Estudos da reatividade de espécies oxidantes e a interação destas espécies com estruturas sensíveis a oxidação e antioxidantes em condições biológicassão de grande importância no entendimento dos processos redox em alimentos e no corpo humano. A mioglobina é a ferro heme proteína majoritária do músculo esquelético de mamíferos e a sua ativação por peróxido de hidrogênio dá origem às espécies reativas de ferro heme hipervalentes,perferrilmioglobina e ferrilmioglobina, que podem induzir a condição de estresse oxidativo. A reação das espécies de ferro heme hipervalentes com constituintes do meio biológico ou alimentos como proteínas ou membranas podem tanto afetar a qualidade de produtos cárneos quanto causar danos celulares no trato gastrointestinal durante sua digestão.Pequenas moléculas tais como o NO, H2S e CO são produzidas endogenamente em sistemas biológicos e, além de desempenharem importantes funções na manutenção dometabolismo celular,podem apresentar atividade antioxidante.A presente Tese procurou investigara cinética e o mecanismo para a redução das espécies perferrilmioglobina e ferrilmioglobina pelo monóxido de carbono, reação esta que apresentaconstante de velocidade de segunda ordem de k2 =(3,3 ± 0,6) 102 mol L-1, a 25 oC, para a redução da espécie perferrilmioglobina. Posteriormente,foi investigada a cinética e mecanismo de redução da ferrilmioglobinapelo H2S levando à formação da espécie sulfomioglobina-Fe(II). A constante de segunda ordem obtida para a reação entre a espécie protonada da ferrilmioglobina e o H2Sfoide k2 = (2,5 ± 0,1) 106 L mol-1 s-1, duas ordens de magnitude superior a constante de velocidade paraa reação entre a espécie ferrilmioglobina e o íonHS-, k2 = (1,0 ± 0,7)104L mol-1 s-1a 25 oC.Para a redução da espécie ferrilmioglobina pelo H2S/HS- e a formação da espécie sulfomioglobina-Fe(II) observa-se um efeito de compensação de temperatura (?H? = (2,1 ± 0,9) kJ mol-1) o que é um fator determinante na ocorrência do processo de greening em produtos cárneos condimentados durante estocagem a baixa temperatura. A formação da espécie sulfomioglobina foi também investigada na reação de redução da ferrilmioglobina pela L-cisteína. Para esta reação foi observada dependência do mecanismo da reação com o pH. A formação da espécie sulfomioglobina foi observada para a reação conduzia em meio ácido a neutro, enquanto que para a reação em condições alcalinas, observa-se a formação majoritária da espécie oximioglobina. Areação da cisteína com a espécie protonada da ferrilmioglobina apresentou constante de segunda ordem de k2 = (5,1 ± 0,4)L mol-1 s-1, e a reação entre a cisteína diânion e a ferrilmioglobina,em meio alcalino,apresentou constante de velocidade de segunda ordem com k2 =(0,12 ± 0,01) L mol-1s-1.A diferença de reatividade e no produto da reação é um indicativo da mudança de mecanismo de transferência de elétrons seguida de adição do radical HSo, em meio ácido, para um mecanismo sequencial detransferência de elétrons do dianion da cisteína para as espécies ferrilmioglina e metamioglobina levando a formação de oximioglobina em condições alcalinas. / Studies on the reactivity and interaction of oxidant species with oxidizable sensitive structures and antioxidants in biological settings are of great importance for understanding the redox process in food and in the human body. Myoglobin is the major heme-iron protein in the mammal skeletal muscle and its activation by hydrogen peroxide generate reactive hypervalent heme-iron species, perferrylmyoglobin and ferrylmyoglobin, which may induce oxidative stress conditions. The reaction of hypervalent heme-iron species with biological medium or food constituents like proteins or membranes may affect the quality of meat products or could lead to cellular damage in the gastrointestinal tract during digestion. Small molecules like NO, H2S, and CO are produced endogenously in biological systems and, despite playing relevant function in the maintenance of cell metabolism, may present antioxidant activity. The present Thesis aimed to investigate the kinetics and mechanism for the reduction of perferrylmyoglobin and ferrylmyoglobin species by carbon monoxide, reaction that shows a second-order reaction constant with k2 = (3.3 ± 0.6) 102L mol-1 s-1at 25 oC for the reduction of the perferrylmyoglobin species. Furthermore, the kinetics and mechanism for the reduction of the ferrylmyoglobin by H2S leading to the formation of the sulfmyoglobin-Fe(II) species has been investigated. The obtained second-order rate constant for the reaction between the protonated ferrylmyoglobin species and H2S was k2 = (2.5 ± 0.1) 106 L mol-1 s-1, two-orders of magnitude higher than the second-order rate constant for the reaction between the ferrylmyoglobin species and the HS- ion, k2 = (1.0 ± 0.7) 104L mol-1 s-1at 25 oC. For the ferrylmyoglobin species reduction by H2S/HS- and the formation of sulfmyoglobin-Fe(II) it is observed an temperature compensation effect (?H? = (2.1 ± 0.9) kJ mol-1) which is the determination factor for the occurrence of the greening process in condiment meat products during storage at low temperature. The formation of the sulfmyoglobin species has been further investigated during the reduction reaction of ferrylmyoglobin by L-cysteine. For this reaction it was observed a dependence of the reaction mechanism on the pH. The formation of sulfmyoglobin was observed for the reaction conducted in acidic and neutral medium, meanwhile for the reaction in alkaline conditions, it is mainly observed the formation of oxymyoglobin. The reaction between cysteine and the protonated ferrylmyoglobin species shown second-order rate constant with k2 = (5.1 ± 0.4) L mol-1 s-1, and the reaction between the cysteine dianion and ferrylmyoglobin, in alkaline medium, shows second order rate constant with k2 = (0.12 ± 0.01) L mol-1s-1.The difference in reactivity and in the reaction product is an indicative of change of the electron transfer-radical addition mechanism to a sequential electron transfer mechanism from the cysteine dianion to the ferrylmyoglobin and metmyoglobin species leading to the formation of oxymyoglobin under alkaline conditions.

Orientador: Wendel Andrade Alves / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Nanociências e Materiais Avançados, 2014

Estudos da reatividade de espécies oxidantes e a interação destas espécies com estruturas sensíveis a oxidação e antioxidantes em condições biológicassão de grande importância no entendimento dos processos redox em alimentos e no corpo humano. A mioglobina é a ferro heme proteína majoritária do músculo esquelético de mamíferos e a sua ativação por peróxido de hidrogênio dá origem às espécies reativas de ferro heme hipervalentes,perferrilmioglobina e ferrilmioglobina, que podem induzir a condição de estresse oxidativo. A reação das espécies de ferro heme hipervalentes com constituintes do meio biológico ou alimentos como proteínas ou membranas podem tanto afetar a qualidade de produtos cárneos quanto causar danos celulares no trato gastrointestinal durante sua digestão.Pequenas moléculas tais como o NO, H2S e CO são produzidas endogenamente em sistemas biológicos e, além de desempenharem importantes funções na manutenção dometabolismo celular,podem apresentar atividade antioxidante.A presente Tese procurou investigara cinética e o mecanismo para a redução das espécies perferrilmioglobina e ferrilmioglobina pelo monóxido de carbono, reação esta que apresentaconstante de velocidade de segunda ordem de k2 =(3,3 ± 0,6) 102 mol L-1, a 25 oC, para a redução da espécie perferrilmioglobina. Posteriormente,foi investigada a cinética e mecanismo de redução da ferrilmioglobinapelo H2S levando à formação da espécie sulfomioglobina-Fe(II). A constante de segunda ordem obtida para a reação entre a espécie protonada da ferrilmioglobina e o H2Sfoide k2 = (2,5 ± 0,1) 106 L mol-1 s-1, duas ordens de magnitude superior a constante de velocidade paraa reação entre a espécie ferrilmioglobina e o íonHS-, k2 = (1,0 ± 0,7)104L mol-1 s-1a 25 oC.Para a redução da espécie ferrilmioglobina pelo H2S/HS- e a formação da espécie sulfomioglobina-Fe(II) observa-se um efeito de compensação de temperatura (?H? = (2,1 ± 0,9) kJ mol-1) o que é um fator determinante na ocorrência do processo de greening em produtos cárneos condimentados durante estocagem a baixa temperatura. A formação da espécie sulfomioglobina foi também investigada na reação de redução da ferrilmioglobina pela L-cisteína. Para esta reação foi observada dependência do mecanismo da reação com o pH. A formação da espécie sulfomioglobina foi observada para a reação conduzia em meio ácido a neutro, enquanto que para a reação em condições alcalinas, observa-se a formação majoritária da espécie oximioglobina. Areação da cisteína com a espécie protonada da ferrilmioglobina apresentou constante de segunda ordem de k2 = (5,1 ± 0,4)L mol-1 s-1, e a reação entre a cisteína diânion e a ferrilmioglobina,em meio alcalino,apresentou constante de velocidade de segunda ordem com k2 =(0,12 ± 0,01) L mol-1s-1.A diferença de reatividade e no produto da reação é um indicativo da mudança de mecanismo de transferência de elétrons seguida de adição do radical HSo, em meio ácido, para um mecanismo sequencial detransferência de elétrons do dianion da cisteína para as espécies ferrilmioglina e metamioglobina levando a formação de oximioglobina em condições alcalinas. / Studies on the reactivity and interaction of oxidant species with oxidizable sensitive structures and antioxidants in biological settings are of great importance for understanding the redox process in food and in the human body. Myoglobin is the major heme-iron protein in the mammal skeletal muscle and its activation by hydrogen peroxide generate reactive hypervalent heme-iron species, perferrylmyoglobin and ferrylmyoglobin, which may induce oxidative stress conditions. The reaction of hypervalent heme-iron species with biological medium or food constituents like proteins or membranes may affect the quality of meat products or could lead to cellular damage in the gastrointestinal tract during digestion. Small molecules like NO, H2S, and CO are produced endogenously in biological systems and, despite playing relevant function in the maintenance of cell metabolism, may present antioxidant activity. The present Thesis aimed to investigate the kinetics and mechanism for the reduction of perferrylmyoglobin and ferrylmyoglobin species by carbon monoxide, reaction that shows a second-order reaction constant with k2 = (3.3 ± 0.6) 102L mol-1 s-1at 25 oC for the reduction of the perferrylmyoglobin species. Furthermore, the kinetics and mechanism for the reduction of the ferrylmyoglobin by H2S leading to the formation of the sulfmyoglobin-Fe(II) species has been investigated. The obtained second-order rate constant for the reaction between the protonated ferrylmyoglobin species and H2S was k2 = (2.5 ± 0.1) 106 L mol-1 s-1, two-orders of magnitude higher than the second-order rate constant for the reaction between the ferrylmyoglobin species and the HS- ion, k2 = (1.0 ± 0.7) 104L mol-1 s-1at 25 oC. For the ferrylmyoglobin species reduction by H2S/HS- and the formation of sulfmyoglobin-Fe(II) it is observed an temperature compensation effect (?H? = (2.1 ± 0.9) kJ mol-1) which is the determination factor for the occurrence of the greening process in condiment meat products during storage at low temperature. The formation of the sulfmyoglobin species has been further investigated during the reduction reaction of ferrylmyoglobin by L-cysteine. For this reaction it was observed a dependence of the reaction mechanism on the pH. The formation of sulfmyoglobin was observed for the reaction conducted in acidic and neutral medium, meanwhile for the reaction in alkaline conditions, it is mainly observed the formation of oxymyoglobin. The reaction between cysteine and the protonated ferrylmyoglobin species shown second-order rate constant with k2 = (5.1 ± 0.4) L mol-1 s-1, and the reaction between the cysteine dianion and ferrylmyoglobin, in alkaline medium, shows second order rate constant with k2 = (0.12 ± 0.01) L mol-1s-1.The difference in reactivity and in the reaction product is an indicative of change of the electron transfer-radical addition mechanism to a sequential electron transfer mechanism from the cysteine dianion to the ferrylmyoglobin and metmyoglobin species leading to the formation of oxymyoglobin under alkaline conditions.

Orientador: Ana Angélica Henrique Fernandes / Resumo: A obesidade é considerada um dos maiores problemas de saúde pública em muitos países, uma vez que está associada queda da qualidade de vida. Embora existam vários fatores que corroboram com o desenvolvimento para tal fato, os hábitos alimentares seja o fator relevante. Os transtornos metabólicos podem resultar em alterações na funcionalidade do fígado, podendo desenvolver Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica (DHGNA). Como o número de obesos e as co-morbidades associadas ao sobrepeso vêm aumentando abruptamente nas últimas décadas, vários modelos de obesidade experimental têm sido propostos para investigar os distúrbios metabólicos envolvendo suas causas e consequências. O glutamato monossódico é amplamente utilizado na culinária e também por indústrias alimentícias, contudo atua no sistema nervoso central e promove a degeneração de áreas importantes do hipotálamo que leva a distúrbios da saciedade e, consequentemente acúmulo excessivo de gordura abdominal. Com a finalidade de estudar substâncias que apresentem potencial atividade terapêutica no controle dos distúrbios metabólicos, o N-acetil-cisteína possui propriedades antioxidantes e exerce hepatoproteção. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi evidenciar a indução da obesidade pelo glutamato monossódico e determinar o efeito do N-acetil-cisteína sobre os parâmetros calorimétricos, metabolismo energético, atividade dos complexos respiratórios e estresse oxidativo no tecido hepático. Foram utilizados 32 ratos Wins... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Obesity is considered one of the greatest public health problems in many countries, since it is associated with a drop in quality of life. Although there are several factors corroborating with the development for this fact, eating habits are the relevant factor. Metabolic disorders can result in changes in liver function, and can develop Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD). As the number of obese and co-morbidities associated with overweight have increased steeply in recent decades, several models of experimental obesity have been proposed to investigate metabolic disorders involving their causes and consequences. Monosodium glutamate is widely used in cooking and also in food industries, but it acts on the central nervous system and promotes the degeneration of important areas of the hypothalamus which leads to satiety disorders and consequently excessive accumulation of abdominal fat. In order to study substances that present potential therapeutic activity in the control of metabolic disorders, N-acetyl-cysteine has antioxidant properties and exerts hepatoprotection. Thus, the objective of the present study was to evidence the induction of obesity by monosodium glutamate and to determine the effect of Nacetyl-cysteine on calorimetric parameters, energy metabolism, respiratory complex activity and oxidative stress in hepatic tissue. Thirty-two Winstar male mice were used at 21 days of age. Initially the animals were distributed in two experimental groups (n = 16). Grou... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

MONTEIRO JUNIOR, José Edvar. Caracterização bioquímica, funcional e estrutural de duas cistatinas recombinantes de feijão-caupi. 2012. 179 f.Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-20T14:56:24Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_jemonteirojunior.pdf: 22956458 bytes, checksum: 4912cb5f52b152df0d6dcc912bb7ccef (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:37:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_jemonteirojunior.pdf: 22956458 bytes, checksum: 4912cb5f52b152df0d6dcc912bb7ccef (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:37:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_jemonteirojunior.pdf: 22956458 bytes, checksum: 4912cb5f52b152df0d6dcc912bb7ccef (MD5) Previous issue date: 2012 / mRNA sequences coding for two cystatins were isolated from leaves of hydroponically growing cowpea plants. The sequences were ligated in the expression vector pET302NT-HIS, which was introduced into Escherichia coli, ArcticExpress (DE3) cells. The expression was induced by addition of 0.5 mM IPTG and the recombinant proteins VuCys1 (Vigna unguiculata one-domain cystatin) and VuCys2 (Vigna unguiculata two-domain cystatin), both fused to an N-terminal 6x-His tag, were purified by homogeneity using an affinity matrix containing Ni2+ immobilized to Sepharose. The apparent molecular masses for VuCys1 (yield of 10 mgP.L-1 culture) and VuCys2 (yield of 22 mgP.mL-1 culture) were 14 and 26 kDa, respectively. Both inhibitors were strongly active against the proteinases papain and chymopapain, while bromelain and particularly cathepsin B were less susceptible to in vitro inhibition. No inhibition was detected against the serine proteinase trypsin. Thermal stability tests revealed that both cystatins are thermostable proteins able to achieve a minimum residual proteolytic inhibition activity against papain of 95% (VuCys1) and 85% (VuCys2) when incubated at 100 C for 60 minutes. Similar stability results were also obtained when the proteins were tested to the ability of to inhibit papain activity after incubation in pH values ranging from 2.0 to 11.0. Circular dichroism spectroscopy measurements demonstrated that the secondary structure arrangement of both cystatins undergoes only fewer alterations when both proteins were incubated in temperatures varying from 10 to 90 C and pH values varying from 2.0 to 11.0, as well. These data are in agreement with the thermal and pH stability results previously obtained on papain inhibition assays. Biological assays conducted with different phytopathogenic fungi didn’t show any negative impact on spore germination as well as on mycelial growth of the tested fungi. Different human pathogens, including the pathogenic yeast Candida albicans were shown to be insensible to VuCys1 and VuCys2. Some scientific reports have proposed the use of cystatins as potential molecules in the control and inhibition of the activity of cysteine proteinases related to carcinogenic process. However, cytotoxicity assays performed on three tumor cell lineages revealed no toxic effects of VuCys1 and VuCys2. Inhibitor activities were also tested against digestive enzymes isolated from third instar larvae of the bruchid insects Callosobruchus maculatus and Zabrotes subfasciatus, two major cowpea plagues. Both cystatins were able to cause high inhibition of C. maculatus enzymes; however they were poorly active against Z. subfasciatus counterpart. Feeding tests were conducted in which both cystatins were added to artificial seeds at final concentrations of 0.025, 0.05 and 0.1% and supplied to C. maculatus. Despite the in vitro inhibition of C. maculatus larvae enzymes, the bioassay data suggest that larvae and adult insects appear to develop adaptive mechanisms which can make them insensible to the ingestion of the inhibitors. Crystallographic studies were carried out in order to solve the tridimensional structure of cystatins. 576 different crystallization conditions were tested in which three were favorable to the formation and growth of diffractable crystals of VuCys1 protein. These crystals belong to the orthorhombic space group P212121 and the unit cell dimension was a = 41.48 Å; b = 64.68 Å and c = 87.91 Å, α = β = γ = 90. V. unguiculata one-domain cystatin presents a typical 3D domain swapped dimmer molecular structure, which was solved at 1.95 Å resolution. No crystals were obtained for VuCys2. The physiological importance of this structure to the plant, the structural stability of both inhibitors and the results raised from biological assays are all discussed in this work. / Sequências de mRNA que codificam para duas cistatinas foram isoladas de folhas de plantas de feijão-caupi cultivadas em sistema hidropônico. As sequências foram ligadas no vetor de expressão pET302NT-His, o qual foi introduzido em células de Escherichia coli, ArcticExpress (DE3). A indução da expressão foi realizada por meio de adição de IPTG (0,5 mM) e as proteínas recombinantes VuCys1 – (cistatina de um domínio de Vigna unguiculata) e VuCys2 – (cistatina de dois domínios de V. unguiculata) ambas fusionadas a uma cauda de histidina N-terminal, foram purificadas por homogeneidade em matriz de afinidade constituída de Ni2+ imobilizado à Sepharose. VuCys1 apresentou uma massa molecular aparente de 14 kDa e um rendimento de 10 mgP.L-1 de meio de cultura, já a proteína VuCys2 mostrou uma massa molecular aparente de 26 kDa e um rendimento de 22 mgP.L-1 de meio de cultura. As duas proteínas foram fortemente ativas contra as proteinases papaína e quimopapaína, moderadamente ativas contra bromelaína e apenas fracamente ativas contra catepsina B, enquanto que nenhuma atividade inibitória foi detectada contra a proteinase serínica tripsina. Ensaios de estabilidade térmica mostraram que as duas cistatinas são proteínas termoestáveis, uma vez que, mesmo após incubação a 100 C por 60 minutos apresentam atividade inibitória residual contra papaína superior a 95% (VuCys1) e superior a 85% (VuCys2). Resultados similares de estabilidade também foram obtidos quando as proteínas foram testadas quanto à capacidade de inibir a atividade de papaína, após incubação em valores de pH variando de 2,0 a 11,0. Análises espectroscópicas de dicroísmo circular revelaram que o padrão de estruturas secundárias de ambos inibidores sofre pouca alteração após incubação em temperaturas variando de 10 a 90 C e em valores de pH variando de 2,0 a 11,0. Estes dados estão de acordo com os resultados de elevada estabilidade térmica e a extremos de pH previamente obtidos nos ensaios de inibição in vitro de papaína. Ensaios biológicos realizados com diferentes espécies de fungos fitopatogênicos não mostraram nenhum efeito negativo das proteínas sobre a germinação de esporos ou crescimento micelial dos fungos testados. Os inibidores também não se mostraram ativos contra diferentes patógenos humanos, incluindo a levedura patogênica Candida albicans. Alguns relatos científicos propõem o uso de cistatinas como agentes em potencial no controle e inibição da atividade de proteinases cisteínicas relacionados a processos carcinogênicos. Contudo, testes de citotoxicidade dos inibidores para três diferentes linhagens de células tumorais não mostraram potencial citotóxico. Os inibidores também foram testados quanto à capacidade de inibir a atividade de enzimas digestivas isoladas do intestino de larvas de terceiro instar dos insetos bruquídeos Callosobruchus maculatus e Zabrotes subfasciatus, duas importantes pragas do feijão-caupi. Ambas as cistatinas apresentaram elevado potencial inibitório contra as enzimas de C. maculatus sendo, porém, fracamente ativas contra as de Z. subfasciatus. Bioensaios foram realizados nos quais as cistatinas foram inseridas em sementes artificiais nas concentrações finais de 0,025; 0,05 e 0,1% e administradas a C. maculatus. A despeito da inibição in vitro das enzimas digestivas das larvas de C. maculatus, os resultados do bioensaio sugerem que, tanto larvas como insetos adultos, parecem desenvolver mecanismos adaptativos à administração dos inibidores que os tornam insensíveis à sua ingestão. Estudos cristalográficos foram realizados na tentativa de solucionar a estrutura tridimensional das cistatinas. 576 condições de cristalização foram testadas das quais três levaram à formação e crescimento de cristais difratáveis de VuCys1. Os cristais pertencem ao grupo espacial ortorrômbico, P212121, e a célula unitária apresentou dimensões de a = 41,48; b = 64,68 e c = 87,91 Å, α = β = γ = 90. VuCys1 apresenta uma estrutura molecular de dímero de domínios trocados a qual foi resolvida a uma resolução de 1,95 Å. Cristais de VuCys2 não foram obtidos nas condições testadas. O significado fisiológico desta estrutura para a planta, a estabilidade estrutural de ambos inibidores e os resultados referentes aos diferentes bioensaios são discutidos no presente trabalho.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This work describes the voltammetric determination of Hg, Ag, Zn, Cd, Pb and Tl using solid electrodes as working electrodes in samples of dialysate concentrates (DCs). These contain a very high ionic strengt (~ 4.1 mol L-1), which makes the direct analysis of other analytical techniques such as ETAAS. Voltammetric methods were suitable for the determination of analytes in samples of DCs without the need for dilution, masking agents or pre-concentration steps. The experimental conditions were optimized in order to increase the selectivity and sensitivity of the current signals of each analyte. Were developed two individual methods, which enable the analysis of metals in a study with adequate sensitivity required by law. Were used a glassy carbon electrode as working electrode and as electrode support for the changes. In this electrode and Ag was determined sequentially with the film formation of bismuth, Zn, Cd, Pb. With the addition of DTPA (diethylene triamine pentaacetic acid) was analyzed Tl. Searching a second modification, the second method has the application of cysteine on the film of bismuth, showed that with adequate sensitivity for the determination of mercury. The methods were used for the analysis of commercial samples of CPHD, comparing the voltammograms of each analyte with a non-saline medium. The limit of quantification values ranging from 0.23 to 5.32 μg L-1, and the values obtained from tests for recoveries ranging from 93.6 to 106.3%. / Neste trabalho é descrita a determinação voltamétrica de Hg, Ag, Zn, Cd, Pb e Tl utilizando eletrodos sólidos como eletrodos de trabalho em amostras de concentrado polieletrolítico de hemodiálise (CPHD). Estas possuem uma elevada força iônica (~ 4,1 mol L-1), o que impossibilita a análise direta em outras técnicas analíticas, como ETAAS. Métodos voltamétricos mostraram-se adequados para a determinação dos analitos em amostras de CPHD, sem ser necessário diluição, agentes mascarantes ou etapas de pré-concentração. As condições experimentais foram otimizadas com o objetivo de aumentar a seletividade e sensibilidade dos sinais de corrente de cada analito. Foram desenvolvidos dois métodos independentes, que permitem a análise dos metais em estudo com adequada sensibilidade, conforme é exigido pela legislação. Foi utilizado o eletrodo de carbono vítreo como eletrodo de trabalho e também como suporte para as modificações. Nesse eletrodo foi possível determinar Ag e, sequencialmente, com a formação do filme de bismuto, Zn, Cd, Pb. Com a adição de DTPA (Ácido Dietilenotriaminopentacético), determinou-se Tl. Buscando a determinação de mercúrio com adequada sensibilidade, uma segunda modificação foi realizada, e o segundo método apresenta a aplicação de cisteína sobre o filme de bismuto. Os métodos foram utilizados nas amostras de CPHD comerciais, comparando o comportamento individual dos analitos, com um meio não-salino. Os valores de limite de quantificação variam de 0,23 a 5,32 μg L-1, e os valores obtidos nos ensaios de recuperações variam entre 93,6 a 106,3%.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In this study we investigated the interaction between lead and the amino acid cysteine, lysine and N-acetylcysteine by testing long-term contact with ion exchanger resins and also the determination of stability constants. The importance of investigating the presence of lead in solutions for parenteral nutrition is related to the risk of internal contamination of these solutions due to the affinity between amino acids that compose these solutions and lead present in plastic packaging. The amino acids according to their relative affinities can act as carriers of metal in living organisms. The long term tests with adsorbents in form of Pb2+ showed that the higher extraction of lead occurs at amino acid that has a greater affinity for the metal and this is evidenced by the value of stability constant calculated, i.e., there was a direct relationship of the values of the calculated stability constants. Kinetic effects were not significant in this study, since the trials were of long duration. Tests with complexing agents such as EDTA and citric acid, that have known stability constants, were also performed for comparison purposes. The quantification of lead in long term tests was performed by atomic absorption spectrometry with flame and electrothermal atomization. The stability constants were obtained by potentiometry by processing the data through the software BEST®. Titrations in aqueous solutions with constant ionic strength and temperature showed that the predominant species in solution have molar ratio of 1:1 (L: M) to N-acetyl-cysteine and lysine and 1:1 and 2:1 for cysteine. The main species found for cysteine were Cys2Pb and CysPbOH with log K = 1.61 and 24.00, respectively, for N-acetylcysteine N-Acetyl-Cys2Pb, N-Acetyl-Cys2PbH and N-Acetyl-CysPbOH with log K =-1.55, 14.52 and 21.49 respectively, and for lysine LysPb with log K = 9.69. The interaction of amino acids studied with lead was also detected by the tests made with the raw material of the packaging of parenteral nutrition solutions through the analysis by AAS. / Neste trabalho investigou-se a interação entre chumbo e os aminoácidos cisteína, N-acetilcisteína e lisina por meio de ensaios de contato de longa duração com resina de troca iônica e estudos para determinar as constantes de estabilidade dos complexos formados entre eles. A importância de investigar a presença de chumbo em soluções de nutrição parenteral relaciona-se ao risco de contaminação interna destas soluções em decorrência da afinidade entre os aminoácidos que compõem as soluções e o chumbo presente nas embalagens plásticas. Os aminoácidos em função de suas afinidades relativas podem atuar como transportadores do metal nos organismos vivos. Os resultados dos ensaios de contato com resina na forma Pb2+ mostraram que a maior extração do chumbo ocorre pelo aminoácido que possui maior afinidade pelo metal e isto é comprovado pelo valor da constante de estabilidade calculada, ou seja, houve relação direta dos valores das constantes obtidas através do cálculo das mesmas para os aminoácidos estudados com a taxa de extração do chumbo da resina pelos ligantes (aminoácidos). O efeito cinético, estabelecido pelas leis de velocidades não importaram nesse estudo, uma vez que os ensaios foram de longa duração. Ensaios com agentes complexantes, como EDTA e ácido cítrico, com constantes de estabilidade já conhecidas, também foram realizados para fins comparativos. A quantificação de chumbo nos ensaios de longa duração foi realizada por espectrometria de absorção atômica (AAS) com atomizações por chama e eletrotérmica. As constantes de estabilidade foram obtidas por potenciometria com o tratamento dos dados através do programa computacional BEST®. Titulações potenciométricas, de soluções aquosas com força iônica e temperatura constantes, mostraram que as espécies predominantes em solução são de razão molar 1:1 (L:M) para N-acetilcisteína e lisina e de 1:1 e 2:1 para cisteína. As principais espécies encontradas foram para cisteína, Cys2Pb e CysPbOH com log K = 1,61 e 24,00 respectivamente, para N-acetilcisteína N-Acetil-Cys2Pb, N-Acetil-Cys2PbH e N-Acetil-CysPbOH, com log K = -1,55; 14,52 e 21,49 respectivamente, e para lisina LysPb, com log K = 9,69. A interação dos aminoácidos estudados com o chumbo também foi constatada pelos ensaios feitos com a matéria-prima das embalagens das soluções de Nutrição Parenteral através da análise por AAS.

Orientadores: Alessandra Alves de Souza, Marco Aurélio Takita / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T03:21:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Muranaka_LigiaSegatto_M.pdf: 4670725 bytes, checksum: f903ecd21649fe431b36cd1ea62d804b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Xylella fastidiosa é uma bactéria Gram-negativa que causa várias doenças em diferentes espécies de plantas, como a clorose variegada dos citros (CVC) em Citrus sinensis, cujos danos econômicos são da ordem de milhões de dólares anuais. O desenvolvimento dos sintomas tem sido associado ao bloqueio dos vasos do xilema causado pela formação de um biofilme pela bactéria. Recentemente foi verificado que o biofilme de X. fastidiosa é mais resistente a compostos antimicrobianos que a forma planctônica. Essa resistência tem se mostrado um fenômeno complexo que não pode ser explicado por um único mecanismo, e sim por multifatores. Nesse sentido, a proposta desse trabalho foi identificar, por microarranjos de DNA, genes possivelmente associados à adaptação do biofilme na presença de compostos antimicrobianos, em concentrações letais para células em crescimento planctônico, mas que não inibiram o crescimento do biofilme. Foram encontrados 223 (7,87%) CDS induzidas na presença de cobre e 150 (5,29%) reprimidas. Com tetraciclina foram 450 (15,89%) induzidas e 449 (15,85%) reprimidas. Muitas sequências codificadoras envolvidas com funções da síntese proteica, metabolismo energético, divisão celular e movimentação foram moduladas negativamente em ambas as situações, sugerindo que tais modificações contribuiriam para um provável estado de resistência. Com a adição da dose subinibitória de cobre também foi observada a indução de genes relacionados à adesão e produção de toxinas, que estão envolvidos com a virulência da bactéria em planta, o que sugere esta seria aumentada possivelmente induzindo maior severidade de sintomas. Já com tetraciclina o oposto foi observado, repressão de genes relacionados à formação do biofilme e produção de toxinas. No entanto, identificamos a indução de um possível mecanismo de resposta SOS, pela qual genes relacionados ao sistema toxina-antitoxina seriam superexpressos. Esse sistema provavelmente está envolvido com a morte celular programada e formação de células persistentes. Assim é possível concluir que doses subinibitórias de compostos antimicrobianos poderiam ao invés de matar, induzir a virulência da bactéria, como ocorrido com o cobre, ou a formação de células persistentes, como observado com a tetraciclina. Outra abordagem desse trabalho foi à realização de experimentos in vitro e in vivo com um análogo de cisteína, o N-acetyl-L-cysteina (NAC), que já vem sendo utilizado na medicina para desestruturação de biofilmes de bactériaspatógenas de humanos. Resultados da quantificação da massa celular, número de célulasviáveis e exopolissacarídeos totais revelaram que todas as doses de NAC (1, 2 e 6 mg/mL) testadas nos experimentos in vitro diminuiram a formação do biofilme e inibiram o crescimento de X. fastidiosa, o que indica um possível efeito tóxico dessa substância. Nos experimentos in vivo foi observada uma grande redução dos sintomas de CVC em plantas de C. sinensis infectadas e tratadas com diferentes doses de NAC. Esses estudos abrem uma real perspectiva ao uso dessa substância para o manejo da CVC. / Abstract: Xylella fastidiosa is a Gram-negative bacterium that causes several diseases in different plant species, including citrus variegated chlorosis (CVC) in sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck), whose economic damage is of millions of dollars annually. The symptoms development has been associated with the blockage of xylem vessels caused by bacterial biofilm formation. Recently it was found that the biofilm of X. fastidiosa is more resistant to antimicrobial compounds than the planktonic cells. This resistance has been considered as a complex phenomenon that cannot be explained by a single mechanism, but by multi-factors. Accordingly, the intent of this study was to identify through DNA microarray technology, genes possibly involved in adaptation of biofilm cells to the presence of antimicrobial compounds in concentrations that are lethal to cells in planktonic growth, but do not inhibit the cell growth in biofilm. We found 223 (7.87%) genes induced in presence of copper and 150 (5.29%) genes repressed. For tetracycline, there were 450 (15.89%) induced genes and 449 (15.85%) repressed ones. Many genes encoding proteins related to protein synthesis, energy metabolism and cell division were negatively modulated in both, copper and tetracycline treatments, suggesting that these changes could contribute to a state of resistance. When a subinhibitory dose of copper was applied we could also observe the induction of genes related to adhesion and thus biofilm formation and toxin production, suggesting that the bacterial virulence should be increased. The opposite was found for tetracycline. However, we observed the induction of a possible SOS response mechanism in which genes related to a toxin-antitoxin system was overexpressed. This system is probably involved with programmed cell death and formation of persistent cells. We then concluded that subinhibitory doses of antimicrobial compounds could induce bacterial virulence as occurred for copper, or the formation of persistent cells, as observed for tetracycline rather than kill the cells. Another approach of this work was to carry out experiments in vitro and in vivo with an analogue of cysteine, N-acetyl-L-cysteine (NAC), which has been already used in medicine as a drug for disruption of biofilms formed by human pathogenic bacteria. Results of cellular mass quantification, number of viable cells and total exopolysaccharide content revealed that all doses (1.0, 2.0 and 6.0 mg / mL) of NAC tested in in vitro experiments decreased the biofilm formation and inhibited growth of X. fastidiosa, which indicated that this substance could also be toxic for the bacteria. In vivo experiments showed a strong reduction in CVC symptoms in C. sinensis plants infected and treated with different doses of NAC. These studies open a real prospect for the use of this compound in CVC management. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_jorgea_pradiee.pdf: 964026 bytes, checksum: e100969ef5fb9f72ec9bf73b616695fd (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / In an attempt to diminish the structural damage to the plasma membrane, due to free radicals and reactive oxygen species (ROS), the antioxidants β-mercaptoethanol (BME) and cysteine (CIS) were tested for semen cryopreservation and in vitro maturation (IVM) and culture (IVC) of ovine embryos. Semen samples from four rams of the Crioula Lanada breed were collected with artificial vagina twice weekly (n = 23). Samples of four rams were pooled and split in six treatments: T1, control without antioxidant, T2, with 2mM BME, T3, with 5mM BME, T4, with 2mM BME and 5mM cysteine; T5, with 5 mM BME and 5mM cysteine, and T6 with 5 mM cysteine. Semen was diluted in tris-egg yolk-glycerol and stored in straws of 0.25 mL containing 100 x 106 spermatozoa. Cooling and freezing were performed using a TK3000 and thawing was performed at 37°C for 20 s. Sperm motility, membrane integrity and mitochondrial activity and acrosome, before freezing and after thawing, did not differ between treatments (P> 0.05). Quantification of ROS and total antioxidant activity after thawing were similar between treatments (P> 0.05). At the tested concentrations, the inclusion of BME, and cysteine did not affect sperm viability after thawing. In the first experiment of IVP, the inclusion of 20 mM of BME in IVM and IVC of embryos was compared to a control treatment without antioxidants. There was no deleterious effect of antioxidant on the cleavage rate (control: 70.0%; BME: 69.8%). However, the rate of development to the blastocyst stage with BME (5.2%) was lower (P <0.001) than with the control (16.9%). In the second experiment, we tested the association of 50 mM BME and 600 mM of CIS in IVM and IVC. There was no difference between control and BME/CIS (P> 0.05), for cleavage (60.3% and 64.3%, respectively) and embryonic development rates (33.6% and 36.6 %, respectively). The addition of 20 mM of isolated BME in IVM and IVC sheep embryos was associated with decreased embryonic development to blastocyst. However, the addition of antioxidants BME, and cysteine in combination, did not affect the rates of cleavage and embryo development to blastocyst. Therefore, the combination of antioxidants and CIS BME used in freezing ram semen and PIV, did not improve the treatments that have been added, albeit at different concentrations. / Na tentativa de diminuir os danos estruturais na membrana plasmática, devido aos radicais livres e espécies reativas de oxigênio (ROS), os antioxidantes β-mercaptoetanol (BME) e cisteína (CIS) foram testados na criopreservação de sêmen e na maturação (MIV) e cultivo (CIV) in vitro de embriões de ovinos. Amostras de sêmen de quatro carneiros da raça Crioula Lanada foram coletadas com vagina artificial, duas vezes por semana (n = 23). As amostras dos quatro machos foram combinadas em pool e divididas em seis tratamentos: T1, Controle, sem antioxidante; T2, com 2mM BME; T3, com 5mM BME; T4, com 2mM BME e 5mM de cisteína; T5, com 5mM BME e 5mM de cisteína; e T6 com 5mM de cisteína. O sêmen foi diluído em tris-gema-glicerol e estocado em palhetas de 0,25 mL contendo 100 x 106 espermatozoides. O resfriamento e o congelamento foram realizados em máquina TK3000 e o descongelamento foi realizado a 37ºC por 20 s. A motilidade, a integridade da membrana espermática e do acrossoma e a atividade mitocondrial, antes do congelamento e após o descongelamento, não diferiram entre os tratamentos (P> 0,05). A quantificação de ROS e da atividade antioxidante total pós-descongelamento foram semelhantes entre os tratamentos (P> 0,05). Nas concentrações testadas, a inclusão de BME e cisteína não influenciou a viabilidade espermática pós-descongelamento. No primeiro experimento de PIV, a inclusão de 20 μM de BME na MIV e CIV de embriões foi comparada a um tratamento controle sem antioxidantes. Não houve efeito deletério do antioxidante sobre a taxa de clivagem (Controle: 70,0%; BME: 69,8%). Porém, a taxa de desenvolvimento até o estágio de blastocisto no tratamento BME (5,2%) foi inferior (P<0,001) à do controle (16,9%). No segundo experimento, foi testada a associação de 50 μM de BME e 600 μM de CIS, na MIV e CIV. Não houve diferença entre os tratamentos controle e BME/CIS (P>0,05), quanto às taxas de clivagem (60,3% e 64,3%, respectivamente) e de desenvolvimento embrionário (33,6% e 36,6%, respectivamente). A adição isolada de 20 μM de BME na MIV e CIV de embriões ovinos foi associada com redução no desenvolvimento embrionário até blastocisto. Porém, a adição dos antioxidantes BME e cisteína, em associação, não afetou as taxas de clivagem e desenvolvimento embrionário até blastocisto. Assim, a associação dos antioxidantes BME e CIS usados no congelamento de sêmen ovino e na PIV, não promoveu melhora dos tratamentos em que foram adicionados, ainda que em concentrações diferentes.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The improvement of pig industry is a consequence of the technological advances. The aim of the present study is to evaluate the effect of cysteine in BTS (Beltsville Thawing Solution) and centrifugation on swine semen to increase the sperm quality and fertility. In the first experiment, different concentrations of cysteine in Beltsville Thawing Solution: BTS (control group); CYS0.1 (BTS added 0.1 mM cysteine); CYS0.5 (BTS added 0.5 mM cysteine); CYS1.0 (BTS added 1.0 mM cysteine); CYS2.5 (BTS added 2.5 mM cysteine); CYS5.0 (BTS added 5.0 mM cysteine); CYS10.0 (BTS added 10.0 mM cysteine) and CYS20.0 (BTS added 20.0 mM cysteine) were evaluated. In the second experiment, semen added to BTS were not centrifuged without (control group) or with 5.0 mM of cysteine (BTSCYS/NC). In other treatment groups, semen were centrifuged with (BTSCYS/CENT) or without (BTS/CENT) 5.0 mM cysteine. Semen were stored at 17 °C for 72 h. To assess the effect of cysteine and centrifugation on fertility, 136 females were randomly allotted in the following groups for artificial insemination with semen diluted in BTS and a) without centrifugation and cysteine (BTS/NC); b) without centrifugation and with 5.0 mM cysteine (BTSCYS/NC) or c) with centrifugation and with 5.0 mM cysteine (BTSCYS/CENT). After artificial insemination, the return to estrus rate and litter size were evaluated. In the first experiment, the quality of semen was determined by tests of sperm motility, vigor, morphology and viability (plasma and acrossomal membrane integrity and mitochondrial potential). In the second experiment, the semen were evaluated by the tests above, DNA compactation and function of plasma membrane. The treatments were evaluated at 0, 24, 48 and 72 h after dilution. In both experiments, the effect of treatments on the storage period was determined by analysis for repeated data (PROC MIXED) and the effect of treatments on the return to estrus rate and the number of piglets were analyzed by using PROC GLM of SAS software and applied the Tukey test for significant models. The percentage of morphological changes did not exceed 20% during storage for 72 h and do not differ between treatments in both experiments. However, the motility in the first experiment, vigor, integrity of plasma membrane and acrossomal well as the potential of mitochondria reduced the period of storage. The motility, vigor and viability decreased to levels below 10% in treatments CYS10.0, CYS20.0 in the first 24 hours of storage at 17 ºC. At the end of the storage period all groups had average below 65% of sperm with intact plasma membrane while the second experiment, treatment BTSCYS/CENT showed lower motility and force the other treatments, and the sperm motility below 60% from 24 hours of storage. The integrity of plasma membranes and acrossomal and the potential of mitochondria was less than 60% in treatments BTSCYS and BTSCYS/CENT. However in the field to the group BTSCYS showed lower average (8.83 ± 3.38) for infants and more return rate (86.05 ± 0.39) when compared to other groups. Therefore, the cysteine at low concentrations as well as maintains the control group the sperm quality. But despite treatment BTSCYS/NC have reached the same rates as the control group for sperm quality, was the treatment that received higher rates of return and lower number of piglets born. / O crescimento da suinocultura se deve a diversos avanços na área tecnológica. Buscando obter maior eficiência reprodutiva, foi analisado o efeito da cisteína ao diluente Beltsville Thawing Solution (BTS) e do processo de centrifugação sobre qualidade espermática. No primeiro experimento, foram avaliadas diferentes concentrações de cisteína no diluente BTS, conforme os seguintes tratamentos: BTS (grupo controle); CIS0,1 (BTS + 0,1 mM de cisteína); CIS0,5 (BTS + 0,5mM de cisteína); CIS1,0 (BTS + 1,0 mM de cisteína); CIS2,5 (BTS + 2,5 mM de cisteína); CIS5,0 (BTS + 5,0 mM de cisteína); CIS10,0 (BTS + 10,0 mM de cisteína) e CIS20,0 (BTS + 20,0 mM de cisteína). No segundo experimento, o sêmen foi dividido em: sêmen não centrifugado diluído em BTS/NC (grupo controle), sêmen não centrifugado diluído em BTS + 5,0 mM de cisteína (BTSCIS/NC), sêmen centrifugado diluído em BTS (BTS/CENT) e sêmen centrifugado diluído em BTS + 5,0 mM de cisteína (BTSCIS/CENT). Ambos os experimentos foram realizados para avaliar a influência dos diferentes tratamentos sobre a qualidade espermática quando o sêmen é armazenado a 17°C por até 72 horas. Para avaliar o efeito da cisteína e da centrifugação sobre fertilidade, 136 fêmeas foram selecionadas e inseminadas nos seguintes tratamentos: BTS/NC, BTSCIS/NC e BTSCIS/CENT. Após a inseminação artificial, as fêmeas foram avaliadas quanto a taxa de retorno e o tamanho da leitegada. A qualidade espermática no primeiro experimento foi determinada pelos testes de motilidade e vigor, alterações morfológicas e viabilidade espermática (membrana plasmática e acrossomal intactas e célula com potencial de mitocôndria). No entanto, no segundo experimento além dos testes citados anteriormente, foram realizados os testes de compactação de DNA e funcionalidade de membrana plasmática. As avaliações dos tratamentos foram realizadas 0, 24, 48 e 72 horas após a diluição do sêmen. Em ambos experimentos, o efeito dos tratamentos em relação ao período de armazenamento foi determinado através da análise para dados repetidos (PROC MIXED). O efeito dos tratamentos em relação a taxa de retorno e o número de nascidos foi analisado usando o PROC GLM, do programa estatístico SAS e aplicado o teste de Tukey quando o modelo foi significativo. A percentagem de alterações morfológicas não excedeu a 20% durante o armazenamento por 72 horas e nem diferiu entre os tratamentos, nos dois experimentos. Porém, no primeiro experimento a motilidade, o vigor, a integridade de membrana plasmática e acrossomal bem como o potencial de mitocôndria foram reduzidas ao longo do período de armazenamento. A motilidade, o vigor e a viabilidade diminuíram a níveis abaixo de 10% nos tratamentos CIS10,0 e CIS20,0 nas primeiras 24 horas de armazenamento a 17ºC. Ao final do período de armazenamento todos os grupos apresentavam média abaixo de 65% de espermatozóides com a membrana plasmática intacta. No segundo experimento, no entanto, o tratamento BTSCIS/CENT apresentou motilidade e vigor inferiores ao demais tratamentos, sendo a motilidade espermática inferior a 60% a partir de 24 horas de armazenamento. A integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de mitocôndria foram inferiores a 60% nos tratamentos BTSCIS e BTSCIS/CENT. No entanto na parte a campo, o grupo BTSCIS apresentou menor média (8,83 ± 3,38) de nascidos e maior taxa de retorno (86,05 ± 0,39) quando comparados aos outros grupos. Portanto, a cisteína em baixas concentrações mantém tão bem quanto o grupo controle a qualidade espermática. Mas, apesar do tratamento BTSCIS/NC ter atingido os mesmos índices que o grupo controle em relação qualidade espermática, foi o tratamento que obteve maior taxa de retorno e menor número de leitões nascidos.