Memoria para optar al título de Bioquímico / La industria acuícola de salmónidos, como la del salmón del Atlántico o de la trucha arcoíris, constituye una de las principales actividades económicas de Chile. Sin embargo, en su puesta en marcha enfrenta desafíos técnicos y ambientales, incluyendo la aparición de enfermedades que se transmiten rápidamente dentro de las poblaciones de cultivo. La segunda causa de pérdidas por patología infecciosa es la Necrosis Pancreática Infecciosa, causada por el virus IPNv. Se ha descrito que la citoquina IFN-I induce una potente actividad antiviral contra IPNv. Para este trabajo de investigación, se propuso clonar IFN-I de la especie Salmo salar en Bacillus megaterium, una bacteria inocua capaz de producir grandes cantidades de proteína y que ha sido utilizada exitosamente en la industria biotecnológica. Para lo anterior, se diseñó un método de clonación clásico y se logró exitosamente la transformación de Escherichia coli con el vector de B. megaterium pSSBm110 con el gen de IFN-I como inserto (pSSBm110:IFN-I). Se probaron luego dos métodos de transformación para B. megaterium, uno de electroporación que no dio resultados cuantificables y otro de creación de protoplastos libres de pared capaces de absorber ADN exógeno. Sin embargo, a pesar de lograr la transformación y la clonación exitosa del vector pSSBm110:IFN-I en B. megaterium, no se logró la detección de la expresión de IFN-I recombinante, por lo cual serán necesarios nuevos intentos para lograr su uso como sistema de expresión para esta citoquina / The salmonid aquaculture industry, such as the Atlantic salmon or the rainbow trout aquaculture, is one of the Chile’s main economic activities. However, this industry faces technical and environmental challenges, including the emergence of diseases which spread quickly through the fish populations. The infectious pancreatic necrosis, which is caused by the IPNv virus, is the second cause of fish losses related to an infectious disease. It has been described that the cytokine IFN-I induces a powerful antiviral response against IPNv. In this research, we proposed the cloning of IFN-I from Salmo salar in the harmless bacterium Bacillus megaterium, a species of high-yielding protein production, successfully used in the biotechnology industry. For this, a classic cloning method was used, obtaining transformed Escherichia coli cells with the B. megaterium pSSBm110 vector, and the IFN-I insert (pSSBm110:IFN-I). Then, two B. megaterium transformation methods were tested. The first one, an electroporation method, which did not offer quantifiable results. The second one, a method based on protoplast cells generation where foreign DNA was absorbed. Even though the transformation and cloning in B. megaterium were both successful, and verified through sequencing, the expression of the recombinant peptide was not detectable. Thus, new attempts will be necessary to use this expression system for this cytokine / FIA PYT-2012-0056

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Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Determina el efecto de las lectinas hemaglutinantes de Lupinus mutabilis (tarwi) en la activación y expresión de citoquinas proinflamatorias en monocitos humanos infectados con Leishmania peruviana y Leishmania braziliensis. Se procedió a purificar las lectinas del extracto de semillas de L. mutabilis mediante dos métodos cromatográficos: exclusión molecular seguido de intercambio aniónico. Para el aislamiento de monocitos humanos de sangre periférica se diseñó y aplicó un método de separación seriada empleando dos polímeros de distintas densidades. El cultivo de monocitos fue tratado con diferentes dosis de fracción de lectinas hemaglutinantes (FrPG) obtenidas por cromatografía de exclusión molecular y lectina purificada (LP) obtenida por cromatografía de intercambio aniónico. Se evaluó la viabilidad celular, producción de anión superóxido y liberación de óxido nítrico. Las concentraciones óptimas de FrPG y LP fueron probadas en cultivos de monocitos humanos infectados con L. peruviana y L. braziliensis, en los que se evaluó la expresión de citoquinas proinflamatorias. Las concentraciones de 50, 75 µg/ml de FrPG y 20 µg/ml de LP produjeron el incremento significativo de la producción de anión superóxido en cultivo de monocitos no infectados. La producción de anión superóxido en monocitos previamente tratados e infectados con L. peruviana fue significativa con 75 µg/ml de FrPG y 20 µg/ml de LP, mientras que en monocitos infectados con L. braziliensis solo se presentó con 20 µg/ml de LP. No se produjo liberación de óxido nítrico en ninguna de las concentraciones de FrPG y LP en los cultivos de monocitos no infectados o infectados con las especies de Leishmania evaluadas. Se incrementó la expresión génica de mRNA para IL-1α y TNF-α solo en los cultivos de monocitos infectados con L. peruviana en presencia de LP a 20 µg/ml. Se concluye que el tratamiento con lectina purificada de tarwi induce la producción de anión superóxido en monocitos no infectados e infectados con L. peruviana y L. braziliensis y favorecen el incremento de la expresión de citoquinas proinflamatorias solo en monocitos infectados con L. peruviana. / Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado / Tesis

Memoria para optar al título profesional de Ingeniera Agrónoma. Mención Fruticultura / Con el objetivo de evaluar cómo afectan distintas técnicas de aplicación del regulador de crecimiento Tidiazurón (TDZ) sobre el crecimiento de bayas, se realizó un ensayo en un parronal de la variedad Thompson Seedless, ubicado en la localidad de La Arena, Región de Atacama. La aplicación se efectuó en bayas de 6 mm y los tratamientos consistieron en 1,67 mg•L-1 de TDZ aplicado mediante atomizador hidroneumático; 1,67 mg•L-1 de TDZ aplicado por bomba de espalda; 1,67 mg•L-1 de TDZ aplicado por inmersión; 0,84 mg•L-1 de TDZ aplicado por inmersión; y un tratamiento sin aplicación de TDZ (control). Al momento de la cosecha, definida por un contenido de sólidos solubles de 16,5°Brix, se evaluó el tamaño y peso de bayas, peso de racimo, color de racimo, desgrane de bayas, sólidos solubles y calidad de raquis. No hubo diferencias en el peso, diámetro ecuatorial y polar de bayas en cuanto a las formas de aplicación. Las bayas tratadas con TDZ con la concentración completa presentaron mayor peso y diámetro polar que el control sin aplicación. En el diámetro ecuatorial, la inmersión fue el único tratamiento que mostró un aumento respecto al control. La aplicación mediante inmersión con la mitad de la concentración no fue suficiente y presentó el mismo tamaño que los racimos no aplicados. El TDZ redujo los racimos color ámbar y aumentó los de color verde. Además, generó un atraso en la fecha de cosecha como también una disminución de los sólidos solubles. De acuerdo a este ensayo, las formas de aplicación de TDZ no determinan diferencias en el tamaño y peso de baya. / In order to assess how different Thidiazuron (TDZ) growth regulator application techniques affect berry growth, a trial was carried out in a cv. Thompson Seedless vineyard, located in La Arena, Atacama Region, Chile. The application was done at 6 mm berry diameter and treatments consisted in 1,67 ppm of TDZ applied atomizer sprayer; 1,67 ppm of TDZ applied by manual sprayer; 1,67 ppm of TDZ applied by immersion; 0,84 ppm of TDZ applied by immersion; and a treatment without application of TDZ (control). At harvest, determined by cluster reaching 16° Brix soluble solids berry size and weight were evaluated. Other parameters were also assessed like cluster weight, color, berry drop and soluble solids, besides rachis quality. There were no differences in berry size regarding method of application. The treated berries showed more weight and polar diameter than those of control treatment without application. In relation at equatorial diameter, immersion was the only treatment showing a significant difference with control. The immersion application with half concentration was not enough and showed the same size than control clusters no application. TDZ reduced number of amber color clusters, and produced a delay harvest date on additionally soluble solids decrease was observed. Berry weight increased with TDZ application, confirming that applications were effective. According to this trial, the application method do not determine differences on berry size.

Lepidium meyenii, Walpers, conocido mundialmente como “maca”, es un tubérculo nativo de los Andes del Perú, que vive en regiones a más de 4000 msnm. Es reconocida mundialmente y ha sido objeto de numerosos estudios por muchas propiedades terapeúticas, afrosidiacas, entre otras que se le atribuyen; siendo alguna de estas ya verificadas científicamente. Su participación como inmunomodulador también ha sido estudiada, llegándose a encontrar efectos protectores, anticancerígenos; sin embargo, aún existe controversia sobre su participación en procesos inflamatorios. Es por eso que el objetivo de la presente investigación fue verificar su efecto sobre la producción de mRNA y secreción de TNF-α, una citoquina clave en los procesos inflamatorios, además de otros intermediarios como óxido nítrico (NO) y anión superóxido en células mononucleares de sangre periférica humana. Para esto se preparó un extracto metanólico (EM), partiendo de harina de hipocótilo deshidratado del ecotipo morado de maca. Se realizaron pruebas de viabilidad, a través de la reducción del MTT. El óxido nítrico fue medido utilizando la reacción de Peter Griess, mientras que el “estallido respiratorio” fue cuantificado a partir de la reducción del nitroblue tetrazolio (NBT). La expresión génica y secreción de TNF-α fueron evaluadas por un análisis cualicuantitativo a partir de PCR convencional, y ELISA tipo sándwich, respectivamente. Los resultados mostraron que el EM no afectó la viabilidad celular, ni estimuló significativamente la producción del anión superóxido. Sin embargo, se demostró un aumento dosis-dependiente de la producción de NO y TNF-α. Los hallazgos sugieren que los metabolitos secundarios que contiene el EM estimulan la respuesta inmune innata celular, siendo necesarias futuras investigaciones que complementen estos hallazgos. / Tesis

El fucoidan es un polisacárido extraído de algas pardas y ha sido ampliamente estudiado por sus propiedades anticoagulantes, antivirales, antiinflamatorias, antioxidantes, antitumorales, antiangiogénicas e inmunomoduladoras, que varían de acuerdo a la especie. Lessonia trabeculata es un alga parda del litoral peruano que se emplea en la industria alimentaria; sin embargo, tiene otros usos potenciales que deben ser investigados. El desarrollo de nuevos productos con actividad biológica a partir de estas algas requiere de evaluaciones in vitro e in vivo. El objetivo fue evaluar la producción de citoquinas de respuesta inmune celular: TNF-α, TNF-β, IFN-γ e IL-2, la producción de especies reactivas de oxígeno (ERO) y óxido nítrico (NO) en ratones inmunizados con glóbulos rojos de carnero (GRC) y tratados con diferentes concentraciones del extracto liofilizado rico en fucoidan de Lessonia trabeculata, empleándose como control fucoidan de Fucus vesiculosus. Los ratones fueron tratados durante 14 días por vía oral, para evaluar la respuesta inmune primaria (RIP), y durante 28 días, para la respuesta inmune secundaria (RIS). Las ERO se evaluaron mediante el ensayo de reducción de nitroazul de tetrazolio, y el NO por la reacción de Griess. La expresión génica y la presencia de citoquinas séricas se determinaron mediante PCR convencional y ELISA de tipo sándwich, respectivamente. Los resultados obtenidos demuestran que el extracto liofilizado rico en fucoidan de Lessonia trabeculata no influye en la producción de ERO ni NO, incrementa la expresión de TNF-α y la concentración en suero de TNF-α, IFN-γ e IL-2 e inhibe la expresión de TNF-β en RIP, promueve la expresión de TNF-β e IL-2, inhibe la expresión de TNF-α y reduce la concentración en suero de IL-2 en RIS. Se concluye que el extracto liofilizado rico en fucoidan de Lessonia trabeculata estimula la inmunidad celular en la respuesta primaria y secundaria, sin embargo, es necesario complementar estos resultados con posteriores investigaciones. / Perú. Ministerio de la Producción. Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad (Innóvate Perú) / Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado / Tesis

Menciona que Leishmania braziliensis es un protozoario causante de la leishmaniasis o uta, enfermedad endémica crónica de baja patogenicidad, alta morbilidad, metaxénica y zoonótica que compromete piel, mucosas y vísceras. Es transmitida por un díptero del género Lutzomyia, afecta alrededor de 12 millones de personas alrededor del mundo y a 12 departamentos en el Perú. Leishmania braziliensis tiene patrones moleculares de membrana asociadas a patógenos que son reconocidos por los receptores tipo toll (TLR) presentes en el hospedero, tanto en la superficie celular como a nivel intracelular. Los TLRs están conformados por una familia de 23 tipos que van a reconocer ligandos presentes en patógenos en común. Cuando se da la unión del ligando con un TLR desencadenará una secuencia de señales activando la expresión de moléculas coestimuladoras y citoquinas promoviendo una inflamación y activando la respuesta adaptativa. El presente trabajo tiene como objetivos caracterizar a la cepa C234 de Leishmania braziliensis mediante secuenciamiento y detectar y cuantificar los niveles de expresión de mRNA de los genes TLR-3, TLR-4 y TLR-9 y de las citoquinas IL-12 y TNF-α en macrófagos murinos enfrentados a la cepa C234 de Leishmania braziliensis, endémica del Perú. Se infectó macrófagos peritoneales de ratones Balb/c con promastigotes de Leishmania braziliensis y se cultivaron por 24 horas, se midió los niveles de óxido nítrico (ON), se extrajo mRNA de los macrófagos y se detectó y cuantificó los niveles de expresión en los genes de TLR-3, TLR- 4 y TLR-9, y de las citoquinas proinflamatorias IL-12 y TNF-α, a través de la técnica de retrotranscripción mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Los resultados indicaron que el estudio filogenético de la cepa C234 mostró alta homología (96%) para Leishmania braziliensis. Además, los macrófagos infectados con Leishmania braziliensis presentaron mayor producción de ON sólo en las primeras horas de infección, descendiendo a las 24 y 48 horas; y se detectó expresión de mRNA para los genes TLR-3, TLR-4 y TLR-9 y de las citoquinas IL-12 y TNF-α. Se concluye que la cepa nativa C234 pertenece a la especie Leishmania braziliensis y que la disminución de la producción de ON está relacionada al mayor tiempo de infección y bajos niveles de expresión del gen TLR-4, así mismo, el incremento del nivel de expresión de mRNA de los genes TLR-3 y TLR-9 podrían estar implicados en la activación de la expresión génica de la citoquina IL-12 en macrófagos peritoneales murinos infectados con Leishmania braziliensis. / Tesis