O câncer de mama é o carcinoma que mais acomete mulheres no Brasil. Os tratamentos disponíveis são recomendados a partir da análise de fatores de prognóstico como a classificação pelo sistema TNM, tipo histológico, status de receptores hormonais e marcadores de proliferação tumoral. No entanto, a classificação dos tumores de mama é muito variável e o poder prognóstico dos marcadores tumorais atuais ainda é limitado, levando muitas pacientes à terapia adjuvante desnecessária. Portanto, novos métodos de prognóstico mais sensíveis são necessários para melhorar a tomada de decisão na clínica oncológica de pacientes com câncer de mama. Do ponto de vista de ciência básica, as modificações transcricionais associadas à oncogênese e progressão do câncer de mama ainda são pouco conhecidas. Além da alteração na expressão de genes codificadores para proteínas, evidências recentes sugerem que RNAs não-codificadores (ncRNAs) podem ter um papel importante na transformação maligna. Este projeto teve como principais objetivos: i) investigar a expressão de ncRNAs intrônicos em amostras de adenocarcinoma de mama e ii) identificar assinaturas de expressão gênica associadas a características anatomo-patológicas e clínicas de tumores de mama com potencial aplicação clínica. Para isso, foram comparados os perfis de expressão gênica de 58 amostras de tecido tumoral de mama, com seguimento clínico conhecido, utilizando uma plataforma de microarranjos de cDNA, enriquecida em ncRNAs provenientes de regiões intrônicas de genes humanos conhecidos. 9 Durante o projeto foram testadas diferentes metodologias para análise da expressão gênica utilizando microarranjos de cDNA com uma ou duas cores. O desenho experimental das hibridizações incluiu a co-hibridização de cada microarranjo com alvos fluorescentes representando o transcritoma da amostra de tumor juntamente com um oligonucleotídeo referência complementar a uma região presente em todas as sondas de cDNA (RefOligo). Este desenho experimental permitiu a avaliação de duas abordagens de análise da expressão gênica: a primeira baseada nas intensidades diretas de cada transcrito (One-Color) e a segunda baseada em razões de expressão onde a intensidade de cada transcrito foi normalizada pelo oligonucleotídeo referência (RefOligo). A utilização direta das intensidades se mostrou mais reprodutível e sensível para a detecção de assinaturas de expressão correlacionadas com características das amostras de mama, e essa abordagem foi escolhida para as análises subseqüentes. Os dados provenientes dos experimentos de microarranjos revelaram níveis de expressão ubíqüos dos transcritos intrônicos nas amostras analisadas, extendendo para o câncer de mama a relevância do estudo desta classe de ncRNAs. Além disso, foi identificada uma assinatura contendo 95 transcritos, correlacionada com o status de expressão do receptor de estrogênio (REr), dos quais cerca de 15% correspondem a ncRNAs. Utilizando apenas amostras com seguimento clínico superior a 4 anos, foi identificada uma assinatura com 113 transcritos, dos quais cerca de 30% são ncRNAs intrônicos, capaz de distinguir com 100% de acurácia pacientes que desenvolveram metástase daqueles que permaneceram livres da doença. Além de contribuir com novos candidatos a marcadores de prognóstico no câncer de mama, este estudo aponta para a participação de ncRNAs intrônicos em complexas redes transcricionais, possivelmente modulando a expressão de genes codificadores para proteínas. A caracterização detalhada da função de ncRNAs com expressão correlacionada a características fenotípicas e clínicas dos tumores de mama deverá fornecer novas informações sobre as bases moleculares da tumorigênese e progressão desta neoplasia. / Breast carcinoma is the most frequently occurring cancer amongst women in Brazil. The treatments available for breast cancer are prescribed based on the results of prognostic factors, such as the TNM classification system, histological type, hormonal receptor status and tumoral markers for cell proliferation. Nevertheless, breast cancer classification can be variable and inconsistent, and the prognosis power of tumoral markers is still limited, resulting in many patients unnecessarily undergoing adjuvant therapy. Therefore, there is an urge for new prognosis methods that are more sensitive, as well as accurate, in order to improve treatment decisions for breast cancer patients. From a basic science perspective, transcriptional modifications associated with oncogenesis and breast cancer progression are still poorly understood. Beyond alterations of the expression of protein-coding genes, recent evidences suggest that non-coding RNAs (ncRNAs) might have an important role in malignant transformation. The main goals of this project are: i) to investigate the expression of intronic ncRNAs in breast cancer tissue and ii) to identify gene expression signatures correlated to anatomo-pathological and clinical characteristics of human breast tumors, with a potential clinical aplication. To achieve this, gene expression profiles of 58 breast tumor samples with clinical follow-up were compared using a microarray platform enriched in non-coding RNAs (ncRNAs) derived from intronic regions of known human genes. During this project different gene expression methodologies were tested for the analysis of one- or two-color cDNA microarrays. The experimental design included the co-hybridization of the microarrays with fluorescent targets representing the tumor sample transcriptome with a reference oligonucleotide that is complementary to a 12 common region present in all cDNA probes (RefOligo). This experimental design permited the evaluation of two gene expression analysis approaches: the first based on direct intensities of each transcript (One-Color) and the second based in expression ratios where the intensity of each transcript is normalized by the reference oligonucleotide (RefOligo). One-Color methodology has shown to provide a more reproducible and sensitive gene expression signatures correlated to the breast samples characteristics and, therefore, this approach was chosen for subsequent analysis. The data provided by the microarray experiments revealed that ubiquitous expression of intronic ncRNAs was observed, confirming the relevance of investigating the role of this class of ncRNAs in breast cancer. Furthermore, a gene expression signature comprising 95 transcripts and correlated to the estrogen receptor status of breast tumor samples was identified, from which approximately 15% are ncRNAs. Using only samples from patients with known follow-up, a signature of 113 transcripts was identified, of which 30% are ncRNAs. This gene expression signature was able to distinguish with 100% accuracy patients that developed metastasis from those that remained disease-free up to 4 years after surgery. Besides the contribution of new molecular prognostic markers for breast cancer, the present study indicates that intronic ncRNAs might play a role in complex transcriptional networks, possibly regulating the expression of protein-coding genes. The detailed caracterization of the functional roles of ncRNAs, whose expression levels are correlated to fenotypical and clinical characteristics of breast tumors, is likely to provide new insigths on the molecular basis of tumorigenesis and progression of this neoplasia.

O carcinoma de célula renal (RCC) subtipo célula clara é o câncer mais letal e prevalente do sistema urinário. O diagnóstico deste tipo de câncer frequentemente é tardio em conseqüência da falta de sintomas perceptíveis aos pacientes. Um dos objetivos deste trabalho é a identificação de novos marcadores moleculares para diagnóstico precoce, o que ajudaria a diminuir a mortalidade em função de complicações resultantes do avanço da doença. Outro objetivo é a identificação de um conjunto de marcadores moleculares de prognóstico, de modo à prever com acurácia a evolução clínica da doença e, por conseqüência, o tempo de sobrevida do paciente. As modificações transcricionais associadas à carcinogênese e à progressão do câncer de rim ainda não foram completamente elucidadas. Além dos oncogenes e genes supressores de tumor, RNAs não-codificadores (ncRNAs) recentemente foram apontados como importantes reguladores da expressão gênica em humanos, e podem ter um papel importante na transformação maligna do câncer de rim. Para analisar a expressão gênica de ncRNAs e de genes codificadores para proteína foram utilizados dois microarranjos desenvolvidos por nosso grupo, enriquecidos em sondas para ncRNAs. Uma das plataformas possui 4 mil sondas de cDNA, das quais 822 sondas são para ncRNAs mapeando em regiões intrônicas. Outra possui 44 mil elementos e combina sondas de oligonucleotídeos (60-mer) intrônicas e exônicas de um mesmo locus genômico. Análises estatísticas foram feitas com a ferramenta Significance Analysis of Microarrays (q &#8804; 0,05) combinadas ou com a técnica de \"patient leave-one-out\" (genes com presença em 8 100% dos subconjuntos), ou alternativamente com o teste discriminante de Golub (p &#8804; 0,01 ou p < 0,05). Com a plataforma de 4 mil sondas foram estudadas 30 amostras de tecido renal de 18 pacientes com RCC subtipo célula clara. Um conjunto de 36 ncRNAs foi identificado como diferencialmente expresso entre amostras tumorais e não-tumorais. Uma assinatura adicional de 265 genes codificadores de proteínas foi identificada, indicando possíveis novos marcadores moleculares. Uma análise estatística supervisionada com dados de 16 pacientes identificou uma assinatura de ncRNAs correlacionada com sobrevida de 5 anos, formada por 27 ncRNAs com significativa expressão alterada em pacientes livres da doença em comparação com pacientes que morreram em função da doença. Uma assinatura adicional de 64 genes codificadores de proteínas também foi identificada como significativamente correlacionada com o acompanhamento clínico dos pacientes. Com a plataforma de 44 mil sondas foram analisados 17 pacientes, com amostras pareadas de tecido renal tumoral e não-tumoral agrupadas em 8 pools, sendo 4 de amostras tumorais e 4 de não-tumorais. Um conjunto de 66 ncRNAs parcialmente intrônicos antisenso e outro de 52 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso foram identificados como diferencialmente expressos. Identificamos um subconjunto de 28 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso e senso cuja expressão do gene codificador de proteína do mesmo locus estava simultaneamente alterada. Estes dados apontam para possíveis redes de regulação da expressão gênica dos ncRNAs em câncer. A extensa lista de ncRNAs e de genes codificadores para proteína identificados neste estudo podem ser promissores marcadores moleculares de carcinoma renal subtipo célula clara. / Renal cell carcinoma (RCC) is the most common malignancy of the adult kidney, and the clear cell subtype is the most prevalent and lethal cancer of the urinary system. Late diagnosis for this type of cancer is frequent, usually as a consequence of the lack of symptoms. One of the objectives of the present work is the identification of new molecular markers for the early diagnosis, which would help decrease mortality that develops as a function of disease progression. Another objective is the identification of a set of prognosis molecular markers, so as to accurately predict the clinical outcome of the disease, and consequently, patient survival. Transcriptional changes associated to carcinogenesis and to kidney cancer progression have not been entirely elucidated. Besides oncogenes and tumor suppressor genes, non-coding RNAs (ncRNAs) have been recently indicated as important regulators of gene expression in humans, and could have an important role in the malignant transformation in renal cancer. In order to measure ncRNA and protein-coding gene expression we have used two microarray platforms developed by our group, which are enriched in ncRNA probes. One of the platforms has 4 thousand cDNA probes, of which 822 are for ncRNAs that map to intronic regions. Another has 44 thousand elements and combines 60-mer oligonucleotide probes for intronic and exonic regions from the same genomic locus. Statistical analyses have been performed with the Significance Analysis of Microarrays tool (q &#8804; 0.05) combined with a patient leave-one-out approach (genes present in 100% of the sub-sets), or alternatively with Golubs discriminant test (p &#8804; 0.01 or p < 0.05). 11 With the 4-thousand probes platform we studied 30 samples from renal tissue of 18 RCC patients with clear cell subtype. A set of 36 ncRNAs has been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. An additional signature of 265 protein-coding genes has been identified, indicating possible new molecular markers. A supervised statistical analysis with data from 16 patients has identified a ncRNA signature correlated to 5-year survival outcome, comprised of 27 ncRNAs with significantly altered expression in diseasefree patients compared to patients who died from cancer within the 5-year follow-up. An additional 64-gene signature of protein-coding genes has been identified as significantly correlated to clinical outcome. With the 44-thousand probes platform we have analyzed 17 patients, with paired tumor and non-tumor samples grouped into 8 pools, of which 4 were from tumor and 4 from nontumor samples. A set of 66 partially intronic antisense ncRNAs and another of 52 totally intronic antisense ncRNAs have been identified as differentially expressed between tumor and non-tumor tissue. A sub-set of 28 totally intronic antisense or sense ncRNAs were identified as having a simultaneous change in expression of the protein-coding gene from the same locus. Overall, the data point to a possible ncRNA regulatory network in cancer. The extensive lists of ncRNAs and of protein-coding genes identified in the present study can be seen as promising molecular markers of RCC from the clear-cell subtype.

[pt] As técnicas de estimação de movimento utilizadas nos padrões de compressão de vídeo proporcionam a utilização mais eficiente dos recursos de transmissão e armazenamento, através da redução do número de bits necessários para representar um sinal de vídeo e da conservação da qualidade do conteúdo que está sendo processado. O objetivo dessa dissertação de Mestrado é propor um novo algoritmo capaz de reduzir a grande complexidade computacional envolvida nestas técnicas, mantendo a qualidade do sinal reconstruído. Dessa maneira, apresenta-se um algoritmo AUMHS (Adaptive Unsymmetrical-cross Multi-Hexagon-grid Search) o qual traz como principais modificações ao algoritmo UMHS (Unsymmetrical-cross Multi-Hexagon-grid Search) a implementação de uma medida de movimento que classifica as cenas de uma seqüência de vídeo de acordo com o movimento detectado para posterior adequação dos parâmetros de estimação de movimento e de outros parâmetros do codificador. Como resultado apresenta-se um ganho expressivo na velocidade de processamento, e conseqüente redução do custo computacional, conservando-se a qualidade obtida pelos principais algoritmos da literatura. O algoritmo foi implementado no codificador do padrão H.264/AVC onde realizou-se análises comparativas de desempenho com os algoritmos UMHS e FSA através da medição de parâmetros como PSNR (Peak Signal to Noise Ratio), tempo de processamento do codificador, tempo de processamento do módulo de estimação de movimento, taxa de bits utilizada e avaliação subjetiva informal. / [en] The motion estimation techniques used by the video compression standards provide an efficient utilization of the transmission and storage resources, through the reduction of the number of bits required to represent a video signal and the conservation of the content quality that is being processed. The objective of this work is to propose a new algorithm capable of reducing the great computational complexity involved in the motion estimation techniques, keeping the quality of the reconstructed signal. In this way, we present an algorithm called AUMHS (Adaptive Unsymmetrical-cross Multi-Hexagon-grid Search) which brings as main modifications relative to the UMHS (Unsymmetrical-cross Multi-Hexagon-grid Search) the implementation of a movement measure that can classify the scenes of a video sequence according to the motion detected for posterior adequacy of the motion estimation and others coder parameters. As result we present an expressive gain in the processing speed, and consequent computational cost reduction, conserving the same quality of the main algorithms published in the literature. The algorithm was implemented in the H.264/AVC coder in order to proceed with comparative analysis of perfomance together with the UMHS and FSA algorithms, measuring parameters as PSNR (Peak Signal you the Noise Ratio), coding processing time, motion estimation time, bit rate, and informal subjective evaluation.

Há um amplo espectro de doenças causadas por estreptococos do grupo A (GAS), e são consideradas um problema de saúde pública em vários países, principalmente os em desenvolvimento, com aproximadamente 600 milhões de casos/ano. As infecções causadas por GAS podem ocasionar doenças invasivas como faringite e pioderma com seqüelas auto-imunes graves como a febre reumática (FR) e glomerulonefrite. A FR acomete principalmente crianças e jovens adultos. A FR apresenta diversas manifestações, sendo a doença reumática cardíaca (DRC) a seqüela mais grave, caracterizada por lesões cardíacas valvares progressivas e permanentes. O tratamento, frequentemente envolve cirurgia cardíaca para a correção de lesões valvulares, o que acarreta alto custo para o Sistema Único de Saúde no Brasil e em vários países. Em trabalhos anteriores sobre os mecanismos desencadeadores das lesões reumáticas no coração, foi possível identificar o papel do linfócito T como mediador principal da autoimunidade, através da análise do receptor de células T infiltrantes de lesão cardíaca de indivíduos com DRC. Várias expansões oligoclonais com diferentes tamanhos da região que reconhece o antígeno, CDR3 foram encontradas. No presente trabalho, analisou-se a atividade tímica através da quantificação de fragmentos circulares excisados pelo rearranjo do gene do receptor do linfócito T (TREC) em linfócitos T de sangue periférico de indivíduos com FR e DRC. Também foi avaliada a presença de células T naïve e de memória através de citometria de fluxo. Os resultados do presente trabalho mostraram que a quantidade de TREC em amostras de sangue periférico do grupo de pacientes com FR/DRC foi significantemente menor quando comparada a observada em indivíduos saudáveis. Interessantemente, em ambos os grupos a quantidade de TREC apresentou correlação negativa com a idade dos indivíduos estudados. Os resultados indicaram diferenças na atividade tímica em pacientes com FR/DRC, provavelmente decorrente do processo autoimune que envolve linfócitos T / There is a wide spectrum of diseases caused by group A streptococci (GAS), that still being considered a public health problem in developing countries, with about 600 million cases per year. Infections by GAS can cause invasive diseases such as pharyngitis and pyoderma leading to serious autoimmune complications such as rheumatic fever (RF) and glomerulonephritis. RF mainly affects children and young adults, and presents different manifestations. Rheumatic heart disease (RHD) is considered the most serious complication leading to valvular lesions that are characterized by progressive and permanent heart damage, which entails high cost to the Public Health System in Brazil and worldwide. In previous works that focused on the mechanisms leading to rheumatic heart lesions, we identified the role of T lymphocytes as principal mediator of autoimmune reactions. Through the in deep analysis of infiltrating T-cell receptor repertoire of patients with RHD, we identified oligoclonal expansions with different sizes of CDR3 that is the region of antigen recognition. In the present study we analyzed the thymic activity through T cell receptor excision circles (TREC) quantification in T cells from peripheral blood of RF/RHD patients. We also evaluated naïve and memory T cells from peripheral blood by flow cytometry. Our results showed that the amount of TREC in the peripheral blood of patients was significantly lower when compared to the healthy individuals. In addition, both groups showed that the amount of TREC is negatively correlated with age. These results indicated that the thymic activity in RF/RHD patients is altered probably due to the autoimmune process that involves T lymphocytes

Há um amplo espectro de doenças causadas por estreptococos do grupo A (GAS), e são consideradas um problema de saúde pública em vários países, principalmente os em desenvolvimento, com aproximadamente 600 milhões de casos/ano. As infecções causadas por GAS podem ocasionar doenças invasivas como faringite e pioderma com seqüelas auto-imunes graves como a febre reumática (FR) e glomerulonefrite. A FR acomete principalmente crianças e jovens adultos. A FR apresenta diversas manifestações, sendo a doença reumática cardíaca (DRC) a seqüela mais grave, caracterizada por lesões cardíacas valvares progressivas e permanentes. O tratamento, frequentemente envolve cirurgia cardíaca para a correção de lesões valvulares, o que acarreta alto custo para o Sistema Único de Saúde no Brasil e em vários países. Em trabalhos anteriores sobre os mecanismos desencadeadores das lesões reumáticas no coração, foi possível identificar o papel do linfócito T como mediador principal da autoimunidade, através da análise do receptor de células T infiltrantes de lesão cardíaca de indivíduos com DRC. Várias expansões oligoclonais com diferentes tamanhos da região que reconhece o antígeno, CDR3 foram encontradas. No presente trabalho, analisou-se a atividade tímica através da quantificação de fragmentos circulares excisados pelo rearranjo do gene do receptor do linfócito T (TREC) em linfócitos T de sangue periférico de indivíduos com FR e DRC. Também foi avaliada a presença de células T naïve e de memória através de citometria de fluxo. Os resultados do presente trabalho mostraram que a quantidade de TREC em amostras de sangue periférico do grupo de pacientes com FR/DRC foi significantemente menor quando comparada a observada em indivíduos saudáveis. Interessantemente, em ambos os grupos a quantidade de TREC apresentou correlação negativa com a idade dos indivíduos estudados. Os resultados indicaram diferenças na atividade tímica em pacientes com FR/DRC, provavelmente decorrente do processo autoimune que envolve linfócitos T / There is a wide spectrum of diseases caused by group A streptococci (GAS), that still being considered a public health problem in developing countries, with about 600 million cases per year. Infections by GAS can cause invasive diseases such as pharyngitis and pyoderma leading to serious autoimmune complications such as rheumatic fever (RF) and glomerulonephritis. RF mainly affects children and young adults, and presents different manifestations. Rheumatic heart disease (RHD) is considered the most serious complication leading to valvular lesions that are characterized by progressive and permanent heart damage, which entails high cost to the Public Health System in Brazil and worldwide. In previous works that focused on the mechanisms leading to rheumatic heart lesions, we identified the role of T lymphocytes as principal mediator of autoimmune reactions. Through the in deep analysis of infiltrating T-cell receptor repertoire of patients with RHD, we identified oligoclonal expansions with different sizes of CDR3 that is the region of antigen recognition. In the present study we analyzed the thymic activity through T cell receptor excision circles (TREC) quantification in T cells from peripheral blood of RF/RHD patients. We also evaluated naïve and memory T cells from peripheral blood by flow cytometry. Our results showed that the amount of TREC in the peripheral blood of patients was significantly lower when compared to the healthy individuals. In addition, both groups showed that the amount of TREC is negatively correlated with age. These results indicated that the thymic activity in RF/RHD patients is altered probably due to the autoimmune process that involves T lymphocytes