Tesis Magíster en Bioquímica, Área de Especialización en Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+) es una coenzima con múltiples funciones. Participa en el metabolismo redox como molécula transportadora de electrones en procesos metabólicos, actúa como indicador del estado energético celular, y es también sustrato de numerosas enzimas implicadas en la desacetilación de reguladores transcripcionales y la movilización de Ca2+ intracelular, entre otros. Diversas investigaciones sugieren que la disminución de los niveles de NAD+ es un factor importante en la progresión de enfermedades cardiovasculares. En diferentes modelos de miocardiopatías se ha observado una disminución en la expresión de la enzima marcapaso de la síntesis de NAD+, Nampt. También se ha descrito que los niveles de NAD+ están disminuidos en condiciones de riesgo cardiovascular como son el envejecimiento, dislipidemia y diabetes mellitus tipo 2. El objetivo de este trabajo fue determinar los efectos de la disminución de NAD+ en el metabolismo y la capacidad adaptativa de los cardiomiocitos. Se utilizó el inhibidor de Nampt, FK866, para disminuir los niveles de NAD+ en cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas. Se evaluó la viabilidad, el metabolismo mitocondrial y la respuesta adaptativa del cardiomiocito a estímulos de insulina, peróxido de hidrógeno (H2O2) y norepinefrina (NE). Los resultados mostraron que la disminución de NAD+ por FK866 redujo el metabolismo mitocondrial sin afectar la viabilidad de los cardiomiocitos. Además, disminuyó la fosforilación de Akt en respuesta a insulina, la sobrevida frente a H2O2 y previno el aumento del área celular y sarcomerización en respuesta a NE. Para evaluar la relación de causalidad entre la disminución de NAD+ y estos efectos, se rescataron los niveles de NAD+ mediante la administración de nicotinamida mononucleótido (NMN). Se observó la recuperación de los parámetros metabólicos y la sobrevida a H2O2, pero no se restableció la respuesta hipertrófica. En conclusión, este trabajo muestra que NAD+ es esencial para el metabolismo mitocondrial del cardiomiocito, y sugiere su participación en la vía de señalización de insulina y en la respuesta adaptativa a H2O2 y NE. / The nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) is a coenzyme with multiple functions. In redox metabolism participates as an electron carrier in metabolic processes, is a cellular energetic status indicator and it is also substrate of many enzymes involved in transcription factor deacetylation and Ca2+ mobilization, among others. Several reports suggest that NAD+ levels are an important factor in cardiovascular diseases progression. In different cardiomyopathy models the expression of the NAD+ synthesis rate-limiting enzyme, Nampt is diminished. Also NAD+ levels are decreased in cardiovascular risk conditions such as aging, dyslipidemia and type 2 diabetes mellitus. The aim of this work was to determine the effects of NAD+ decrease on cardiomyocytes’ metabolism and adaptive capability. The Nampt inhibitor, FK866, was used to reduce NAD+ levels in primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes, and viability, mitochondrial metabolism, and cardiomyocytes adaptive response to insulin, hydrogen peroxide (H2O2) and norepinephrine (NE) stimuli were assessed. The results showed that the NAD+ reduction induced by FK866 decreased mitochondrial metabolism without affecting cardiomyocytes viability. Insulin-stimulated Akt phosphorylation and H2O2-survival were also diminished and cellular area increase and sarcomerization induced by NE was prevented. The causality between NAD+ decrease and those effects was assessed through NAD+ levels recovery by nicotinamide mononucleotide (NMN) administration. Both metabolism and H2O2-survival were reestablished, but not the hypertrophic response. In conclusion this work reveals that NAD+ is essential for cardiomyocyte mitochondrial metabolism, and suggest its participation on insulin signaling pathway and adaptive responses to H2O2 and NE. / Fondap; Fondecyt

El bloqueo completo de rama izquierda (BCRI) expresa una demora o interrupción en la conducción del impulso eléctrico en algún sitio de la rama izquierda o sus ramificaciones, llevando, en la mayoría de los casos, a una asincronía interventricular (AIE) e intraventricular (AIA) de la activación ventricular izquierda. El BCRI benigno es raro, usualmente tarde o temprano la enfermedad miocárdica se manifiesta. Aun en ausencia de enfermedad demostrable acarrea un ligero aumento de mortalidad. En casos de cardiopatía, la mortalidad total y súbita se incrementa hasta 10 veces. La mortalidad es mayor en pacientes con eje a la izquierda con respecto a los pacientes con eje normal, aunque la progresión a bloqueo aurículo-ventricular en ambos casos es baja. Este bloqueo de rama puede deberse a lesión del tronco de la rama izquierda o de ambas divisiones simultáneamente. Electrocardiográficamente estas dos alternativas son indiferenciables, pero pueden indicar condiciones anatómicas y evolutivas diferentes ya que, en el primer caso (troncular), puede encontrarse en ausencia de cardiopatía demostrable, en tanto que en el segundo, siempre acompaña a extensas lesiones miocárdicas. En todos los casos, el BCRI implica una profunda desorganización del complejo QRS.

Magíster en Bioquímica, área de especialización Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular / Memoria para optar al Título de Bioquímica / La obesidad y la diabetes son condiciones altamente prevalentes que representan un importante factor de riesgo para el desarrollo de patologías cardiovasculares, principal causa de muerte entre los pacientes diabéticos. La lipotoxicidad y las alteraciones metabólicas juegan un papel fundamental en la resistencia a la hormona insulina y el daño cardiaco en estos pacientes. Los cardiomiocitos son las unidades funcionales del corazón y poseen un alto requerimiento energético que depende en su mayor parte de la función mitocondrial. Las mitocondrias forman una red dinámica que se remodela constantemente por eventos de fisión y fusión. La mantención de una morfología mitocondrial balanceada es fundamental para mantener una funcionalidad adecuada de este organelo. El objetivo de este trabajo fue investigar el efecto de las ceramidas, que derivan del metabolismo lipídico, en la señalización de la insulina y la dinámica mitocondrial en cultivos primarios de cardiomiocitos de rata. La señalización de insulina se evaluó mediante Western blot para Akt fosforilada y la morfología mitocondrial por microscopía confocal en células teñidas con Mitotracker Green. El tratamiento de los cardiomiocitos con C2-ceramida (40 μM, 3 h) disminuyó la fosforilación de Akt basalmente y en respuesta a insulina y favoreció la fisión mitocondrial, aumentando la translocación de la proteína de fisión Drp-1 hacia este organelo. Para evaluar si ambos efectos estaban relacionados, se inhibió la actividad de Drp-1 mediante el uso de un dominante negativo y de un inhibidor químico, antes del tratamiento con C2-ceramida. La inhibición de Drp-1 mediante ambas herramientas previno la fisión mitocondrial causada por C2-ceramida y rescató la fosforilación de Akt en respuesta a insulina. Trabajos previos de nuestro laboratorio muestran que el tratamiento de los cardiomiocitos con palmitato 500 μM durante 3 h también induce fisión de la red mitocondrial. En este trabajo se mostró que al inhibir la síntesis de ceramidas a partir de palmitato se previene, en parte, los efectos de este ácido graso sobre la dinámica mitocondrial de los cardiomiocitos. En conclusión, la fragmentación de la red mitocondrial inducida por ceramidas es necesaria para la disminución de la señalización de insulina en los cardiomiocitos. Además, la fisión mitocondrial inducida por palmitato en este modelo depende en parte de la generación de ceramidas. / Obesity and diabetes are highly prevalent conditions that represent an important risk factor for the development of cardiovascular diseases, the main cause of death in diabetic patients. Lipotoxicity and metabolic alterations take part in insulin resistance and heart damage in these patients. Cardiomyocytes are the functional basic units of the heart and have a high energy requirement that depends largely on mitochondrial function. Mitochondria form a dynamic network that is constantly remodelled by fission and fusion events. The maintenance of a balanced mitochondrial morphology is critical to maintain a proper functionality of this organelle. The aim of this study was to investigate the effect of ceramides, derived from lipid metabolism, in insulin signalling and mitochondrial dynamics in primary cultures of rat cardiomyocytes. Insulin signalling was assessed by Western blot for phosphorylated Akt and mitochondrial morphology by confocal microscopy in Mitotracker Green-stained cells. Treatment of cardiomyocytes with C2-ceramide (40 μM, 3 h) decreased the phosphorylation of Akt at baseline and in response to insulin and induced mitochondrial fission, increasing the translocation of the fission protein Drp-1 to this organelle. To assess whether both effects were related, Drp-1 activity was inhibited by using a dominant negative and a chemical inhibitor, before treatment with C2-ceramide. The inhibition of Drp-1 by both tools prevented mitochondrial fission caused by C2-ceramide and rescued Akt phosphorylation in response to insulin. Previous work in our laboratory showed that treatment of cardiomyocytes with palmitate 500 μM for 3 h also induces mitochondrial fission. We showed that inhibiting the synthesis of ceramides from palmitate prevented in part the effects of this fatty acid on mitochondrial dynamics in cardiomyocytes. In conclusion, the mitochondrial network fragmentation induced by ceramides is required for the decrease of insulin signalling in cardiomyocytes. Furthermore, palmitate-induced mitochondrial fission in this model depends in part on the generation of ceramides. / Fondap, Fondecyt

Memoria para optar al título de Bioquímico / Las enfermedades cardiovasculares isquémicas son una de las principales causas de muerte en Chile. En estas patologías, los cardiomiocitos están expuestos a privación de nutrientes, hipoxia y estrés osmótico. Nuestro laboratorio ha estudiado el efecto del estrés hiperosmótico sobre el cardiomiocito. Sin embargo se desconocen las consecuencias del estrés hiposmótico ya que a diferencia de otros tipos celulares, las células cardíacas no están expuestas fisiológicamente a grandes fluctuaciones en la osmolaridad externa. Durante los procesos de isquemia y reperfusión, los cardiomiocitos se exponen a estrés oxidativo, desbalance redox intracelular e hiposmolaridad, pudiendo ser las consecuencias de esta última muy severas para el corazón, debido a los cambios electrofisiológicos que acompañan al hinchamiento celular. Este aumento del volumen celular es especialmente marcado durante la reperfusión, evento indispensable para reestablecer la irrigación sanguínea y rescatar al miocardio. Esta memoria estudió el efecto de las especies reactivas de oxígeno en la regulación del volumen y muerte activada por estrés hiposmótico en cardiomiocitos. Nuestros resultados a través de calceína-AM y microscopia confocal, muestran que cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas expuestos a estrés hiposmótico con soluciones 248 ó 202 mOsm (medio de cultivo diluido 15% y 30% con agua), aumentaron su volumen en un 40 y 60%, respectivamente. Estas células no presentaron disminución regulada de volumen (RVD) espontáneamente, ni en presencia de gramicidina (inductor de RVD). El estrés hiposmótico generó especies reactivas del oxígeno (ROS), evaluada por diclorofluoresceina, siendo el radical hidroxilo la principal especie radicalaria detectada por resonancia de espín electrónico (ESR), usando el atrapador 5,5-dimetilpirrolina 1-óxido. El origen de ROS se determinó observando el efecto de apocinina (inhibidor NADPH oxidasa), rotenona (inhibidor mitocondria), alopurinol (inhibidor xantino oxidasa) y N-acetil-cisteína sobre la oxidación de diclorofluoresceina (DCF-DA). Los resultados muestran que sólo apocinina inhibió la generación de ROS dependiente del estrés hiposmótico. Mediante ESR y células transducidas con AdCAT (catalasa), AdSOD1(superóxido dismutasa citosólica), AdSOD2 (superóxido dismutasa mitocondrial) y AdGPx (glutatión peroxidasa) se identificó a NADPH oxidasa como principal fuente de las ROS. Por otra parte, su generación también se asoció a una disminución en el nivel total de GSH desde los 60 min post-estímulo, siendo significativo a las 4 h, para 202 mOsm. El estrés hiposmótico disminuyó la viabilidad de los cardiomiocitos, determinada por azul de tripán, a las 6 h en un 45 y 40% según el nivel de hiposmolaridad, A diferencia del estrés hiperosmótico no se detectó activación de las caspasas 9 y 3, sugiriendo la existencia de una muerte independiente de caspasas. Dado que no se evaluaron otros parámetros de muerte, aún se desconoce la participación de necrosis o autofagia en la muerte de los cardiomiocitos activada por estrés hiposmótico. La viabilidad celular se recuperó en células transducidas con AdCAT y expuestas a estrés hiposmótico. Además en estas células hubo un RVD parcial. En conclusión, los resultados indican que el estrés hiposmótico aumenta el volumen del cardiomiocito, siendo NADPH oxidasa una de las principales fuentes en la generación de ROS. Estos últimos inhiben el mecanismo de RVD y median la muerte celular estimulada por el estrés hiposmótico.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El metabolismo proteico es altamente regulado. Los eucariontes poseen diferentes sistemas degradativos como lisosomas y el sistema ubiquitina/proteosoma. Este último, responsable de la degradación de más del 80% de las proteínas intracelulares, regula una amplia gama de procesos intracelulares. Alteraciones en este sistema han sido observadas en enfermedades neurodegenerativas, detectándose acumulación de agregados de proteínas poliubiquitinadas. Las células evitan la acumulación de estos agregados mediante su degradación por el proteosoma y autofagia. Sin embargo, una vez formados, estos cuerpos son refractarios a la proteólisis y se acumulan en agresomas (cuerpos de inclusión asociados a microtúbulos). Recientemente, amplios depósitos proteicos se han detectado en enfermedades cardiacas, aún cuando el papel del sistema ubiquitina/proteosoma no ha sido dilucidado. El objetivo de esta memoria fue investigar qué efecto producen diferentes condiciones de estrés celular, asociados a procesos de isquemia cardiaca como privación de glucosa, estrés hiperosmótico mediado por sorbitol, privación de aminoácidos y suero, sobre el sistema ubiquitina/proteosoma en cardiomiocitos. Estudios de inmunofluorescencia mostraron la formación de agregados proteicos poliubiquitinados, distribuidos ampliamente en el citoplasma, y después de 18 h post tratamiento se observaron grandes agregados proteicos, concentrados en estructuras tipo agresomas, orientados a un lado de la zona perinuclear. La aparición de estas estructuras no se debió a un incremento en el nivel de las proteínas poliubiquitinadas (excepto en células privadas de glucosa) o a una alteración del sistema enzimático de conjugación de ubiquitina o inhibición del proteosoma. La desorganización de los microtúbulos con Vinblastina y colocalización con Hsp70 confirmó que estas estructuras correspondían a agresomas. Además, los agresomas colocalizaron con Rab24, una GTPasa pequeña implicada en autofagia, y con la proteína LC3-GFP, confirmando una estrecha relación entre agresomas y la autofagia. Resultados similares se encontraron al utilizar inhibidores del proteosoma. Finalmente, la inducción de la autofagia con rapamicina facilitó la remoción de los agresomas. En conclusión, condiciones de estrés celular inducen la formación de agresomas en cardiomiocitos. La formación de agresomas no es dependiente de la inhibición del proteosoma o a una alteración en el sistema enzimático de conjugación de la ubiquitina y la inducción de la autofagia facilitó su remoción / Protein metabolism is highly regulated. Eukaryotic cells have two main degradative systems: lysosomes and ubiquitin-proteasome system (UPS). UPS is responsible over 80% intracellular protein degradation and regulates many cellular processes. Alterations in this system has been reported in neurodegeneratives disorders in which polyubiquitin protein aggregates were detected. Cells can avoid protein aggregate accumulation by degradation through UPS or autophagy. Nevertheless, once aggregate accumulates, they are refractory to proteolytic degradation and then tend to accumulate in aggresomes (microtubules-associated inclusion bodies). These protein deposits have been recently detected in cardiovascular diseases, although the precisely role of UPS remains unclear. The aim of this work was to determine the effects of several cardiac ischemiarelated stress conditions such us glucose deprivation, hyperosmotic stress mediated by sorbitol, starvation and serum deprivation on the UPS in cultured neonatal rat cardiomyocytes. Poly-ubiquitin protein immunofluorescence detection showed that the four treatments induced the deposit of polyubiquitin-protein aggregates widely distributed in the cytoplasm. After 18 h post treatment, highly concentrated polyubiquitin-protein deposits in aggresome-like structures in the perinuclear zone were detected. The formation of these structures was independent to the level of polyubiquitin-protein increase (except in glucose deprivated cells) or changes in enzymatic ubiquitinconjugating system or proteasome activity inhibition. Vinblastine-dependent microtubules disruption and colocalization with Hsp70 confirmed that these structures were aggresomes. Moreover, we observed aggresome colocalization with Rab24, a small GTPase implicated in autophagy and GFP-LC3. This last result suggest a link between aggresomes and autophagy. Similar results were observed in proteasome inhibited cells. Autophagy induction with rapamycin facilitated aggresome remotion. In summary, stress conditions induce aggresome formation in primary cultures of cardiac myocytes, being this process independent of proteasome inhibition or alteration in ubiquitin-conjugating system. Autophagy induction facilitated aggresome remotion in these cells

Debido al crecimiento de la Asociación Pro Ecclesia Sancta, entidad religiosa perteneciente a la Iglesia Católica, y a la necesidad de contar con un local adecuado para el desarrollo de las actividades, es que surgió la idea de proyectar un local destinado a Iglesia y Centro Pastoral Sagrado Corazón de Jesús, donde se desarrollan labores religiosas, culturales y de servicio a la comunidad. El Programa del proyecto se desarrolló sobre un terreno vacio de 7 884,12m2 y un área total construida de 11 925,28m2 al cual se ingresa peatonalmente desde la Av. La República y con acceso vehicular por el Jr. Santorín en el distrito de Santiago de Surco.

Memoria para optar al título de Bioquímico / El correcto funcionamiento celular requiere condiciones físicas específicas, como pH, temperatura y fuerza iónica. Cualquier alteración de estos parámetros puede producir consecuencias graves para las células. La mantención del volumen celular es otro de los parámetros importantes para la célula ya que regula la fuerza iónica y las concentraciones de osmolitos y segundos mensajeros intracelulares. En patologías como la diabetes o isquémicas como el infarto agudo al miocardio, ocurren alteraciones del volumen celular. Durante la isquemia disminuye el aporte de nutrientes y oxígeno a las células por lo que aumenta el catabolismo de nutrientes para obtener energía. Como consecuencia, aumenta la osmolaridad intracelular y con ello, la entrada de agua a la célula produciéndose un aumento de su volumen. Pero las células han desarrollado mecanismos para regular su volumen y volver a la normalidad frente a cambios en la osmolaridad del medio. En el caso del estrés hiposmótico, la estrategia consiste en sacar iones de la célula, lo que disminuye su contenido de agua. Se ha descrito que los cardiomiocitos no regulan espontáneamente su volumen en condiciones de estrés hiposmótico, lo que se ha asociado a muerte. Este hecho es importante si consideramos que el corazón es uno de los órganos más afectados por enfermedades que incluyen episodios isquémicos. Las conexinas son proteínas de transmembrana que forman hexámeros (hemicanal) y se insertan en la membrana plasmática de las células. Si dos hemicanales de células adyacentes se unen forman un canal de una unión en hendidura, y permiten la comunicación de los citoplasmas de las células vecinas. Se ha propuesto que los hemicanales formados por la conexina 43 (Hcs-Cx43) podrían participar en la regulación de volumen de las células, ya que forman verdaderos poros en la superficie celular que permite el paso de agua e iones por difusión simple. El objetivo de esta tesis consistió en determinar si los hemicanales formados por conexinas participan en la regulación de volumen del cardiomiocito expuesto a estrés hiposmótico. Para este fin cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas se expusieron a estrés hiposmótico y se estudió: • Si el estrés hiposmótico modifica el estado funcional de los Hcs-Cx43 a través de la técnica de captación de etidio • Si los cambios en el estado funcional de los Hcs-Cx obedecen a modificaciones en la cantidad de los Hcs-Cx43 expuestos en la membrana o cambios en su estado de fosforilación, mediante la técnica de biotinilación de proteínas de superficie • Si los Hcs-Cx43 participan en la regulación de volumen del cardiomiocito expuesto a estrés hiposmótico, mediante el uso de calceina-AM y microscopía confocal como indicador de los cambios de volumen de la célula e interviniendo el sistema con el inhibidor específico de Hcs-Cx43, Gap26. Los resultados muestran que los Hcs-Cx aumentan su estado funcional al exponer las células a estrés hiposmótico, lo que impide la regulación de volumen del cardiomiocito, ya que al inhibirlos con Gap26 recuperan su volumen. Además se sugiere que el aumento funcional de los Hcs-Cx no se podría explicar por cambios en el estado de fosforilación o alteraciones de la cantidad de Hcs-Cx expuestos en la membrana celular. De estos resultados se concluye que los hemicanales formados por conexinas participan en el control del volumen del cardiomiocito / The cell homeostasis requires specific physical conditions such as pH, temperature and ionic strength. Any alteration in these parameters may produce serious consequences to the cell. The maintenance of cell volume is key parameter because is involved in the regulation of ionic strength, and concentration of osmolyte and intracellular second messengers. Alterations in cell volume have been described in pathologies such as diabetes, stroke and acute myocardial infarction. During ischemia the nutrients and oxygen availability to the cells diminishes, resulting in an increased catabolism in order to obtain energy. As a consequence, intracellular osmolarity increases leading to water influx into the cell and an increase in cell volume. Cells have developed different compensatory mechanisms to restore their volume when they are exposed to changes in external osmolarity. In the case of hyposmotic stress, ions are pumped out the cell to diminish water content. It has been shown that cardiac myocytes are unable to spontaneously regulate their volume when exposed to osmotic stress, and this event has been associated with increased cell death susceptibility. This is important if we consider that cardiac tissue is one of the most affected organs by ischemic diseases. Connexins are transmembrane proteins forming hexamers (hemichannels) at the cell membrane. When two hemichannels from adjacent cells reach each other, they form a gap junction channel, which allow communication of both cytoplasms. It has been proposed that hemichannels formed by connexin 43 (Hcs-Cx43) may participate in cell volume regulation because they form pores in the cell surface allowing the passage of water and ions by simple diffusion. The aim of this work was to evaluate whether Hcs-Cx43 participates in the volume regulation of cardiac myocytes exposed to hyposmotic stress. To this end, cultured neonatal rat cardiac myocytes were exposed to hyposmotic stress and we study whether: • Hyposmotic stress modifies the functional state of Hcs-Cx43 assessing the ethidium uptake by the cells • Changes in Hcs-Cx functional state are explained by the number of Hcs-Cx43 present in the cell membrane or by changes in their phosphorylation status. • Hcs-Cx43 participates in the volume regulation of cardiac myocyte exposed to hyposmotic stress. This was evaluated using calcein-AM and confocal microscopy to measure changes in cell volume and Gap26 to inhibit Hcs-Cx43. The results showed that the functional state of Hcs-Cx is enhanced in cells exposed to hyposmotic stress. Such increase in the functional state of Hcs-Cx could not be explained by changes in the phosphorylation state or alterations in the amount of Hcs- Cx exposed in the cell surface. The increase in cardiac myocyte volume induced by hyposmostic stress was inhibited by Gap26. These results collectively show that connexin hemichannels participates in the regulation of cardiac myocyte volume

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El sistema renina-angiotensina (RAS) forma parte de un eje de control homeostático de procesos tan importantes como el mantenimiento del tono vascular, el balance hidroeléctrico y la contractilidad cardíaca. Su sobre-activación se relaciona con el desarrollo de hipertensión arterial, la que con el paso del tiempo desencadena una serie de procesos deletéreos de remodelado que cursan con hipertrofia del cardiomiocito, lo que puede llevar finalmente a la insuficiencia cardíaca. Adicionalmente, se ha mostrado que la sola desregulación de este sistema puede desencadenar hipertrofia y remodelado cardíaco. Para la compleja regulación del RAS, el organismo hace uso de distintos efectores o agonistas dentro de los que para nuestra investigación, destacamos al péptido angiotensina 1-9 que cada vez toma más importancia por su efecto fisiológico, descrito y corroborado por distintos investigadores, de contrarrestar y prevenir la señalización hipertrófica en cardiomiocitos originada por distintos estímulos, tanto in vitro como in vivo. En el presente trabajo se investigó el mecanismo anti-hipertrófico de Angiotensina 1-9, para lo que valiéndonos de previas investigaciones de nuestro laboratorio y de otros grupos de investigación, nos centramos en la señalización mediada por calcio que tiene un papel principal en la contracción, control del metabolismo energético celular y expresión génica en el corazón, siendo además uno de los principales actores en la hipertrofia cardiaca. Los resultados mostraron que la preincubación de angiotensina 1-9 no tuvo efectos directo sobre los movimientos de calcio; ya sea citoplasmático o mitocondriales, pero sí disminuyó la respuesta de calcio citoplasmático frente a un estímulo pro-hipertrófico, como la Norepinefrina e incrementó los transitorios mitocondriales de calcio evocados tanto por norepinefrina como histamina (esta última se ha descrito como gatillante de la salida de calcio desde el retículo endoplásmico hacia la mitocondria a través de los canales sensibles a IP3. Finalmente al investigar mediante inmunohistoquímica si los aumentos de calcio en la mitocondria se debían a un acercamiento entre el retículo y la mitocondria producido por la preincubación de Ang 1-9, evidenciamos que no se produce un acercamiento entre estos organelos, pero interesantemente si se evita el alejamiento de estos inducidos por estímulos prohipertróficos. Como conclusión de nuestro estudio Ang 1-9 corrige los niveles de Ca2+ citoplasmático inducidos por estímulos prohipertróficos, posiblemente por una mejora en la eficiencia en la entrada de Ca2+ a la mitocondria, lo que no se debe a una modulación de cercanía entre el retículo y la mitocondria / The renin-angiotensin system (RAS) is part of a homeostatic control shaft of important processes such as the maintenance of vascular tone, the electrolyte balance and cardiac contractility. The over-activation of this system has been associated with the development of high blood pressure, which over time triggers a series of deleterious remodeling processes that occur through cardiomyocyte hypertrophy and that can possible end in heart failure. Additionally it has been demonstrated that dysregulation of this system, by itself, can trigger cardiac hypertrophy and remodeling. To achieve the regulation of RAS, the organism uses different effectors or agonists, among them the peptide Angiotensin 1-9 that we highlight to our investigation, who has becoming increasingly more important for its physiological effect described and corroborated by other investigators to counteract and prevent hypertrophic signaling in cardiomyocytes caused by various stimuli in vitro and in vivo. In the present work we wanted to delve into the hypertrophic mechanism of Angiotensin 1-9, and availing ourselves of previous research in our and other laboratories, we focus on calcium signaling, in order to get to understand a little more of this process, coupling to the fact that this plays a major role in contraction, control of cellular energy metabolism and gene expression in the heart. In our results we first found that the pre-incubation of Angiotensin 1-9 itself had no direct effect on cytoplasmic or mitochondrial calcium movements, but decreased the cytoplasmic calcium response of the pro-hypertrophic agent Norepinephrine, and increased the mitochondrial calcium transients evoked by both, norepinephrine and histamine (which has been described that triggers output of calcium from the endoplasmic reticulum into mitochondria trough the IP3 calcium channels). Finally, using immunohistochemistry to investigate whether increases in calcium in mitochondria were due to a closer approach between the reticulum and the mitochondria induced by the Angiotensin 1-9 pre-incubation, we saw no differences in the proximity between these organelles, but interestingly the pre-incubation avoid the estrangement induced by the Norepinephrine pro-hypertrophic stimuli. As conclusion to our study we found that Angiotensin 1-9 is able to correct the cytoplasmic Ca2+ levels induced by a pro-hypertrophic stimuli, possibly by an improvement in the efficiency of Ca2+ entry into the mitochondria, which is not due to a modulation of the closeness between reticulum and mitochondria / Fondecyt, Fondef, Mecesup

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / A pesar de que el Ca+2 posee un papel fundamental en regular la función contráctil del cardiomiocito adulto, se desconoce si este ión media las acciones metabólicas de insulina, especialmente aquellas relacionadas con el ingreso de la glucosa a la célula. En esta tesis se investigó la participación del Ca+2 en la activación de AKT y en la captación de glucosa inducida por insulina en cultivos de cardiomiocitos aislados de rata adulta. La quelación del Ca+2 extracelular utilizando EGTA, no inhibió la fosforilación de AKT ni el transporte de glucosa estimulado por insulina, demostrando que el efecto de insulina es independiente de un influjo de Ca+2 desde el medio extracelular. Por el contrario la depleción del Ca+2 del medio intracelular utilizando BAPTA-AM, disminuyó drásticamente la fosforilación de AKT y el transporte de glucosa inducido por insulina, demostrando que ambas etapas de la señalización de insulina dependen de la presencia de Ca+2 intracelular. En la evaluación del componente de Ca+2 intracelular involucrado en la fosforilación de AKT, tanto el bloqueador del canal/receptor intracelular Ryanodina y el inhibidor de los procesos dependientes de IP3 2-APB tendieron a disminuir la fosforilación de AKT dependiente de insulina en el cardiomiocito adulto. En contraste, 2-APB pero no ryanodina afectó la captación de glucosa inducida por insulina en cardiomiocitos de rata adulta, lo que sugiere una interrelación entre la liberación de Ca+2 dependiente de IP3 y el transporte de glucosa inducido por insulina en el cardiomiocito adulto. Otros aspectos observados en la regulación por Ca+2 del transporte de glucosa indican que la captación de glucosa basal y dependiente de insulina es mayor en ausencia de Ca+2 en el medio extracelular, sugiriendo que el Ca+2 extracelular podría participar en los procesos de endocitosis de GLUT4. Además, se observó que el tratamiento de las células con el ionóforo divalente de Ca+2 Ionomicina, no afectó la captación basal de glucosa pero disminuyó la inducida por insulina, indicando que el Ca+2 necesario para la regulación del transporte de glucosa debe permanecer dentro de un rango de concentración. En conclusión, el Ca+2 intracelular es un importante mediador fisiológico de la fosforilación de AKT y del transporte de glucosa estimulado por insulina y, que este último proceso es fuertemente modulado por la liberación de Ca+2 desde los reservorios intracelulares dependientes de IP3R / Although Ca+2 has a key role in regulating the contractile function of adult cardiomyocytes, it still unknown if this ion mediates the metabolic actions of insulin, especially those related to glucose uptake. Chelation of extracellular Ca+2, using EGTA, did not inhibit insulin-dependent AKT activation and glucose uptake, demonstrating that the effect of insulin is independent of a Ca+2 influx from the extracellular environment. On the contrary, depletion of intracellular Ca+2, using BAPTA-AM, drastically reduced insulin-dependent AKT activation and glucose uptake, showing that both steps of insulin signaling depend on intracellular calcium. To investigate the intracellular Ca+2 component involved in AKT phosphorylation, ryanodine (RyR channel Ca2+ blocker) and 2-APB (IP3R inhibitor) were used. Both drugs trend to decrease the insulin-dependent AKT activation in adult cardiomyocytes. In contrast, 2-APB but not Ryanodine affects insulin induced glucose uptake in adult rat cardiomyocytes, suggesting an interrelationship between the IP3 dependent Ca+2 release and insulin induced glucose uptake in adult cardiomyocytes. Other aspects observed in Ca+2 regulation of glucose uptake show that basal and insulin stimulated glucose uptakes were greater in the absence of extracellular Ca+2, suggesting this Ca+2 might participate in GLUT4 endocytosis. In addition, treatment of cells with divalent calcium ionophore, Ionomycin, did not affect basal glucose uptake but decreased insulin-stimulated glucose uptake. These findings suggest that Ca+2 involved in the regulation of glucose transport must remain within a range of concentration. In conclusion, intracellular Ca+2 is an important physiological mediator of AKT phosphorylation and glucose transport stimulated by insulin, and that the latter process is strongly modulated by the release of Ca+2 from intracellular reservoirs IP3R-dependent

Los trasplantes cardíacos son el tratamiento de elección para pacientes con insuficiencia cardíaca severa refractaria a tratamiento médico. Al 2020, el Instituto Nacional Cardiovascular “Carlos Alberto Peschiera Carrillo” es el único centro que realiza estos procedimientos en el Perú. Sin embargo, no hay mucha producción científica sobre estos y resulta esencial la elaboración de un perfil clínico-quirúrgico de estos pacientes. Por ello, investigación realizada describe las características clínico-quirúrgicas de los trasplantes cardíacos en el Instituto Nacional Cardiovascular “Carlos Alberto Peschiera Carrillo” 1993 - 2019. Realiza un estudio observacional, descriptivo, transversal y retrospectivo. La población fue el total de trasplantes cardíacos realizados en el Instituto Nacional Cardiovascular “Carlos Alberto Peschiera Carrillo” desde 1993 al 2019, con un tamaño de 87 pacientes. Los casos que cumplieron con los criterios de elegibilidad fueron de 83 receptores, 31 donantes y 4 pacientes en la lista de espera. Se llenaron fichas de recolección virtuales de datos elaboradas con variables agrupadas en variables preoperatorias, operatorias, postoperatorias, para el análisis de supervivencia y de la lista de espera. Los datos recolectados se procesaron con estadísticos descriptivos y se realizó un análisis de supervivencia mediante el estimador de Kaplan-Meier. Encuentra que el 57% de los receptores fue hombre y la edad media 41.1 años. El 89.6% tuvo el diagnóstico de insuficiencia cardiaca severa por cardiomiopatía dilatada no isquémica idiopática. Todos fueron trasplantes cardíacos ortotópicos, el 96.4% fue con la técnica bicaval unipulmonar y sobrevivieron 82. El 50% tuvo anemia severa como complicación precoz y el 29.3% disfunción renal como complicación tardía. Fallecieron 13 en el postoperatorio con una supervivencia al año del 87.8% y a los 5 año del 84.1%. El 61.3% de donantes fue hombre, la edad media de 29.9 años al fallecer y el 54.8% fue por traumatismo encefalocraneano severo por politraumatismo. Todos los pacientes de la lista de espera ingresaron con el diagnóstico de insuficiencia cardíaca severa por cardiomiopatía dilatada no isquémica. Concluye que el mayor porcentaje de los trasplantes cardíacos fueron por insuficiencia cardiaca severa por cardiomiopatía dilatada no isquémica idiopática INTERMACS 3 con la técnica bicaval unipulmonar y se tuvo una supervivencia del 87.8% al año y del 84.1% a los cinco años. / Tesis