmonaire pourrait présenter un risque élevé d'irritation et d'effets indésirables locaux, une libération contrôlée du cisplatine à partir de particules déposées dans le parenchyme pulmonaire s’avère nécessaire. Cependant, dans les poumons, ces particules non dissoutes d’origine étrangère sont rapidement éliminées par les mécanismes d’élimination, en particulier par la clairance par les macrophages au niveau des alvéoles. Par conséquent, des stratégies de formulation capables de limiter la clairance des particules sont nécessaires pour assurer une résidence pulmonaire élevée de ces particules à libération contrôlée.La stratégie de formulation de ce travail a donc consisté à développer une formulation pour inhalateur à poudre sèche à base de microparticules lipidiques solides capable de (i) être déposées dans le poumon, (ii) de contrôler la libération du cisplatine et (iii) de rester dans le poumon suffisamment longtemps dans le but d’optimiser l'indice thérapeutique (c'est-à-dire augmenter le potentiel thérapeutique du cisplatine et diminuer ses potentiels effets secondaires).Les objectifs principaux des formulations basées sur les microparticules lipidiques solides étaient (i) de présenter des hautes charges en cisplatine au sein des microparticules lipidiques tout en présentant des propriétés aérodynamiques compatibles avec la capacité pulmonaire des patients atteints de cancer du poumon (par exemple, une fraction déposée élevée et une capacité élevée à la désagglomération sous faible débit d'air dans un inhalateur de faible résistance), (ii) de fournir une matrice capable de libérer le cisplatine de manière contrôlée in vitro, (iii) d’être capable de rester dans le poumon suffisamment longtemps in vivo, tout cela (iv) en utilisant des techniques de production ayant une bonne capacité d’augmentation d’échelle et (v) de n’utiliser que des excipients potentiellement bien tolérés au niveau du poumon.Le cisplatine a été initialement réduit sous forme microcristalline à l’aide de cycles d'homogénéisation à haute pression jusqu'à 20 000 psi. Cette procédure a permis d'obtenir des particules non enrobées ayant un diamètre moyen inférieur à 1.0 μm. Afin d’évaluer les capacités de libération du cisplatine des formulations à partir de la fraction capable théoriquement de se déposer dans les poumons, un nouveau test de dissolution a été adapté à partir d’un appareil à palettes classique de la pharmacopée et d’un impacteur à cascade « Fast Screening Impactor ». Une formulation sans excipient, obtenue à partir de la suspension de cisplatine, soumise à la technique de séchage par l’atomisation (100% de cisplatine) a été produite comme point de départ. Celle-ci a ensuite été comparée à une formulation de cisplatine/tocophéryl polyéthylène glycol succinate (TPGS) (95:5), qui présentait une capacité de déposition pulmonaire in vitro (fraction de particules fines (FPF) de 24.2% pour la première et de 51.5% pour la deuxième, exprimée par rapport à la dose nominale). Toutes deux ont démontré des capacités de libération immédiate, avec 90% du cisplatin dissous en moins de 10 minutes.D’autres formulations, cette fois élaborées sous la forme de microparticules lipidiques solides ont ensuite été produites à partir de la suspension microcristalline de cisplatine et de divers excipients lipidiques. Ces microparticules avaient préalablement été testées pour leur aptitude à être séchées par atomisation après solubilisation des excipients dans de l'isopropanol chaud. L’ajout d’un triglycéride, la tristéarine (TS), comme excipient lipidique principal et également d’une fraction comprenant un excipient contenant du polyéthylène glycol (PEG), à l’aide de TPGS ou de distéaroyl phosphoéthanolamine polyéthylène glycol 2000 (DSPE-mPEG-2000) a montré des résultats intéressants. Ces formulations, ayant une teneur en cisplatine d’au moins 50%, ont présenté des aptitudes élevées pour la libération contrôlée dans le fluide pulmonaire simulé in vitro à 37 °C, et ce, pendant plus de 24 h (jusqu'à 56% libérées après 24 h) ainsi qu’un faible « burst-effect » (de seulement 24% et 16% après 10 minutes avec et sans excipients PEGylés, respectivement). Elles ont également montré des propriétés aérodynamiques élevées, avec une FPF élevée allant de 37.3 à 50.3% m/m par rapport à la dose nominale et un diamètre aérodynamique compris entre 2.0 et 2.4 μm. Le meilleur candidat à libération immédiate (évaluée sur base de la FPF, soit la formulation cisplatine/TPGS 95:5 m/m) et les formulations à libération contrôlée les plus prometteuses n’incluant pas d’excipients PEGylés (cisplatine/TS 50:50 m/m) et incluant des excipients PEGylés (évalués sur les capacités de libération contrôlée, c'est-à-dire la formulation cisplatin/TS/TPGS 50:49.5:0.5 m/m/m) ont ensuite été administrées à des souris CD-1, en comparaison d’une nébulisation endotrachéale d'une solution de cisplatine. Ceci a été fait à l’aide de dispositifs endotrachéaux dédiés aux poudres pour le DP-4M© « Dry Powder Insufflator » et aux solutions pour le Microsprayer™ IA-1C© de Penn-Century. Ces formulations ont été comparées à l'injection intraveineuse (IV) au cours d’une étude pharmacocinétique étendue sur 48 heures.L'administration de formulations de poudres sèches pour inhalation a nécessité le développement préalable d'un diluant par atomisation (Mannitol:Leucine 10:1 m/m) ainsi que d’une méthode de dilution des poudres (mélange tridimensionnel pendant 4 heures et suivi d’un double-tamisage) afin de pouvoir délivrer des quantités précises et répétables de poudre dans les poumons de souris à la dose d’1.25 mg/kg. Le suivi des paramètres pharmacocinétiques a ainsi pu être réalisé au niveau des poumons, du sang, des reins, du foie, du médiastin et de la rate des souris. Ceci a été fait à l’aide d’une méthode de spectrométrie d'absorption atomique électrothermique, qui a été préalablement développée et validée. Les résultats obtenus ont montré que l'administration endotrachéale de formulations de poudres sèches permettait d’augmenter fortement l'exposition des poumons par le cisplatine, exprimée en aire sous la courbe (AUC) tout en diminuant l'exposition systémique. Plus précisément, la seule formulation présentant une rétention pulmonaire prolongée était celle qui comprenait un excipient PEGylé (cisplatine/TS/TPGS 50:49.5:0.5 m/m/m), ce qui a été observé pendant environ 7 heures. Cette rétention pulmonaire a été associée à des profils de concentration en fonction du temps plus réguliers dans le sang (tmax supérieur et Cmax inférieur), ce qui a également confirmé ses capacités de libération contrôlée in vivo car la perméabilité de l’épithélium pulmonaire pour le cisplatine dissous s’est avérée très élevée. L'exposition globale établie à partir de l’AUC a permis de calculer l’efficacité de ciblage (Te: rapport de l'AUC mesurée dans les poumons et de la somme des AUC mesurées dans les organes non cibles) et l’avantage du ciblage (Ta: rapport de l’AUC mesuré dans les poumons suite à l’administration pulmonaire et de l'AUC mesurée dans les poumons suite à l’administration par la voie IV). Par exemple, le Ta de la formulation décrite ci-dessus (cisplatine/TS/TPGS 50:49.5:0.5 m/m/m) était de 10.9, comparativement à 1 pour l’IV, 3.3 pour la nébulisation endotrachéale, 2.6 pour la formulation de poudre sèche à libération immédiate (cisplatine/TPGS 95:5 w/w) et 3.7 pour la formulation de poudre sèche à libération contrôlée ne comprenant pas d’excipient PEGylé (cisplatine/TS 50:50). Dans le même temps, le Te mesuré pour les mêmes formulations était de 1.6, 0.09, 1.1, 0.4 et 0.9, respectivement, démontrant également le rendement élevé de la voie inhalée par rapport à la voie IV dans sa capacité à cibler les poumons. Plus important encore, ceci a démontré le grand avantage des capacités de rétention pulmonaire de la formulation à libération contrôlée comprenant un excipient PEGylé.Dans la dernière partie de ce travail, les doses maximales tolérées (DMT) des formulations ont été déterminées. Le meilleur candidat, choisi en fonction des résultats de pharmacocinétique (formulation à libération contrôlée ayant des capacités de rétention pulmonaire composé de cisplatine/TS/TPGS 50:49.5:0.5 m/m/m), avait une meilleure tolérance globale que les deux approches à libération immédiate testées (formulation de poudre sèche cisplatine/TPGS 95:5 et la nébulisation endotrachéale d'une solution de cisplatine). Plus précisément, il s’est avéré possible de doubler le dosage administré pour la formulation à libération contrôlée (1.0 mg/kg) par rapport à la poudre sèche à libération immédiate et à la nébulisation endotrachéale (toutes les deux à 0.5 mg/kg) suivant un schéma d'administration chronique (3 fois par semaine pendant 2 semaines). De plus, une évaluation de la tolérance pulmonaire de cette formulation à libération prolongée a été réalisée et comparée à la poudre sèche à libération immédiate, à la nébulisation endotrachéale et à la voie IV. Elle a été réalisée par analyse du liquide provenant du lavage broncho-alvéolaire, 24 heures après une administration unique à la dose maximale tolérée préalablement déterminée pour chaque formulation. Aucune augmentation des cytokines IL-1β, IL-6 et TNF-α n’a pu être détectée à la suite des administrations. Aucunes preuves de lésion tissulaire ou de cytotoxicité n'ont pu être observées au travers du dosage de la teneur en protéines totale et de l'activité de la lactate déshydrogénase. Les seules observations qui ont pu être faites ont été une diminution des cellules totales et une augmentation des polynucléaires neutrophiles dans le lavage broncho-alvéolaire, ce qui n'a pas été observé suite à l’administration IV ou après l'administration du véhicule de la formulation à libération contrôlée seul (c'est-à-dire les microparticules lipidiques solides PEGylées et le diluant). Cette augmentation ne semble pas liée aux microparticules lipidiques solides ou au diluent mais probablement à l’exposition pulmonaire au cisplatine, car cette augmentation a été observée pour chaque groupe inhalé contenant du cisplatine. Le cisplatine a ensuite été administré à des souris qui ont été greffées de manière orthotopique par une lignée murine de carcinome pulmonaire M109-HiFR, modèle préclinique préalablement développé au sein de notre laboratoire. Les formulations de poudres sèches ont été évaluées par rapport à l'administration IV à chaque dose testée (0.5 et 1.0 mg/kg, respectivement). Cette étude a d'abord confirmé la toxicité plus faible de l'approche à libération contrôlée, car la formulation à libération immédiate a causé un nombre beaucoup plus élevé de décès pendant le traitement des souris greffées. La formulation à libération contrôlée administrée à 1.0 mg/kg, a montré une survie plus élevée que le contrôle négatif, mais une réponse comparable à la dose IV administrée à la moitié de la dose (0.5 mg/kg). Ce résultat inattendu par rapport aux résultats de l’étude pharmacocinétique s'explique probablement par le fait que le modèle de tumeur utilisé est hautement métastatique. Les souris traitées avec des formulations inhalées sont mortes en raison de tumeurs secondaires distantes par rapport à la tumeur primaire implantée au niveau du poumon, alors que celles traitées par la voie systémique sont mortes en raison d’un envahissement tumoral pulmonaire. Cela nous amène à penser que ce type de traitement inhalé pourrait avoir un plus grand potentiel en combinaison à la voie parentérale. Ce travail a ainsi permis d’établir la preuve du concept de formulation à base de poudre sèche de cisplatine à libération contrôlée, en utilisant un processus de fabrication capable de subir une mise à l’échelle industrielle. L’utilisation de microparticules lipidiques solides a confirmé que l'encapsulation d’actifs présentant une certaine hydrophilie, comme le cisplatine, était possible en utilisant des excipients hautement hydrophobes et qu'une modification de leur surface était cependant obligatoire pour obtenir une rétention pulmonaire intéressante in vivo. Les microparticules lipidiques solides ont montré de bons signes de tolérance au cours de l'étude exploratoire, mais celle-ci doit encore être confirmée avec une administration chronique des poudres. Ceci doit être fait en suivant des paramètres supplémentaires, tels que des analyses histologiques du tissu pulmonaire. De plus, la comparaison de la néphrotoxicité des formulations avec celle mesurée par la voie IV doit être effectuée avec des méthodes appropriées et sensibles. Enfin, l'étude de survie de la formulation à libération prolongée a montré des résultats mitigés, en partie à cause des caractéristiques du modèle orthotopique de tumeur pulmonaire. Cependant, il semblerait que la chimiothérapie inhalée à un rôle important à jouer en combinaison avec la chimiothérapie systémique classique. Ceci doit être évalué dans une étude future. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished