Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: Helen Alves Penha / Banca: Fabrício José Jaciani / Banca: Flávia Maria de Souza Carvalho / Resumo: O cancro cítrico tem como agente causal a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), que afeta diferentes espécies de citros economicamente importantes. É uma doença ainda sem método curativo, e pela sua relevância e dano econômico, faz-se necessário o entendimento em termos moleculares da interação Xac-citros para o desenvolvimento de estratégias que controlem a doença. O objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos da deleção da ORF XAC0024 presente no genoma da Xac isolado 306, que codifica uma proteína hipotética conservada e que apresenta vários domínios putativos, entre eles o domínio peptidase M23. A hipótese é que esta proteína pode estar envolvida com a patogenicidade e/ou virulência da bactéria. Para obter o mutante ΔXAC0024 foi utilizada a técnica de mutagênese sítio-dirigida, seguida de recombinação homóloga com o vetor suicida pOK1. O mutante ΔXAC0024 foi analisado em relação às características de patogenicidade, crescimento in vivo e in vitro, capacidade de autoagregação, produção de biofilme e produção de goma xantana. O teste de patogenicidade e a curva de crescimento in vivo foram realizados em limão cravo utilizando o método de infiltração por seringa para a inoculação da bactéria. Os sintomas do desenvolvimento da doença foram registrados por fotografia digital até o 25º dia após a inoculação (dai) e a curva de crescimento in vivo também foi determinada até o 25º dai. A curva de crescimento in vitro e a agregação célula-a-célula foram analisa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The bacteria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is the causal agent of citrus canker, a disease that affects different species of economically important citrus. There is no a curative method for this disease, and do to its relevance and economic damage, it is necessary to understand at molecular level the Xac-citrus interaction in order to develop strategies to control the disease. The objective of this study was to investigate the effects of the deletion of the ORF XAC0024 present in the genome of Xac strain 306, which encodes a conserved hypothetical protein and has several putative domains, including peptidase M23 domain. It is hypothesized that this protein may be involved in the pathogenicity and / or virulence of the bacterium. For the ΔXAC0024 mutant was used for site-directed mutagenesis technique, followed by homologous recombination with the suicide vector pOK1. The ΔXAC0024 mutant was analyzed in relation to pathogenicity characteristics, growth in vivo and in vitro, self-aggregation capacity, biofilm production and production of xanthan gum. The pathogenicity test and in vivo growth curves were performed on Rangpur lime using syringe-infiltration method for the inoculation of bacteria. Symptoms of the disease development were recorded by digital photography to the 25° day after inoculation (dai) and in vivo growth curve was also determined to give the 25°. The growth curve in vitro and cell-to-cell aggregation were analyzed in liquid culture medium NB. Biofilm p... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Henrique Ferreira / Coorientador: Alexandre Morais do Amaral / Banca: Maurício Bacci Junior / Banca: Maria Teresa Marques Novo Mansur / Banca: José Belasque Júnior / Banca: André Rodrigues / Resumo: A citricultura é uma das atividades mais importantes do setor agrícola brasileiro. Ainda assim, a incidência de doenças como o cancro cítrico afeta sobremaneira a produtividade dos pomares. Seu agente etiológico, a bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) é capaz de infectar todas as espécies cultivadas, não havendo cura para plantas afetadas. Assim, dados a respeito de seus processos biológicos básicos poderiam auxiliar a vislumbrar soluções para esta enfermidade. Assim, visamos com este trabalho obter informações sobre a formação do septo em Xac, processo do qual participa a proteína ZapA e cujas perturbações têm alto potencial de interferência na multiplicação da bactéria e, portanto, em seu controle. Três estratégias foram utilizadas para esta determinação: 1) estudo de interactantes de ZapA através de ensaio de duplo-híbrido em leveduras; 2) análise do perfil de expressão global de um mutante produzindo cópias extras de ZapA, com a identificação de vias possivelmente por ela influenciadas; e 3) disrupção de ZapA e XAC3407, para averiguar sua interferência no estabelecimento de infecção in planta, sendo XAC3407 um possível novo componente septal a ser descrito em Xanthomonas spp. Embora aparentemente os resultados não apontem para um envolvimento direto entre ZapA e a expressão do fenótipo virulento de Xac, os processos celulares nos quais esta proteína parece atuar diretamente são bastante variados, incluindo aqueles relativos à percepção de estresse, regulação da montagem do flagelo, citoesqueleto e biossíntese de componentes do envelope celular. Todos estes elementos são discutidos caso a caso neste trabalho, na tentativa de que possam lançar luz no conhecimento acerca da biologia básica de Xac / Abstract: Citriculture is one of the most important activities of Brazilian agricultural sector. Even though, the incidence of diseases such as citrus canker affects drastically the orchards productivity. Its etiologic agent, the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) is able to infect all citric cultivars, without any treatment to the diseased plants until now. That's the reason why new data concerning the basic biological processes of Xac can be enormously useful to provide insight on its control. What we sought with this work was to assess new information on Xac's septum formation, a process where the protein ZapA is involved and which impairment has a high potential for disturbing the bacterium growth and, consequently, be useful for control purposes. Three approaches were used for us to reach these goals: 1) the study of ZapA interactants by an yeast-two-hybrid assay; 2) analysis of the expression profile of a mutant strain with extra copies of ZapA, allowing the identification of biochemical pathways possibly influenced by this protein; and 3) depletion of ZapA as well as of XAC3407, to assess its interference during infection establishment in planta, being XAC3407 a possible new septal component to be described in Xanthomonas spp. Although our data seems not to support any involvement of ZapA in the virulent phenotype of Xac, the protein-protein interactions and pathways in which it is enrolled are as broad as stress perception, flagellum assembly regulation, cytoskeleton and cell envelope biosynthesis. All these elements are discussed in this work in the hope that it may shed light on the current knowledge of Xac's basic biology / Doutor

Resumo: O cancro cítrico doença causada pela bactéria gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), representa muitos prejuízos para citricultura brasileira e mundial. Em 2002, a Xac teve todo seu genoma seqüenciado. Uma biblioteca de mütantes foi constituída e os mutantes foram analisados por inoculação in planta, deste modo tres mutantes foram selecionados por apresentarem diferenças nos sintomas, quando comparados com a estirpe selvagem Xac. Os genes nocauteados nos mutantes codificam três proteínas diferentes: DGTP pirofosfato tiamina sintase, envolvida na biossíntese de vitamina B 1, a subunidade E da enzima PHA sintase, que atua na síntese de polihidroxialcanoatos. que acumulados na forma de grânulos intracelulares constituem substâncias de reserva da célula, e podem formar biopolímeros e, ainda o terceiro gene nocauteado, que codifica uma proteína hipotética. As curvas de crescimento revelaram que o mutante da DGTP pirofosfohidrolase tiamina sintase não se desenvolve na planta hospedeira. O mutante da PHA sintase cresce menos que a Xac selvagem nos dois primeiros dias de avaliação, já o mutante da proteína hipotética sofre uma fase de declínio a partir do oitavo dia de avaliação experimental. A subunidade E da PHA sintase da Xac, gene codificador desta proteína foi donado em vetor de expressão e a proteína recombinante foi produzida em E.coli na forma solúvel. / Abstract: The citric canker disease caused for the bacterium gram negative Xantlzomonas axonopodis pv. citri (Xac), presents many damages for Brazilian and world-wide citriculture. In 2002, aiming to know the mechanisms of attack of the disease, the Xac had alI its sequenced genome. A library of mutants was constituted and the mutants had been analyzed by inoculation in plant, three mutants had been isolated for not to show differences in the symptoms when compared with the wild lineage Xac. The mutants codify three different proteins: DGTP pyrophosphate tiamine synthase involved in biosynthesis B 1 vitamin; enzyme PHA synthase subunit E that is involved in the synthesis of polyhydroxyalkanoate, in the intracellular granule f01111, they constitute substances of reserve of the cell an can still to form biopolymer; and hypothetical proteins. The profile of growth of the wild Xac and the mutated Xacs in the three cases of the mutants had been evaluated in order to compare the profile of growth of the bacterial wild and mutant during the infection in citric host. The growth curves showed that the mutant of the DGTP pyrophosphate tiamine synthase does not develop the disease in the host plant. The PHA synthase grows less than the wild Xac in the first days of evaluaction, however the mutant of the hypotetical, shown a decline period for eighth day of the experimental evaluaction. The subunit E the PHA synthase of the Xac, the code gene of this protein was cloned in expression vector and the recombinant protein was produced in E.coli in the soluble form. / Orientador: Julio Cezar Franco de Oliveira / Coorientadora: Maria Ines Tiraboschi Ferro / Banca: João Martins Pizauro Junior / Banca: Roberto Willians Noda / Mestre

Orientador: Jesus Aparecido Ferro / Coorientador: José Belasque Júnior / Banca: Rui Pereira Leite / Banca: Nelson Arno Wulff / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Jackson Antônio Marcondes de Souza / Resumo: Um dos objetivos do presente estudo foi avaliar a diversidade genética de isolados brasileiros de X. citri subsp. citri (Xcc) com base em genes efetores do Sistema de Secreção Tipo III (avrXacE1, avrXacE2, avrXacE3, avrBs2, hpaF, XAC3090 e pthA4). Um total de 49 haplótipos foi identificado entre os 157 isolados analisados por "Southern blot", e o maior polimorfismo genético observado nas análises com a sonda PthA4. Esses efetores estão amplamente distribuídos na população do patógeno e podem ser úteis para uma melhor compreensão da interação patógeno-hospedeiro. Outro objetivo desse trabalho foi a caracterização patogênica e genética de isolados de X. fuscans subsp. aurantifolii tipos B e C (Xfa-B e Xfa-C). Observou-se pequena agressividade dos isolados de Xfa-B e grande variação na patogenicidade de Xfa-C. Os isolados de Xfa-C produtores de pigmento escuro em meio de cultura foram menos agressivos que os isolados não produtores. Alguns isolados de Xfa-C foram patogênicos também a limões, limas ácidas, citrumelo 'Swingle' e tangerinas. Os isolados de Xfa-B e Xfa-C foram diferenciados pelas técnicas de AFLP, BOX e ERIC-PCR, com relativa diversidade entre isolados do mesmo patótipo, e análises da sequência do gene gyrB revelaram alta similaridade desses isolados com espécies de Xanthomonas patogênicas a outros hospedeiros (X. fuscans subsp. fuscans e X. axonopodis pvs. anacardii, dieffenbachiae, rhynchosiae, sesbaniae e vignicola). No presente estudo também foi descrito o primeiro relato de X. alfalfae (Xa) no Brasil. Os isolados investigados demonstraram limitada patogenicidade e agruparam-se geneticamente com X. alfalfae subsps. alfalfae e citrumelonis e X. axonopodis pvs. allii, cassiae, desmodii, patelii e ricini / Abstract: In the present study, as one of the objectives, is showed the genetic diversity of Brazilian strains of X. citri subsp. citri (Xcc) based on effector genes of the Type III Secretion System (avrXacE1, avrXacE2, avrXacE3, avrBs2, hpaF, XAC3090 e pthA4). A total of 49 haplotypes were identified from 157 Xcc strains by Southern blot analysis using the cited genes as DNA probes. The highest polymorphism was observed with the PthA4. Those bacterium genes are extensively present in the Xcc population and can be used to a better comprehension of the Xcc-plant interaction. As a second objective, we present the genetic and pathogenic characterization of X. fuscans subsp. aurantifolii types B and C strains (Xfa-B e Xfa-C). In the pathogenic testes carried out Xfa-B presented a very limited pathogenicity, weaker than Xfa-C. Strains of this last pathotype presented a relatively high degree of pathogenicity variation, and those Xfa-C strains producers of dark pigment on culture medium were less pathogen than those not producers. Also some Xfa-C strains are pathogens to limes, lemons, Swingle citrumelo, and mandarins. Strains of Xfa-B and C were clearly differentiated by the molecular techniques AFLP, BOX and ERIC-PCR. Sequences of the gyrB gene revealed a high similarity of Xfa strains and other pathovars of Xanthomonas not pathogens of citrus. Finally, we presented the first detection of X. alfalfa (Xa) in Brazil, detected on a single Swingle citrumelo tree in São Paulo state. The Brazilian Xa strains showed a very limited pathogenicty, similar of a X. alfalfa subsp. citrumelonis / Doutor

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Eliana Gertrudes de Macedo Lemos / Banca: Shaker Chuck Farah / Banca: Celso Eduardo Benedetti / Resumo: O presente trabalho teve como principal objetivo realizar estudos funcionais na bactéria Xac, estudando o possível envolvimento dos genes copA, copB e cutC no mecanismo de resistência a cobre nesta bactéria. Estes estudos funcionais envolveram: análise da expressão dos genes durante o crescimento na presença de cobre por Northern e Western blots e por eletroforese bi-dimensional, produção e purificação das proteínas recombinantes e produção de anticorpos, inativação de um dos genes (copA) para avaliar a participação da proteína CopA no mecanismo de resistência a cobre e análise da interação das proteínas de resistência a cobre com outras proteínas de Xac através do ensaio de duplo híbrido de leveduras. Os resultados obtidos mostraram que a linhagem mutante infecta a planta, mas os sintomas são mais retardados na presença do metal, quando comparada à linhagem selvagem. O crescimento das células mutantes na ausência e presença de cobre in planta indicou maior sensibilidade ao cobre pelas células mutantes. Na tentativa de verificar se as proteínas CopA, CopB e CutC interagem com outras proteínas de Xac, um ensaio de duplo híbrido de leveduras foi realizado. Através deste ensaio, algumas proteínas foram identificadas, as quais necessitam de estudos de caracterização adicionais. / Abstract: Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causal agent of the citrus canker, a serious disease that affects the most commercial citrus cultivars causing serious economic impacts. Symptoms include canker lesions, leading to abscission of fruit and leaves and general tree decline. By sequencing the genome of this bacterium (ONSA Network, FAPESP, Brazil), a better knowledge of this microorganism and its molecular interactions with the host might be elucidated. For this, we analyzed the gene expression during growth in the presence of copper by Northern and Western blots, 2D-electrophoresis, production and purification of the CopA, CopB, and CutC recombinant proteins, inactivation of the copA gene to evaluate the participation of CopA protein in the copper resistance mechanism, and protein-protein interactions assays by the yeast two-hybrid assay. Results showed that the mutant strain infects the plant, but the lesions formation was retarded in the presence of copper. The mutant strain showed more sensitivity to copper than the wild type strain during growth in planta. In order to verify whether the CopA, CopB, and CutC proteins interact with other proteins of Xac, a yeast two-hybrid assay was performed. By this assay, some proteins were identified, which need further characterizations. / Doutor

Orientador: Antonio Carlos Maringoni / Banca: Renate Krause Sakate / Banca: Julio Rodrigues Neto / Resumo: O presente trabalho teve por objetivo avaliar a produção e a sensibilidade de 48 isolados de Xanthomonas axonopodis pv. citri e de 14 isolados de Xanthomonas spp. à bacteriocinas. Estudos foram realizados para verificar o efeito da temperatura, tempo de incubação e do tipo do meio de cultura sobre a produção de bacteriocina por isolados de X. axonopodis pv. citri. Todos isolados de X. axonopodis pv. citri não foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por eles, não sendo essas afetadas pelo meio BDA, nutriente ágar + NaCl e YPDA, nos diferentes tempos e temperaturas de incubação. Porém, isolados de X. axonopodis pv. passiflorae foram sensíveis às bacteriocinas produzidas por 25 isolados de avaliados e o isolado de X. campestri pv. campestris e o de X. axonopodis pv. manihotis apresentaram sensibilidade variável. Dos 25 isolados de X. axonopodis pv. citri apenas cinco não foram inibidos pelas bacteriocinas produzidas por dois isolados de X. axonopodis pv. passiflorae. As bacteriocinas produzidas pelos isolados de X. axonopodis pv. citri (FDC-806) e de X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) foram termolábeis e resistentes à lisozima e sensíveis a DNAse. A bacteriocina produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. passiflorae foi resistente à ação de proteinase K, tripsina e RNAse enquanto que a produzida pelo isolado de X. axonopodis pv. citri foi sensível a essas enzimas. / Abstract: The objective of this work was to evaluate the production and sensitivity of 48 Xanthomonas axonopodis pv. citri strains and 14 Xanthomonas spp. strains to bacteriocins. A number of studies were carried out to verify the effect of temperature, incubation time, and type of culture medium on bacteriocine yield by X. axonopodis pv. citri strains. None of the X. axonopodis pv. citri strains were sensitive to the bacteriocins produced by themselves, and were not affected by the PDA, nutrient agar + NaCl, and YPDA media, at the different incubation times and temperatures studied. However, X. axonopodis pv. passiflorae and strains were sensitive to the bacteriocins produced by the 25 Xac strains evaluated, while a X. campestri pv. campestris and X. axonopodis pv. manihotis strains showed variable sensitivity. Of the 25 X. axonopodis pv. citri strains, only five were not inhibited by the bacteriocins produced by the two X. axonopodis pv. passiflorae strains. The bacteriocins produced by X. axonopodis pv. citri (FDC-806) and X. axonopodis pv. passiflorae (Mar 2850-A) were thermolabile and resistant to lysozyme and sensitive to DNAse. The bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. passiflorae was resistant to the action of proteinase K, trypsin and RNAse, while the bacteriocin produced by the X. axonopodis pv. citri isolate was sensitive to those enzymes. / Mestre

Resumo: A citricultura é uma atividade agro-industrial de suma importância para o Estado de São Paulo e para o Brasil. Com uma área plantada em torno de aproximadamente 1 milhão de hectares o país mantém a posição de maior produtor mundial de citros. Desse total, 77% encontram-se localizados na região Sudeste. O sistema citrícola representa 4,47% das exportações de produtos do agronegócio nacional, sendo que o suco de laranja concentrado representa 72% do valor dessas exportações. Entretanto, todo este potencial econômico vem sendo prejudicado por várias doenças dentre elas uma denominada Cancro Cítrico, a qual é causada por um fitopatógeno bacteriano denominado Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). Com o objetivo de analisar os feitos da interação entre essa bactéria e seu hospedeiro natural, utilizou-se a técnica de Análise da Transcrição Reversa em Tempo Real (qRT-PCR) para quantificar a expressão dos genes que compõem o SSTT, SSTQ, algumas ORFs hipotéticas e as quatro cópias do gene pthA. Para tanto, realizou-se um estudo prévio com 10 genes candidatos visando identificar os mais adequados para serem usados como genes de referência no processo de normalização de dados em experimentos dessa natureza. O experimento contou com quatro replicatas biológicas e duas replicatas técnicas. Com base nos resultados, verificou-se que os genes rpoB e rpoC parecem ser os mais indicados para a normalização de dados em experimentos de expressão gênica por qRT-PCR que envolvam analises intergrupos. A maioria dos genes que compõem o SSTT se mostraram induzidos quando a bactéria esteve em contato com seu hospedeiro, com destaque para os genes hrpXct e hrpB4, o que sugere que este sistema tenha um importante papel na patogenicidade dessa bactéria. Por outro lado, os resultados e o estudo da expressão gênica evidenciaram que... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The citrus is an agro-industrial activity of great importance for the State of São Paulo and Brazil. With a planted area around 1 million hectares the country maintains its position of world's leading producer of citrus. Of these, 77% are located in the Southeast. The citrus system represents 4.47% of national agribusiness exportation, being the orange juice concentrate responsible for 72% of the value of these exports. However, all this economic potential is being hampered by diseases among them one called citrus canker, which is caused by a phytopathogenic bacterium known as Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). With the aim of analyzing the achievements of the interaction between this bacterium and its natural host, we used the technique of Real- Time Reverse Transcription Analysis (qRT-PCR) to quantify the expression of genes that comprise the SSTT, SSTQ, some hypothetical ORFs and the four copies of the gene pthA. Thus, a preliminary study with 10 candidate genes were conducted to identify the most suitable ones for use as reference in the process of data standardization in such experiments. The experiment had four biological replicates and two technical replicates. Based on the results, it was found that the rpoB and rpoC genes seem to be the most suitable for the standardization of data in experiments of gene expression by qRT-PCR analysis involving intergroup. Most of the genes that comprise the SSTT was induced when the bacterium was in contact with its host, with emphasis on the genes... (Complete abstract, click electronic access below) / Orientador: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Marcelo Luiz de Laia / Banca: Leandro Marcio Moreira / Banca: Luiz Roberto Furlan / Mestre

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Alexandre Morais do Amaral / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T05:44:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baptista_JulianaCristina_M.pdf: 1606790 bytes, checksum: 2559d8ff6d67422a6685a6a8d5a31cd6 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), e responsável por consideráveis prejuízos para a produção de laranja, no Brasil e no mundo. A doença e altamente agressiva para a planta de citros, provocando, entre outros, lesões em folhas e frutos, com redução tanto na qualidade de frutos quanto na produtividade. Devido a sua importância, recentemente a bactéria teve seu genoma completamente seqüenciado, onde foram identificados, por homologia de seqüência de proteínas, varias ORFs ("open reading frames") associadas ao processo de infecção. Dentre elas, varias seqüências que teoricamente codificam para proteínas envolvidas na degradação da parede celular vegetal, o que pode ser um indicativo de que a bactéria utiliza mecanismos relacionados a este evento durante o seu processo infeccioso e de adaptação. Entretanto, não ha ate o momento informação experimental a respeito da funcionalidade de seqüências em Xac que permitam a degradação da parede celular. O objetivo principal deste trabalho foi identificar funcionalmente, em Xac, através de ensaios in Vectra e in vitro, genes envolvidos na produção ou transporte de proteínas relacionadas a degradação de celulose e com isso analisar a sua relevância na capacidade infectiva ou adaptativa da bactéria. Para tal, foram produzidos mutantes a partir de inserções aleatórias de transposon e sitio-dirigidas, estabelecendo-se uma coleção de linhagens, cujo fenótipo e genótipo foram avaliados por ensaios biológicos e sequenciamento. Verificou-se que o operon xps do sistema de secreção do tipo II e funcional em Xac e que os genes XAC0028, XAC0029, XAC2374, XAC3516 e XAC4231 participam da degradação de celulose / Abstract: The citrus canker, caused by the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is responsible for considerable losses for the orange production, in Brazil and abroad. The disease is highly aggressive for citrus plants, resulting, among others, in injuries on leaves and fruits, with a reduction in the quality of fruits as much as in the productivity. Due to its importance, recently the bacterium had its genome completely sequenced and a number of open reading frames (ORFs) where identified by homology with protein sequences and annotated as associated to the infection process. Amongst them, some sequences that theoretically code for proteins involved in the degradation of the plant cell wall, which may indicate that the bacterium uses mechanisms related to this event during the process of adaptation and infection. However, there is no experimental data regarding such sequences to prove their real function during the pathogenesis of Xac. The main objective of this work was to identify functionally, in Xac, through in vitro and in vivo assays, genes involved in the production or transport of proteins related to the degradation of cellulose and, therefore, to analyze its relevance in the capacity of adaptation and infection of the bacterium. During the investigation, a collection of mutant strains of Xac was produced by random and site-directed mutagenesis, which were analyzed through the identification of leaf lesions and their action on degradation of artificial cellulose in plate as well as the growth in leaves. Through tests of mutagenesis and in vitro assays, this study shows that the xps operon that is present in Xac and encodes a type II secretion system machinery is functional and the genes XAC0028, XAC0029, XAC2374, XAC3516 and XAC4231 participate in cellulose degradation. In summary, for the first time it was experimentally demonstrated that Xac is capable in hydrolizing cellulose / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T23:20:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cernadas_RaulAndres_D.pdf: 2626366 bytes, checksum: 35442a2f5cdd8214cd7309ecd63c7954 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A forma mais agressiva de cancro cítrico, cancrose A, é causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), que ataca qualquer variedade ou espécie de citros. Além de Xac, Xanthomonas axonopodis pv aurantifolii (Xaa) causa um tipo mais leve da doença, cancrose C, restrita ao limão Galego (Citrus aurantifolii). Na laranja Pêra (Citrus sinensis), Xaa provoca uma resposta de defesa que impede o desenvolvimento dos sintomas do cancro incluindo a ruptura da epiderme que é fundamental à disseminação da bactéria. Neste trabalho, abordamos a patogenicidade diferencial entre Xac e Xaa na laranja Pêra para estudar a expressão gênica na planta associada ao desenvolvimento dos sintomas (hipertrofia e hiperplasia celular) e à resposta de defesa. O projeto apresenta a identificação e caracterização de genes expressos diferencialmente em resposta à infecção por Xac e Xaa responsáveis pelo cancro cítrico. A partir de três estratégias independentes (Display diferencial de PCR, Hibridação subtrativa suprimida e micro arranjos de DNA) detalhou-se o perfil transcricional de folhas de laranja infiltradas com Xaa, Xac ou água como controle. Mais de 120 genes candidatos foram validados através de PCR quantitativo em tempo real ou hibridação Northern. Os genes diferencialmente expressos a 6 ou 48 hs após da infecção (hai) aparecem agrupados em categorias funcionais como: remodelamento de parede celular, divisão e expansão celular, tráfego de vesículas, resposta de defesa, metabolismo de nitrogênio e carbono e sinalização de hormônios como auxina, giberelina e etileno. Inicialmente, tanto Xaa quanto Xac induzem respostas de defesa associadas com ataque de patógenos incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio e lignificação da parede celular. Notavelmente, a mudança no perfil transcricional mostra que Xac suprime as defesas da planta entre 6 e 48 hai, ao mesmo tempo em que induz genes relacionados com o metabolismo da parede celular, divisão celular e trafego de vesículas, entre outros. A conseqüência dessa manipulação transcricional no hospedeiro por parte de Xac dá origem à um estado fisiológico típico de expansão celular (hipertrofia). O inibidor de trafego de vesículas, Brefeldina A, atrasou o desenvolvimento dos sintomas do cancro, indicando que essa atividade está mais relacionada com hipertrofia celular do que com respostas de defesa. No perfil transcricional de folhas infectadas com Xaa destaca-se a ativação de uma via de sinalização por proteína quinase ativada por patógeno, envolvendo também fatores de transcrição do tipo WRKY, assim como elementos de resposta a etileno. Tanto Xac quanto Xaa parecem modular a transcrição de genes relacionados com sinalização e transporte de auxinas e biosíntese de giberelina. O tratamento de folhas de laranja com, ácido naftalenoacético (NAA) e ácido giberélico (GA3) demonstrou que esses hormônios induzem a expressão de genes de remodelamento de parede celular, biosíntese de giberelina e sinalização de auxina. Além disso, o inibidor de biosíntese de giberelina (Chlorocoline Chloride) diminuiu significativamente a expressão de genes induzidos por NAA sugerindo que exista uma regulação cruzada entre auxina e giberelina que controla a expressão de genes relacionados com divisão e expansão celular em citros. Finalmente, duas regiões promotoras de genes que codificam proteínas relacionadas com patogenicidade (PR-1 e PR-5) foram isoladas e caracterizadas. Esses genes são fortemente induzidos por Xaa e Xac em 6 e 48 hai. Substancialmente, existem elementos similares com o "upa box" nas regiões promotoras de PR-1 e PR-5. Mediante experimentos de Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) demonstrou-se que a proteína PthA4 de Xanthomonas é capaz de ligar-se no "upa box" presente nos promotores de PR-1 e PR-5. Tanto o promotor de PR-1 quanto o de PR-5 dirigem a expressão transitória do gene repórter uidA em N. benthamiana mediante Agro infiltração. / Resumo: A forma mais agressiva de cancro cítrico, cancrose A, é causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac), que ataca qualquer variedade ou espécie de citros. Além de Xac, Xanthomonas axonopodis pv aurantifolii (Xaa) causa um tipo mais leve da doença, cancrose C, restrita ao limão Galego (Citrus aurantifolii). Na laranja Pêra (Citrus sinensis), Xaa provoca uma resposta de defesa que impede o desenvolvimento dos sintomas do cancro incluindo a ruptura da epiderme que é fundamental à disseminação da bactéria. Neste trabalho, abordamos a patogenicidade diferencial entre Xac e Xaa na laranja Pêra para estudar a expressão gênica na planta associada ao desenvolvimento dos sintomas (hipertrofia e hiperplasia celular) e à resposta de defesa. O projeto apresenta a identificação e caracterização de genes expressos diferencialmente em resposta à infecção por Xac e Xaa responsáveis pelo cancro cítrico. A partir de três estratégias independentes (Display diferencial de PCR, Hibridação subtrativa suprimida e micro arranjos de DNA) detalhou-se o perfil transcricional de folhas de laranja infiltradas com Xaa, Xac ou água como controle. Mais de 120 genes candidatos foram validados através de PCR quantitativo em tempo real ou hibridação Northern. Os genes diferencialmente expressos a 6 ou 48 hs após da infecção (hai) aparecem agrupados em categorias funcionais como: remodelamento de parede celular, divisão e expansão celular, tráfego de vesículas, resposta de defesa, metabolismo de nitrogênio e carbono e sinalização de hormônios como auxina, giberelina e etileno. Inicialmente, tanto Xaa quanto Xac induzem respostas de defesa associadas com ataque de patógenos incluindo a produção de espécies reativas de oxigênio e lignificação da parede celular. Notavelmente, a mudança no perfil transcricional mostra que Xac suprime as defesas da planta entre 6 e 48 hai, ao mesmo tempo em que induz genes relacionados com o metabolismo da parede celular, divisão celular e trafego de vesículas, entre outros. A conseqüência dessa manipulação transcricional no hospedeiro por parte de Xac dá origem à um estado fisiológico típico de^expansão celular (hipertrofia). O inibidor de trafego de vesículas, Brefeldina A, atrasou o desenvolvimento dos sintomas do cancro, indicando que essa atividade está mais relacionada com hipertrofia celular do que com respostas de defesa.No perfil transcricional de folhas infectadas com Xaa destaca-se a ativação de uma via de sinalização por proteína quinase ativada por patógeno, envolvendo também fatores de transcrição do tipo WRKY, assim como elementos de resposta a etileno. Tanto Xac quanto Xaa parecem modular a transcrição de genes relacionados com sinalização e transporte de auxinas e biosíntese de giberelina. O tratamento de folhas de laranja com, ácido naftalenoacético (NAA) e ácido giberélico (GA3) demonstrou que esses hormônios induzem a expressão de genes de remodelamento de parede celular, biosíntese de giberelina e sinalização de auxína. Além disso, o inibidor de biosíntese de giberelina (Chlorocoline Chloridè) diminuiu significativamente a expressão de genes induzidos por NAA sugerindo que exista uma regulação cruzada entre auxina e giberelina que controla a expressão de genes relacionados com divisão e expansão celular em citros. Finalmente, duas regiões promotoras de genes que codificam proteínas relacionadas com patogenicidade (PR-1 e PR-5) foram isoladas e caracterizadas. Esses genes são fortemente induzidos por Xaa e Xac em 6 e 48 hai. Substancialmente, existem elementos similares com o "upa box" nas regiões promotoras de PR-1 e PR-5. Mediante experimentos de Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) demonstrou-se que a proteína PthA4 de Xanthomonas é capaz de ligar-se no "upa box" presente nos promotores de PR-1 e PR-5. Tanto o promotor de PR-1 quanto o de PR-5 dirigem a expressão transitória do gene repórter uidA em N. benthamiana mediante Agro infiltração / Abstract: The most aggressive form of the citrus canker disease is caused by the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), which can infect all commercial varieties or species of citrus. In addition to Xac, Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii (Xaa) causes a weaker form of the disease, known as cancrose C, which is restricted to Mexican Lime (Citrus aurantifolii). In sweet orange (Citrus sinensis), Xaa triggers a defense response that halts the canker-symptoms development including the epidermal rupture, which is essential for bacterial dissemination. In this work, we approached the differential pathogenicity existing between Xac and Xaa in order to survey the host gene expression associated with symptoms development (cellular hypertrophy and hyperplasia) and defense response in sweet orange. The project presents the identification and initial characterization of differentially expressed genes in response to the infection with the citrus canker pathogens, Xac and Xaa. Three independent strategies were conducted in order to have a detailed transcriptional profiling of orange leaves infected with Xaa, Xac or water as mock control (Differential Display PCR, Suppression Subtractive Hybridization and GeneChip Microarrays). More than 120 candidate genes were validated through quantitative real time PCR or Northern blot. The differentially expressed genes at 6 or 48 hours after infection (hai) were grouped into functional categories: cell-wall remodeling, cell division and expansion, vesicle trafficking, carbon and nitrogen metabolism or hormone signaling, auxin, gibberellin and ethylene. Initially, both Xaa and Xac elicit a defense response associated with pathogen attack that includes the production of reactive oxygen species (ROS) and cell-wall lignification. Notably, the changes in the transcriptional profiles show that Xac suppresses the plant defenses between 6 and 48 hai and at the same time it induces genes related to the cell-wall metabolism, cell division and vesicle trafficking among others. The consequence of this host manipulation by Xac originates a physiological state very similar to that of cell expansion (hypertrophy). The vesicle trafficking inhibitor, Brefeldin A, delayed the development of canker symptoms indicating that this activity is more related to the cellular enlargement than to the defense responses. The transcriptional profile of Xaa-infiltrated leaves highlights the activation of amitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway related to pathogen attack with the involvement of other components of defense responses like WRKY-transcriptional factors and ethylene-response elements. Both Xac and Xaa appear to modulate the transcription of genes related to auxin signaling and transport and gibberellin biosynthesis. Treatments of orange leaves with 1- naphthylphthalamic acid (NAA) . / Abstract: The most aggressive form of the citrus canker disease is caused by the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), which can infect all commercial varieties or species of citrus. In addition to Xac,Xanlhomonas axonopodis pv. aurantifolii (Xaa) causes a weaker form of the disease, known as cancrose C, which is restricted to Mexican Lime {Citrus aurantifolii). In sweet orange {Citrus sinensis), Xaa triggers a defense response that halts the canker-symptoms development including the epidermal rupture, which is essential for bacterial dissemination. In this work, we approached the differential pathogenicity existing between Xac and Xaa in order to survey the host gene expression associated with symptoms development (cellular hypertrophy and hyperplasia) and defense response in sweet orange. The project presents the identification and initial characterization of differentially expressed genes in response to the infection with the citrus canker pathogens, Xac and Xaa. Three independent strategies were conducted in order to have a detailed transcriptional profiling of orange leaves infected with Xaa, Xac or water as mock control (Differential Display PCR, Suppression Subtractive Hybridization and GeneChip Microarrays). More than 120 candidate genes were validated through quantitative real time PCR or Northern blot. The differentially expressed genes at 6 or 48 hours after infection (hai) were grouped into functional categories: cell-wall remodeling, cell division and expansion, vesicle trafficking, carbon and nitrogen metabolism or hormone signaling, auxin, gibberellin and ethylene. Initially, both Xaa and Xac elicit a defense response associated with pathogen attack that includes the production of reactive oxygen species (ROS) and cell-wall lignification. T Notably, the changes in the transcriptional profiles show that Xac suppresses the plant defenses between 6 and 48 hai and at the same time it induces genes related to the cell-wall metabolism, cell division and vesicle trafficking among others. The consequence of this host manipulation by Xac originates a physiological state very similar to that of cell expansion (hypertrophy). The vesicle trafficking inhibitor, Brefeldin A, delayed the development of canker symptoms indicating that this activity is more related to the cellular enlargement than to the defense responses. The transcriptional profile of Xaa-infiltrated leaves highlights the activation of a mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway related to pathogen attack with the involvement of other components of defense responses like WRKY-transcriptional factors and ethylene-response elements. Both Xac and Xaa appear to modulate the transcription of genes related to auxin signaling and transport and gibberellin biosynthesis. Treatments of orange leaves with 1-naphthylphihalamic acid (NAA) e Gihherellic Acid (GKi) demonstrated that these hormones induce the expression of genes related to cell-wall remodeling, gibberellin biosynthesis and auxin signaling. Moreover, the gibberellin-biosynthesis inhibitor (Chlorocoline Chloride) decreased significantly the expression of auxin-induced genes suggesting a cross-talk regulation between auxin and gibberellin controlling the expression of citrus genes associated with cell division and expansion. Finally, two promoter regions of the pathogenesis related (PR) genes, PR-I and PR-5.2, were isolated and characterized. These genes are strongly up-regulated by Xaa and Xac at 6 or 48 hai. Substantially, there are "upd" box-like motifs in the promoter regions of both PR-I and PR-5.2. By means of Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) we have demonstrated that PthA4 from Xac is capable of binding the "upd" box-like regions found in PR-1 e PR-5 promoters. Furthermore, both of the isolated promoters (PR-1 and PR-5) address the transient expression of the reporter gene uidA in JV. bethamiana leaves through agro infiltration / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O processo de desmineralização óssea tem sido mostrado vantajoso em procedimentos de enxertia óssea empregando blocos osseos, porem a sua utilização na periodontia em enxertos osseos autógenos particulados não esta ainda descrita na literatura. De acordo com a literatura é possível observar que existem diferentes agentes demineralizantes na pratica clinica os quais podem ser empregados no processo de desmineralização óssea, razão pela qual este estudo teve como objetivo comparar dois diferentes agentes desmineralizantes de enxertos ósseos autógenos particulados (ácido cítrico pH1 a 50% e tetraciclina hidroclorada a 50mg/ml) em diferentes tempos de aplicação, quanto ao efeito produzido no reparo de defeitos críticos em calvária de ratos. Foram utilizados 120 ratos adultos machos com aproximadamente 4 meses de vida. Neste estudo foi utilizado o modelo de defeito crítico de 8 mm, esses animais foram divididos em 8 grupos de estudo formados por 15 animais (5 em cada período experimental): CN (controle negativo): os defeitos permaneceram sem enxerto; CP (controle positivo): os defeitos foram preenchidos por osso particulado não desmineralizado; AC 15: os defeitos foram preenchidos com osso particulado desmineralizado por ácido cítrico durante 15 segundos; AC 30: os defeitos foram preenchidos com osso particulado desmineralizado por ácido cítrico durante 30 segundos; AC 60: os defeitos foram preenchidos com osso particulado desmineralizado por ácido cítrico durante 60 segundos; TCN 15: os defeitos foram preenchidos com osso particulado desmineralizado por tetraciclina durante 15 segundos; TCN 30: os defeitos foram preenchidos com osso particulado desmineralizado por tetraciclina durante 30 segundos; TCN 60: os defeitos foram preenchidos com osso particulado desmineralizado por tetraciclina durante 60 segundos. Foi realizada aeutanasia dos animais aos 7, 30 e 60 dias para realização de microtomografia computadorizada e analise histomorfometrica, para avaliar a área, volume e densidade óssea nos defeitos após os tempos experimentais definidos. Aos 7 dias, não era esperada formação de tecido ósseo significante, mas surpreendentemente, os espécimes desmineralizados com ácido cítrico demonstraram precocidade na produção de eventos regenerativos já nesse período. Durante os períodos experimentais foi possível observar como os espécimes tratados com acido cítrico apresentavam maior formação óssea nos defeito quando comparados com os controles e com os grupos onde empregados tetraciclina. Efeito provavelmente relacionado com a eliminação da parte mineral do osso e liberação de Proteinas morfogeneticas ósseas e fatores de crescimentos, liberados a partir da matriz ossea Concluiu-se que a desmineralização com ácido cítrico do osso autógeno particulado enxertado em defeitos críticos promoveu maior área, volume e densidade de formação óssea do que a desmineralização com tetraciclina e do que a não desmineralização. Observando-se melhores resultados aos 15 e 30 segundos de desmineralização. / Bone demineralization process has been shown useful in bone grafting procedures using onlay bone grafting, however its use in periodontics in bony autogenous particulate graft is not yet described in the literature. According to the literature you can see that there are different demineralizantes agents in clinical practice which can be used in bone demineralization process, which is why this study was to compare two different demineralization agents of bone autogenous particulate graft (citric acid pH1 the 50% tetracycline Hydrochloride and 50mg / ml) in different application time, the effect produced in the repair of critical defects in rat calvarium. 120 adult male rats with approximately 4 months of age were used. In this study we used the 8mm critical defect model, the animals were divided into 8 study groups consisting of 15 animals (5 in each experimental period): CN (negative control): the defect remained free graft; CP (positive control): the defects were filled by nondemineralized bone particles; AC 15: The defects were filled with demineralized bone particles of citric acid for 15 seconds; AC 30: defects were filled with demineralized bone particles of citric acid for 30 seconds; AC 60: The defects were filled with demineralized bone particles of citric acid for 60 seconds; TCN 15: defects were filled with demineralized bone particles tetracycline for 15 seconds; TCN 30: defects were filled with demineralized bone particles tetracycline for 30 seconds; TCN 60: defects were filled with demineralized bone particles tetracycline for 60 seconds. aeutanasia animals was performed at 7, 30 and 60 days for performing computed microtomography and histomorphometric analysis to assess the area, bone volume and density of the defects after the defined experimental times. At 7 days, it was not expected significant formation of bone tissue, but surprisingly, samples demineralized with citric acid demonstrated earliness in the production of regenerative events already during this period. During the experimental periods was possible to observe how the specimens treated with citric acid showed increased bone formation in defects when compared to controls and to groups where employees tetracycline. Effect probably related to the disposal of the mineral part of bone and release of bone morphogenetic proteins and factors of growth, released from the bone matrix concluded that the demineralisation by citric acid particulate autogenous bone graft in critical defects caused greater area, volume formation and bone density than tetracycline demineralization and demineralization that do not. Observing better results at 15 and 30 seconds demineralization.