L'inactivation du chromosome X est la réponse trouvée par l'évolution pour pallier à la divergence gonosomique entre mâle (XY) et femelle (XX). Ce phénomène sert donc à mettre les deux sexes sur un pied d'égalité en limitant la quantité de transcrits provenant des chromosomes X présents dans les cellules femelles. Au cours de mon doctorat, j'ai tenté de contribuer à l'étude des mécanismes de régulation transcriptionnelle, notamment l'activation, des deux acteurs principaux de l'inactivation: Xist et Tsix, son transcrit antisens. Pendant ces 4 anne��es, j'ai entrepris de cartographier le profil de fixation de plusieurs protéines le long du locus Xist/Tsix, dans le but de comprendre les mécanismes permettant une surexpression de Xist lors de la disparition de ses facteurs répressifs en cours de différenciation. J'ai donc pu établir un modèle de régulation transcriptionnelle de l'ARN non-codant Xist, impliquant plusieurs protéines connues pour leur rôle dans la régulation transcriptionnelle (CTCF et YY1) aussi bien que dans la formation de structures tridimensionnelles (la cohésine). La pertinence de ce modèle est renforcée par nos études montrant que de nombreux aspects de ce modèle sont conservés à travers l'évolution (notamment chez l'homme). J'ai également pu contribuer à la découverte de nouveaux activateurs de Tsix, certains facteurs de pluripotence se fixant au minisatellite DxPas34 afin de réguler l'élongation de la transcription de l'antisens. Ces résultats apportent donc d'importantes informations concernant les mécanismes régulant la mise en place du phénomène d'inactivation du chromosome X au cours du développement précoce de l'embryon.

Ces dernières années, les avancées technologiques ont révélé qu’une majeure partie de notre génome est transcrit en ARNs non codants, qui sont impliqués dans de nombreuses pathologies. Dès lors, nous avons voulu, lors de cette thèse, mieux comprendre le rôle des ARNs non codants dans le cancer du sein.Dans un premier temps, nous avons étudié les micros ARNs non codants (miRs) dans un modèle cellulaire de cancer mammaire. Nous avons identifié deux miRs qui sont exprimés dans les lignées mammaires normales, mais pas dans les lignées cancéreuses. La surexpression de miR-137 entraine une diminution de la prolifération et de la migration des cellules cancéreuses. De plus, nous avons identifié que miR-137 cible directement la protéine histone déméthylase KDM5B et diminue son expression génique et protéique. Ensuite, nous avons cherché si d’autres histones déméthylases de la famille KDM5 pouvaient être régulées par les miRs. Nous avons découvert que KDM5C, qui est surexprimée dans les lignées mammaires cancéreuses, est une cible directe de miR-138. La surexpression de miR-138 dans les lignées tumorales diminue l’expression de KDM5C et entraine une chute de la prolifération cellulaire. Globalement, ces résultats révèlent que les miRs peuvent réguler les protéines épigénétiques KDM5 et contrôler la prolifération cellulaire.La deuxième partie de cette thèse est consacrée à un nouveau sujet de recherche pour la communauté scientifique :l’étude des longs ARNs non codants (lncRNAs). Des études pionnières révèlent que quelques lncRNAs sont impliqués dans les cancers du sein. Des milliers de lncRNAs existent, mais très peu ont été caractérisés. Dès lors, nous avons décidé d’évaluer globalement leur profil d’expression dans une large cohorte de cancers du sein. Nous avons identifié 215 lncRNAs dérégulés dans les tumeurs. Nos résultats révèlent que l’expression des lncRNAs permet de classer les cancers du sein en différents sous-types. Des analyses bioinformatiques ont permis de prédire leurs fonctions et leurs implications dans différentes voies moléculaires clés du cancer du sein telles que les voies PI3K/AKT/mTOR et MAPK. Nous avons également découvert que 210 lncRNAs sont des marqueurs pronostics indépendants du risque de rechute. Enfin, nous avons choisi deux lncRNAs que nous avons étudiés expérimentalement. Nous avons montré que lnc-KIN-2 contrôle la prolifération cellulaire en régulant l’expression des gènes GATA3 et ESR1. Ensuite, nous avons découvert que CYTOR, un lncRNA surexprimé dans les tumeurs mammaires, régule des gènes de la voie EGFR/mTOR et est requis pour la prolifération et la migration cellulaire ainsi que pour le maintien du cytosquelette et de la morphologie normale de la cellule.En démontrant l’importance biologique des ARNs non codants dans le développement des tumeurs mammaires, ces résultats laissent entrevoir la mise en lumière de nouveaux mécanismes par lesquels ces ARNs particuliers, qui ne codent pas des protéines, contribuent au processus de cancérogénèse et pourraient devenir des nouvelles cibles thérapeutiques. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le domaine Dlk1-Dio3 est l’un des rares domaines imprimés contrôlés par une région de contrôle d'impression méthylée sur le chromosome paternel, nommée IG-DMR. Dans l’embryon, au niveau du domaine Dlk1, Rtl1 et Dio3 les gènes codant pour des protéines sont exprimés à partir du chromosome paternel, tandis que les ARNs non-codants dont Meg3, les snoRNAs à boite C/D et les micro-ARNs sont exprimés à partir du chromosome maternel.Il a été montré que la copie maternelle de l'IG-DMR est nécessaire pour l'expression des gènes imprimés de ce domaine et que les ARNs de types enhancer (de la même région) activent la transcription des ARNs non-codants. Cependant, les mécanismes qui régulent l'expression imprimée de gènes codant pour des protéines restent indéterminés. Dans ce projet, nous avons cherché à élucider les mécanismes qui contrôlent l'expression spécifiquement paternelle des gènes codant pour des protéines ainsi que le rôle possible des ARNs non-codants dans ce processus.Pour nos études alléliques, nous avons utilisé des cellules ES hybrides qui ont été obtenues en croisant des lignées de M. musculus domesticus et M. musculus molossinus. Ces cellules ont été différenciées in vitro dans des lignées neurales. Dans les cellules ES, l'expression Dlk1 est détectée à partir des deux chromosomes parentaux à des niveaux très bas. Lors de la différenciation, l'allèle paternel de Dlk1 devient actif tandis que le niveau d'expression de l'allèle maternel reste faible. Nos études de la chromatine ont montré que cette surexpression est due à l’activation de la chromatine sur l'allèle paternel de Dlk1.L'un de nos objectifs était d'explorer le rôle de Meg3 (un long ARN non-codant) dans la régulation de l’empreinte de Dlk1. A cet effet, nous avons généré des cellules souches embryonnaires déficientes en Meg3. Dans toutes les lignées déficientes, de suppressions maternelles ou bi-alléliques, nous avons constaté une perte d’expression de tous les ANRs non-codants. De plus, l’expression de Dlk1 devient bi-allélique dans ces cellules. Pour élucider le mécanisme de l'empreinte de ce gène, nous avons décidé d'étudier les caractéristiques de la chromatine au niveau du promoteur Dlk1 dans les cellules déficientes en Meg3. Nous avons examiné les modifications activatrices et répressives des histones ainsi que l'occupation de l'ARN Pol II. Nous avons observé l'acquisition des marques d’une chromatine active sur les deux chromosomes ainsi que le recrutement bi-allélique de l'ARN Pol II.Bien que nous n’ayons pas pu détecter une perte de la marque répressive H3K27me3 suite à la surexpression de Dlk1, nous avons observé un gain d'acétylation sur ce résidu lysine. Afin de comprendre davantage le rôle de la marque H3K27me3 sur l’empreinte de Dlk1, nous avons généré des cellules ES dépourvues de EZH2, la méthyltransférase de H3K27. L’expression de Dlk1 dans les cellules différenciées dépourvues de H3K27me3 est bi-allélique.Enfin, ces données suggèrent que l'expression des ARNs non-codant empêche l'activation de Dlk1 sur le chromosome maternel via l’activité de EZH2 au cours du développement. / The Dlk1-Dio3 imprinted domain is one of the few imprinted domains that are controlled by a paternally methylated imprinting control region, IG-DMR. Protein-coding genes of the domain, Dlk1, Rtl1 and Dio3 are expressed from the paternal chromosome, and non-coding RNAs (ncRNAs) including Meg3, C/D box snoRNAs and microRNAs are expressed from the maternal chromosome exclusively in the embryo. Maternal copy of the IG-DMR is required for the imprinted gene expression at this domain. Enhancer RNAs transcribed from this region are involved in activation of ncRNA expression on the maternal chromosome. However, the regulation of imprinted expression of protein-coding genes remains unknown. In this project, we aimed to elucidate the mechanisms controlling the paternal specific expression of protein-coding genes and a possible role of ncRNAs in this process.For our allelic studies, we made use of hybrid ES cells that were obtained by crossing M. musculus domesticus and M. musculus molossinus strains. These cells were differentiated in vitro into neural lineages. In ES cells, Dlk1 expression is detected from both parental chromosomes at very low levels. Upon differentiation, paternal allele of Dlk1 gets activated while low level of expression is detected from maternal allele. Our chromatin studies showed that this upregulation is through the acquisition of active chromatin on the paternal allele of Dlk1.One of our aims was to explore the role of Meg3 long non-coding RNA (lncRNA) in the regulation of Dlk1 imprinting. For this purpose, we generated ES cells deficient in Meg3. In all maternal or biallelic deletion lines, we observed complete loss of all ncRNA expression. Interestingly, in these cells Dlk1 expression becomes biallelic. To elucidate the mechanism of imprinting of this gene, we set out to study the chromatin features at the Dlk1 promoter in Meg3 deficient cells. We looked into active and repressive histone modifications and RNA Pol II occupancy. We observed acquisition of active chromatin marks on both chromosomes as well as biallelic recruitment of RNA Pol II.Although we could not detect a loss of repressive mark H3K27me3 upon Dlk1 upregulation on the paternal allele, we observed gain of acetylation on this lysine residue. To further investigate the role of H3K27me3 mark on Dlk1 imprinting, we generated ES cells that lack functional EZH2, the H3K27 methyltransferase. Dlk1 is biallelically expressed in the differentiated cells that are devoid of H3K27me3.Combined, these data suggest a model in which non-coding RNA expression prevents the developmental activation of Dlk1 on the maternal chromosome by a process that also requires the activity of EZH2.

Dans les cellules de souris, l'hétérochromatine péricentromérique, caractérisée par les répétitions des satellites majeurs et une signature épigénétique spécifique, la triméthylation de l'histone H3 sur la lysine 9 (H3K9me3), est organisée en structures nucléaires particulières appelées chromocentres. Cette région est transcriptionnellement active, produisant des ARN non-codants. Pour caractériser le profil transcriptionnel des satellites majeurs, nous avons utilisé des oligonucléotides LNA séquence spécifiques, pour des expériences de northern blot. Nous avons mis en évidence un profil de transcription complexe, révélé avec les sondes conçues pour cibler les deux brins des répétitions des satellites majeurs. Ce profil est modulé en réponse au choc thermique, condition dans laquelle un court ARN transcrit par l'ARN polymérase III, est surexprimé. Cependant, des problèmes de spécificité inhérents à l'utilisation de ces sondes LNA, ne nous ont pas permis de confirmer que les transcrits détectés ont pour origine les satellites majeurs. La seconde partie de ce travail a consisté en l'étude de l'impact de la modification ciblée de H3K9me3 aux satellites majeurs par une protéine TALE fusionnée à l'histone déméthylase mJMJD2D. Nous avons montré que le signal H3K9me3 est aboli dans les cellules transfectées avec cette protéine TALE. La déméthylation provoque des changements morphologiques des chromocentres, tels que l'augmentation de la taille des foci de satellites majeurs, accompagnés par la diminution de leur nombre, suggérant la fusion de plusieurs chromocentres. / In mouse cells, pericentromeric heterochromatin, characterized by major satellite repeats and a specific epigenetic signature, the trimethylation of the histone H3 at lysine 9 (H3K9me3) is organised in particular nuclear structures called chromocenters. This region is actively transcribed, producing non-coding RNA. To investigate the transcriptional profile of major satellites, we made used of the sequence specific LNA modified oligonucleotides in northern blot experiments. We have shown that a complex transcriptional pattern is revealed with the probes designed to target both strands of the major satellite repeat. This pattern is modified in response to heat shock, in which we reveal that a short, RNA polymerase III-transcribed RNA is overexpressed. However, specificity problems encountered with the use of these LNA probes inabled us to confirm with certainty the major satellite origin of the detected transcripts. The second part of this work consisted in the studying of the impact of the targeted modification of the H3K9me3 at the major satellites by a TALE protein fused to a histone demethylase, mJMJD2D. We have shown that the H3K9me3 signal is abolished in the cells transfected with this TALE protein. The demethylation triggers morphological changes of the chromocenters such as the increase of the major satellite foci size, that are accompanied by the decrease in the foci number, suggesting the merging of several chromocenters.

Le cancer du sein représente à l’échelle mondiale le deuxième cancer le plus fréquent et la première des tumeurs malignes de la femme. Actuellement, seuls certains biomarqueurs (RO, RP, récepteur HER2, index Ki67) et la signature transcriptomique PAM50 sont pris en compte dans la classification morphologique et l’orientation thérapeutique. Les analyses transcriptomiques à haut débit ont révélé que plus de 80% du génome humain est transcrit en ARN. Parmi les ARNs non codants, les transcrits dont la longueur est supérieure à 200 nt sont arbitrairement qualifiés de longs ARNs non codants (lncRNAs). Les lncRNAs jouent un rôle crucial dans le maintien de l’homéostasie cellulaire et présentent des profils d’expression anormaux dans diverses pathologies, dont le cancer. L’objectif principal de mon projet de thèse a consisté à analyser l’expression des lncRNAs, leur fonctionnalité et leur rôle dans l’oncogénèse mammaire. La première partie s’est focalisée sur l’étude des gènes ANRIL (ainsi que 10 gènes de la même voie de signalisation) et MALAT1, deux lncRNAs dont les mécanismes d’action et la signification clinique au cours de la cancérogénèse mammaire sont encore controversés. ANRIL et MALAT1 sont respectivement surexprimés dans 20% et 14% des tumeurs de notre série, confirmant leurs rôles pro-oncogénique dans la cancérogénèse mammaire. La surexpression de MALAT1 se traduit en RNA-FISH par la présence de volumineux speckles intranucléaires. La complexité de leur dérégulation est liée à la présence d’isoformes et de réseaux d’interactions avec les mRNAs et les miRNAs. Concernant les sous-unités appartenant aux complexes Polycomb PRC2 et PRC1qui interagissent avec ANRIL, EZH2 (PRC2) est normalement ciblé par 3 miRNAs onco-suppresseurs (miR-26A1, miR-125B et miR-214) qui sont sous-exprimés dans notre série de CCIs. Les 2 oncomiRs miR-181B1 and miR-181A2 qui ciblent et inactivent CBX7 (PRC1), apparaissent surexprimés dans notre série, en relation avec l’activation de l’oncogène HMGA1. Concernant MALAT1, le complexe de biogénèse des miRNAs Drosha-DGCR8-Microprocesseur régule l’expression d’un variant d’épissage ∆-MALAT1 et ce dernier est impliqué dans l’activation de la voie PI3K/Akt. Des corrélations significatives sont observées entre MALAT1 et des gènes impliqués dans l’épissage alternatif, le cycle cellulaire, l’apoptose, la réparation de l’ADN et la migration cellulaire. Les profils transcriptomiques aberrants de ces 2 lncRNAs semblent caractéristiques des carcinomes mammaires. Ainsi, ANRIL (i) présente une association positive inattendue avec le cluster p16-CDKN2A/p15-CDKN2B/p14-ARF dans notre série, alors que cette association apparait négative dans les carcinomes de prostate et (ii) inactive épigénétiquement les miRNAs onco-suppresseurs miR-99a/miR-449a dans les carcinomes gastriques et non dans notre série de CCIs. D’un point de vue clinique, deux signatures pronostiques indépendantes ont pu être identifiées, l’une intégrant les 2 partenaires protéiques d’ANRIL appartenant aux complexes Polycomb (surexpression d’EZH2 / sous-expression de CBX7), et l’autre représentée par la sous-expression de Δ-MALAT1, observée dans 20% des tumeurs de notre série. La présence de variants d’épissage alternatifs, de réseaux d’interactions multiples et d’une spécificité d’organe devra être prise en compte lors de l’évaluation des thérapies épigénétiques ciblant ANRIL (inhibiteurs des bromodomaines et des oncoMIRs) ou MALAT1 (ASOs) dans les cancers du sein. La deuxième partie du projet de thèse a consisté en l’analyse du transcriptome non codant des carcinomes mammaires par une stratégie pangénomique, afin d’identifier de nouveaux types de lncRNAs, tels les nouveaux lncRNAs antisens, circulaires et associés à des séquences ultra-conservées ou induisant des résistances médicamenteuses. / Breast cancer is the second most common cancer and the first malignancy of women. Currently, only few biomarkers (ER, PR, receptor HER2, index Ki67) and transcriptomic signature PAM50 are included in the morphological classification and therapeutic orientation. Transcriptome genome-wide analyses unexpectedly revealed that over 80% of the DNA is transcribed into RNA. Among these noncoding RNAs, transcripts longer than 200 nt are arbitrarily qualified as long noncoding RNAs (lncRNAs). LncRNAs play a crucial role in maintenance of cellular homeostasis and present abnormal expression patterns in various diseases, including cancer. The main objective of my project was to analyze expression of lncRNAs, their functionality and their roles in breast oncogenesis. The first part focused on the study of ANRIL and MALAT1 genes, two lncRNAs whose mechanisms of action and clinical significance in breast carcinogenesis are still controversial. ANRIL and MALAT1 respectively overexpressed in 20% and 14% of tumors in our series, confirming their pro-oncogenic roles in mammary carcinogenesis. MALAT1 overexpression results in RNA-FISH by presence of huge intranuclear speckles. Complexity of their deregulation is associated with presence of various isoforms and interaction networks with miRNAs, mRNAs and other lncRNAs. Concerning PRC2/PRC1 polycomb sub-units interacting with ANRIL, EZH2 (PRC2) is normally targeted by 3 onco-suppressor miRNAs (miR-26A1, miR-125B and miR-214) that are under-expressed in our series of CCIs. The 2 oncomiRs miR-181B1 and miR-181A2 that normally target and inactivate CBX7 (PRC1) appear overexpressed in our series of CCIs, resulting from activation of the oncogene HMGA1. Concerning MALAT1, the miRNAs biogenesis complex Drosha-DGCR8-Microprocessor regulates expression levels of the splicing variant Δ-MALAT1 and the latter is involved in activation of PI3K/Akt pathway. Significant correlations were observed between MALAT1 and genes involved in alternative splicing, cell cycle, apoptosis, DNA repair and migration. Aberrant transcriptomic profiles of these two lncRNAs seem characteristics of mammary carcinomas. Thus, ANRIL (i) presents an unexpected positive association with the p16-CDKN2A/p15-CDKN2B/p14-ARF cluster in our series of CCIs, whereas this association appears negative in prostate carcinomas and (ii) epigenetically inactivates onco-suppressor miRNAs miR99a/miR-449a in gastric carcinomas, but not in our series. From a clinic point of view, two independent prognostic signatures were identified, one incorporating two protein partners of ANRIL belonging to the polycomb complexes (EZH2 overexpression / CBX7 under-expression) and the other represented by under-expression of the variant Δ-MALAT1 observed in 20% of tumors in our series. The presence of alternative splice variants, multiple interactions with mRNAs and miRNAs and organ specificity should be considered when evaluating epigenetic antitumoral drugs designed to target ANRIL (bromodomains and oncoMIRs inhibitors) and MALAT1 (ASOs) in breast cancers. The second part of the project involved analysis of non-coding transcriptome of mammary carcinomas to identify new types of lncRNAs, including new antisens lncRNAs, circular lncRNAs, induced lncRNAs, noncoding ultraconserved transcripts and lncRNAs associated with resistance to systemic treatments. The preliminary analysis performed on a small cohort of breast cancers (n=8) will allow the implementation of the main (n=40) which will enhance robustness of identified signatures.

Le carcinome hépatocellulaire (CHC) est la forme la plus fréquente de cancer du foie et l’une des principales causes de mortalité par cancer dans le monde. Il s’agit d’une maladie de mauvais pronostic, aux ressources thérapeutiques limitées, hétérogène sur le plan immunophénotypique et génomique, qui se développe très souvent sur un foie remanié cirrhotique. Les études moléculaires ont révélé plusieurs sous-classes de CHC caractérisés par des signatures génomiques et protéomiques distinctes. Au cours de mon travail de thèse, nous avons contribué à améliorer notre compréhension de la biologie des CHC et des classifications moléculaires en cartographiant le génome non-codant de tumeurs de CHC induites par des virus hépatotropes (VHB, VHC) et en étudiant la sous-classe moléculaire de CHC la plus agressive KRT19-positif. Nous avons établi la première carte de transcriptome à ARN non codants du CHC et révélé une forte activation intra-tumorale des rétrotransposons à LTR, qui sont principalement inhibés dans les cellules hépatiques normales, dans des CHC induits par les VHB et VHC. Certains des transcrits dérivés de LTR se sont révélés être des régulateurs clés de l’expression génique et donc activer la croissance cellulaire. Dans la deuxième étude, nous identifions une nouvelle voie de régulation des CHC KRT19-positif affectant le métabolisme énergétique de ces tumeurs. Les CHC KRT19-positif sont des tumeurs fortement glycolytiques liée à une activation de la réponse à l’hypoxie. L’excès de production par les CHC KRT19-positif de l’oncométabolite 2-hydroxyglutarate en absence de mutation des gènes IDH1 et IDH2 était associé à un profil aberrant hyperméthylé sur la lysine 9 de l’histone H3 (H3K9me3) suggérant une répression de la transcription notamment des gènes impliqués dans la différenciation cellulaire. / Hepatocellular carcinoma (HCC) is the main primary liver cancer and one of the most leading cause of cancer-related death worldwide. This heterogeneous disease with a worse prognosis has been subjected of numerous studies aimed to establish global phenotypic profiles. During my thesis, I dedicated my work to improve these classifications by identifying signatures on the non-coding genome and working on a very aggressive form of HCC expressing progenitors markers. With help of a Japanese team, we demonstrated that LTR-derived ncRNAs were active in HCC and that correlation correlates with expression of common cancer markers (GPC3) ans TP53 mutations. This signature can also be used to discriminate HCCs at high risk of recurrence. Finally, we have showed that these LTRs are detectable on prenoplastic stages in the Mdr2 KO mouse model. In parallel, I worked on HCC that expresses progenitor markers such as cytokeratin 19. Using proteomic and transcriptionnal approaches and in silico analyses, we propose that the occurrence of this type of cancer id due to an hypoxic event likely related to trans-arterial chemoembolization. These tumors have a highly glycolytic phenotype with production of an oncometabolite (2-hydroxyglutarate) that has been generally foubd in IDH1/2 mutated cholangiocarcinomas. Finally we suggest the use of metformin, type 2 diabetes drug, to reverse metabolic reprogramming and restore sensitivity to chemotherapy

Les ARN non-codant (ARNnc) assurent différentes fonctions vitales permettant aux bactéries de s'adapter rapidement aux conditions changeantes de leur environnement L'analyse de données transcriptomiques de la souche Pseudomonas brassicacearum NFM421 en réponse à différents stress en utilisant des puces à ADN qui contiennent aussi bien les régions codantes que les régions non codantes a révélé la modulation de deux ARNnc potentiels en réponse à des métaux lourds (Cd et U), dénommés IrsZ et IrsY. De plus, le génome de P. brassicacearum a été entièrement séquencé et une centaine d'ARNnc potentiels a été identifié par l'utilisation d'outils bioinformatiques de prédiction d'ARNnc. Ce travail vise à caractériser les deux ARNnc potentiels, IrsZ et IrsY, et à déterminer leur fonction chez P. brassicacearum. L'analyse bioinformatique de leur séquence ne révèle pas d'homologue dans la base de données des ARNnc. Nous avons validé expérimentalement par différentes approches techniques l'expression des deux ARNnc candidats dans différentes conditions de cultures et sous différents stress. Ceci a conduit notamment à révéler la modulation par le fer de l'expression des deux ARNnc IrsZ et IrsY. Leur expression est fortement activée par de fortes concentrations en fer. Cependant, en réponse à un stress oxydant causé par le peroxyde d'hydrogène, l'expression des deux ARNnc est réprimée. Cette répression est exacerbée chez les bactéries surexprimant oxyR. Nos travaux semblent indiquer que IrsZ et IrsY agissent comme des senseurs du statut intracellulaire du fer. / Regulatory non-coding RNAs (ncRNA), act as regulators of translation and message stability. They modulate a wide range of physiological responses to environmental stimuli. Due to their biological interest, different bioinformatics tools and experimental approaches have been developed for detecting new ncRNA. Transcriptome analysis of the plan root-associated bacterium Pseudomonas brassicacearum NFM421 strain in response to various stresses, using microarrays containing coding as well as non-coding DNA fragments, revealed the modulation of two potentials ncRNA in response to heavy metals (Cd and U), named IrsZ and IrsY. Furthermore, P. brassicacearum genome was completely sequenced and hundreds of potentials ncRNA have been predicted by using computational tools. This work aims at characterizing the two potentials ncRNA, IrsZ and IrsY, and to determine their function in P. brassicacearum. No homologous was found in the ncRNA database. We validated the expression of the two potential ncRNA by different experimental approaches in different culture conditions and under different stresses. This led to reveal that both IrsZ and IrsY are modulated by iron. Their expression is strongly activated by high concentrations of iron. However, the expression of both Irs ncRNA is suppressed under oxidative stress generated by hydrogen peroxide. This repression is exacerbated in P. brassicacearum overexpressing oxyR. Our work suggests that IrsZ and IrsY act as sensors of intracellular iron status.

L’ARN non-codant 7SK forme la charpente d’un complexe, 7SK snRNP, qui régule l’activité du facteur d’élongation de la transcription P-TEFb, intervenant dans la levée des pauses transcriptionelles chez les métazoaires. Le 7SK snRNP comprend les protéines LARP7, essentielle pour la stabilité de l’ARN 7SK et MePCE, participant à sa coiffe. Dans le cadre d’une investigation du rapport entre structure et fonction de l’ARN7SK, le projet était de comprendre commen la protéine LARP7 reconnait et assemble l’ARN dans le 7SK snRNP. La protéine LARP7, membre d’une famille reliée à laprotéine La, est spécifique de 7SK. Les éléments responsables de l’interaction ont été analysés par des méthodes biochimiques dans des complexes reconstitués à partir d’ARN synthétique et de protéines recombinantes. Le module La, dans la région N-terminale, reconnaît et lie les trois uridines à l’extrémité 3’ de l’ARN et, additionellement,une séquence conservée au pied de la tigeboucle en 3’, induisant une conformation fermée de l’ARN. L’autre extrémité de la protéine comprend un domain RRM de reconnaissance de l’ARN, qui se lie à la boucle apicale de la tige-boucle 3’. La protéine LARP7 reconnaît également une région conservée au centre de l’ARN. Dans l’ensemble, LARP7 utiliserait ses domaines terminaux et central pour envelopper l’ARN et le stabiliser. Au cours de ces travaux, une interaction directe du domaine C-terminal avec la tige-boucle 5’ a également été mise en évidence. Celle-ci comprend le site de liaison à la HEXIM, la protéine qui déclenche l’interaction avec P-TEFb et un rôle fonctionnel de LARP7 est envisagé. / The non-coding RNA 7SK is the scaffold for the 7SK snRNP complex that regulates PTEFb, the positive transcription elongation factor, which relieves transcription pauses in metazoans. The 7SK snRNP comprises the proteins LARP7, essential for 7SK stability and MePCE, involved in capping. In the frame of an investigation of how the structure of the7SK RNA sustains its function, the project was to understand how is the RNA recognized and assembled in the 7SK snRNPby the associated protein LARP7. LARP7, a La-related protein is specific for 7SK. The elements responsible for the interaction were investigated by biochemical approaches in vitro with complexes reconstituted from purified recombinant proteins and transcribed RNA. The La-module of LARP7 recognizes and binds the triplet of uridines at the 3’-end of the 7SK RNA and additionally binds to a conserved region at the foot of the 3’-hairpin.This may stabilize a closed conformation of the 7SK. On the other end of the LARP7molecule, the C-terminal domain comprising a RRM (RNA Recognition Motif) binds to the apical loop of the 3’hairpin. Further investigations showed that a conserved region in the core of the RNA is also involved. On the whole, this strongly suggests thatLARP7 wraps around 7SK using its N terminal, C-terminal and linker domains to ensure the RNA stabilization into a functional core. In the course of the investigation, was revealed a direct interaction of the C-terminal domain of LARP7 with the 5’-hairpin of the RNA, which is responsible for 7SK function as it contains the binding site of HEXIM, the protein which bridges 7SK and P-TEFb. A possible functional role of LARP7 is envisioned.

Les virus à ARN sont à l’origine de nombreuses épidémies depuis ces dernières décennies. Malgré des avancées thérapeutiques majeures, une majorité d’infection est orpheline de traitement. Le développement d’antiviraux à spectre large est une alternative thérapeutique pour maximiser le nombre de virus ciblés, minimiser les coûts de production et améliorer la prise pour les patients. Afin de trouver de nouvelles cibles cellulaires, la compréhension des mécanismes moléculaires utilisés par les virus pour infecter l’hôte est essentielle.Les virus utilisent des facteurs cellulaires pour survivre et se propager. Parmi ceux-ci, on trouve les microARNs (miARNs) et les longs ARNs non-codants (lncARNs) qui peuvent participer à la réponse antivirale mais peuvent également être détournés par les virus pour favoriser l’infection. Ces d’ARN non-codants peuvent interagir avec des protéines cellulaires (« RNA-binding protein » (RBP)) telles que la protéine KSRP. Cette RBP est impliquée dans le contrôle de l’expression des ARNs en participant à l’épissage de certains pré-ARNm, à la dégradation des ARNs contenant des séquences riches en AU et à la maturation de certains miARNs. Ses fonctions et sa localisation sont dépendantes de la phosphorylation de certains résidus par les kinases cellulaires Akt, ATM et p38/MAPK.Le but de ma thèse a été d’étudier la modulation de l’expression de ces deux classes d’ARN non-codants au cours de l’infection par des virus à ARN tels que le virus de l’Hépatite C (VHC) et la souche HCoV-229E des Coronavirus. Plus particulièrement nous avons cherché à étudier l’implication de KSRP dans la régulation d’ARN non-codants essentiels pour ces infections.Mes recherches ont commencé par l’étude de la maturation du microARN-122 (miR-122), un facteur proviral de l’infection par le VHC. Nous avons montré que KSRP phosphorylée sur le résidu S193 par Akt interagissait avec le complexe nucléaire DROSHA/DGCR8 et ainsi était essentielle à la maturation du pri-miR-122 en miR-122 favorisant la réplication virale. Notre avons ensuite étudié le rôle des phosphorylations de KSRP par ATM et p38/MAPK sur la réplication et sur la maturation du miR-122. La phosphorylation par ATM ne semble pas jouer un rôle majeur sur ces deux paramètres. En revanche, la phosphorylation de KSRP sur le résidu T692 par la kinase p38/MAPK semble jouer un rôle positif sur la réplication VHC.Dans un second temps, par homologie avec les résultats obtenus dans le cas du VHC, nous avons étudié le rôle de KSRP lors de l’infection par la souche HCoV-229E des Coronavirus. En transfectant un siKSRP ou un plasmide exprimant la protéine KSRP, nous avons pu démontrer que KSRP était un facteur proviral pour la réplication virale.Afin d’identifier les ARN non-codants modulés au cours de l’infection HcoV-229E et dont l’expression pouvait être régulée par KSRP, nous avons effectué deux analyses de séquençage à haut débit (« NGS »). L’analyse réalisée sur des cellules infectées vs non-infectées nous a permis d’identifier l’ensemble des miARNs et lncARNs dérégulés par le virus. Nous avons croisé ces résultats avec un second « NGS » fait sur des cellules infectées, inhibées pour KSRP et nous avons trouvé que l’expression du LinC00473 était modulée dans les deux conditions expérimentales. En étudiant ce facteur cellulaire au cours de l’infection nous avons observé une forte induction KSRP-dépendante du LinC00473 à 24 h post-infection, puis une diminution à 48 h post-infection. L’inhibition de ce facteur entraîne une diminution de la réplication virale suggérant que le LinC00473 est un facteur proviral au début de l’infection.Nos résultats ont permis de montrer le rôle proviral de la protéine KSRP lors de deux infections virales (VHC et HCoV-229E des Coronavirus). Son implication dans la régulation de l’expression des ARNs fait de cette protéine un outil efficace pour découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques ARN non-codants au cours d’autres infections virales. / Résumé en anglaisRNA viruses have been the cause of many epidemics in recent decades. Despite major therapeutic advances, a majority of infection is currently orphan for treatment. The development of new broad spectrum antivirals is a therapeutic alternative to maximize the number of targeted viruses, minimize production costs and improve access to population. In order to find new cellular targets for this type of therapeutic approach, understanding the molecular mechanisms used by RNA viruses to infect the host is essential.Viruses exploit cellular factors to survive and to disseminate. Among those factors, microRNA (miRNA) and long non-coding RNA (lnCRNA) can participate to cellular antiviral response but can also be hijacked by the virus to improve the infection. These two families of non-coding RNA could interact with cellular RNA-binding protein (RBP) such as KSRP. This ubiquitous protein is involved in RNA expression control via its participation to pre-mRNA splicing, decay of AU-rich element mRNA and maturation of microRNAs. The functions and localization of KSRP are dependent of post- modification by the cellular kinases Akt, ATM and p38/MAPK.The aim of my thesis was to study the modulation of the expression of these two classes of non-coding RNA during infection by RNA viruses such as the hepatitis C virus (HCV) and the HCoV-229E strain of the Coronaviruses. More specifically, we evaluated the involvement of KSRP in the regulation of non-coding RNAs essential for these infections.My research project began with the study of microRNA-122 (miR-122) the maturation. This miRNA is a proviral factor for HCV infection. We have shown that the Akt-dependent phosphorylation of S193-KSRP promoted the interaction of pri-miR-122 with the DROSHA / DGCR8 nuclear complex and thus was essential for the maturation of miR-122, finally promoting viral replication. We then investigated the role of KSRP phosphorylation by ATM and p38 / MAPK on viral replication and on miR-122 maturation. ATM phosphorylation does not seem to play a major role in these two parameters. In contrast, phosphorylation of KSRP on the T692 residue by p38 / MAPK kinase appears to play a positive role on viral replication.In a second step, by homology with the results obtained in the case of the HCV infection, we studied the role of KSRP during the infection with the HCoV-229E strain of Coronaviruses. After siKSRP transfection or exogenous expression of the KSRP protein, we were able to demonstrate that KSRP was a proviral cellular factor for HCoV-229E replication.In order to characterize the modulation of non-coding RNAs expression during HcoV-229E infection and to identify the non-coding RNAs whose expression could be regulated by KSRP, we performed two high-throughput sequencing ("NGS") assays. The analysis performed on infected and non-infected cells allowed us to identify all the miRNAs and lncRNAs whose expression was altered by the virus. We cross-examined these results with a second "NGS" performed on HCoV-229E infected cells inhibited for KSRP. We found that the expression of an InCARN (LinC00473) was modulated under both experimental conditions. We demonstrated a strong KSRP-dependent induction of LinC00473 expression at 24 h post-infection, then a decrease at 48 h post-infection. Inhibition of this factor results in decreased viral replication suggesting that LinC00473 is a proviral cell factor at the onset of infection.Our results have shown the proviral role of the KSRP protein during two viral infections (HCV and HCoV-229E of the coronaviruses). Its involvement in the regulation of RNA expression makes of KSRP an effective tool for discovering new non-coding RNA therapeutic targets for other viral infections

Bordetella pertussis, l’agent responsable de la coqueluche, provoque près de 200000 morts par an dans le monde. Malgré une forte couverture vaccinale, une réémergence de la maladie a été observée dans les pays développés, liée en partie à une adaptation à la pression vaccinale. Les souches capables d’échapper à la réponse immunitaire montrent des réarrangements génomiques importants, provoqués par des éléments génétiques mobiles (IS) présents en plus de 230 copies, qui pourraient impacter sur la transcription des gènes et ARN régulateurs du pathogène.Pour élucider l’impact des IS sur le transcriptome global de Bordetella pertussis, nous avons d’abord déterminé le transcriptome codant et non-codant du pathogène par des approches de séquençage d’ARN couplées à des prédictions bioinformatiques. Cette étude a permis d’identifier les structures codantes mono- et polycistroniques, incluant des structures régulatrices telles que des riboswitches, un excludon et de longs 5’ et 3’UTR chevauchants. Une cartographie de candidats ARN régulateurs non-codant a été édifiée à partir de nouveaux transcrits localisés en régions intergéniques (IGR) et de transcrits orientés en antisens de séquences codantes. Des prolongements de transcriptions des IS ont été observés, prenant leur origine de promoteurs internes à l’IS ou formés par insertion de celles-ci. Ces transcrits sont spécifiques d’une souche à l’autre du pathogène, et s’orientent en sens ou en antisens des gènes environnant, ou dans des IGR. Le potentiel caractère régulateur de ces transcrits a été étudié par la caractérisation et l’étude du mode d’action d’un ARN régulateur, BPnc264, orienté en antisens du gène de virulence fim2. / Bordetella pertussis, the causative agent of whooping cough, is responsible of more than 200000 deaths worldwide. Despite a high vaccine coverage in developed countries, a reemergence of the disease has been observed, which is in part linked to vaccine-pressure. Strains able to evade vaccine-induced immunity show high genome organization rearrangements, essentially due to mobile genetic elements (IS) present in more than 230 copies, which could impact on messenger and regulatory transcription of the pathogene.To assess the impact of IS on the global transcriptome of Bordetella pertussis, we first determined the coding and non-coding primary transcriptome by a combination of differents RNA-sequencing approaches and predictive bioinformatics analysis software packages. We identify mono- and polycistronic coding structures, including regulatories structures like riboswitches, excludon, and long overlapping 5’ and 3’UTR. A list of candidates regulating transcripts (small RNA) has been mapped from new transcripts located in intergenic regions (IGR) and transcripts oriented in antisense of annotated coding sequences. Extended transcriptions emerging from IS elements have been observed, originating from internal promoters or newly formed promoters by insertion in a specific genomic region. Those transcripts can extend in sense or in antisense of the flanking gene, or in IGR. The regulatory function of those transcripts has been studied from the characterization and the mode of action of an extended regulatory RNA, BPnc264, oriented in antisense of the virulence gene fim2.