El KBrO3 es un compuesto químico oxidante clasificado como tóxico que se sigue utilizado a pesar de las restricciones o prohibiciones en su uso. Las investigaciones lo muestran como inductor de citotoxicidad, genotoxicidad, mutagénesis, teratogénesis, carcinogénesis, etc; sin embargo, los datos obtenidos en el sistema reproductivo masculino son insuficientes para ser concluyentes. Con la finalidad de estudiar los efectos de la exposición prolongada del KBrO3 en 4 momentos de un ciclo espermatogénico completo y en la línea eritropoyética de la Médula Ósea Roja (MOR), se dividió aleatoriamente un grupo de 50 ratones en 5 grupos de tratamiento, los cuales fueron sometidos a inoculaciones intraperitoneales diarias de este compuesto químico. Los grupos fueron: Grupo I: Día 7, Grupo II: Día 15, Grupo III: Día 21, Grupo IV: Día 35 y Grupo V: Control Negativo (CN). En cada grupo se realizaron espermatogramas acorde con los parámetros de la OMS, (2010) y evaluaciones de citotoxicidad y genotoxicidad en la médula ósea roja. El análisis estadístico fue realizado mediante ANOVA con la prueba post hoc de Tukey en el programa SPSS 20.0. Los resultados (media ± DE) mostraron que los órganos reproductivos analizados disminuyen significativamente su peso a partir del Grupo III. Se observó que en el Grupo I el porcentaje de espermatozoides no móviles se elevó (26,50±3,69 vs. 19,30±4,45 del CN), de vitalidad espermática se redujo (68,90±2,33 vs. 75,50±1,90 del CN) y el de espermatozoides con membrana normal se redujo (49,40±2,50 vs. 63,90±1,90 del CN) de forma significativa. En el Grupo II, los espermatozoides morfológicamente normales se redujeron desde 96,40±1,69 del CN hasta 93,30±1,63 y la concentración espermática disminuyó a 49,80±3,62 millones/mL (de los 55,60±2,84 millones/mL del CN). Estas afecciones se incrementaron significativamente en los Grupos III y IV evidenciando un efecto acumulativo en la línea germinal espermática. A nivel de la médula ósea roja, el índice de citotoxicidad mostró diferencias significativas desde el Grupo I (0,6479±0,0153 vs. 0,9627±0,0102 del CN) y se mantuvo constante para los tratamientos restantes, la genotoxicidad mostró un efecto negativo desde el Grupo I (16,05±1,87 vs. los 3,20±1,03 del CN) que fue acumulativo y se incrementó con los tratamientos restantes. La toxicidad en la línea germinal espermática y la toxicidad en la línea eritropoyética de la médula ósea roja no mostraron correlación significativa. Por lo tanto se concluye; que el KBrO3 induce efectos tóxicos no correlacionados en ambas líneas celulares de ratones reduciendo el potencial fértil y provocando citotoxicidad y genotoxicidad en la línea eritropoyética. / The KBrO3 is an oxidant and toxic compound that is still used, despite restrictions or prohibitions. Researchs shows it as cytotoxicity, genotoxicity, mutagenicity, teratogenicity, carcinogenicity-inducing, etc; however the data obtained in the male reproductive system are insufficient to be conclusive. In order to study the effects of protracted exposures of KBrO3 in 4 moments of a complete sperm germline cycle and red bone marrow (RBM) erythropoietic line, a group of 50 mice was randomly divided in five treatment groups of 10 mice each, which were subjected to daily injections of this chemical compound, groups were: Group I: Day 7, Group II: Day 15, Group III: Day 21, Group IV: Day 35 and Group V: Negative Control (NC). For each of these groups were performed spermatogram tests according to the WHO (2012) recommended parameters and cytotoxicity and genotoxicity tests in the red bone marrow. Statistical analyses were performed using ANOVA with Tukey post hoc test in SPSS 20.0 program. The results (mean ± SD) show that the reproductive organs significantly decrease its weight in Group III. In Group I of treatment the percentage of no motile spermatozoa number was increase (26,50±3,69 vs. 19,30±4,45 from NC), sperm vitality was reduced (68,90±2,33 vs. 75,50±1,90 from NC), and the spermatozoa with normal membrane was reduced (49,40±2,50 vs. 63,90±1,90 from NC). In Group II, the morphologically normal spermatozoa was reduced to 93,30±1,63 (vs. 96,40±0,69 from NC) and sperm concentration decreased to 49,80±3,62 million per mL (vs. 55,60±2,84 million from NC), in Groups III and IV these conditions were increased significantly showing a cumulative effect on sperm germline. The red bone marrow cytotoxicity level showed significant differences from Group I (0,6479±0,0153 vs. 0,9627±0,0102 from NC) and remained constant for the remaining treatments, genotoxicity showed cumulative effect increased with treatments from group I (16,05±1,87 vs. 3,20±1,03 from NC). The toxicity in sperm germline and toxicity in red bone marrow erythropoietic line showed no significant correlation. Therefore it is concluded that KBrO3 induces toxic effects uncorrelated in both mice cells lines reducing fertility potential and causing cytotoxicity and genotoxicity in the erythropoietic line.

Los estudios llevados a cabo en el presente trabajo de Tesis Doctoral, tuvieron como objetivo general, evaluar la capacidad deletérea del herbicida flurocloridona y de dos de sus formulaciones comerciales Twin Pack Gold® y Rainbow® empleadas en el agro de nuestro país conteniendo un 25% del principio activo. Estos formulados se emplean en el tratamiento de cultivos agrícolas como algodón, apio, arveja, avena, cebada, centeno, lenteja, perejil, zanahoria, caña de azúcar, girasol, papa y trigo, entre otros. Para evaluar la toxicidad del mencionado herbicida y de sus formulaciones comerciales, se emplearon como modelo de estudio in vitro dos líneas celulares de mamífero (CHO-K1 y HepG2) y como modelo in vivo larvas del anfibio anuro Rhinella arenarum. Los efectos genotóxicos de dichos herbicidas, fueron investigados mediante el estudio de biomarcadores de efecto, analizando la frecuencia de intercambios de cromátidas hermanas (ICHs) y los ensayos cometa (EC) y de micronúcleos (MN). En la línea celular CHO-K1 todos los compuestos ensayados fueron capaces de inducir ICHs con concentraciones de 0,25-15 μg/ml. La capacidad de los compuestos para inducir ICHs fue: Twin Pack Gold® > FLC > Rainbow®. El formulado comercial Twin Pack Gold® fue el único compuesto capaz de incrementar la frecuencia de MN con la concentración de 5 μg/ml. Además, las mayores concentraciones ensayadas de ambos formulados (10-15 μg/ml) resultaron ser citotóxicas tal cual fue evidenciado a través de cambios morfológicos, pérdidas de la integridad de la membrana plasmática y alteraciones nucleares que no permitieron monitorear la frecuencia de MN. Todos los compuestos fueron capaces de inducir rupturas de cadena simple y/o sitios álcali sensibles en el ADN, evidenciado mediante la variante alcalina del EC con todas las concentraciones ensayadas. En células HepG2, al igual que en las células CHO-K1, sólo el formulado Twin Pack Gold® fue capaz de incrementar la frecuencia de MN a la concentración de 5 μg/ml, no pudiéndose monitorear la frecuencia de MN con las concentraciones de 10-15 μg/ml de ambos formulados comerciales debido a la aparición de alteraciones celulares como ocurrió en el sistema celular CHO-K1. El análisis de los compuestos estudiados evidenció que fueron capaces de inducir rupturas de cadena simple y/o sitios álcali sensibles en el ADN con todas las concentraciones ensayadas lo cual fue evidenciado mediante el análisis de los nucleoides obtenidos en el EC. Los efectos citotóxicos fueron evaluados mediante el análisis del índice de proliferación celular (IPC), el índice mitótico (IM), el índice de división nuclear (IDN), los ensayos colorimétricos de captación de Rojo Neutro y MTT (RN y MTT, respectivamente) y el estudio de muerte celular programada o apoptosis. En la línea celular CHO-K1 los resultados revelaron que el IPC decrece en función de la concentración empleada de todos los compuestos ensayados y para una concentración dada, la capacidad de ambas formulaciones comerciales de inducir un retraso en la progresión del ciclo celular siempre fue mayor que la inducción producida por el principio activo FLC. Asimismo, se observó actividad mitodepresiva ejercida tanto por el principio activo como por los formulados comerciales. Asimismo, se observó una marcada reducción de la actividad mitocondrial con las mayores concentraciones ensayadas de todos los compuestos. Cuando se realizó el ensayo de RN únicamente la formulación comercial Rainbow® ejerció efecto citotóxico a nivel lisosomal. El estudio de la viabilidad celular evidenció que los formulados comerciales resultaron ser más citotóxicos que el principio activo FLC. En células HepG2 se observó que solamente los formulados comerciales fueron capaces de inducir una alteración de la actividad mitocondrial y lisosomal. Además, se observó inducción de apoptosis cuando las células fueron expuestas durante 24 h a todos los compuestos. En sistemas in vivo, de larvas de R. arenarum, se determinó una CL5096 h con valores de 2,96 mg/L para Twin Pack Gold® y de 2,85 mg/L para Rainbow®. Sólo el formulado Rainbow® fue capaz de incrementar a las 48 h de exposición la frecuencia de MN en eritrocitos circulantes con la concentración de 0,71 mg/L. Por el contrario, ambos formulados fueron capaces de inducir efecto genotóxico con todas las concentraciones empleadas tanto a las 48 como a las 96 h de exposición evaluadas mediante el EC. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se propuso que la respuesta diferencial encontrada en cada modelo de estudio frente a los compuestos podría deberse a la presencia de xenobióticos de naturaleza desconocida presentes en el excipiente de las formulaciones comerciales, así como a variaciones en la sensibilidad diferencial de los modelos en estudio. Los resultados de los estudios de mortalidad, genotoxicidad y citotoxicidad de FLC, Twin Pack Gold® y Rainbow® obtenidos en el desarrollo de la presente Tesis Doctoral, representan una evidencia concreta de que el herbicida FLC debe ser tenido en cuenta como un agente inductor de daño genotóxico y citotóxico, y debería ser clasificado, según los valores de toxicidad aguda CL5096 h obtenidos mediante la exposición de larvas de R. arenarum a Twin Pack Gold® y Rainbow®, como compuesto tóxico (categoría II), siguiendo la clasificación propuesta por Instituciones reguladoras tales como OECD y UN. Asimismo, se sugiere la necesidad de una correcta evaluación toxicológica de FLC y de las formulaciones comerciales existentes del herbicida antes que continúen siendo aplicadas masivamente en nuestro país y en el mundo, representando un factor de riesgo para los organismos expuestos, incluyendo al ser humano. / Directores de la tesis: Sonia Soloneski y Marcelo L. Larramendy

Objective: The aim of this study was to evaluate the antibacterial effect of Physalis peruviana on Streptococcus mutans (ATCC 25175) and Streptococcus sanguinis (ATCC 10556). Materials y Methods: The present in vitro experimental study was to determinate the antibacterial effect of the fruit of Physalis Peruviana’s methanolic extract against Streptococcus mutans (ATCC 25175) and Streptococcus sanguinis (ATCC 10556) and Clorhexidine (CHX) as control group, the minimum inhibitory concentration (MIC) and citotoxicity. For the antibacterial assay, 14 wells were prepared from the extract and Clorhexidine 0.12% as a positive control for each bacteria. The method used was agar diffusion test preparing wells with the experimental solutions cultivated in anaerobic conditions for 48 hours at 37ºC, after this time, the growth inhibition was analysed in milimiters. with wells. Results: It was found antibacterial effect of the metanolic extract of the fruit in Streptococcus mutans and Streptococcus sanguinis. In the first group, the inhibicion halo of the extract was 19.15mm ± 1.83 and for Clorhexidine 25.78mm ± 2.27, while for the group of Streptococcus sanguinis, the Physalis Peruviana’s extract had 18.56mm ± 1.59 for inhibicion halos and 22.92mm ± 1.96 for Clorhexidine. On the other hand, the extract’s MIC was 50mg/ml. Finally, the methanolic extract of Physalis peruviana inhibited 50% of viability cells (CC50) at 241.01ug/ml concentration. Conclusions: The methanolic extract of Physalis Peruviana had antibacterial effect against Streptococcus mutans and Streptococcus sanguinis. Besides, this fruit wasn’t citotoxic for Jurkat’s line cell. / Objetivo: evaluar in vitro el efecto antibacteriano del extracto metanólico de Physalis peruviana sobre cepas de Streptococcus mutans (ATCC 25175) y Streptococcus sanguinis (ATCC 10556). Materiales y Métodos: el presente estudio fue de tipo experimental in vitro. Se evaluó el efecto antibacteriano del extracto metanólico del fruto de Physalis peruviana frente a cepas de Streptococcus mutans (ATCC 25175) y Streptococcus sanguinis (ATCC 10556) y la Clorhexidina (CHX) como grupo control, determinando la concentración mínima inhibitoria (CMI) y citotoxicidad. Para realizar la actividad antibacteriana se trabajó con una muestra de 14 pocillos por grupo, mediante el método de difusión en agar con pocillos. Por otro lado, para la MIC se utilizó el método de dilución en caldo en medio Brain Heart infusión Broth (BHI) y para evaluar la citotoxicidad se empleó la línea celular Jurkat mediante el ensayo de MTT. Resultados: se observaron halos de inhibición de 19.15mm ± 1.83 para el extracto de physalis peruvina y 25.78mm ± 2.27 para la clorhexidina sobre Streptococcus mutans, mientras que para el grupo de Streptococcus sanguinis, se observaron halos de inhibición de 18.56mm ± 1.59 del extracto de la planta y 22.92mm ± 1.96 para la clorhexidina. Por otro lado, la MIC del extracto fue de 50mg/ml. Finalmente, el extracto metanólico de la Physalis peruviana inhibió la viabilidad celular al 50% (CC50) en una concentración de 241.01ug/ml. Conclusiones: el extracto metanólico de Physalis Peruviana tuvo efecto antibacteriano sobre cepas de Streptococcus mutans y Streptococcus sanguinis. Además, no fue citotóxico para la línea celular Jurkat. / Tesis

Les propietats insecticides d’una sèrie d’esters d’al•lil va ésser avaluada en diferents insectes mitjançant diferents modes d’aplicació. L’acció per aplicació tòpica va variar en funció de l’ester d’al•lil aplicat. El cinamat i el naftoat d’al•lil van ser els compostos més actius front a ous i larves neonates de C. pomonella, G. molesta i L. botrana, mentre que el salicilat d’al•lil no va produir mortalitat a la major dosi assajada (10 mg/mL). El cinamat d’al•lil va ser l’únic ester actiu per aplicació tòpica en adults de A. pisum, mentre que tots els esters d’al•lil testatsvan ser actius en adults de T. castaneum. Els esters d’al•lil assajats van produir una pèrdua de la viabilitat cel•lular en les línees cel•lulars d’insectes quan va èsser mesurda mitjançant dos metodologies diferents (MTT i Blau de tripà), degut a una disrupció de les membranes cel•lulars. El cinamat d’al•lil va ser el compost més actiu i les cèl•lules procedents de l’aparell digestiu de Choristoneura fumiferana (Lepidòpter) les més sensibles. L’acció insecticida per ingestió va ser confirmada en larves de S. littoralis i C. pomonella, i en nimfes de A. pisum, senyalant l’aparell digestiu com a principal punt d’acció dels esters d’al•lil. Els corresponents àcids i dicloropropilesters van mostrar una menor o igual acció insecticida que els corresponents esters d’al•lil, deguda també, a una acció en la membrana cel•lular. Les diferències en l’acció dels compostos seria deguda a diferències en les propietats lipofíliques dels compostos i la seva interacció amb les membranes cel•lulars. Pel que fa a l’efecte dels esters d’al•lil en la comunicació química dels insectes, aquesta va tenir lloc en T. castaneum però no en A. pisum, el que es podria utilitzar per a mantenir els productes enmagatzemats lliures de T. castaneum. Pel que fa a C. pomonella i a L. botrana, tots els esters d’al•lil assajats van produir una resposta en les antenes dels mascles de C. pomonella, però tan sols el cinamat d’al•lil la va provocar en les femelles de C. pomonella i en mascles i femelles de L. botrana. Aquesta acció no es va veure reflexada en un increment de l’atracció de mascles cap a fonts amb l’ester d’al•lil i feromona en assajos en túnel de vent, però si en l’atracció de femelles. Aquest fet podria utilitzar-se per a incrementar el nombre de captures de femelles en trampes de feromona. Aquests resultats suggereixen un paper dels esters d’al•lil en el control de plagues, especialment del cinamat d’al•lil. / La acción insecticida de varios esteres de alilo fue testada en diversos insectos y mediante distintos modos de aplicación. La actividad por aplicación tópica varió en función del éster de alilo. El cinamato de alilo y el naftoato de alilo fueros los compuestos más activos en huevos y larvas neonatas de C. pomonella, G. molesta y L. botrana, mientras que el salicilato de alilo no produjo mortalidad a la dosis más alta testada (10 mg/mL). El cinamato de alilo fue el único éster activo por aplicación tópica en A. pisum mientras que todos los esteres testados lo fueron para T. castaneum. Los esteres de alilo estudiados produjeron pérdida de viabilidad celular en todas las líneas celulares de insectos cuando dicha viabilidad fue analizada mediante dos metodologías distintas (MTT y Azul de Tripano), y siendo ésta debida a la disrupción de la membrana celular. El cinamato de alilo fue el producto más activo, y las células del aparato digestivo de Choristoneura fumiferana (Lepidoptera) las más sensibles. La acción insecticida por ingestión en larvas de S. littoralis y C. pomonella, y en ninfas de A. pisum, fue confirmada y el aparato digestivo fue señalado como principal punto de acción de los esteres de alilo. Los correspondientes ácidos y dicloropropilesteres presentaron una menor o igual acción insecticida que los esteres de alilo siendo dicha acción también debida a un efecto en la membrana celular. Las diferencias en la acción de los distintos compuestos podrían ser debidas a diferencias en las propiedades lipofílicas de los compuestos y su interacción con las membranas celulares. Los esteres de alilo produjeron un efecto en la comunicación química de T. castaneum pero no en A. pisum, lo que podría utilizarse para mantener los productos almacenados libres de T. castaneum. En cuanto a C. pomonella y L. botrana, todos los esteres de alilo probados produjeron una respuesta en las antenas de los machos de C. pomonella, mientras que tan solo el cinamato de alilo la produjo en las antenas de hembras de C. pomonella y en machos y hembras de L. botrana. Esta respuesta no se tradujo en un aumento de la atracción de machos hacia cebos con mezclas de ester de alilo y feromona en ensayos de túnel de viento, pero si aumentó el número de hembras atraídas. Este hecho podría utilizarse par incrementar el número de hembras capturadas en trampas de feromona. Estos resultados, sugieren el papel de los esteres de alilo en el control de plagas, especialmente del cinamato de alilo.

Objetivos: a) General: mejorar las propiedades, biocompatibilidad y durabilidad de biomateriales dentales metálicos (BMDM) de modo que una vez instalados en la cavidad oral, beneficien la calidad de vida del ser humano. b) Específicos: estudiar la estabilidad y citotoxicidad de BMDM en medios biológicos simulados, en presencia de nuevos inhibidores orgánicos de la corrosión y comparar los resultados con los obtenidos en su ausencia. Enfoque y planificación del trabajo: Evaluar el proceso de corrosión de un bronce al aluminio de uso odontológico (ABCu) en comparación con el de su principal componente, cobre, en salivas sintéticas y en medio de cultivo de células. Estudiar el efecto citotóxico de ABCu sobre células osteoblásticas. Determinar la citogenotoxicidad de los compuestos orgánicos a utilizar como inhibidores. Evaluar la capacidad inhibidora de los compuestos orgánicos sobre la corrosión y efecto citotóxico de los materiales metálicos tratados. Datos significativos y resultados más importantes: La ABCu y el cobre estudiados presentan baja resistencia a la corrosión y efecto citotóxico. La concentración de iones liberados es mucho mayor alrededor del metal que los valores umbrales de citotoxicidad de los iones liberados al medio y no está relacionada con la composición de la aleación. De los inhibidores de la corrosión estudiados, un enjuague bucal a base de digluconato de clorhexidina y xilitol protegió eficientemente a la ABCu del ataque corrosivo, y disminuyó marcadamente la liberación de iones y en consecuencia también su efecto citotóxico. Conclusiones: Los inhibidores de la corrosión no tóxicos que aumentan la resistencia a la corrosión, disminuyen la liberación de iones hacia el medio oral y tejidos circundantes, y benefician la biocompatibilidad, favorecen el uso de ABCu disminuyendo los riesgos para el paciente odontológico. Se confirma la importancia de definir con exactitud la composición y pH de las soluciones biológicas usadas para evaluar in vitro la corrosión y biocompatibilidad de las aleaciones dentales.

Objetivo: Evaluar el efecto antibacteriano y citotóxico in vitro de los extractos metanólicos de Rubus idaeus (Frambuesa), Vaccinium myrtillus (Arándano azul) y Fragaria ananassa (Fresa) sobre cepas de Streptococcus mutans (ATCC®25175) y Streptococcus sanguinis (ATCC®10556).  Métodos: Se preparó un extracto metanólico por cada fruto. Se realizaron 10 repeticiones para cada grupo de extracto en cada caso. Se utilizó Clorhexidina al 2% como control positivo. Las propiedades antibacterianas de cada extracto se determinaron mediante el método de difusión en pozo. La concentración mínima inhibitoria (CMI) fue determinada mediante el método de microdilución y la citotoxicidad se analizó mediante la prueba de reducción de MTT, utilizando una línea celular MDCK.  Resultados: El extracto metanólico de arándano azul (Vaccinium myrtillus) tuvo el mayor efecto antibacteriano con un resultado de 30.44 ± 5.72 mm frente a Streptococcus mutans y de 29.33 ± 6.13 mm frente a Streptococcus sanguinis. Los extractos metanólicos de frambuesa, arándano azul y fresa obtuvieron una concentración mínima inhibitoria (CMI) frente a Streptococcus mutans de 0.8 µg/ml, 1.6 µg/ml y 3.1 µg/ml respectivamente; y los extractos metanólicos de arándano azul y fresa frente a Streptococcus sanguinis obtuvieron 3.1 µg/ml y 12.5 µg/ml respectivamente. Los ensayos de viabilidad celular demostraron una baja citotoxicidad de los extractos a altas concentraciones. La viabilidad celular fue más alta para los extractos de Arándano azul y Fresa con 98.2%.  Conclusiones: Los hallazgos evidencian las propiedades antibacterianas de los extractos metanólicos de Rubus idaeus (Frambuesa), Vaccinium myrtillus (Arándano azul) y Fragaria ananassa (Fresa) frente a los microorganismos previamente mencionados. No se evidenció citotoxicidad de los extractos a altas concentraciones. / Objective: Evaluate the in vitro antibacterial and cytotoxic effect of Rubus idaeus (Raspberry), Vaccinium myrtillus (Blueberry) and Fragaria ananassa (Strawberry) methanolic extracts against Streptococcus mutans (ATCC®25175) and Streptococcus sanguinis (ATCC®10556) strains. Methods: A methanolic extract was prepared for each fruit. Ten independent samples were made for each group of extract. 2% Chlorhexidine was used as a positive control. Antibacterial activity of each methanolic extract was determined by the well diffusion method. The minimum inhibitory concentration (MIC) was established by the microdilution method. Cytotoxicity was analyzed by the MTT reduction test, using a MDCK cell line. Results: The methanolic extract of blueberry (Vaccinium myrtillus) had the highest antibacterial effect with a result of 30.44 ± 5.72 mm against Streptococcus mutans and 29.33 ± 6.13 mm against Streptococcus sanguinis. The methanolic extracts of raspberry, blueberry and strawberry obtained a minimum inhibitory concentration (MIC) against Streptococcus mutans of 0.8 µg/ml, 1.6 µg/ml and 3.1 µg/ml respectively; and the methanolic extracts of blueberry and strawberry against Streptococcus sanguinis obtained 3.1 µg/ml and 12.5 µg/ml respectively. Cell viability assays demonstrated low cytotoxicity of the methanolic extracts at very high concentrations. Cell viability for blueberry and strawberry methanolic extracts was the highest with 98.2%. Conclusions: The findings evidence the antibacterial properties of methanolic extracts of Rubus idaeus (Raspberry), Vaccinium myrtillus (Blueberry) and Fragaria ananassa (Strawberry) against the previously mentioned microorganisms. The methanolic extracts didn’t show cytotoxicity at high concentrations. / Tesis

En aquesta tesi s'ha caracteritzat la ruta d'internalització de l'onconasa, una RNasa citotòxica. Els resultats indiquen que l'onconasa entra a les cèl·lules per la via dependent de clatrina i del complex AP-2. Seguidament es dirigeix als endosomes de reciclatge i es a través d'aquesta ruta que la proteïna exerceix la citotoxicitat. Per altra banda, els resultats d'aquest treball demostren que PE5, una variant citotòxica de la ribonucleasa pancreàtica humana (HP-RNasa), interacciona amb la importina  mitjançant diferents residus que tot i que no són seqüencials, es troben propers en l'estructura tridimensional d'aquesta proteïna. PM8 és una HP-RNasa amb estructura cristal·logràfica dimèrica constituïda per intercanvi de dominis N-terminals. En aquesta tesi s'han establert les condicions per estabilitzar aquest dimer en solució i també es proposa un mecanisme per la dimerització. / In this thesis it has been characterized the internalization pathway of onconase, which is a cytotoxic ribonuclease. The results show that onconase enters cells using AP-2/clathrin mediated pathway and then is routed to the recycling endosomes. In addition, the results show that this is the route used by onconase to perform its cytotoxicity. On the other hand, the results indicate that PE5, a cytotoxic human pancreatic ribonuclease (HP-RNase), interacts with importin α using different residues that although they are scattered along the sequence, they are close in the three-dimensional structure of the protein. PM8 constitutes a crystallographic dimer by the exchange of the N-terminal domains. In this thesis it has been investigated the solution conditions that favour the dimeric form and it is proposed a dimerization process of this variant. Finally, the pattern of substrate cleavage is studied by HP-RNase.

Amb la finalitat d'aprofundir en les bases moleculars de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, es van construir variants derivades de l'HP-RNasa seguint dues estratègies. En la primera, es van generar variants de l'enzim resistents a l'acció de l'inhibidor proteic de les ribonucleases (hRI), substituint residus implicats en la interfície de contacte entre la ribonucleasa i l'hRI. En la segona, es va addicionar el motiu RGD en regions de superfície de la proteïna implicades en la formació del complex amb l'hRI, a fi de promoure la seva interacció amb la membrana plasmàtica de les cèl·lules i a la vegada disminuir l'afinitat de les variants per l'hRI. Es va comprovar que només les variants portadores de substitucions múltiples adquirien la capacitat de resistència a l'hRI.L'estudi del percentatge d'inhibició de la síntesi proteica en cèl·lules incubades amb cadascuna de les variants va mostrar que només dues de les variants construïdes havien adquirit propietats citotòxiques. La citotoxicitat més elevada la va presentar una variant que no era resistent a l'hRI, amb valors que eren només entre 5 i 15 vegades inferiors als de l'onconasa. Aquest resultat demostrà que la sensibilitat a l'hRI no és necessàriament un paràmetre limitant per a la citotoxicitat de les ribonucleases. Cap de les variants que incorporava un motiu RGD presentà citotoxicitat, evidenciant que aquest motiu no és efectiu a fi de dotar les ribonucleases pancreàtiques de propietats citotòxiques.Es van estudiar les bases moleculars de la citotoxicitat de la variant més citotòxica. En primer lloc, l'anàlisi de la internalització per marcatge radioactiu d'aquesta variant en relació amb l'onconasa i amb altres variants de l'HP-RNasa no citotòxiques, va posar en evidència que només l'onconasa era internalitzada eficientment. Es descartava així la possibilitat que l'acció citotòxica de l'enzim estudiat fos conseqüència d'una major eficiència d'endocitosi. També es va comprovar que l'addició del motiu RGD no era capaç de promoure la internalització de les proteïnes amb més eficàcia. Per microscòpia confocal de fluorescència, les variants humanes només es van començar a detectar a l'interior de la cèl·lula a partir de les 24 h d'incubació.Totes les variants generades van presentar una eficiència catalítica superior al 50 % de l'activitat de la seva proteïna parental, PM5, indicant que probablement l'estructura del centre actiu no havia estat afectada de manera dràstica per les substitucions introduïdes. No obstant, en tots els casos es va produir una disminució en la termoestabilitat respecte a PM5. Aquest resultat indicà que la correlació descrita a la bibliografia entre l'increment de termoestabilitat i l'increment de citotoxicitat per les ribonucleases no sempre es compleix. Per microscòpia confocal es va comprovar que tant la proteïna més citotòxica, com una variant no citotòxica resistent a l'hRI, així com la proteïna parental, seguien la via de degradació lisosomal. Aquesta ruta de trànsit no va ser afectada per l'addició de drogues que alteren les vies de trànsit retrògrad (monensina i brefeldina A), però sí per l'addició de la bafilomicina A1, una droga que neutralitza el pH endosomal i que va actuar alentint el trànsit de les proteïnes als lisosomes. D'acord amb aquests resultats, els valors de citotoxicitat de les variants es van incrementar de manera significativa només en presència de bafilomicina A1, suggerint que les ribonucleases transloquen al citoplasma a partir d'algun punt de la via de trànsit endosomal.Es va comprovar que l'acció de la variant més citotòxica era deguda a que l'addició d'un segon motiu de tres Arg en PE5 dota a aquesta proteïna amb un senyal de transport nuclear. La fracció d'enzim que aconsegueix translocar al citoplasma a partir d'algun punt de la via endosomal previ als lisosomes, és conduït ràpidament al nucli de la cèl·lula per mitjà del mecanisme clàssic de transport actiu. Per la seva afinitat amb l'rRNA, l'enzim es concentra en el nuclèol, on probablement duu a terme la seva activitat catalítica. La interacció d'aquesta variant amb els receptors nucleocitoplasmàtics, les importines, impediria per altra banda el bloqueig de l'enzim per part de l'hRI.Els resultats obtinguts presenten una nova estratègia de disseny de ribonucleases citotòxiques, basada en l'addició de segments NLS a fi de promoure el transport nuclear dels enzims. Aquesta estratègia podria permetre superar limitacions que fins al moment han estat descrites com a limitants de la citotoxicitat de les ribonucleases pancreàtiques, com la sensibilitat a l'hRI o la baixa eficiència d'internalització. / The main objective of this thesis is to study the molecular bases of the cytotoxicity of certain ribonucleases. With the final aim to obtain cytotoxic variants derived from human pancreatic ribonuclease. For this purpose, we created variants derived from HP-RNase by using two different strategies. In the first, variants of the enzyme that were resistant to the action of the protein inhibitor of the ribonuclease (RI) were generated, replacing residues involved in the contact interfase between the ribonuclease and RI. In the second, RGD motifs were added to the surface of the proteins involved in the formation of the RI complex, with the aim of promoting their interaction with the cell plasmatic membrane, whilst at the same time decreasing the variant's affinity for RI. We showed that only variants carrying multiple substitutions acquired the capacity to resist the RI.The study of the percentage of inhibition of protein synthesis in incubated cells using each of the variants showed that only two variants had acquired cytotoxic properties. The highest level of cytotoxicity found in a non-resistant variant to RI had a value that was only 5 and 25 times lower than those registered by Onconase®. This result shows that RI sensitivity is not a limiting factor for the cytotoxicity of the ribonuclease. None of the variants which contained RGD motifs showed any sign of toxicity, suggesting that for this reason it is not effective in giving pancreatic ribonuclease cytotoxic properties.The cytotoxic molecular bases of the most cytotoxic variant were studied. Firstly by the analysis of the internalisation of this particular variant by radioactive marking in relation to Onconase and other non-cytotoxic variants of HP-RNase, which showed that only Onconase was effectively internalised. Thus the possibility that the cytotoxic action of the enzyme under observation was a result of a more efficient endocytosis was ruled out. It was also shown that the addition of the RGD motif was unable to encourage the internalisation of the proteins more effectively. Using confocal microscopy, the human variants only began to be noted inside the cell after 24 hours incubation.All the variants that were created retained a catalytic efficiency that was never less than 50 % of the catalytic activity achieved by the parent protein PM5. This suggests that the structure within the active centre had not been affected in any serious way by the introduction of the substitutions. However a decrease in thermostabilty was noted across the board with regards to PM5. This result indicates that the correlation mentioned in the bibliography between the increase of thermostability and the increase of cytotoxicity of the ribonuclease does not always exist.Using a confocal microscope, we confirmed that both the most cytotoxic protein, such as a non-cytotoxic variant resistant to RI, and the parent protein, followed the same lysosomal pathway of degradation. This outcome was unaffected by the addition of drugs which can change retrograde transit pathways (monensine and brefeldine A), but was effected by the addition of bafilomicine A1 a drug which neutralises endosomal pH and which in this case acted by slowing down the movement of proteins to lysosomes. In accordance with these results, the cytotoxicity values of the variants were significantly increased only by the presence bafilomicine A1 suggesting that the ribonuclease translocate into the cytoplasm starting from a point somewhere along the endosomal transit pathway.We confirmed that the behaviour of the most cytotoxic variant was due to the fact that the addition of a second motif of 3 Arg in PE5 endowed the protein with a nuclear transport signal. The division of the enzyme that translocates into the cytoplasm (from somewhere along the endosomal transit path before the lysosomes) is rapidly moved towards the core of the cell via the conventional mechanism for nucleus transport. Due to its affinity for rRNA, the enzyme gathers in the nucleolus, where it probably carries out its catalytic activity. On the other hand, the interaction of this variant with nucleocytoplasmatic receptors will prevent the RI from inhibiting the enzyme.These results offer a new strategy for the design of cytotoxic ribonuclease, based on the addition of NLS motifs, with the aim of encouraging the nuclear transport of enzymes. This strategy could allow one to overcome limitations that up until now have been the down-side to the cytotoxicity of pancreatic ribonuclease, such as a sensitivity for RI or the limited efficiency of internalisation.