Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The aim of this work was study the phenomenological concepts, operational and, above all, mass productivity in the crystallization of citric acid in vibrated bed, using large population of seeds (dense phase). It was used a truncated conical stainless steel crystallizer, containing a mobile central axis with coupled perforated disks, transferring vibrational energy to the crystallization environment. It was conducted a representation of the crystallization suspension environment flow of crystalline particles that illustrated the process of bed fluidization. The solution initially saturated, to its saturate temperature, was taken to the crystallization temperature 55°C, becoming supersaturated, and seeded with commercial grainy citric acid crystals. It was used as statistic toll a central composite design to construct a representative model and influence verification of process significant variables: crystallization time, a degree of supersaturation and intensity of vibration. The response analyzed was the productivity (mass percentage increase) in crystallization process. Using the model obtained, it was calculated the maximum productivity condition in mass, which consisted a percentage increase in mass of 164.7%. This condition was posteriorly tested in the experimental unit resulting in an productivity of 187.7%. The crystallizers in series simulation occurred using commercial citric acid seeds with the same final diameter of the tests using the optimized conditions, keeping other variables constant, resulting in a mass percentage increase, for the second step, of 166.9%. These showed efficiency in obtaining crystals with larger end. Was performed to evaluate the secondary nucleation by capturing the image of crystals in crystallization trials, where was noticed the appearance of small polycrystalline structures in the crystalline surface of the crystals, caused by the high degree of supersaturation, or due to the systematic separation of these / Este trabalho tem como objetivo o estudo de conceitos fenomenológicos, operacionais e, sobretudo, produtividade mássica, na cristalização de ácido cítrico em leito vibrado, utilizando grande população de sementes (fase densa). Foi utilizado um cristalizador tronco-cônico de aço inoxidável, contendo um eixo central móvel com discos perfurados acoplados, que transferiu energia vibracional ao meio de cristalização. Efetuou-se uma representação do escoamento da suspensão com as partículas cristalinas que ilustrou o processo de fluidização do leito. A solução inicialmente saturada, à respectiva temperatura de saturação, foi levada à temperatura de cristalização 55°C, tornando-se supersaturada, e semeada com cristais comerciais de ácido cítrico granular. Foi utilizado como ferramenta estatística um planejamento composto central para construção de um modelo representativo e na verificação da influência das variáveis significativas do processo: tempo de cristalização, concentração de supersaturação e intensidade de vibração. A resposta analisada foi a produtividade (aumento percentual de massa) no processo de cristalização. Através do modelo obtido, foi calculada a condição de máxima produtividade em termos mássicos, que consistiu em um aumento percentual mássico de 164,7%. Esta condição foi posteriormente testada na unidade experimental resultando em uma produtividade de 187,7%. A simulação de cristalizadores em série se deu com a utilização de sementes de ácido cítrico comercial com o mesmo diâmetro final dos testes utilizando a condição otimizada, mantendo-se as demais variáveis constantes, resultando em um aumento percentual mássico, para a segunda etapa de cristalização, de 166,9 %. Estes mostraram eficiência na obtenção de cristais com maior dimensão final. Foi realizada a avaliação da nucleação secundária através da captura de imagem dos cristais nos experimentos de cristalização, onde notou-se o aparecimento de pequenas estruturas policristalinas na superfície cristalina dos cristais, causados pelo alto grau de supersaturação, ou devido à sistemática de separação dos mesmos. / Mestre em Engenharia Química

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:44:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:59:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 07160.pdf: 4424646 bytes, checksum: 4938889fd9a885e62dfeaafc99b1274d (MD5) / Dissertacao (Mestrado Profissionalizante em Lasers em Odontologia) / IPEN/D-MPLO / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares, IPEN/CNEN-SP; Faculdade de Odontologia, Universidade de Sao Paulo

Orientador: Miriam Dupas Hubinger / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-10T19:32:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chiumarelli_Marcela_M.pdf: 1629923 bytes, checksum: abd7d32f903582ebd917ade60b7b53fe (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A manga é uma fruta largamente cultivada e consumida no Brasil, sendo exportada também 'in natura¿ para diversos países. Na forma minimamente processada, apesar da grande praticidade, as fatias podem apresentar escurecimento enzimático e mudanças desagradáveis de textura. Neste contexto, este trabalho visou estudar a vida útil de fatias de manga (Mangifera indica cv 'Tommy Atkins¿) pré-tratadas com ácido cítrico e/ou recobertas com fécula de mandioca ou alginato de sódio e estocadas a 5°C. Em testes preliminares, concentrações de 0,5% a 2% (p/v) de ácido cítrico e 1% a 3% (p/v) de fécula de mandioca foram analisadas quanto a: perda de peso, propriedades mecânicas (tensão e deformação na ruptura) e cor (L*, C* e H*). As concentrações de 0,5% de ácido cítrico e 1% de fécula de mandioca foram definidas como as melhores condições de tratamento. Na etapa subseqüente, foram analisadas as condições ótimas de tratamento associadas (ácido cítrico e cobertura de fécula de mandioca), fatias de manga imersas em solução de ácido cítrico (0,5%) com cobertura a base de alginato de sódio (concentração de 2% p/v) e a adição de 1% (p/v) de glicerol nos tratamentos com recobrimentos. As amostras com cobertura de alginato apresentaram maior perda de textura e escurecimento enzimático. As películas de fécula de mandioca foram mais eficientes na conservação dos parâmetros de qualidade das fatias de manga. Embora todas as coberturas tenham reduzido a taxa respiratória do produto, a adição de glicerol permitiu maior troca gasosa. Para o estudo de vida útil do produto, foram selecionados os tratamentos com cobertura de fécula, com e sem glicerol. O tratamento com película de fécula sem glicerol foi mais eficiente na manutenção da textura e coloração. Devido à imersão em ácido cítrico, essas amostras apresentaram maiores valores de acidez total titulável e menores valores de sólidos solúveis totais. As fatias com película de fécula de mandioca sem glicerol apresentaram boa aceitação sensorial e sua vida útil foi atestada em 15 dias. As fatias com película de fécula contendo glicerol apresentaram sabor amargo e, devido ao crescimento microbiano, obtiveram uma vida útil de 10 dias / Abstract: Mango is a widely grown and consumed fruit in Brazil, being also exported 'in natura¿ to many different countries. Fresh-cut mangoes, in spite of their practicity, may have enzymatic browning and unpleasant changes of texture. Thus, this work aimed to study the shelf-life of mango slices (Mangifera indica cv 'Tommy Atkins¿) pre-treated with citric acid and/or covered with cassava starch or sodium alginate and stored at 5°C. Preliminary tests with citric acid concentrations between 0.5% and 2% (w/v) and cassava starch from 1% to 3% (w/v) were made to quantify weight loss, mechanical properties (stress and strain at failure) and color (L*, C* and H*). The 0.5% citric acid and the 1% cassava starch concentrations were considered the best treatment conditions. In the following procedures, the best conditions for associated treatments (citric acid and cassava starch coating), mango slices dipped in citric acid solution (0.5%) with sodium alginate coating (2% w/v) and the addition of 1% (w/v) of glycerol on the coated treatments were analyzed. The samples with alginate coating showed the higher texture loss and enzymatic browning. Cassava starch coatings were more efficient in maintaining the quality parameters of the mango slices. Although all coatings have reduced the respiration rate of the product, the addition of glycerol promoted higher gas exchange. The treatments with cassava starch, with and without glycerol, were selected to the shelf-life study. The non-glycerol cassava starch treatment was more efficient in maintaining the texture and color. Due to the citric acid dipping, these samples presented higher values of titratable acidity and lower values of total soluble solids. The cassava starch coating slices without glycerol had a good sensorial acceptance and their shelf-life was attested to be of 15 days. The cassava starch coating slices containing glycerol presented a bitter taste and, due to microbiological growth, had a shelf-life of 10 days / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Para testar a hipótese de que a desmineralização in situ das superfícies de contato enxerto-leito, e a forma como o enxerto é estabilizado ao leito, podem influenciar os mecanismos envolvidos na consolidação do enxerto, fragmentos ósseos de 10 mm de diâmetro foram removidos das metáfises proximais tibiais de 36 coelhos (Oryctolagus Cuniculus) e transplantados para uma área adjacente. Na tíbia esquerda dos animais, as superfícies de contato do enxerto e do leito hospedeiro foram desmineralizadas com ácido cítrico pH 1,0 por 3 minutos antes dos enxertos serem fixados ao leito. Na tíbia direita, o transplante do bloco ósseo não foi precedido de desmineralização. Metade dos enxertos foi imobilizada sobre o leito pela superposição de uma membrana não reabsorvível de politetrafluoretileno colada com cianoacrilato ao leito à distância da interface enxerto-leito. A outra metade dos enxertos foi fixada por um parafuso de titânio no centro do enxerto. Assim, foram formados 4 grupos de estudo: membrana (M), membrana + ácido (MA), parafuso (P) e parafuso + ácido (PA). Três animais de cada grupo forneceram espécimes para análise microscópica quantitativa e qualitativa aos 15, 30 e 45 dias de pós-operatório. A análise qualitativa demonstrou que não houve formação óssea na interface em nenhum espécime aos 15 dias e que nos demais períodos, em todos os grupos, a quantidade de tecido ósseo neoformado na interface e seu estágio de maturação aumentaram com o tempo. Ambos os métodos de fixação empregados foram eficientes em manter os enxertos em posição, porém a membrana promoveu menor reabsorção da estrutura do enxerto. A análise quantitativa computadorizada revelou que, aos 30 dias, os grupos MA e PA apresentaram maior área de formação óssea na interface (71,34 ± 12,03%; 56,74 ± 2,15% respectivamente) em relação aos grupos M e P (51,75 ± 11,02%; 43,95 ± 4,05% respectivamente) e superfícies de consolidação óssea mais extensas (93,41 ± 5,95%; 93,73 ± 4,96% respectivamente) do que os grupos sem tratamento ácido (73,49 ± 7,7%; 73,77 ± 11,77% respectivamente para M e P), sendo essas diferenças estatisticamente significantes (p<0,05). Aos 45 dias de pós-operatório, os grupos MA e PA (71,18 ± 8,9%; 58,97 ± 3,97% respectivamente) apresentaram resultados superiores aos grupos M e P (59,78 ± 11,28%; 46,08 ± 3,53% respectivamente) em relação à área de neoformação óssea na interface, porém essa diferença não foi significativa. Concluiu-se que a desmineralização ácida das superfícies contactantes nos enxertos ósseos autógenos em bloco na tíbia de coelhos promoveu a osteogênese na interface enxerto-leito e acelerou a consolidação dos enxertos. Além disso, quando o tratamento ácido foi associado ao uso de membrana como método de fixação, a consolidação e grau de reabsorção óssea foram otimizados. / In order to test the hypothesis that the demineralization \"in situ\" of contacting surfaces of bone graft/bone bed and the fixation method used for graft stabilization can influence the mechanisms involved in the consolidation of the graft, bone fragments of 10 mm in diameter were removed from the proximal tibial metaphysis of thirty-six male rabbits (Oryctolagus Cuniculus) and transplanted to an adjacent area. In the left tibia of the animals, the contacting surfaces of the graft and host bed were demineralized with citric acid pH 1.0 for 3 minutes before the grafts were fixed to the receptor bed. In the right tibia, the bone block transplantation was not preceded by demineralization. Half of the grafts were immobilized on the bone bed by a nonresorbable polytetrafluoroethylene membrane glued with cyanoacrylate adhesive to the host bed distant from the bone graft-bone bed interface. The other half of the grafts were fixed by a titanium screw in the center of the graft. Thus, four groups were formed: membrane (M), membrane + acid (MA), screw (P) and screw + acid (PA). Three animals from each group provided specimens for quantitative and qualitative microscopic analysis at 15, 30 and 45 days postoperatively. Qualitative analysis showed no significant bone formation at the interface in any specimen of the groups at 15 days and on the other periods in all groups, the amount of newly formed bone at the interface as well as the stage of bone maturation increased with time. Both fixation methods were effective in maintaining the graft in position, but the membrane resulted in less resorption of the graft. Quantitative analysis, performed by means of a computer program for image analysis, showed that at day 30, groups MA and PA, showed greater area of bone formation at the interface (71.34 ± 12.03%; 56.74 ± 2 15%) than groups M and P (51.75 ± 11.02%, 43.95 ± 4.05%) and more osseointegrated bone surfaces (93.41 ± 5.95%, 93.73 ± 4.96%) than those without acid treatment (73.49 ± 7.7%, 73.77 ± 11.77%), and these differences were statistically significant. At 45 days postoperatively MA and PA groups (71.18 ± 8.9%, 58.97 ± 3.97%) showed better results than the M and P groups (59.78 ± 11.28%, 46 , 08 ± 3.53%) compared to the area of new bone formation at the interface and osseointegrated surfaces, but these differences were not significant. It was concluded that the acid demineralization of contacting surfaces in autogenous onlay bone grafts in the tibia of rabbits promotes osteogenesis in bone graft-host bed interface and accelerates the consolidation of the grafts. Furthermore, the association of this surface treatment to the use of membrane/cyanoacrylate fixation method, optimizes the results regarding consolidation and degree of bone graft resorption.

Realizaram-se estudos potenciostáticos e potenciodinâmicos do comportamento eletroquímico do estanho em meio ácido de perclorato de sódio desaerado, com adições sistemáticas de ácido cítrico. Paralelamente aos ensaios eletroquímicos acompanhou-se o estado superficial do eletrodo com microscópio de luz refletida e microscópio eletrônico de varredura (SEM). Foi constatada, inicialmente, a ocorrência da redução do perclorato em presença do eletrodo de estanho. A redução do perclorato de sódio 0,5 M no eletrodo de estanho ocorre durante catodizações em meio ácido, no intervalo de potenciais de -0,7 V a -1,3 V; sendo que a presença do óxido facilita a redução. A geração de CI- deve ocorrer após a redução do cloreto básico de estanho. A presença do ácido cítrico reduz, mas não inibe completamente, a formação de cloreto, e causa a formação de uma camada de óxido que contém átomos de estanho e cloro. O potencial crítico de corrosão foi determinado em meio de perclorato de sódio 0,5 M, no intervalo de pH de 1,0 a 4,0. Os resultados obtidos mostraram que o tipo de corrosão depende do pH. Em pH 3,0 e 4,0, a formação de pite é antecedida pela formação de uma camada de óxido, que pode ser descrita por um modelo de dissolução-precipitação. A nucleação e o crescimento dos pites envolvem uma série de contribuições de corrente: corrente de formação do óxido, corrente de nucleação instantânea e corrente de nucleação progressiva. A formação dos pites, em pH=4,0, ocorre em duas etapas: nucleação instantânea tridimensional seguida de crescimento controlado por difusão hemisférica (nucleação progressiva). A presença de cloreto agrava a corrosão do estanho com e sem a presença de ácido cítrico. A concentração mínima do ácido orgânico para inibir a corrosão por pite do estanho em CIO4- 0,5 M é de 10-2 M, para o intervalo de pH estudado. A influência de adições sistemáticas de ácido cítrico no perfil potenciodinâmico do estanho foi observada. A concentração mínima do ácido orgânico para modificar a curva I/E do estanho em CIO4- 0,5 M é de 10-2 M, para o intervalo de pH estudado. A presença do ácido orgânico causa a formação de óxidos mais estáveis que são detectados em dois picos de corrente. No primeiro ocorre a oxidação de espécies adsorvidas de acordo com o modelo de Srinivasan e Gileadi. No segundo, ocorre a oxidação de espécies em solução onde a formação do filme pode ser descrita pelo modelo de Muller e Calandra. / Potentiodynamic and potentiostatic studies of the electrochemical behaviour of tin in sodium perchlorate deaerated, with and without citric acid, were carried out. Besides the electrochemical experiments, the electrode surface was investigated by scanning electron microscopy (SEM) and by a metallographic microscope. The electrochemistry of tin in sodium perchlorate has been found unexpectediy to be complicated by the reduction of the perchlorate anion. The reduction process has been shown to take place through a potential region comprising the negative side of the double layer region and the positive side of the hydrogen region (-0,7 V &#8804; E &#8804; -1,3 V). The presence of oxide on the electrode surface favours the reduction. The reduction may occur in two steps: the formation of basic tin chloride followed by its reduction, producing CI-. The presence of citric acid reduces, but don\'t inhibits completely, the formation of chloride, during reduction, and induces the growth of an oxide layer which contains Sn and CI atoms. The breakdown potential was determined in sodium perchlorate 0,5 M in the pH range from 1,0 to 4,0. The results showed that the type of corrosion - pitting or general corrosion - depends on pH. At pH 3,0 and 4,0 the pit initiation is preceeded by the formation of an oxide layer, described by a dissolution-precipitation model for metal passivation. Pit nucleation and growth involve a number of contributions which were distinguished through the analysis of current transients at constant potentials. At pH 4,0, pit growth occurs in two steps and can, in principie, be described by instantaneous nucleation followed by progressive nucleation. The inhibiting effect of citric acid on pitting corrosion is recognized by the shift of the breakdown potentials to more positive values. The minimum concentration of the organic acid to inhibit pitting of tin is 10-2 M. The influence of systematic additions of citric acid on the potentiodynamic profile of tin in NaCIO4 0,5 M was observed. The minimun concentration of the organic acid to change the I/E curves is 10-2 M, in the pH range from 1,0 to 4,0. The scan rate dependence in the potential region of formation and reduction of the film showed that in a first stage adsorption occurs, according to Srinivasan and Gileadi\'s model. In the second stage, the v1/2 dependence found can be explained by ohmic resistance control, on the basis of Muller\'s passivation model.

Este trabalho objetivou caracterizar os danos pós-colheita em frutos de laranja &#39;Valência&#39; e de tangor &#39;Murcott&#39;, destinados à exportação, e em frutos de laranjas &#39;Pêra&#39;, &#39;Lima&#39; e &#39;Natal&#39; e de tangor &#39;Murcott&#39;, destinados ao mercado interno, após diferentes etapas do beneficiamento em packinghouse, em 2004 e 2005 e na Ceagesp-SP em 2006; identificar os pontos críticos e a magnitude de impacto em linhas de beneficiamento de citros dos packinghouses; e caracterizar a micoflora ambiental nos packinghouses e nos pontos de revenda de atacadistas da Ceagesp, assim como a micoflora da superfície de equipamentos e instalações e a presença de isolados de Penicillium spp. resistentes a fungicidas nos packinghouses. Frutos cítricos foram coletados na chegada ao packinghouse, após a pré-lavagem, após o desverdecimento, na banca, no palete e na Ceagesp, e armazenados durante 14 a 21 dias a 25&#176;C e 85-90% de UR. A incidência de injúrias foi avaliada visualmente a cada três dias. Para a avaliação da magnitude de impactos nos pontos de transferência da linha de beneficiamento empregou-se uma esfera instrumentada com registrador de aceleração (G). A micoflora ambiental foi amostrada mediante o método gravimétrico, com placas de Petri, contendo meio batata-dextrose-ágar, abertas por dois minutos. A micoflora de superfície de equipamentos e instalações foi amostrada mediante placas Rodac. Observou-se baixa incidência (<3,5%) de podridões nos frutos destinados à exportação. As principais podridões encontradas em laranja &#39;Valência&#39; e tangor &#39;Murcott&#39; foram a podridão peduncular de Lasiodiplodia e a antracnose, respectivamente. Nos frutos para o mercado interno a incidência de podridões atingiu valores médios entre 12,8% e 36,2%, ao final do armazenamento, sendo o bolor verde a principal doença pós-colheita nos diferentes frutos cítricos. As injúrias mecânicas de oleocelose foram crescentes com o beneficiamento até a banca de embalagem e a aplicação de cera reduziu a incidência de frutos murchos. Na avaliação dos impactos na linha de beneficiamento do packinghouse de exportação, 95% dos impactos variaram entre 30-95 G. Já no packinghouse de mercado interno, 94% dos impactos variaram entre 24-131 G. A população fúngica no ambiente e na superfície do packinghouse de exportação foi de 12,3 e 52,3 ufc/placa, respectivamente, enquanto a população fúngica no packinghouse de mercado interno foi de 46,3 e 68,2 ufc/placa, respectivamente. Posição intermediária aos packinghouses foi observada na Ceagesp, com uma população fúngica ambiental de 25,3 ufc/placa. Cladosporium e Penicillium foram os gêneros fúngicos mais abundantes. A contaminação de &#34;zonas limpas&#34; nos packinghouses (lavagem dos frutos, banca, caixa e contêiner) não foi substancialmente menor que nas &#34;zonas sujas&#34; (recepção dos frutos e primeira seleção). A porcentagem de isolados de P. digitatum resistentes a tiabendazol foi de 25,9 no ambiente e de 30,1 na superfície do packinghouse de exportação, enquanto que para imazalil foi de 1,5 no ambiente e de 16,0 na superfície. No packinghouse de mercado interno, a porcentagem de isolados de P. digitatum resistentes a tiabendazol foi de 51,9 no ambiente e de 39,2 na superfície, enquanto que para imazalil foi de 0,1 e 0,9, respectivamente. / The purposes of this work were a) to characterize postharvest injuries in &#39;Valência&#39; oranges and &#39;Murcott&#39; tangors aimed at the external market, and in &#39;Pêra&#39;, &#39;Lima&#39;, &#39;Natal&#39; oranges and &#39;Murcott&#39; tangors aimed at the internal market after different processing stages in a packinghouse in 2004 and 2005, and at Ceagesp-SP in 2006; b) to identify critical points and impact extent on processing lines in packinghouses; c) to characterize the environmental mycoflora in packinghouses and in retail points at Ceagesp; d) to characterize the superficial mycoflora of equipment and facilities, and e) to characterize the presence of isolated Penicillium spp. resistant to fungicides in packinghouses. Fruits were collected at the packinghouse, at their arrival, after pre-washing and degreening, from the packing table, from the pallet and at Ceagesp. They were stored for 14 to 21 days at 25&#176;C and 85-90% RH. The incidence of injuries was visually evaluated every three days. An instrumented sphere with acceleration register (G) was used to evaluate the extent of impacts at the transference points of the citrus processing line. The environmental mycoflora was sampled according to the gravimetric method, using Petri dishes containing potato-dextrose-agar medium opened for two minutes. The superficial mycoflora on equipment and facilities was sampled with Rodac plates. There was low rot incidence (under 3.5%) in fruits aimed at the external market. The main disease affecting &#39;Valência&#39; oranges and &#39;Murcott&#39; tangors were Lasiodiplodia stem-end rot and anthracnose, respectively. Rots averaged between 12.8% and 36.2% at the end of the storage period in fruits aimed at the internal market, and green mold was the main postharvest disease. Oleocellosis increased along the processing stages until the arrival of fruits at the packing table. Wax application reduced the incidence of wilted fruits. Ninety-five percent of the impacts in the packinghouse processing line in fruits aimed at the external market ranged between 30 and 95 G, while 94% of the impacts in fruits aimed at the internal market ranged between 24 and 131 G. The environmental and the packinghouse superficial fungal population in fruits aimed at the external market were 12.3 and 52.3 cfu/plate, respectively, while these populations in fruits aimed at the internal market were 46.3 and 68.2 cfu/plate, respectively. Intermediate values in relation to packinghouses were observed at Ceagesp, where the environmental fungal population was 25.3 cfu/plate. Cladosporium and Penicillium were the most prevailing genera of fungi. The contamination of &#34;clean zones&#34; in the packinghouses (washing of fruits, packing table, boxes and containers) was not substantially lower than contamination in &#34;dirty zones&#34; (reception of fruits and first selection). The percentage of P. digitatum isolates resistant to thiabendazole was 25.9 in the environment and 30.1 on the packinghouse surface for fruits aimed at the external market, while the corresponding data concerning isolates resistant to imazalil were 1.5 and 16.0, respectively. In the packinghouse of fruits aimed at the internal market, the percentage of isolates of P. digitatum resistant to thiabendazole was 51.9 in the environment and 39.2 on the packinghouse surface, while the corresponding data concerning isolates resistant to imazalil were 0.1 and 0.9, respectively.

Microrganismos endofíticos são aqueles, cultiváveis ou não, que habitam o interior da planta hospedeira sem causar danos aparentes, podendo ou não apresentar estruturas externas visíveis. Esta interação endófito-planta é intrínseca a determinadas espécies de plantas e/ou bactérias. Embora bactérias do gênero Curtobacterium sejam normalmente estudadas como fitopatógenas, este grupo vem sendo isolado como endófito de diferentes espécies vegetais, tais como citros, trevo, arroz, batata, milho, olmeiro, café e álamo. Tais bactérias vem sendo estudada no controle de doenças em pepino, batata e fumo, na promoção de crescimento, interagindo com bactérias promotoras de crescimento (PGPR) e fitopatógenas. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi estudar a variabilidade genética e fisiológica de Curtobacterium sp. isolados endofiticamente de citros, por meio das técnicas moleculares ARDRA, RAPD, AFLP e sequenciamento do gene 16S rRNA, além de características fisiológicas (coloração da colônia, fitopatogenicidade e perfil enzimático). Além dos isolados endofíticos de citros, foram utilizados isolados endofíticos e fitopatogênicos de diversas culturas proveniente de diferentes regiões do Brasil e outros países. Embora a coloração das colônias seja uma característica altamente variável, foi observada correlação, onde os isolados endofíticos de citros apresentaram coloração variando de alaranjado a róseo, enquanto os outros isolados analisados apresentaram coloração amarelada e creme. A análise por ARDRA possibilitou a formação de 4 ribotipos (A, B, C e D), sendo que todos os fitopatógenos foram agrupados no ribotipo D. As análises de variabilidade por meio do RAPD e AFLP permitiram a separação dos isolados bacterianos em 2 grupos principais, endófitos e fitopatógenos, além de mostrar grande variabilidade dentro do grupo de isolados endofíticos de citros. De acordo com os resultados do sequenciamento do gene 16S rRNA, os isolados endofíticos de citros foram agrupados separadamente das demais espécies analisadas. Os resultados do presente estudo demonstram que os isolados endofíticos de citros apresentam genótipo divergente, sugerindo que estes isolados possam pertencer a uma nova espécie ou subespécie de Curtobacterium. / The endophytic microorganisms are those, cultivated or not, that inhabit the interior of the plant host without causing apparent damages, presenting or not visible external structures. This interaction microorganisms-plant is specific to certain species of plants and/or bacteria. Although bacteria from genus Curtobacterium genus are normally studied as phytopathogens, this group has been isolated as endophytes from several plants, such as citrus, potato, rice, maize, coffee, elm trees, red clover and poplar. Also, this bacterium has been associated to disease biocontrol in tobacco, cucumber and potato; influencing host growth or interacting with plant growth-promoting rhizobacteria and other phytopathogenic bacteria. Therefore, the aim of this study was to evaluate the genetic and physiological variability of citrus endophytic strains of Curtobacterium by physiological traits (colony color, pathogenicity and enzymatic profile), as well as molecular techniques, such as ARDRA, RAPD, AFLP and 16S rRNA gene sequencing. In the present study endophytic and phytopathogenic strains from many different plants and regions around the world were used. Although the colony color is a high variable character, correlation was observed, since phytopathogenic strains presented yellow and ivory colors, while endophytes from citrus presented orange and pink colors. Four ARDRA profile (A, B, C, D) were observed in the evaluated population, being all phytopathogenic strains include in the ribotype D. The RAPD and AFLP analysis allocated the endophytes and phytopathogens in two different major groups, besides a high variability inside citrus endophytes cluster. According to 16S rRNA gene sequence analysis, citrus endophytic were clustered in a different group of others Curtobacterium strains. The results of the present study demonstrated that the citrus endophytic strains is a divergent genotype, suggesting that citrus endophytic strains could belong to a new Curtobacterium species or subspecies.

O presente trabalho foi subdividido em quatro capítulos com os seguintes objetivos: (i) elaborar uma minuciosa revisão de literatura abordando os principais aspectos da interação viróide-hospedeiro e as relações evolutivas dos viróides e virusóides; (ii) identificar e caracterizar viróides associados a videiras, no Brasil; (iii) purificar, clonar e caracterizar, um RNA circular de seqüência totalmente desconhecida; (iv) estudar alguns aspectos relacionados à interação viróidehospedeiro. Inicialmente, foram identificadas e caracterizadas duas espécies de viróides (o Citrus exocortis viroid CEVd e o Hop stunt viroid, HSVd) isolados de videiras no Brasil. Para tal, promoveu-se extração de RNAs totais de folhas de Vitis vinifera &#145;Cabernet Sauvignon&#146; e V. labrusca &#145;Niagara Rosada&#146;, seguida de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados e seqüenciados. Os resultados revelaram que as videiras estavam duplamente infectadas com o CEVd e HSVd. As análises filogenéticas mostraram que os clones de HSVd de videira agruparam-se com outros variantes de videira, formando um grupo separado de um segundo formado por variantes de citros. Já os clones de CEVd de videira agruparam-se com isolados de citros e videira. No capítulo 3, empregou-se um método para a clonagem e caracterização de um pequeno RNA circular (com aproximadamente 300 nucleotídeos) de seqüência totalmente desconhecida. Este RNA, quando submetido à eletroforese dupla em géis de poliacrilamida desnaturantes, apresentou um retardamento na migração, similar aos viróides. Após a clonagem de fragmentos do RNA, amplificados via RTPCR com oligonucleotídeos aleatórios (apresentando seis nucleotídeos degenerados no terminal 3&#145),os clones obtidos foram seqüenciados. A partir desses dados, dois oligonucleotídeos adjacentes de polaridades opostas foram desenhados e empregados para amplificar via RT-PCR a seqüência completa do RNA circular. A análise das seqüências revelou a presença da CCR (central conserved region) do Apple scar skin viroid (ASSVd), espécie tipo do gênero Apscaviroid, e compartilha similaridade com outros membros deste gênero, o que sugere fortemente que o RNA circular é um viróide recombinante. Finalmente, no capítulo 4, foram realizados experimentos que comprovaram a existência do motivo loop E (presente na CCR de algumas espécies dos Pospiviroidae) in vivo no PSTVd. Demonstrou-se também, utilizando ensaios de união in vitro (análise de retardo em gel, EMSA e entrecruzamento com luz ultravioleta), que as proteínas L5 e TFIIIA de Arabidopsis thaliana se unem especificamente ao PSTVd com a mesma afinidade que elas se unem ao seu substrato natural, o rRNA 5S, enquanto que a afinidade por um viróide cloroplástico (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) foi significativamente menor. Estas duas proteínas devem participar na síntese e movimento intracelular do PSTVd in vivo. / The present work has been divided into four chapters to: (i) review the main points in viroid-host interactions and present different aspects in the evolutionary relationship of the viroids and virusoids; (ii) identify and characterize viroids infecting grapevine in Brazil; (iii) purify, clone and sequence what appears to be a novel citrus viroid; (iv) study some aspects related to the viroid-host protein interactions. Firstly, two viroid species (Citrus exocortis viroid, CEVd and Hop stunt viroid, HSVd) were identified and characterized from grapevine in Brazil. Total RNAs, extracted from leaves of Vitis vinifera &#145;Cabernet Sauvignon&#146; and V. labrusca &#145;Niagara Rosada&#146;, were RT-PCR amplified with specific primers for the five viroids described infecting grapevines. The resulting products were separated by agarose gel electrophoresis and the DNA fragments of the expected full-size were eluted, cloned and sequenced. The grapevines analyzed were doublyinfected by CEVd and HSVd. A phylogenetic analysis showed that the Brazilian grapevine HSVd variants clustered with other grapevine HSVd variants forming a specific group separated from citrus variants, whereas the Brazilian CEVd variants clustered with other citrus and grapevine variants. On the other hand, a method for cloning small circular RNAs of unknown sequence has been applied to an RNA of this kind from citrus (with ca. 300 nucleotides). This RNA, when analyzed by PAGE in denaturing conditions, showed the slow mobility typical of viroid RNAs. After denaturation, the purified RNA was RT-PCR amplified using a primer with six randomized positions at its 3? terminus, with the resulting products being then cloned and sequenced. From these data, two adjacent primers of opposite polarities were designed and used to RT-PCR amplify the complete sequence. Analysis of the sequences revealed the presence of the CCR (central conserved region) of the Apple scar skin viroid (ASSVd), the type member of the genus Apscaviroid, and scattered similarities with other members of this genus, suggesting that the circular RNA is a viroid recombinant. Finally, UV irradiation of infected tissue has revealed the existence in vivo of an RNA motif (loop E) in Potato spindle tuber viroid (PSTVd), the type member of the family Pospiviroidae (nuclear viroids), and RNA-protein binding followed by eletrophoretic mobility shift (EMSA) and UV cross-linking label transfer assays have shown that transcription factor IIIA (TFIIIA) and L5 ribosomal protein from Arabidopsis thaliana bind this RNA in vitro with the same affinity as they bind 5S rRNA, whereas the affinity for a chloroplastic viroid (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) is significantly lower. These two proteins may participate in synthesis and delivery of PSTVd in vivo.

Orientador: Cínthia Pereira Machado Tabchoury / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T16:55:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Romao_DayseAndrade_M.pdf: 1484114 bytes, checksum: 22ae5951c7308f4697935396ac72aaeb (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Modelos in vitro devem mimetizar situações próximas das condições reais, entretanto poucos modelos para avaliar erosão em esmalte dentário nestas condições são encontrados na literatura, além de apresentarem algumas limitações. Assim, o objetivo do presente estudo foi validar um modelo de ciclagens erosivas que simule os episódios de erosão/exposição do esmalte dental à saliva, avaliando o efeito dose-resposta para soluções de ácido cítrico com diferentes valores de pH. O modelo de ciclagens erosivas de pH teve uma duração de 5 dias, de forma que blocos de esmalte bovino, selecionados quanto à dureza de superfície e análise de perfilometria, foram imersos em saliva humana estimulada por 1 h a 37ºC sob agitação (100 rpm) antes do primeiro desafio erosivo de cada dia para formação de película adquirida. Em seguida os blocos dentais foram tratados 4 vezes ao dia com a solução de tratamento (2,5 mL/mm2 de área exposta de esmalte dental) sob agitação (100 rpm) por 1 min e nos intervalos entre os tratamentos e durante à noite, os blocos foram imersos em saliva artificial a 37?C sem agitação. Para avaliação do modelo quanto ao efeito dose-resposta ao pH, os blocos (n=12) foram tratados com as seguintes soluções: G1 - cacodilato pH 7,0 (controle); G2 - ácido cítrico pH 2,5; G3 - ácido cítrico pH 3,5; G4 - ácido cítrico pH 4,5; G5 - ácido cítrico pH 5,5; G6 - ácido cítrico pH 7,0. Todas as soluções foram preparadas na concentração de 47,6 mM. Diariamente, ao final da ciclagem e após a imersão na saliva artificial durante à noite, os blocos foram avaliados quanto à dureza de superfície para cálculo da porcentagem de perda de dureza de superfície (%PDS) e ao final do experimento a análise perfilométrica foi novamente realizada. Os resultados foram submetidos à análise de variância e teste de Tukey(p<0,05). Os resultados ao final da ciclagem mostraram que houve um aumento crescente da %PDS em função dos dias na maioria dos grupos e que os blocos tratados com solução de pH 2,5 apresentaram a maior %PDS (p<0,05). Na comparação entre grupos os resultados demonstram que no 4o dia de ciclagem foram verificadas diferenças significativas entre todos os grupos (p<0,05). Já os resultados após saliva apresentaram menores valores de %PDS quando comparados àqueles após ciclagem. Quanto à perfilometria, os blocos dentais tratados com soluções de pH 2,5 e 3,5 apresentaram as maiores perdas de superfície, diferindo entre si e dos demais grupos (p<0,05). Conclui-se que o estudo proposto permitiu a validação de um modelo de ciclagens erosivas que demonstrou efeito dose-resposta para erosão inicial de esmalte dentário após exposição a diferentes valores de pH / Abstract: In vitro models should mimic situations close to the real conditions, however, few models to assess tooth enamel erosion in these conditions are found in the literature, besides presenting some limitations. Thus, the objective of this study was validate a model that simulates cycling episodes of erosion/exposure of dental enamel to saliva, evaluating the dose-response effect for citric acid solutions with different pH values. The model of erosive cycling lasted 5 days, and bovine enamel blocks, selected according to the surface hardness and surface profilometry analysis, were immersed in stimulated human saliva for 1 h at 37°C under agitation (100 rpm) before the first erosive challenge in each day for salivary pellicle formation. Then the dental blocks were treated 4 times daily with the treatment solution (2.5 mL/mm2 per area of exposed enamel) under stirring (100 rpm) for 1 min and in the intervals between treatments and during the nigth the blocks were immersed in artificial saliva at 37?C without stirring. To evaluate the model with regard to the dose-response to pH, blocks (n = 12) were treated with the following solutions: G1 - cacodylate pH 7.0 (control), G2 - citric acid pH 2.5, G3 - acid citric pH 3.5; G4 - citric acid pH 4.5; G5 - citric acid pH 5.5; G6 - citric acid pH 7.0. All the solutions were prepared in a concentration of 47.6 mM. Daily, at the end of the cycling and after immersion in artificial saliva during the night, the blocks were evaluated for surface hardness to calculate the percentage of surface hardness loss (%SHL) and at the end of the experiment profilometry analysis was performed again. The results were submitted to ANOVA and Tukey's test (p<0.05). The results showed a gradual increase in the %SHL at the end of the cycling model as a function of days in most of the groups and the blocks treated with pH 2.5 solution showed the highest %SHL (p<0.05). In the comparison of the groups, the results showed in the 4th cycling day significant differences among all groups (p<0.05). The results after saliva exposure showed lower %SHL when compared to those after cycling. Regarding profilometry, dental blocks treated with solutions pH 2.5 and 3.5 showed the highest surface losses, differing from each other and from the other groups (p<0.05). In conclusion, the proposed study allowed the validation of an erosive cycling model that demonstrated dose-response effect for early tooth enamel erosion after exposure to different pH values / Mestrado / Cariologia / Mestra em Odontologia

O presente trabalho foi subdividido em quatro capítulos com os seguintes objetivos: (i) elaborar uma minuciosa revisão de literatura abordando os principais aspectos da interação viróide-hospedeiro e as relações evolutivas dos viróides e virusóides; (ii) identificar e caracterizar viróides associados a videiras, no Brasil; (iii) purificar, clonar e caracterizar, um RNA circular de seqüência totalmente desconhecida; (iv) estudar alguns aspectos relacionados à interação viróidehospedeiro. Inicialmente, foram identificadas e caracterizadas duas espécies de viróides (o Citrus exocortis viroid CEVd e o Hop stunt viroid, HSVd) isolados de videiras no Brasil. Para tal, promoveu-se extração de RNAs totais de folhas de Vitis vinifera &#145;Cabernet Sauvignon&#146; e V. labrusca &#145;Niagara Rosada&#146;, seguida de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados e seqüenciados. Os resultados revelaram que as videiras estavam duplamente infectadas com o CEVd e HSVd. As análises filogenéticas mostraram que os clones de HSVd de videira agruparam-se com outros variantes de videira, formando um grupo separado de um segundo formado por variantes de citros. Já os clones de CEVd de videira agruparam-se com isolados de citros e videira. No capítulo 3, empregou-se um método para a clonagem e caracterização de um pequeno RNA circular (com aproximadamente 300 nucleotídeos) de seqüência totalmente desconhecida. Este RNA, quando submetido à eletroforese dupla em géis de poliacrilamida desnaturantes, apresentou um retardamento na migração, similar aos viróides. Após a clonagem de fragmentos do RNA, amplificados via RTPCR com oligonucleotídeos aleatórios (apresentando seis nucleotídeos degenerados no terminal 3&#145),os clones obtidos foram seqüenciados. A partir desses dados, dois oligonucleotídeos adjacentes de polaridades opostas foram desenhados e empregados para amplificar via RT-PCR a seqüência completa do RNA circular. A análise das seqüências revelou a presença da CCR (central conserved region) do Apple scar skin viroid (ASSVd), espécie tipo do gênero Apscaviroid, e compartilha similaridade com outros membros deste gênero, o que sugere fortemente que o RNA circular é um viróide recombinante. Finalmente, no capítulo 4, foram realizados experimentos que comprovaram a existência do motivo loop E (presente na CCR de algumas espécies dos Pospiviroidae) in vivo no PSTVd. Demonstrou-se também, utilizando ensaios de união in vitro (análise de retardo em gel, EMSA e entrecruzamento com luz ultravioleta), que as proteínas L5 e TFIIIA de Arabidopsis thaliana se unem especificamente ao PSTVd com a mesma afinidade que elas se unem ao seu substrato natural, o rRNA 5S, enquanto que a afinidade por um viróide cloroplástico (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) foi significativamente menor. Estas duas proteínas devem participar na síntese e movimento intracelular do PSTVd in vivo. / The present work has been divided into four chapters to: (i) review the main points in viroid-host interactions and present different aspects in the evolutionary relationship of the viroids and virusoids; (ii) identify and characterize viroids infecting grapevine in Brazil; (iii) purify, clone and sequence what appears to be a novel citrus viroid; (iv) study some aspects related to the viroid-host protein interactions. Firstly, two viroid species (Citrus exocortis viroid, CEVd and Hop stunt viroid, HSVd) were identified and characterized from grapevine in Brazil. Total RNAs, extracted from leaves of Vitis vinifera &#145;Cabernet Sauvignon&#146; and V. labrusca &#145;Niagara Rosada&#146;, were RT-PCR amplified with specific primers for the five viroids described infecting grapevines. The resulting products were separated by agarose gel electrophoresis and the DNA fragments of the expected full-size were eluted, cloned and sequenced. The grapevines analyzed were doublyinfected by CEVd and HSVd. A phylogenetic analysis showed that the Brazilian grapevine HSVd variants clustered with other grapevine HSVd variants forming a specific group separated from citrus variants, whereas the Brazilian CEVd variants clustered with other citrus and grapevine variants. On the other hand, a method for cloning small circular RNAs of unknown sequence has been applied to an RNA of this kind from citrus (with ca. 300 nucleotides). This RNA, when analyzed by PAGE in denaturing conditions, showed the slow mobility typical of viroid RNAs. After denaturation, the purified RNA was RT-PCR amplified using a primer with six randomized positions at its 3? terminus, with the resulting products being then cloned and sequenced. From these data, two adjacent primers of opposite polarities were designed and used to RT-PCR amplify the complete sequence. Analysis of the sequences revealed the presence of the CCR (central conserved region) of the Apple scar skin viroid (ASSVd), the type member of the genus Apscaviroid, and scattered similarities with other members of this genus, suggesting that the circular RNA is a viroid recombinant. Finally, UV irradiation of infected tissue has revealed the existence in vivo of an RNA motif (loop E) in Potato spindle tuber viroid (PSTVd), the type member of the family Pospiviroidae (nuclear viroids), and RNA-protein binding followed by eletrophoretic mobility shift (EMSA) and UV cross-linking label transfer assays have shown that transcription factor IIIA (TFIIIA) and L5 ribosomal protein from Arabidopsis thaliana bind this RNA in vitro with the same affinity as they bind 5S rRNA, whereas the affinity for a chloroplastic viroid (Avocado sunblotch viroid, ASBVd) is significantly lower. These two proteins may participate in synthesis and delivery of PSTVd in vivo.