Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:27:23Z : No. of bitstreams: 1 000199389.pdf: 584941 bytes, checksum: 5a9337c1a6d76389fabc4039dfce878f (MD5) / A bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri é um fitopatógeno causador do cancro cítrico que compromete parte da produção de laranjas do Estado de São Paulo, com reflexos negativos para a economia do Estado e do País. Para que haja um controle futuro do cancro cítrico, vários pesquisadores se empenharam no Projeto Genoma-Xanthomonas visando desvendar o conjunto gênico desta bactéria e fornecer subsídios para a identificação dos genes envolvidos com a sua patogenicidade. Neste sentido, o atual trabalho visa o monitoramento da expressão gênica do patógeno quando submetido a diferentes condições ambientais, tais como variações no pH extracelular e antibacterianos utilizando o Differential Display RT - PCR. Deste modo, obtivemos a expressão de genes importantes quando o microrganismo foi submetido ao pH 8.0 tais como: um gene relacionado a um transportador MFS, valina - piruvato aminotransferase, glucano 1,4--glucosidase e uma proteína hipotética conservada. Quando submetida à agentes inibidores como a ampicilina, a Xanthomonas expressou proteínas como a integrase, proteína de virulência e uma fosforibosilformilglicinamida ciclo ligase. Quando em meio de cultura contendo penicilina, a bactéria expressou o gene da tirosil t-RNA sintetase. Há um grande interesse em desvendar os mecanismos de ataque da Xanthomonas axonopodis pv. citri, na sua interação com o vegetal e também suas estratégias para inibir o sistema de defesa do hospedeiro, promovendo o surgimento da doença. Neste sentido, espera-se que estes resultados, adicionados a outros projetos funcionais, possam fornecer informações quanto ao mecanismo de defesa da Xanthomonas, bem como da interação planta-bactéria e conseqüentemente auxiliar no controle do cancro cítrico. / The bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri is a pathogen causing citric canker that compromises part of the orange production in the State of São Paulo, with negative consequences for the economy of the State and the Country. For the future control of citric canker, several investigators participated in the Xanthomonas Genome Project in order to determine the gene set of this bacterium and to contribute to the identification of the genes involved in its pathogenicity. In this respect, the objective of the current study was to monitor the gene expression of the pathogen when submitted to different environmental conditions such as variation in extracellular pH, and to different antibacterial agents using Differential Display RT-PCR. Using this method we obtained the expression of important genes when the bacteria were submitted to pH 8.0, such as a gene related to an MFS transporter, valine-pyruvate aminotransferase, glucan 1,4--glucosidase and a conserved hypothetical protein. When submitted to the action of inhibitory agents such as ampicillin, Xanthomonas expressed various proteins, i.e., integrase, virulence protein and a phosphoribosylformylglycinamide cycloligase. In a culture containing penicillin, the bacteria expressed the gene of tyrosyl t-RNA synthetase. There is great interest in determining the mechanisms of attack of Xanthomonas axonopodis pv. citri, its interaction with plants and also the strategies it uses to inhibit the defense system of the host, promoting the onset of the disease. In this respect, the present results, added to those obtained in other functional projects, are expected to provide information about the defense mechanism of Xanthomonas and about the plant-bacterium interaction in order to contribute to the control of citric canker

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-04-23Bitstream added on 2014-06-13T18:31:29Z : No. of bitstreams: 1 avilaneto_pm_me_rcla.pdf: 2987014 bytes, checksum: 42f0c4d662fdc347535b329b4435956b (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Com a utilização crescente do biodiesel no mundo, houve uma grande disponibilidade de glicerol no mercado. No brasil, é esperado um mercado de 200 mil toneladas de glicerol de biodiesel com a utilização de 5% de biodiesel ao diesel. Apesar disso, a clarificação e purificação deste glicerol ainda é um processo muito oneroso, sendo que a utilização do glicerol na forma bruta, além de gerar produtos de alto valor agregado, pode contribuir para diminuir o valor do biodiesel no mercado, uma vez que os custos de armazenamento ou descarte do glicerol bruto está atrelado ao preço do biodiesel. O glicerol de biodiesel preferencialmente é utilizado para produção de 1,3 propanodiol por bactérias, porém pouco se tem estudado a respeito da sua fermentação por leveduras, que podem utilizar maiores quantidades de glicerol e maiores taxas de conversão. Foram realizadas fermentações com 30 cepas de leveduras capazes de assimilar o glicerol utilizando frascos tipo erlenmeyer e glicerol como única fonte de carbono. O caldo fermentado foi analisado em HPLC equipado com detector UV e IR na busca de etanol, propanol, butanol, lactato, propionato, citrato, succinato e acetato, 1,3 propanodiol, 1,2 propanodiol, e 2,3 butanodiol. Foi utilizando o método de planejamento experimental para otimização do crescimento em frascos e três fermentações em reator para avaliação do meio otimizado. Também foram realizados dois planejamentos experimentais para otimização do meio de produção em frascos e seis fermentações em reator variando a aeração e a agitação. Foi verificado que Yarrowia lipolytica NRRL Y-1095 foi a cepa maior promissora na utilização de glicerol para produção de citrato. O meio de crescimento foi otimizado em glicerol 50 g.L-1, extrato de levedura 5 g.L-1, sulfato de amônia1 g.L-1, KH2PO4 7 g.L-1, Na2HPO4... / With the increasing use of biodiesel in the world, there is great availability of glycerol in the market. In Brazil, it is expected a availability of 200 thousand tons of biodiesel glycerol with the mixture of 5% biodiesel into mineral biodiesel. Nevertheless, the purification and clarification of glycerol is a very costly process, and the use of raw glycerol to generate products with high added value, may reduce the price of biodiesel in the market, since raw glycerol storing and disposing costs are put on the biodiesel price. Raw glycerol is preferably used to produce 1,3 propanediol by bacteria, but little has been studied about its fermentation by yeasts, which can use larger amounts of glycerol and have higher conversion rates. Fermentations were performed with 30 yeast strains able to use glycerol as the sole carbon source using Erlenmeyer flask. The fermented broth was analyzed on HPLC equipped with UV and RI detector searching ethanol, propanol, butanol, lactate, propionate, citrate, succinate and acetate, 1,3 propanediol, 1,2 propanediol, and 2,3 butanediol. The method of experimental design was used for growth optimization and three fermentation were performed in fermentor vase to evaluate the optimized medium. Two experimental designs were made for the evaluate the production medium and six fermentation in fermentor vase varying aeration and agitation. It was found that Yarrowia lipolytica NRRL Y-1095 strain was the most promising in the use of glycerol to produce citrate. The growth medium was optimized in glycerol 50.0 g.L-1, yeast extract 5.0 gL-1, ammonium sulfate 1.0 gL-1, KH2PO4 7.0 gL-1, Na2HPO4 2.5 gL-1, FeCl3 0.65 mg.L - 1, ZnSO4 1.2 mg.L-1, CuSO4.5H2O 0.31 mg.L-1 and MnSO4 0.27 mg.L-1, reaching 6.32 gL-1 of dry weight in bottles and 23gL-1 in fermentation reactor. It was found that glycerol was the only significant factor... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-03-18Bitstream added on 2014-06-13T20:36:50Z : No. of bitstreams: 1 fontanari_la_me_arafo.pdf: 1048250 bytes, checksum: a30d89a53a7dc0062a5544433078f318 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O fator etiológico principal da doença periodontal é a placa bacteriana e a raspagem e o alisamento radicular é o tratamento utilizado para removê-lo, mas, além de não promover total descontaminação forma smear layer que pode funcionar com uma barreira física ao restabelecimento de uma nova inserção conjuntiva, atrasando ou até impedindo a regeneração dos tecidos periodontais. O condicionamento radicular com diferentes agentes químicos visa remover a smear layer e expor fibras colágenas da superfície radicular promovendo uma descontaminação adicional à raiz, favorecendo o processo de reparação do periodonto. Apesar de alguns estudos in vitro apresentarem resultados favoráveis à realização do condicionamento radicular, estudos in vivo apresentam resultados controversos. Estes resultados conflitantes podem ser atribuídos a diversos fatores e provavelmente o grau de hipermineralização do dente seja um dos mais importantes fatores. Assim, este estudo avaliou o condicionamento radicular com diferentes agentes (ácido cítrico 25% e 1%, EDTA 24%, cloridrato de tetraciclina 50mg/ml e solução salina) em espécimes de dentes com cálculo visível (expostos à placa bacteriana) e dentes inclusos (não expostos à placa bacteriana). Após tramitação laboratorial de rotina os espécimes foram fotografados em microscopia eletrônica de varredura. Um examinador treinado, calibrado e cego avaliou as fotomicrografias obtidas utilizando o Índice de Remoção de Smear Layer. A análise estatística (teste Mann Whitney) foi realizada comparando-se a freqüência dos escores obtidos, e mostrou que houve uma tendência a dentes não expostos à placa bacteriana apresentarem 15 maior facilidade de remoção de smear layer (desmineralização), quando comparados a dentes expostos à placa bacteriana / The main etiological factor of periodontal disease is dental plaque and scaling, and root planning is the treatment used to remove it. This treatment doesn’t promote total decontamination and it forms smear layer which can work as a physical barrier to establish a new connective insertion, delaying or even preventing the regeneration of periodontal tissues. The root conditioning with different chemical agents aims to remove the smear layer and expose collagen fibers on the root surface promoting additional root decontamination, thus resulting in the periodontal repair. Although some in vitro studies produce favorable results to perform of root conditioning, in vivo studies are controversial. These conflicting results may be attributed to several factors and the degree of tooth hypermineralization is probably one of the most important factors. Thus, this study examined the root conditioning with different agents (25% and 1% citric acid, 24% EDTA, 50 mg/ml tetracycline hydrochloride and saline solution) in tooth specimens with visible calculus (exposed to dental plaque) and impacted teeth (not exposed to plaque). After routine laboratory performance, specimens were photographed in scanning electron microscopy. A trained examiner, blinded and calibrated, evaluated the photomicrographs by the Index of smear layer removal. Statistical analysis (Mann Whitney test) was performed to compare the score frequency, and showed that teeth not exposed to dental plaque presented easier of smear layer removal (demineralization) when compared to teeth exposed to dental plaque

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:02Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-27Bitstream added on 2014-06-13T20:17:45Z : No. of bitstreams: 1 rocha_frg_me_arafo.pdf: 2074950 bytes, checksum: 44b81ca3437b0380ff6a9431b98cf128 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A regeneração periodontal ainda representa um importante desafio, devido a limitações na efetividade e imprevisibilidade das abordagens clínicas. O condicionamento radicular e a utilização de mediadores biológicos, como os fatores de crescimento, são duas das técnicas que tem sido estudadas para esta finalidade; também tem sido proposta a combinação de ambas. Foi avaliado in vitro o efeito do condicionamento ácido da dentina na liberação de bFGF e BMP-7 aplicados topicamente de forma isolada ou associados, além da influência de tais tratamentos na expressão de genesalvo relacionados ao metabolismo de tecido conjuntivo mineralizado e não mineralizado em três tipos celulares relevantes para o processo regenerativo no microambiente periodontal. Espécimes de dentina bovina foram subdivididos em dois grupos: não condicionados e condicionados com ácido cítrico 25% durante 3 minutos. bFGF recombinante humano (10 e 50 ng), BMP-7 (100 e 300 ng) e associação bFGF/BMP-7 (50 ng e 100 ng, respectivamente) foram suspendidos em 50 μL de meio de cultura e aplicados topicamente sobre a dentina. A liberação de fatores de crescimento aplicados topicamente sobre a dentina condicionada e não condicionada foi determinada por meio de ELISA. Linhagens celulares de camundongos – fibroblastos do ligamento periodontal, cementoblastos e células do estroma ósseo – foram plaqueadas sobre os espécimes de dentina com e sem condicionamento ácido prévio, tratados ou não com os fatores de crescimento. Após 24 horas, as células aderidas sobre as amostras de dentina foram coletadas, o RNA total extraído e a expressão gênica de colágeno 1-alfa1, fibronectina e Runx2 foi avaliada por RTqPCR. Os resultados encontrados neste estudo indicam que os fatores de crescimento são retidos pela dentina após aplicação tópica... / Periodontal regeneration still poses a challenge both in terms of predictability and magnitude of effect. Chemical root conditioning and the use of biological mediators are two strategies studied to improve the results of regenerative therapies. The objective of this study was to determine the effect of acid conditioning of dentin on the release of topically applied bFGF and BMP-7, isolated or associated. We also evaluated the impact of such treatment in the expression of target genes related to the metabolism of mineralized connective tissue and non-mineralized in three cell types relevant for the regenerative process in the periodontal microenvironment. Dentin specimens, which were obtained from bovine teeth, were divided into two groups: non-conditioned and conditioned with 25% citric acid for 3 minutes. Human growth factors produced by recombinant DNA technology were diluted in 50 mL of culture medium and topically applied on the dentin in the following amounts: recombinant human bFGF (10 and 50 ng), BMP-7 (100 and 300 ng) and associated bFGF/BMP-7 (50 ng and 100 ng, respectively). The released of growth factor topically applied on the conditioned and non-conditioning dentin samples was determined by ELISA. Murine cell lines - periodontal ligament fibroblasts, cementoblasts and bone marrow stromal cells - were grown on dentin specimens with and without prior acid conditioning and application of growth factors. After 24 hours, the cells adhered on the samples of dentin were collected, total RNA extracted and gene expression of collagen 1-alpha 1, fibronectin and Runx2 was determined by RT-qPCR. The results of this study indicate that: growth factors are retained by dentin after topical application and that the peak release occurs in two hours; the conditioning of dentin with citric acid favored the retention of topically applied growth... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Henrique Ferreira / Banca: Alessandra Alves de Souza / Banca: Patricia Pasquali Parise Maltempi / Resumo: Xanthomonas. citri subsp. citri (Xac) é o agente causal do cancro cítrico, uma das doenças mais graves que afetam plantas cítricas de importância comercial em todo o mundo. O controle eficaz para o cancro cítrico constitui na eliminação de plantas infectadas em programas rigorosos para conter a propagação da bactéria. No entanto, o relaxamento recente nas políticas para combater cancro cítrico em áreas como o estado de São Paulo - Brasil, está a contribuir para a propagação da doença. O conhecimento da biologia deste patógeno de plantas e também dos mecanismos envolvidos na interação planta-patógeno são de grande importância para apoiar o desenvolvimento de estratégias para lidar com o cancro cítrico. Um trabalho recente de nosso grupo demonstrou que os mutantes X. citri com disrupção do gene parB são comprometidos na segregação cromossômica e na capacidade de produzir os sintomas da doença na planta. No presente trabalho, nós estendemos nossas caracterizações, avaliando os efeitos da falta de parB em mutantes X. citri através de uma deleção limpa. ParB é uma proteína de ligação ao DNA e está envolvida no processo de segregação cromossômica através de interação com outras proteínas. Devido à dificuldade de deleção de genes envolvidos neste processo em X. citri, o nocaute de parB foi realizado numa variante abrigando um plasmídeo replicativo capaz de expressar cópias extras de ParB (ParB-TAP) sob o controle de para (promotor de arabinose). A viabilidade de X. citri parB nocaute (XacΔparB-pLAC2) foi avaliada em experimentos de curva de crescimento e em comparação com a estirpe do tipo selvagem, em condições de repressão ou de indução de parB-tap ligado a este promotor; O objetivo foi explorar as condições de depleção e superexpressão de ParB e seus efeitos através da caracterização do referido promotor. Em seguida, X. citri parB nocaute foi visualizado por microscopia de... / Abstract: Xanthomonas citri ssp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, one of the most severe diseases that affect citrus plants of commercial importance around the world. An effective control for citrus canker constitutes the elimination of infected plants in rigorous programs to contain the spread of the bacteria. However, recent relaxation in the policies to combat citrus canker in areas such as the state of São Paulo, Brazil, the major orange juice producer in the world, are contributing to the spread of the disease. Therefore, knowledge of the biology of this plant pathogen and also of the mechanisms involved in plant-pathogen interaction are of great importance to support the development of strategies to deal with citrus canker. Recent work from our group demonstrated that X. citri mutants disrupted for parB are compromised in chromosome segregation and are unable to produce disease symptoms in plant. In the present work, we extended our characterizations by evaluating the effects of a lack of ParB in X. citri mutants carrying a clean deletion of its coding DNA. ParB is a DNA binding protein and is involved in chromosome segregation process through interaction with other proteins. Because of difficult in genes deletion involved this process in X. citri, the parB gene was deleted in a X. citri variant harboring a replicative plasmid able to express extra copies of ParB (ParB-TAP) under the control of the para (arabinose promoter). The viability of the X. citri parB knockout was assessed in growth curve experiments and compared with the wild type strain under different conditions of parB-tap repression or induction. The aim was to explore the conditions depletion and overexpression of ParB and its effects through the characterization of para in X. citri Thus, the X. citri parB knockout was visualized under differential interference contrast (DIC) microscopy in order to detect morphological alterations normally expected from ... / Mestre

Orientador: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Flavia Maria de Souza Carvalho / Banca: Fabrício José Jaciani / Resumo: O estudo da interação planta-patógeno é de grande importância para o entendimento do cancro cítrico, justificando assim a busca por genes que estejam ligados a patogenicidade e virulência em Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), agente causal dessa doença. Neste estudo, foi realizada mutagênese aleatória por inserção do transposon EZ-Tn5 in vitro no genoma da Xac. Obteve-se 8000 mutantes onde 292 foram conduzidos em ensaio experimental in planta. Cinco mutantes expressaram sintomatologia alterada, dois com ausência total de sintomas e três com leve hiperplasia. A análise da sequência dos genes onde se inseriu o transposon indicam mutações nos genes purF, yapH, oar, um gene que codifica uma proteína hipotética (XAC 0196), e na região entre os genes pobB (XAC0362) e glpR (XAC0361). As análises de curvas de crescimento bacteriano in planta demonstraram que, exceto o gene purF, todos os demais podem ser genes envolvidos na patogenicidade de Xac. Dois destes, yapH e oar são descritos como relacionados à adesividade bacteriana, evidenciando que a interferência nesse processo exerce influência direta no sucesso da infecção de Xac. Destaca-se também a importância da identificação de uma proteína hipotética, já que essa apresentou sintomatologia atenuada quando ocorreu a inserção do transposon / Abstract: The study of plant-pathogen interaction is very important to citrus canker understanding, justifying the search for virulence and pathogenicity related genes in Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), causal agent of this disease. In this study, a random mutagenesis by Tn5 transposon insertion into Xac's genome was performed. Eight thousand mutants were produced and 292 mutants were tested in planta. From those, five mutants expressed altered symptomatology, two showed complete absence of symptoms and three reduced hyperplasia. Gene sequences analysis where transposon was inserted, indicated mutations in purF, yapH and oar genes, in a region that codes for a hypothetical protein (XAC0196), and in a region between pobB (XAC0362) and glpR (XAC0361) genes. Analysis of bacteria growth curve in planta showed that, except for purF gene, all the others genes may be involved in Xac pathogenicity. Two of these genes, yapH and oar, are described as bacterial adhesion related genes, highlighting that interference in this process has direct influence in the Xac infection success. The importance of hypothetical protein identification is emphasized, since it presented attenuated symptomatology when mutated / Mestre

Orientador: Maria Isabel Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-27T07:39:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Armiliato_Luciano_M.pdf: 13776089 bytes, checksum: 606f32d6f46335198f71e529fb966a7d (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: o ácido cítrico (2-Hidroxi-1,2,3 ácido propano tricarboxílico) é o principal constituinte das frutas cítricas. Com o emprego de técnica de processos microbiológicos foi possível obter esse ácido por fermentação, reduzindo-se o custo de obtenção e possibilitando um grande aumento do uso em escala industrial, o que o diferencia de outros produtos que previamente foram elaborados por métodos microbiológicos e atualmente se produzem por via química. Atualmente o ácido cítrico é um dos mais importantes ácidos orgânicos produzidos por via microbiana. Sozinho, ele representa cerca de 60% do mercado de acidulantes nas indústrias de alimentos. No entanto, seu preço bastante elevado se deve, principalmente, ao fato de que sua produção industrial é feita por Aspergillus niger, um fungo que tem um tempo de fermentação muito grande, geralmente maior do que sete dias. Uma alternativa a esse método de produção é a utilização de leveduras em lugar dos fungos, o que tornaria o processo fermentativo mais atrativo economicamente devido às maiores facilidades operacionais (processo contínuo e com reciclo de células, por exemplo). Verificouse que leveduras do gênero Candida têm uma taxa de produção de ácido cítrico semelhante aos fungos. A maior desvantagem da levedura é a produção simultânea de altos teores de ácido isocítrico, um produto com baixo. valor comercial. A excreção de ácido isocítrico pode ser controlada através da manipulação dos meios de cultura e das condições de agitação e aeração. Neste trabalho foi realizado um planejamento experimental 2 com três ensaios no ponto central analisando-se as variáveis agitação e aeração estudadas numa faixa de 460 a 740 rpm e 0,4 a 0,9 vvm, respectivamente. A relação de ácido cítrico: isocítrico foi de 1 : 1, e as análises não revelaram nenhuma significância das variáveis na faixa estudada. Além da variação das condições operacionais do processo, também foram estudadas fontes alternativas de carbono e nitrogênio para o crescimento celular e também para a produção de ácido cítrico. Como alternativa à glicose, foram utilizados melaço de cana e sacarose, e em substituição ao NH4CI foram utilizados água de maceração de milho, sulfato de amônia e uréia. Os testes preliminares indicaram que a água de maceração de milho combinada com o melaço apresenta um bom crescimento celular, mas afetam significativamente a produção de ácido cítrico, levando esta a níveis muito baixos. / Abstract: Citric acid (2-hydroxy-1,2,3-propane tricarboxylic acid) is found in many citric fruits. Using microbiological techniques it has been possible to obtain this acid by fermentation using Aspergillus niger, increasing its industrial application, differencing of others products previously obtained by microbiological process and actually obtained by chemical method. Today, citric acid is one of the most important organic acids produced by microbiological technique, responding for 60% of the total acidulant used in food industries. Indeed, it is a very expensive product, especially because the long fermentation time required, more than seven days. A alternative method is to use yeasts instead of fungi in the fermentative process, reducing the citric acid cost due to the fact that it is easier to operate when compared to another using fungi. Yeasts belonging to the genus Candida have citric acid production rates similar to fungi. However, the yeasts produce simultaneously isocitric acid, depending on the culture conditions. In this work an Experimental Design 22 with 3 central points was accomplished, changing the agitation (from 460 to 740 rpm) and the aeration (from 0.4 to 0.9 vvm). The ratio citric : isocitric acid found was about 1 and the statistical analysis showed no significant effect of this variables in the ratio studied. Besides, alternative sources of carbon and nitrogen, such as sugar cane molasses and sucrose (carbon source) and urea, (NH4hSO4and com syrup (nitrogen source), were studied. The results showed that sugar cane molasses combined with com syrup present a high cellular growth but interfere in the citric acid production phase. / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Rafael Marini Ferreira / Banca: Fabricio José Jaciani / Banca; Helen Alves Penha / Resumo: Diante da importância do cancro cítrico para a citricultura mundial, a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri, o agente causal da doença, tem sido amplamente estudada. Pesquisadores brasileiros realizaram o sequenciamento completo do genoma da X. citri subsp. citri isolado 306 (Xac306), com o intuito de elucidar os genes e mecanismos envolvidos na patogenicidade e/ou virulência da bactéria. As ORFs XAC2361 e XAC3898 possuem tamanhos e locais diferentes no genoma da Xac306, mas têm em comum o domínio Peptidase_M23, cujo processo biológico predito é de hidrolase de parede celular, mas a real função destas proteínas em Xac ainda é desconhecida. Este trabalho teve como objetivo avaliar, por meio da mutação sítio-dirigida, se as ORFs XAC2361 e XAC3898 estão relacionadas com a virulência e/ou patogenicidade de X. citri subsp. citri 306 e com o desenvolvimento do cancro cítrico. Para isso, foram realizados testes in vitro e in planta dos mutantes obtidos, visando observar alterações fenotípicas. Devido a presença de peptídeo sinal, a ORF XAC2361 foi fundida à proteína fluorescente mCherry (XAC2361-mCherry) para expressão in vivo e avaliação por microscopia de fluorescência. As análises fenotípicas demonstraram que o mutante ΔXAC2361 não apresentou alterações nos sintomas quando avaliado em limoeiro cravo (Citrus limonia Osbeck), porém apresentou menor capacidade de crescimento in vitro, menor motilidade swimming e swarming e menor capacidade de sobrevivência em SDS. Por outro lado,... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In view of the importance of citrus canker in citrus culture worlwide, the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri, the causal agent of this disease, has been extensively studied. Brazilian researchers performed the complete sequencing of the genome of X. citri subsp. citri isolate 306 (Xac306), in order to elucidate the genes and mechanisms involved in the pathogenicity and/or virulence of Xac. The ORFs XAC2361 and XAC3898 have different sizes and location in the genome, but have in common the M23 Peptidase domain, whose biological process is predicted to act as cell wall hydrolase, but the actual function of these proteins in Xac is still unknown. This work aimed to evaluate, through site-directed mutagenesis, whether XAC2361 and XAC3898 ORFs are related to the virulence and / or pathogenicity of Xac306 and the development of citrus canker. In order to observe phenotypic changes, in vitro and in planta tests of the mutants were carried out. Due to the presence of signal peptide, the ORF XAC2361 was fused to the mCherry fluorescent protein (XAC2361-mCherry) for in vivo expression and fluorescence microscopy evaluation. Phenotypic analyzes demonstrated that the ΔXAC2361 mutant showed no change in symptoms when evaluated in Mexican lime (Citrus limonia Osbeck), but presented lower in vitro growth capacity, lower swimming and swarming motility, and lower survival capacity in SDS. On the other hand, the ΔXAC3898 mutant showed a significant reduction in virulence, lower in plant... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Daiane Cristina Sass / Banca: Eduardo José Crevelin / Banca: Derlene Attili de Angelis / Resumo: As bactérias do gênero Xanthomonas afetam culturas agrícolas de grande importância econômica no Brasil. O controle destas doenças realizado pela utilização de produtos químicos, entre outras práticas, causa impactos negativos na saúde e ao meio ambiente. Isso torna a busca de alternativas sustentáveis de combate a estas doenças cada vez mais importante. Uma possível alternativa aos produtos químicos que tem despertado grande interesse é a aplicação de metabólitos secundários. Suspeita-se que fungos que vivem em ambientes extremos como a Antártica podem produzir metabólitos secundários ainda desconhecidos. Dessa maneira, este projeto teve como objetivo principal investigar a potencial atividade de metabólitos secundários produzidos por 33 fungos isolados do solo contra três espécies de Xanthomonas economicamente importantes para a agricultura do país. Para tanto, foram utilizados fungos coletados em solo em expedição à Antártica (2013) no âmbito do INCT Criosfera, que estão preservados junto à Central de Recursos Microbianos da UNESP. Os extratos (n=66) foram testados contra Xanthomonas patogênicas das culturas de tomate (Xanthomonas euvesicatoria), frutas cítricas (Xanthomonas citri subsp. citri) e maracujá (Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae). Do total de extratos brutos submetidos a bioensaio contra os fitopatógenos, 18 (27,27%) apresentaram taxa de inibição ≥ 90%. Os extratos com potencial inibitório tiveram origem em fungos identificados por sequenciamento da região I... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bacteria of the genus Xanthomonas affect agricultural crops of great economic importance in Brazil. Control of these diseases is made by the use of chemicals, among other practices, that causes negative impacts on human health and the environment. This makes the search for sustainable alternatives to combat these diseases increasingly important. A possible alternative to chemicals that have aroused great interest is the application of secondary metabolites. It is suspected that fungi living in extreme environments such as Antarctica may produce secondary metabolites as of yet unknown. Therefore this study had as main objective investigate the potential activity of secondary metabolites produced by 33 fungi isolated from the soil against three economically important Xanthomonas species. For this purpose fungi previously collected in the Antarctic expedition (2013) under the INCOS Criosfera and preserved at the Microbial Resource Center of UNESP were utillized. The extracts produced by the 33 isolates (n = 66) were tested against pathogenic Xanthomonas of tomato crops: Xanthomonas euvesicatoria; citrus: Xanthomonas citri subsp. citri; and of passion fruit culture, Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae. From the total of extracts submitted to bioassay against phytopathogens, 18 (27.27%) presented inhibition rate ≥ 90%. The extracts with inhibitory potential were produced by fungi identified through sequencing of the ITS4 and ITS5 regions as belonging to the Ascomycota phylum, g... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-28Bitstream added on 2014-08-13T18:01:03Z : No. of bitstreams: 1 000747755_20150228.pdf: 1109024 bytes, checksum: 06c7c1198100258efa09641d5260b3b6 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-03-03T12:45:20Z: 000747755_20150228.pdf,Bitstream added on 2015-03-03T12:45:57Z : No. of bitstreams: 1 000747755.pdf: 3571665 bytes, checksum: f979331ca4c187b62a431c61c0a3ef61 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é o agente causal do cancro cítrico asiático, uma severa doença que afeta todos os cultivares das principais áreas produtores ao redor do mundo. Até o momento não há nenhum tratamento capaz de combater o cancro cítrico. Dessa forma, a erradicação de plantas infectadas constitui a única medida de controle efetivo para evitar a disseminação da doença. Com o programa de erradicação sob ameaça e um claro risco de que Xac torne-se endêmica na principal área produtora de laranja no mundo, há uma necessidade urgente para o desenvolvimento de novas estratégias para o combate do cancro. Neste trabalho foi avaliada a atividade de galatos de alquila para a prevenção do crescimento de Xac. Estes ésteres desempenham um potencial de atividade anti-Xac similar ao da kanamicina (controle positivo), como observado pelo teste Resazurin Microtiter Assay (REMA). O tratamento de Xac com estas substâncias induziram alteração na morfologia celular, e a investigação de possíveis alvos intracelulares usando linhagens de Xac com o septo e centrômero marcados, apontaram para um alvo comum envolvido com a segregação cromossômica/divisão. Além disso, a inoculação artificial de citros com Xac pré-tratada com galatos de alquila demonstraram que a bactéria perde a habilidade de colonizar o hospedeiro, o que é uma evidência a favor do potencial destes ésteres em proteger plantas contra a infecção de Xac. No intuito de determinar o mecanismo de ação, alguns experimentos foram realizados em Bacillus subtillis. Os galatos de alquila também mostraram-se ativos contra B. subtillis. A localização de FtsZ foi rapidamente perturbada após o tratamento, o que sugere que as substâncias possam ter a maquinaria de divisão celular como alvo. Quando estudados in vitro, as substâncias afetaram FtsZ formando estruturas que podiam ser facilmente sedimentadas em alta velocidade, ... / The bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the causal agent of asiatic citrus canker, a severe disease that affects all the cultivars of citrus in the main citrus producing areas worldwide. There is no curative treatment for citrus canker. Thus, the eradication of infected plants constitutes the only effective control for the spread of disease. Since the eradication program is under threat, and with a clear risk of Xac becoming endemic in the main orange producing area worldwide, there is an urgent need for the development of new strategies to fight citrus canker. In this work, were evaluated the potential use of alkyl galates to prevent Xac growth. These esters displayed a potent anti-Xac activity similar to kanamycin (positive control) as observed by the Resazurin Microtiter Assay (REMA). Treatment of Xac with these compounds induced altered cell morphology, and investigation of the possible intracellular targets using Xac strains labeled for septum and centromere pointed to a common target involved with chromosome segregation and cell division. Furthermore, artificial inoculation of citrus with Xac pre-treated with alkyl galates showed that the bacterium loses the ability to colonize its host, which argued in favor of the potential of these esters to protect citrus plants against Xac infection. In attempt to determine their mechanism of action some experiments were performed in Bacillus subtillis. Alkyl gallates were also active against B. subtilis and the FtsZ localization is rapidly perturbed after the treatment, which suggested that the compounds may target the cell division machinery. When studied in vitro, the alkyl gallates affected FtsZ by forming structures that could easily be spun down at high velocity, independent of the presence of nucleotide. These structures seem to be specific since the BSA (bovine serum albumin) protein did not sediment in the presence of the alkyl gallates. Also, GTP hydrolysis, an indicator ... / FAPESP: 10/02667-4 / CNPq: 201196/2012-3