Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

One of the major challenges in neuroscience is to understand the neuronal processes that underlie learning and memory. For example, what biochemical pathways underlie the coincidence detection between stimuli during classical conditioning, or between an action and its consequences during operant conditioning? In which neural substructures is this information stored? How similar are the pathways mediating these two types of associative learning and at which level do they diverge? The fly Drosophila melanogaster is an appropriate model organism to address these questions due to the availability of suitable learning paradigms and neurogenetic tools. It permits an extensive study of the functional role of the gene S6KII which in Drosophila had been found to be differentially involved in classical and operant conditioning (Bertolucci, 2002; Putz et al., 2004). Genomic rescue experiments showed that olfactory conditioning in the Tully machine, a paradigm for Pavlovian olfactory conditioning, depends on the presence of an intact S6KII gene. This rescue was successfully performed on both the null mutant and a partial deletion, suggesting that the removal of the phosphorylating unit of the kinase was the main cause of the functional defect. The GAL4/UAS system was used to achieve temporal and spatial control of S6KII expression. It was shown that expression of the kinase during the adult stage was essential for the rescue. This finding ruled out a developmental origin of the mutant learning phenotype. Furthermore, targeted spatial rescue of S6KII revealed a requirement in the mushroom bodies and excluded other brain structures like the median bundle, the antennal lobes and the central complex. This pattern is very similar to the one previously identified with the rutabaga mutant (Zars et al., 2000). Experiments with the double mutant rut, ign58-1 suggest that both rutabaga and S6KII operate in the same signalling pathway. Previous studies had already shown that deviating results from operant and classical conditioning point to different roles for S6KII in the two types of learning (Bertolucci, 2002; Putz, 2002). This conclusion was further strengthened by the defective performance of the transgenic lines in place learning and their normal behavior in olfactory conditioning. A novel type of learning experiment, called “idle experiment”, was designed. It is based on the conditioning of the walking activity and represents a purely operant task, overcoming some of the limitations of the “standard” heat-box experiment, a place learning paradigm. The novel nature of the idle experiment allowed exploring “learned helplessness” in flies, unveiling astonishing similarities to more complex organisms such as rats, mice and humans. Learned helplessness in Drosophila is found only in females and is sensitive to antidepressants. / Eine der größten Herausforderungen in der Neurobiologie ist es, die neuronalen Prozesse zu verstehen, die Lernen und Gedächtnis zugrundeliegen. Welche biochemischen Pfade liegen z.B. der Koinzidenzdetektion von Reizen (klassische Konditionierung) oder einer Handlung und ihren Konsequenzen (operante Konditionierung) zugrunde? In welchen neuronalen Unterstrukturen werden diese Informationen gespeichert? Wie ähnlich sind die Stoffwechselwege, die diese beiden Arten des assoziativen Lernens vermitteln und auf welchem Niveau divergieren sie? Drosophila melanogaster ist wegen der Verfügbarkeit von Lern-Paradigmen und neurogenetischen Werkzeugen ein geeigneter Modell-Organismus, zum diese Fragen zu adressieren. Er ermöglicht eine umfangreiche Studie der Funktion des Gens S6KII, das in der Taufliege in klassischer und operanter Konditionierung unterschiedlich involviert ist (Bertolucci, 2002; Putz et al., 2004). Rettungsexperimenten zeigen, dass die olfaktorische Konditionierung in der Tully Maschine (ein klassisches, Pawlow’sches Konditionierungsparadigma) von dem Vorhandensein eines intakten S6KII Gens abhängt. Die Rettung war sowohl mit einer vollständigen, als auch einer partiellen Deletion erfolgreich und dies zeigt, dass der Verlust der phosphorylierenden Untereinheit der Kinase die Hauptursache des Funktionsdefektes war. Das GAL4/UAS System wurde benutzt, um die S6KII Expression zeitlich und räumlich zu steuern. Es wurde gezeigt, dass die Expression der Kinase während des adulten Stadiums für die Rettung hinreichend war. Dieser Befund schließt eine Entwicklungsstörung als Ursache für den mutanten Phänotyp aus. Außerdem zeigte die gezielte räumliche Rettung von S6KII die Notwendigkeit der Pilzkörper und schloss Strukturen wie das mediane Bündel, die Antennalloben und den Zentralkomplex aus. Dieses Muster ist dem vorher mit der rutabaga Mutation identifizierten sehr ähnlich (Zars et al., 2000). Experimente mit der Doppelmutante rut, ign58-1 deuten an, dass rutabaga und S6KII im gleichen Signalweg aktiv sind. Vorhergehende Studien hatten bereits gezeigt, dass die unterschiedlichen Ergebnisse bei operanter und klassischer Konditionierung auf verschiedenen Rollen für S6KII in den zwei Arten des Lernens hindeuten (Bertolucci, 2002; Putz, 2002). Diese Schlussfolgerung wurde durch den mutanten Phänotyp der transgenen Linien in der Positionskonditionierung und ihr wildtypisches Verhalten in der klassischen Konditionierung zusätzlich bekräftigt. Eine neue Art von Lern-Experiment, genannt „Idle Experiment“, wurde entworfen. Es basiert auf der Konditionierung der Laufaktivität, stellt eine operante Aufgabenstellung dar und überwindet einige der Limitationen des „Standard“ Heat-Box Experimentes. Die neue Art des Idle Experimentes erlaubt es, „gelernte Hilflosigkeit“ in Fliegen zu erforschen, dabei zeigte sich eine erstaunliche Ähnlichkeit zu den Vorgängen in komplizierteren Organismen wie Ratten, Mäusen oder Menschen. Gelernte Hilflosigkeit in der Taufliege wurde nur in den Weibchen beobachtet und wird von Antidepressiva beeinflusst.

Le lépidoptère Spodoptera frugiperda est un ravageur important des cultures mais aussi l'organisme source de la lignée cellulaire Sf9, utilisée pour la production de protéines recombinantes dans le système d'expression baculovirus/cellule d'insecte. Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié la transcription chez le baculovirus AcMNPV aux temps précoces de l'infection. Nous montrons tout d'abord que les régions homologues (hrs) portées par le génome de ce virus contiennent de nombreux motifs de reconnaissance pour des facteurs de transcription de type AP1/CREB, et que ces sites fixent spécifiquement des protéines de la cellule-hôte, Sf9. Par ailleurs, dans le contexte de l'infection, ces sites sont nécessaires à la transactivation médiée par le facteur viral très précoce IE1 qui se fixe lui aussi sur les hrs. Cette étude montre pour la première fois l'implication de facteurs cellulaires dans ce mécanisme de transactivation virale. La progression de ces travaux a cependant été freinée par le peu de données disponibles sur les gènes exprimés par Sf9. Pour en faciliter l'accès, nous avons donc construit une banque d'ADNc, dont l'exploitation fait l'objet de la deuxième partie de ce mémoire. Son criblage a permis d'obtenir la séquence complète de l'ADN complémentaire du gène hsp90 chez S. frugiperda, et d'en déterminer les principales caractéristiques. Par ailleurs, le séquençage à grande échelle de la banque a conduit à la constitution d'une banque d'ESTs, permettant l'identification de la quasi-totalité des gènes de protéines ribosomales. L'analyse de leur séquence a révélé l'existence de particularités qui semblent restreintes aux insectes et aux lépidoptères, un résultat inattendu compte tenu de la grande conservation de ces gènes entre espèces.

Tesis por compendio / La exposición crónica a sustancias de abuso lleva a cambios adaptativos en el cerebro que implican alteraciones en la expresión génica. Se ha propuesto que los factores de transcripción CREB y deltaFosB serían dianas moleculares para la regulación de la plasticidad, la cual lleva a la adicción.En este trabajo hemos estudiado los cambios en la activación de CREB, en PVN y NTS, y las quinasas que mediarían su activación durante la dependencia y síndrome de abstinencia a morfina, así como la respuesta del eje HHA durante dicho síndrome. También se investigó la posibilidad de que la activación de CREB y su coactivador transcripcional TORC1 dependan de la activación de receptores adrenérgicos. Además se evaluaron las posibles modificaciones en la expresión de FosB/deltaFosB en diferentes áreas cerebrales implicadas en la adicción, así como los cambios neuroendocrinos/neuroquímicos responsables de las alteraciones metabólicas observadas durante el tratamiento crónico con morfina. / Chronic exposure to opioids and other abused drugs results in adaptive changes in the brain involving alterations in gene expression. It is proposed that the transcription factors CREB and deltaFosB be molecular targets for the regulation of plasticity, which leads to addiction.In this work we studied changes in activation of the cAMP-response element binding protein (CREB) in PVN and NTS and the kinases that may mediate this activation during dependence and morphine withdrawal and the HPA axis response after naloxone-induced morphine withdrawal. We also investigated the possibility that the activation of CREB and the transcriptional coactivator of CREB, TORC1, arises from the activation of adrenergic receptors. We also evaluated the possible modifications in FosB/deltaFosB expression in several brain areas involved in addiction and neuroendocrine/neurochemical changes that are responsible for the metabolic alterations seen during chronic morphine treatment.

Coffin-Lowry Syndrome (CLS), an X-linked form of intellectual disability, is caused by mutations of the RPS6KA3 gene encoding the growth factor regulated kinase RSK2. To understand the consequences of RSK2 deficiency in the hippocampus we performed a comparison of the hippocampal gene expression profiles from Rsk2-KO and WT mice. It revealed differentialexpression of 100 genes, encoding proteins acting in various biological pathways. We further analyzed the consequences of deregulation of one of these genes, Gria2 encoding GluR2, a subunit of the glutamate AMPAR. An abnormal two-fold increased expression of GluR2 was found in the hippocampus of Rsk2-KO mice. Electrophysiology studies showed a reduction of basal AMPAR and NMDAR mediated transmission, in the hippocampus of Rsk2-KO mice. Activity of ERK1/2 was also abnormally increased in the adult hippocampus of Rsk2-KO mice. P-Sp1 level was also significantly higher in RSK2 deficient cells. Together, my results suggested that over expression of GluR2 in RSK2 deficient cells, is caused by increased Sp1 transcriptional activity on the Gria2 gene, which, itself, is the result of ERK1/2 increased signaling.

Thesis (Ph.D. in Neuroscience) -- University of Colorado Denver, 2008. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 110-125). Online version available via ProQuest Digital Dissertations.

Une hyperactivation de la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) contribue à la pathogenèse des maladies des vaisseaux. Des travaux antérieurs suggèrent que l’augmentation de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) inhibe la prolifération des CMLV. Provoquer une augmentation d’AMPc préviendrait aussi certaines maladies vasculaires qui sont associées à des altérations dans sa signalisation impliquant l'activité de la protéine kinase A (PKA). Des études ont démontré la contribution du facteur de transcription « early growth response protein-1» (Egr-1) dans la pathogenèse des maladies vasculaires et une surexpression d’Egr-1 a été rapportée dans des modèles d'athérosclérose et d'hyperplasie intimale. Divers agents vasoactifs contrôlent l'expression d’Egr-1 suivant des mécanismes qui ont fait l’objet de plusieurs études mais demeurent incomplètement élucidés. L'angiotensine-II (Ang-II) est l'un des principaux peptides vasoactifs impliqués dans la pathogenèse des maladies vasculaires. Une des voies de signalisation induite par l’Ang-II implique l’augmentation du calcium (Ca2+) intracellulaire. Celle-ci se produit par l’activation de l'entrée de calcium opérée par la relâche des réserves (SOCE) de Ca2+ réticulaire suite à l’activation du récepteur à l’inositol-3-phosphate (IP3R) et le recrutement ultérieur du complexe conducteur formé par la molécule d'interaction stromale 1 (STIM-1) et le canal Orai-1. Bien qu’il ait déjà été démontré que l’expression de l'Egr-1 est régulée par la signalisation calcique en réponse à plusieurs stimuli, l'implication du complexe STIM-1/Orai-1 dans l'expression d'Egr-1 dans la CMLV n’a jamais été étudiée. De même, la question de savoir si la signalisation induite par l'Ang-II conduisant à l'expression d'Egr-1 est modulée par l'AMPc n’a jamais été explorée. Par conséquent, les travaux menés dans cette thèse ont consisté à examiner le rôle de la signalisation du Ca2+ dans l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II dans la CMLV avec une attention particulière portée sur le rôle joué par STIM-1 et Orai-1. En outre, nous avons examiné l'effet de l’augmentation de l’AMPc sur l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II et étudié les voies de signalisation associées. Nos données montrent que l’inhibition du récepteur IP3R et du SOCE par le 2-aminoéthoxydiphénylborate atténue la libération de Ca2+ induite par l’Ang-II et ceci s’accompagne d’une baisse des niveaux d’expression de protéine et d’ARN messager de l’Egr-1. La stimulation de l’expression de l'Egr-1 a également été supprimée à la suite du blocage de la calmoduline et de la protéine kinase CaMKII. De plus, le blocage par interférence d’ARN de l’expression de STIM-1 et Orai-1 a atténué l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II ainsi que la phosphorylation des protéines ERK et CREB. Par ailleurs, l'isoproterenol (ISO) et la forskoline (FSK), deux activateurs de l'adénylate cyclase ont atténué de manière dose-dépendante l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II. Des réponses similaires ont été observées en utilisant des analogues non spécifique (dibutyryl-cAMP) et PKA-spécifique (Benzoyl-cAMP) de l’AMPc, ainsi qu'un inhibiteur à large spectre de l'activité phosphodiesterase intracellualaire (isobutylméthylxanthine). L'inhibition de l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II s’accompagne d'une augmentation de l’activité de la PKA mesurée par la phosphorylation de la « phosphoprotéine activée par les vasodilatateurs (VASP) », et d’une diminution concomitante de la phosphorylation de la protéine ERK. Le blocage pharmacologique de la PKA a réduit la phosphorylation de VASP et restauré la phosphorylation de la protéine ERK ainsi que l'expression d'Egr-1 en présence de l’Ang-II. En résumé, nos données démontrent que la voie STIM-1/Orai-1 /Ca2+ médie l'expression de l'Egr-1 induite par l'Ang-II dans la CMLV et suggèrent que la suppression de la réponse à l’Ang-II menant à l’expression de l'Egr-1 peut expliquer les effets vasoprotecteurs de l’AMPc. En outre, ces travaux montrent que les mécanismes moléculaires de régulation de l’expression d’Egr-1 en réponse aux signaux externes culminent vers la modulation des cascades de signalisation en aval de la protéine ERK dans les CMLV. / Aberrant vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferative responses contribute to the development of neointimal lesions. Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is believed to inhibit VSMC proliferation, and vascular diseases are associated with impairments in cAMP-induced signalling responses involving protein kinase A (PKA) signaling. An enhanced expression of the early growth response protein-1 (Egr-1), a zinc finger transcription factor, has been reported in models of vascular diseases and, a crucial role of Egr-1 in regulating the expression of genes implicated in neointimal formation leading to atherogenesis has been suggested. Various vasoactive factors have been shown to modulate Egr-1 expression in VSMC via mechanisms which remain to be completely understood. Angiotensin-II (Ang-II) is one of the key vasoactive peptides implicated in the pathogenesis of vascular diseases. Ang-II elevates intracellular calcium (Ca2+) through activation of voltage-gated calcium channels as well as store-operated calcium channels. The store-operated calcium entry (SOCE) involves an inositol-3-phosphate receptor (IP3R)-coupled depletion of endoplasmic reticular Ca2+ and a subsequent activation of the stromal interaction molecule 1 (STIM-1) /Orai-1 complex. Although Egr-1 has been demonstrated to be upregulated in a Ca2+-dependent fashion in response to several stimuli, the involvement of STIM-1/Orai-1-dependent signaling in Egr-1 expression in VSMC has never been addressed. Besides, whether Ang-II-induced signaling leading to Egr-1 expression is modulated by cAMP-dependent signaling pathway remains unexplored. Therefore, in the present studies, we have examined the role of Ca2+ signaling in Ang-II-induced Egr-1 expression in VSMC and investigated the contribution of STIM-1 or Orai-1. Additionnaly, we have examined the effect of cAMP on Ang-II-induced expression of Egr-1 and have investigated the associated signalling pathways. Pharmacological blockade of IP3R and SOCE by 2-aminoethoxydiphenylborate (2-APB) decreased Ang-II-induced Ca2+ release and attenuated Ang-II-induced enhanced expression of Egr-1 protein and mRNA levels. Egr-1 upregulation was also suppressed following blockade of calmodulin and CaMKII. Furthermore, RNA interference-mediated depletion of STIM-1 or Orai-1 attenuated Ang-II-induced Egr-1 expression, as well as Ang-II-induced phosphorylation of ERK1/2 and CREB. Moreover, isoproterenol (ISO) and forskolin (FSK), two respective receptor and non-receptor activators of adenylate cyclase, attenuated Ang-II-induced Egr-1 expression in a dose-dependent fashion. Similar responses were observed using non-specific (dibutyryl-cAMP) and PKA-specific (Benzoyl-cAMP) analogs of cAMP, as well as a broad spectrum inhibitor of intracellular phosphodiesterase activity (isobutylmethylxanthine). The inhibition of Ang-II-induced Egr-1 expression was accompanied by an increase in serine 157 phosphorylation of the vasodilator-activated phosphoprotein (VASP), a marker of PKA activity, and this was associated with a concomitant decrease in ERK phosphorylation. Pharmacological blockade of PKA using H89 decreased VASP phosphorylation, restored Ang-II-induced ERK phosphorylation and abolished ISO- and FSK-mediated inhibition of Ang-II-induced Egr-1 expression. In summary, our data demonstrate that STIM-1/Orai-1/Ca2+-dependent signaling pathways mediate Ang-II-induced Egr-1 expression in A-10 VSMC and suggest that PKA-mediated suppression of Ang-II-induced Egr-1 expression and phosphorylation of ERK may be among the mechanisms by which cAMP exerts its vasoprotective effects. In addition, our data supports the notion that stimuli-induced regulation of Egr-1 expression involves the participation of signaling cascades downstream of ERK in VSMC.

The α7 subunit of the nicotinic receptor, a ligand gated ion channel with an affinity for nicotine, has long been implicated in the pathophysiology of schizophrenia due to the extremely high rate of smoking within the patient population. However, the exact role of the receptor has never fully been determined. In the following studies, various functions the receptor may assume in disease state are evaluated. There is a strong relationship between the immune system and schizophrenia, with the α7 subunit possibly serving as the link between the two. One of the following studies looks at the possibility of the receptor functioning as antigen in an autoimmune response. Blood sera of schizophrenic patients, as well as controls, were analyzed for the presence of antibodies to the α7 subunit of the nicotinic receptor. A sensitive ligand-based assay revealed schizophrenic patients could possess a pathogenic level of antibody that may exacerbate the degenerative nature of the disease, allowing for the possibility that receptor antibodies may serve as a contributing factor in the etiology of the disorder in at least a subset of patients. In other studies, the expression of the α7 receptor was investigated. Recombinant α7 receptor production has eluded researchers in non-mammalian species and this was the focus of our initial studies. In general, the lack of sufficient molecular recombinant techniques utilizing the receptor makes characterization of the α7 receptor and it's specific protein interactions difficult to evaluate. The regulatory mechanisms of the nicotinic receptor α7 subunit production and receptor formation have yet to be completely elucidated. Results in this investigation found a relationship between a functional CRE-element in the promoter region.

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Synaptic dysfunction caused by soluble β-amyloid peptide (Aβ) is a hallmark of early-stage Alzheimer's disease (AD), and is tightly linked to cognitive decline. By yet unknown mechanisms, Aβ suppresses the transcriptional activity of cAMP-responsive element-binding protein (CREB), a master regulator of cell survival and plasticity-related gene expression. Here, we report that Aβ elicits nucleocytoplasmic trafficking of Jacob, a protein that connects a NMDA-receptor-derived signalosome to CREB, in AD patient brains and mouse hippocampal neurons. Aβ-regulated trafficking of Jacob induces transcriptional inactivation of CREB leading to impairment and loss of synapses in mouse models of AD. The small chemical compound Nitarsone selectively hinders the assembly of a Jacob/LIM-only 4 (LMO4)/ Protein phosphatase 1 (PP1) signalosome and thereby restores CREB transcriptional activity. Nitarsone prevents impairment of synaptic plasticity as well as cognitive decline in mouse models of AD. Collectively, the data suggest targeting Jacob protein-induced CREB shutoff as a therapeutic avenue against early synaptic dysfunction in AD.