Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Alessandro de Mello Varani / Banca: José Belasque Júnior / Banca: Marcos Tulio de Oliveira / Banca: Maria Teresa Marques Novo Mansur / Banca: Maria Célia Bertolini / Resumo: O Cancro Cítrico é uma importante doença que afeta diversas espécies de citros. Tal doença resulta da infecção pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), transmitida pela água, contato ou propagação de folhas infectadas. Estudos comparativos têm mostrado que uma das características mais intrigantes do gênero Xanthomonas é a extraordinária plasticidade do genoma e sua arquitetura altamente mosaica. Isso se deve principalmente a rearranjos genômicos envolvendo diversas ilhas genômicas (GI), sequências de Inserção (IS), e alguns eventos de inserção de profagos. A anotação de IS de alta qualidade em conjunto com a genômica comparativa revelaram um transposon completo da família TN3 no genoma de Xanthomonas citri (ISXax2), contendo diversos genes passageiros efetores do SSTT, incluindo a altamente conservada transglicosilase lítica de mureína (mlt), uma proteína auxiliar do SSTT. Inserção aleatória de transposons foi utilizada para gerar o mutante cromossomal XacΔmltB e mutação sítio-dirigida foi utilizada para gerar o mutante plasmidial XacΔmlt. Usando ISXax2 de Xac como exemplo demonstramos que a cópia plasmidial de mltB (mlt) era funcional e requerida para gerar sintomas in vivo. Ensaios de transposição demonstraram taxas para ISXax2 com uma frequência de cerca de 1.65 x 10-5. Neste estudo nós usamos uma mistura de abordagens experimentais e de bioinformática para elucidar o papel e comportamento desse potencial elemento transponível no plasmídeo de Xac. Demonstramos que a estrutura completa foi capaz de sofrer transposição e que Cassetes de Inserção Móveis (MICs) contendo efetores TAL também poderiam ser mobilizados. Estes resultados mostram forte evidência que em Xac e espécies relacionadas, genes de virulência e patogenicidade podem se espalhar através de um mecanismo de transposição do tipo TN3, usando para tanto plasmídeos conjugativos como vetores intercelulares. Propomos ... / Abstract: Citrus canker (CC) is an important disease affecting many citrus species. It can result from infection by Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) and can be transmitted by water, contact or propagation of infected leaves. Comparative studies have shown that one of the most intriguing features within the Xanthomonas genus is the extraordinary genome plasticity and highly mosaic architecture. This is largely the consequence of genomic rearrangements involving several genomic islands (GI), insertion sequences (IS), and few prophages insertion events. High quality IS annotation coupled with comparative genomics revealed a complete transposon of the Tn3 family in the Xanthomonas citri genome (ISXax2), with several T3SEs passenger genes, including a highly conserved lytic murein transglycosylase (mlt), a helper protein of the T3SS. Random transposon insertion was used to generate XacΔmltB and site directed mutagenesis was used to generate the XacΔmlt mutant. Using ISXax2 from Xac as an example we demonstrated that the plasmid copy of mltB (mlt) was indeed functional and required to generate symptoms in vivo. Transposition assays showed transposition rates for ISXax2 with a frequency of about 1.65 x 10-5. In this study we have used a mixture of bioinformatic and experimental approaches to address the role and behavior of such potentially transposable element. We showed that the entire structure was capable of transposition and that MICs (Mobile Insertion Cassettes) containing TAL effectors could also be mobilized. These results provide strong evidence that, in the case of Xac and closely related species, pathogenicity and virulence genes can be spread by a Tn3-like transposition mechanism, using conjugative plasmids as intercellular vectors. We propose that this process is a key agent to modulate the bacterial virulence and the host-specificity in this group of plant pathogens / Doutor

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Rui Pereira Leite Júnior / Banca: Alessandro de Mello Varani / Banca: José Belasque Júnior / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), é uma das principais doenças que acometem a citricultura mundial e ataca uma ampla gama de espécies comerciais de citros, causando perdas significativas nos países produtores. A espécie de laranja doce Hamlin (Citrus sinensis) é suscetível ao cancro cítrico, enquanto a espécie de tangerina Satsuma (Citrus unshiu) é resistente. Para compreender os mecanismos moleculares relacionados aos sistemas de defesa ativados pela planta é importante identificar as alterações transcricionais de cada espécie vegetal sob estresse fitopatogênico, a fim de desvendar os elementos moleculares que são específicos de cada espécie. O objetivo do presente trabalho foi realizar uma análise comparativa temporal do transcriptoma de duas espécies cítricas contrastantes em resposta à Xac, pela técnica do RNA-Seq (Illumina). Um total de 5.673 e 6.231 transcritos diferencialmente expressos foi induzido nos tempos 24, 48 e 72 horas após a inoculação de Xac em Satsuma e Hamlin, respectivamente, enquanto 3.982 e 7.944 transcritos foram reprimidos. Deste total, 52 transcritos foram induzidos em comum, nas duas espécies, em todos os tempos de inoculação. Estes genes estão relacionados com a defesa basal da planta contra o ataque de Xac, pois apresentam genes que participam na percepção e reconhecimento do patógeno, genes que codificam fatores de transcrição e genes que participam na defesa da planta, como glucanases e proteinases. Entre os genes induzidos exclusivamente na espécie resistente Satsuma destacou-se uma proteinase aspártica. Esta proteína apresentou a maior expressão gênica no tempo 24 horas e pode estar envolvida na resistência desta espécie, visto que na espécie suscetível Hamlin, a expressão desta proteína foi menos expressiva e tardia, no tempo 48 horas. Outra resposta oposta entre as espécie foi na expressão de genes relacionados à ... / Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), is a one of the most important disease affecting citrus production worldwide and attacks a wide range of commercial species of citrus trees, causing significant losses in producing countries. Hamlin sweet orange (Citrus sinensis) is canker-sensitive, while Satsuma mandarin (Citrus unshiu) is canker-resistant. To understand the molecular mechanisms underlying the differences in responses to Xac, transcriptional profiles of these two genotypes following Xac attack were compared by RNA-Seq (Illumina). The purpose of this study was to examine simultaneous changes in gene expression profile during the early stages (24, 48 and 72 hpi) of citrus canker infection in Satsuma and Hamlin. A total of 5673 and 6231 up-regulated transcripts were identified at 24, 48 and 72 hpi in Satsuma and Hamlin, respectively, while 3982 and 7944 were down-regulated. Of these, 52 transcripts were up-regulated in common between both genotypes. These genes in common are related to basic defense against Xac, because there are genes involved in patogen perception and recognition, transcription factors and genes related to plant defense, such as glucanases and proteinases. Among up-regulated genes expressed only in Satsuma, aspartic proteinase was highlighted. This protein presented the highest gene expression 24 hpi and it can be involved in Satsuma resistance, since the expression of this protein was less pronounced and delayed in Hamlin. Another opposite response between these two genotypes was the expression of genes related to cell wall. Such genes were pectato lyase, extensin, cellulose sinthase, and xiloglucano endotransglycosilase. The genes were up-regulated in Satsuma, while in Hamlin, they were down-regulated. For genes related to plant defense, both genotypes up- regulated pathogenesis-related proteins, especially 72 hpi. However, the expression of these genes did not prevent the symptoms in ... / Mestre

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Tiago Santana Balbuena / Banca: Fabrício José Jaciani / Banca: Flávia Maria de Souza Carvalho / Banca: Henrique Ferreira / Resumo: A bactéria Gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é o agente causal do cancro cítrico, doença ainda sem método curativo que gera grande impacto econômico na produção de laranja. Estudos moleculares envolvendo patossistemas, como o Xac-citros, vêm ganhando espaço no auxílio do entendimento sobre os processos fitopatogênicos. Diante disto, o objetivo do presente trabalho foi investigar a expressão dos genes exsF e exsG de Xac e o efeito dos seus nocautes na patogenicidade de Xac em limoeiro cravo (Citrus limonia Osbeck), bem como obter as proteínas por eles codificadas e utilizá-las em ensaios iniciais de cristalização. Na análise da expressão destes genes, foi utilizada a técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR), onde foi avaliada a expressão dos mesmos em Xac inoculada em folhas de limoeiro cravo coletadas em três tempos após a inoculação (48, 72 e 120 h) comparada com a expressão em Xac inoculada em meio de cultura. Já para a produção do mutante duplo de Xac apresentando os genes exsF e exsG nocauteados, foi utilizada a técnica de mutação sítio-dirigida por PCR utilizando o vetor suicida pOK1 e a estratégia de troca alélica. Para a produção das proteínas ExsF e ExsG recombinantes foi utilizada a expressão heteróloga em E. coli através do uso do vetor de expressão pET SUMO e os ensaios iniciais de cristalização foram realizados utilizando-se kits comerciais e não comerciais. A análise da expressão dos genes exsF e exsG revelou que estes foram induzidos, cerca de 10 vezes mais, após 72 horas de infecção da Xac em folhas de limoeiro cravo, em comparação com a Xac multiplicada em meio de cultura. Os ensaios de patogenicidade utilizando o mutante duplo de Xac Δ3135/3136 revelaram que este foi avirulento em folhas de limoeiro cravo, em contraste com a linhagem 306 selvagem, que elicitou os sintomas de cancro cítrico. Além disso, a mutação reduziu a capacidade de multiplicação... / Abstract: The Gram-negative bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, disease that causes a significant economic impact on the orange production. Molecular studies involving pathosystems like Xac-citrus have been used to as an approach to understand the pathogenic processes. Therewith, the objective of this study was to investigate the expression of exsF and exsG Xac genes and the effect of its silencing in Xac pathogenicity in Rangpur lime (Citrus limonia Osbeck) leaves and also get the proteins coded by them and use it in initial tests of crystallization. The real-time PCR (qRT-PCR) technique was used in the analysis of gene expression.The in planta expression of exsF and exsG genes were evaluated in Xac isolated from Rangpur lime leaves collected at 48, 72 and 120 h after inoculation compared to Xac growing in NA culture. For the production of Xac double mutant having the ExsF and exsG genes silenced, the site-directed mutagenesis technique by PCR using the suicide vector pOK1 was used. For the production of ExsF and ExsG recombinant proteins, the E. coli heterologous expression in the pET SUMO expression vector was used. Finally, the initial crystallization trials were performed using commercial and non-commercial kits. The gene expression analysis showed that the exsF and exsG genes were induced about 10-fold more after 72 hours of Xac infection in Rangpur lime leaves, compared with the Xac grown in the culture medium. The functional assays performed with the Xac Δ3135/3136 double mutant showed that it was avirulent on Rangpur lime leaves, in contrast to the wild type strain Xac 306. Moreover, the mutation reduced the multiplication of the bacteria in planta. The mutation also affected the biofilm production, that was reduced in the mutated strain. Through the heterologous expression assays and protein purification it was possible to obtain only the ExsG protein, soluble and pure enough to be ... / Doutor

O processo de desmineralização óssea tem sido mostrado vantajoso em procedimentos de enxertia óssea empregando blocos osseos, porem a sua utilização na periodontia em enxertos osseos autógenos particulados não esta ainda descrita na literatura. De acordo com a literatura é possível observar que existem diferentes agentes demineralizantes na pratica clinica os quais podem ser empregados no processo de desmineralização óssea, razão pela qual este estudo teve como objetivo comparar dois diferentes agentes desmineralizantes de enxertos ósseos autógenos particulados (ácido cítrico pH1 a 50% e tetraciclina hidroclorada a 50mg/ml) em diferentes tempos de aplicação, quanto ao efeito produzido no reparo de defeitos críticos em calvária de ratos. Foram utilizados 120 ratos adultos machos com aproximadamente 4 meses de vida. Neste estudo foi utilizado o modelo de defeito crítico de 8 mm, esses animais foram divididos em 8 grupos de estudo formados por 15 animais (5 em cada período experimental): CN (controle negativo): os defeitos permaneceram sem enxerto; CP (controle positivo): os defeitos foram preenchidos por osso particulado não desmineralizado; AC 15: os defeitos foram preenchidos com osso particulado desmineralizado por ácido cítrico durante 15 segundos; AC 30: os defeitos foram preenchidos com osso particulado desmineralizado por ácido cítrico durante 30 segundos; AC 60: os defeitos foram preenchidos com osso particulado desmineralizado por ácido cítrico durante 60 segundos; TCN 15: os defeitos foram preenchidos com osso particulado desmineralizado por tetraciclina durante 15 segundos; TCN 30: os defeitos foram preenchidos com osso particulado desmineralizado por tetraciclina durante 30 segundos; TCN 60: os defeitos foram preenchidos com osso particulado desmineralizado por tetraciclina durante 60 segundos. Foi realizada aeutanasia dos animais aos 7, 30 e 60 dias para realização de microtomografia computadorizada e analise histomorfometrica, para avaliar a área, volume e densidade óssea nos defeitos após os tempos experimentais definidos. Aos 7 dias, não era esperada formação de tecido ósseo significante, mas surpreendentemente, os espécimes desmineralizados com ácido cítrico demonstraram precocidade na produção de eventos regenerativos já nesse período. Durante os períodos experimentais foi possível observar como os espécimes tratados com acido cítrico apresentavam maior formação óssea nos defeito quando comparados com os controles e com os grupos onde empregados tetraciclina. Efeito provavelmente relacionado com a eliminação da parte mineral do osso e liberação de Proteinas morfogeneticas ósseas e fatores de crescimentos, liberados a partir da matriz ossea Concluiu-se que a desmineralização com ácido cítrico do osso autógeno particulado enxertado em defeitos críticos promoveu maior área, volume e densidade de formação óssea do que a desmineralização com tetraciclina e do que a não desmineralização. Observando-se melhores resultados aos 15 e 30 segundos de desmineralização. / Bone demineralization process has been shown useful in bone grafting procedures using onlay bone grafting, however its use in periodontics in bony autogenous particulate graft is not yet described in the literature. According to the literature you can see that there are different demineralizantes agents in clinical practice which can be used in bone demineralization process, which is why this study was to compare two different demineralization agents of bone autogenous particulate graft (citric acid pH1 the 50% tetracycline Hydrochloride and 50mg / ml) in different application time, the effect produced in the repair of critical defects in rat calvarium. 120 adult male rats with approximately 4 months of age were used. In this study we used the 8mm critical defect model, the animals were divided into 8 study groups consisting of 15 animals (5 in each experimental period): CN (negative control): the defect remained free graft; CP (positive control): the defects were filled by nondemineralized bone particles; AC 15: The defects were filled with demineralized bone particles of citric acid for 15 seconds; AC 30: defects were filled with demineralized bone particles of citric acid for 30 seconds; AC 60: The defects were filled with demineralized bone particles of citric acid for 60 seconds; TCN 15: defects were filled with demineralized bone particles tetracycline for 15 seconds; TCN 30: defects were filled with demineralized bone particles tetracycline for 30 seconds; TCN 60: defects were filled with demineralized bone particles tetracycline for 60 seconds. aeutanasia animals was performed at 7, 30 and 60 days for performing computed microtomography and histomorphometric analysis to assess the area, bone volume and density of the defects after the defined experimental times. At 7 days, it was not expected significant formation of bone tissue, but surprisingly, samples demineralized with citric acid demonstrated earliness in the production of regenerative events already during this period. During the experimental periods was possible to observe how the specimens treated with citric acid showed increased bone formation in defects when compared to controls and to groups where employees tetracycline. Effect probably related to the disposal of the mineral part of bone and release of bone morphogenetic proteins and factors of growth, released from the bone matrix concluded that the demineralisation by citric acid particulate autogenous bone graft in critical defects caused greater area, volume formation and bone density than tetracycline demineralization and demineralization that do not. Observing better results at 15 and 30 seconds demineralization.

Orientador: Henrique Ferreira / Resumo: A citricultura constitui uma importante atividade econômica no país, com o Brasil sendo o maior produtor de laranja doce no mundo. A produção é ameaçada pelo cancro cítrico asiático, uma doença severa que traz grande prejuízo e leva a necessidade do controle de seu agente causador, a bactéria Gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). Atualmente não há nenhuma medida curativa para os pomares e a opção é o manejo integrado para evitar o avanço da doença. O único controle químico utilizado no presente é a aplicação de compostos a base de cobre, os quais trazem riscos de contaminação ao solo e de mananciais de água. Desta forma, estratégias alternativas de controle são essenciais para manter a citricultura brasileira competitiva no mercado. Compostos derivados do metabolismo vegetal tais como os flavonoides, ácido fenólicos e terpenóides são classes de substâncias com um grande potencial antimicrobiano. Nesse contexto, foi avaliada a ação anti-Xac de compostos híbridos de chalcona, ésteres do ácido vanílico e os monoterpenóides Timol e Carvacrol. No caso dos híbridos de pirazinamida-chalconas, não houve atividade antimicrobiana constatada contra Xac. Para os vanilatos, os compostos de cadeia lateral de 5 até 8 carbonos apresentaram ação anti-Xac, com atividade bacteriostática. Timol e Carvacrol mostraram atividade anti-Xac, uma vez que foram bactericidas a 200 μg.mL-1. Estes terpenóides foram avaliados quanto ao seu modo de ação e apresentaram atividade na permeabilizaç... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Citriculture has great importance to Brazil`s economy, with the country occupying the post of the largest sweet orange producer in the world. This production is threatened by Asiatic citrus canker, a crop disease which causes great losses in production and fruit quality. Because of these problems, there is a need to manage its causal agent – the Gram-negative bacteria Xanthomonas citri subps. citri (Xac). Nowadays there are no curative measure to surpass the disease in the orchards and the only option is the integrated management to avoid its spread. The only chemical control used in this strategy is based on copper, which is associated with soil and water springs contamination. For that reason, new alternative control strategies become essential to maintain the Brazilian citriculture competitive in the market. Compounds derived from plants metabolism such as flavonoids, phenolic acids and terpenoids are interesting substances with antimicrobial proprieties. In this context, we evaluated the anti-Xac action of hybrid chalcone compounds, vanillic acid esters and monoterpenoids (Thymol and Carvacrol). The pyrazinamide-chalcone hybrids showed no antimicrobial activity against Xac. In the case of the vanillic acid esters, synthetic compounds with a side chain structure composed of 5 to 8 carbons presented an bacteriostatic anti-Xac activity. Compounds Thymol and Carvacrol also showed anti-Xac action, once this compounds were bactericidal at 200 μg.mL-1. These terpenoids were eval... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-04-28Bitstream added on 2014-06-13T20:21:38Z : No. of bitstreams: 1 teixeira_ec_dr_araiq.pdf: 2441746 bytes, checksum: 6a8b98becf92d1426314457c9b30825c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O presente trabalho teve como principal objetivo realizar estudos funcionais na bactéria Xac, estudando o possível envolvimento dos genes copA, copB e cutC no mecanismo de resistência a cobre nesta bactéria. Estes estudos funcionais envolveram: análise da expressão dos genes durante o crescimento na presença de cobre por Northern e Western blots e por eletroforese bi-dimensional, produção e purificação das proteínas recombinantes e produção de anticorpos, inativação de um dos genes (copA) para avaliar a participação da proteína CopA no mecanismo de resistência a cobre e análise da interação das proteínas de resistência a cobre com outras proteínas de Xac através do ensaio de duplo híbrido de leveduras. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem mutante infecta a planta, mas os sintomas são mais retardados na presença do metal, quando comparada à linhagem selvagem. O crescimento das células mutantes na ausência e presença de cobre in planta indicou maior sensibilidade ao cobre pelas células mutantes. Na tentativa de verificar se as proteínas CopA, CopB e CutC interagem com outras proteínas de Xac, um ensaio de duplo híbrido de leveduras foi realizado. Através deste ensaio, algumas proteínas foram identificadas, as quais necessitam de estudos de caracterização adicionais. / Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causal agent of the citrus canker, a serious disease that affects the most commercial citrus cultivars causing serious economic impacts. Symptoms include canker lesions, leading to abscission of fruit and leaves and general tree decline. By sequencing the genome of this bacterium (ONSA Network, FAPESP, Brazil), a better knowledge of this microorganism and its molecular interactions with the host might be elucidated. For this, we analyzed the gene expression during growth in the presence of copper by Northern and Western blots, 2D-electrophoresis, production and purification of the CopA, CopB, and CutC recombinant proteins, inactivation of the copA gene to evaluate the participation of CopA protein in the copper resistance mechanism, and protein-protein interactions assays by the yeast two-hybrid assay. Results showed that the mutant strain infects the plant, but the lesions formation was retarded in the presence of copper. The mutant strain showed more sensitivity to copper than the wild type strain during growth in planta. In order to verify whether the CopA, CopB, and CutC proteins interact with other proteins of Xac, a yeast two-hybrid assay was performed. By this assay, some proteins were identified, which need further characterizations.

Orientador: Henrique Ferreira / Banca: Marco Aurélio Takita / Banca: Fernando Carlos Pagnocca / Resumo: O cancro cítrico é uma doença causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), e que afeta plantas de citros por todo o mundo. O genoma de Xac foi completamente seqüenciado, o que revelou grandes quantidades de ORFs (~30%) codificando para produtos com função desconhecida (proteínas hipotéticas). Baseando-se no princípio de que muitos eventos bioquímicos acontecem em sítios específicos no interior celular, a localização de proteínas em fusão com GFP tem sido amplamente utilizada para a obtenção de informações valiosas a respeito de suas funções. Para iniciarmos estudos de localização de proteínas hipotéticas em Xac, construímos um vetor integrativo capaz de expressá-las em fusão com o polipeptídio GFP, pPM2a. O vetor de expressão para Xac carrega um cassete promotor/repressor de xilose (xylR/pxyl), o gene gfp, um RBS sintético e um fragmento do gene de α-amilase de Xac, para direcionar a integração do sistema de expressão no lócus amy do cromossomo bacteriano. Mostramos aqui a integração estável do vetor no lócus amy de Xac. Além disso, mutantes de Xac expressando o polipeptídio GFP não apresentam nenhuma alteração em seu fenótipo de patogenicidade para o hospedeiro (laranja doce). Mutantes de Xac expressando versões marcadas com GFP para as proteínas ParB e ZapA, ambas codificadas por Xac, foram utilizadas para a padronização dos estudos de localização subcelular. GFP-ZapAXac apresentou um padrão de localização análogo ao de seu ortólogo presente em Bacillus subtilis: uma estrutura semelhante a uma barra, posicionada no meio do bacilo, onde o septo se desenvolve, orientado perpendicularmente com relação ao eixo longitudinal da célula. Este é o primeiro relato de um estudo de localização realizado em Xac. Ao contrário de GFP-ZapAXac, ParBXac-GFP não mostrou nenhum padrão de localização, apesar de a fusão... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Citrus canker is a disease caused by the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), which affects citrus plants worldwide. The genome of Xac was completely sequenced, which unveiled an expressive amount of ORFs (~30%) coding for products of unknown function (hypothetical proteins). Based on the principle that many biochemical events happen at specific sites within the cells, protein localization studies have been extensively used to gather valuable information about function. In order to start subcellular localization studies of hypothetical proteins encoded by Xac using fluorescent microscopy, we constructed an integrative expression vector for GFP-tagging of proteins in this bacterium, pPM2a. The expression vector for Xac carries a xylose repressor/promoter cassette (xylR/pxyl), the gfp gene, a synthetic Ribosome Binding Site (RBS), and a fragment of the α-amylase gene of Xac, to drive the integration of the whole expression system into the amy locus of the bacterial chromosome. We show here stable integration of the expression vector into the amy locus of Xac. Furthermore, Xac mutants expressing the polypeptide GFP do not exhibit any alteration in pathogenicity to the host plant sweet orange. Mutants of Xac expressing GFPtagged versions of ParB and ZapA proteins, both encoded by Xac, were used to standardize the subcellular localization studies. GFP-ZapAXac showed a localization pattern analogous to its ortholog encoded by Bacillus subtilis: a bar-like structure positioned in the middle of the rods, where the septum develops, oriented perpendicularly to the longitudinal axis of the cell. This is the first report of a protein localization study performed in Xac Unlike GFP-ZapAXac, ParBXac-GFP did not display any detectable localization pattern, despite the fact that we were able to detect the production of the fusion ParBXac-GFP in Western blot experiments... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Henrique Ferreira / Coorientadora: Isabel Cristiane da Silva / Banca: Alessandra Alves de Souza / Banca: Fernando Carlos Pagnocca / Resumo: O agente etiológico do cancro cítrico, Xanthomonas citri subsp. citri (X.citri), infecta todas as variedades de citros de interesse econômico ao redor do mundo. Sem controle químico eficaz, a única forma aconselhada de se evitar a propagação da doença é a erradicação de plantas. Essa prática, porém, não é aceita pelos citricultores e demanda grandes investimentos em inspeção de pomares por pessoal treinado no reconhecimento da doença. Nos últimos anos, a legislação para controle do cancro cítrico tem sofrido afrouxamentos que resultaram em um progressivo aumento da doença no maior produtor mundial de laranja, o estado de São Paulo. Esta pesquisa teve como objetivo estender um projeto que vem sendo realizado em nosso grupo que é o desenvolvimento de substâncias inibidoras de crescimento de X. citri (galatos de alquila). No presente trabalho, quatro novas moléculas, originadas a partir de galatos de alquila - galatos de alquila acetilados - demonstraram inibir o crescimento de X.citri de modo similar ao da canamicina (controle positivo), observado pelo ensaio Resazurin Microtiter Assay Plate (REMA). Em observações com microscopia de fluorescência e utilizando-se uma linhagem de X.citri com septo marcado, a localização da proteína GFP-ZapA foi rapidamente perturbada após o tratamento, sugerindo que as substâncias poderiam ter a maquinaria de divisão celular como alvo. Entretanto, em ensaios bioquímicos com FtsZ purificada de X. citri na presença dos galatos de alquila acetilados, verificou-se que essas drogas têm pouca ou nenhuma ação na sedimentação e na inibição da atividade GTPásica de FtsZ, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico) / Abstract: Xanthomonas citri subsp. citri (X.citri) is the etiological agent of citrus canker, a disease that affects all the varieties of citrus of economic importance around the world. Currently, eradication of infected trees constitutes the only effective practice to control the spread of X. citri. This disease has enormous social and economic impact in the orange juice production industry, especially concerning the difficulties to inspect plantations and to persuade growers to eliminate foci of the disease. Regarding this, recent relaxations in the policies of eradication within the state of São Paulo, the main orange producer in the world, indicate that citrus canker may become endemic in this area. The current proposal aims to extend the work that is being done in our research group, developing inhibitors of X. citri growth (alkyl gallates). In this study, four new molecules originated from alkyl gallates - acetylated alkyl gallates - were able to inhibit the X.citri growth, similarly to kanamycin (positive control), assessed by Resazurin Microtiter Plate Assay (REMA). In fluorescent microscopy assay, using a mutant strain of X. citri labeled with green fluorescent protein (GFP) in ZapA, the drugs were able to disrupt the location of septa, suggesting that the substances may have the cell division machinery as a target. However, in biochemical assays using FtsZ purified from X. citri in the presence of the drugs, the drugs showed low or no effect on the sedimentation or GTPase activity of FtsZ. Instead of this, they showed reasonable effect on membrane permeability and probably ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Título original: Fungos isolados do solo da Antártica : avaliação da atividade contra bactérias fitopatogênicas / Orientador: Daiane Cristina Sass / Banca: Ben-Hur Mattiuz / Banca: Patricia Giovanella Grazziotin / Resumo: As bactérias fitopatogênicas do gênero Xanthomonas são capazes de atingir diversos cultivares de interesse comercial, causando anualmente perdas severas na produção. Um exemplo deste gênero é a Xanthomonas citri subsp. citri, causadora do cancro cítrico em diversas espécies de citros. O controle desta doença atualmente conta com o uso de quebraventos, erradicação de plantas contaminadas e desinfecção de equipamentos, embora o modo mais eficiente seja o uso de produtos químicos a base de cobre. Outra bactéria pertencente ao mesmo gênero é a X. albilineans, causadora da escaldadura-das-folhas na cana-de-açúcar. O controle dessa doença ainda é pouco efetivo, sendo aconselhada a desinfecção de equipamentos e mudas. Pensando no problema fitossanitário relacionado a essas bactérias e nos efeitos negativos associados aos produtos químicos à base de metais pesados, torna-se indispensável a busca por compostos naturais capazes de controlar estas doenças e que possam ser menos nocivos ao ambiente. Neste contexto, micro-organismos de ambientes extremos podem produzir metabólitos secundários ainda desconhecidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi obter extratos brutos de fungos filamentosos isolados do solo antártico e avaliar seu potencial de bioatividade contra X. citri e X. albilineans através de ensaios de viabilidade celular. Foram testados 122 extratos contra ambas as bactérias. Nove destes extratos inibiram de forma satisfatória (>90%) o crescimento celular de X. citri e dois ex... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Phytopathogenic bacteria of the genus Xanthomonas able of attain several cultivars of commercial interest, causing yearly severe production losses. An example of bacterium of this genus is Xanthomonas citri subsp. citri, which causes citrus canker in various species of citrus. The control of this disease currently counts on the use of windbreaks, eradication of contaminated plants and disinfection of equipment, although the most efficient way is the use of copper-based chemicals. Another bacterium belonging to the same genus is X. albilineans, which causes leaf scald in sugarcane. The control of this disease is still not very effective, being advised the disinfection of equipment and seedlings. Thinking about the phytosanitary problem related to these bacteria and the negative effects associated with heavy metal chemicals, it is essential to search for natural compounds capable of controlling these diseases and that are less harmful to the environment. In this sense, microorganisms from extreme environments can produce secondary metabolites that are still unknown. Thus, the aim of this work was to obtain crude extracts of filamentous fungi isolated from the Antarctic soil and to evaluate their bioactivity potential against X. citri and X. albilineans through cell viability assays. In total, 122 extracts were tested against both bacteria. Nine of the 122 extracts inhibited satisfactorily (>90%) the cell growth of X. citri and two of the 122 extracts showed satisfactory inhibit... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Henrique Ferreira / Resumo: Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) é o agente etiológico do cancro cítrico, uma doença que ataca todas as variedades comerciais de citros, causando prejuízos econômicos em vários países produtores. Em áreas endêmicas, o cancro cítrico é controlado principalmente por aplicação de bactericidas cúpricos. Compostos alternativos para controlar a doença são desejáveis, pois os bactericidas cúpricos causam impactos ambientais e podem induzir resistência em X. citri. Um passo importante para a descoberta e avaliação de novos compostos para controle de X. citri é a caracterização de genes/proteínas que são alvos em potencial. O gene mreB codifica para uma proteína que é uma actina bacteriana com papel-chave na determinação da morfologia celular. Esses genes foram caracterizados em algumas bactérias, nas quais foi demonstrado que são essenciais. Não existem relatos da caracterização de mreB em X. citri. A proteína MreB e a actina tem baixa similaridade de sequência, apesar de serem homólogos funcionais. Essas características fazem de MreB um alvo interessante para novos compostos antibacterianos. Os objetivos deste trabalho foram descrever a função e determinar a localização subcelular de MreB em X. citri. Para estudar a função de MreB, duas estratégias foram usadas para deletar o gene mreB em X. citri. Entretanto, não foi possível obter mutantes deletados para mreB nem na ausência, nem na presença de complementação. Esse resultado evidenciou que mreB é essencial para X. citri e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Xanthomonas citri subsp. citri (X. citri) is the etiological agent of Citrus canker, a widespread plant disease that attacks all varieties of commercial citrus plants, causing economic loss worldwide. In endemic areas, citrus canker is controlled mainly by the application of cupric bactericides. Alternative compounds to control this pathogen are desirable, since copper based bactericides have negative environmental impact and induce resistance in X. citri. An important step for the discovery and evaluation of new compounds to control X. citri is the characterization of genes/proteins that are potential targets. The mreB gene codes for a protein that is a bacterial actin homologue with a key role in rod shape morphogenesis. This gene was characterized in some bacteria, in which it was shown to be essential. There are no reports of characterization of mreB in X. citri. MreB and actin have a weak sequence similarity, despite being functional homologues. These characteristics make MreB an interesting target for new antibacterial chemical compounds. The objectives of this work were to study the function and subcellular localization of MreB in X. citri. To study the function of MreB in X. citri, two strategies were used to delete the mreB gene. However, neither strategy produced deleted mutants. This result confirmed that mreB is essential to X. citri and showed that the complementation method used was not adequate to ensure the viability of X. citri. To investigate MreB subcellula... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre