Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-18Bitstream added on 2014-06-13T20:46:13Z : No. of bitstreams: 1 maia_ms_dr_botfmvz.pdf: 678528 bytes, checksum: 3bcfd108f831025fba94f0aefc916387 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O Objetivo deste estudo foi determinar o efeito da adição do surfactante lauril sulfato de sódio (Orvus es Paste OEP) e dos antioxidantes Trolox-C (6- hidroxi-2, 5,7,8-tetrametilcroman-2-acido carboxílico) e catalase ao meio diluidor, na motilidade espermática, integridade de membrana plasmática, acrossomal e mitocondrial, estádio de capacitação e geração de radicais livres no espermatozóide ovino pós-descongelação. Para isso, foram realizados dois experimentos. No Experimento 1, avaliou-se o efeito da adição do surfactante ao diluidor. O sêmen de 10 carneiros foi coletado por meio de vagina artificial e diluído para uma concentração final de 400x106 espermatozóides/mL no meio Tris-gema contendo OEP (0; 0,5 e 1%) ou no diluidor glicina-gema-leite (controle). A motilidade foi determinada pelo sistema computadorizado de análise de sêmen (CASA), a integridade de membrana pela combinação dos corantes fluorescente iodeto de propídio e diacetato de carboxifluoresceína (IP+DIC) e o estádio de capacitação pela técnica da CTC. Houve efeito significativo do tratamento em todos os parâmetros da motilidade, na integridade de membranas e na capacitação espermática. A adição de 0,5% ou 1% de OEP ao diluidor TRIS-gema aumentou significativamente (P<0,05) a motilidade, a integridade de membranas e o percentual de espermatozóides não capacitados, comparado ao controle. O diluidor TRIS 1 foi selecionado para utilização como meio base para o experimento 2. No Experimento 2, foi determinado o efeito da adição dos antioxidantes ao diluidor. O sêmen foi coletado e os seguintes tratamentos foram aplicados: T1- TRIS (controle), T2- TRO+ (diluidor T1 + Trolox, 50mM/108 espermatozóides), T3-CAT+ (diluidor T1 + catalase, 50mg/mL), T4- TRO/CAT+ (diluidor T1 + Trolox e Catalase, nas mesmas concentrações utilizadas no T2 e T3)...(Rsumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / The aim of this study was to determine the effect of addition of surfactant sodium lauryl sulfate (Orvus es Paste OEP), and antioxidants, Trolox-C (6- hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxilic acid) and catalase to an extender on the motility, plasmatic and acrosomal and mitochondrial membrane integrity, capacitation status and free radicals generation of post thaw ram spermatozoa. Two experiments were performed. In Experiment 1, the effect of addition of surfactant was evaluated. The semen was collected from ten rams by artificial vagina and it was diluted to a final concentration of 400x 106 sperm/mL in egg yolk-Tris extender containing OEP (0, 0.5 and 1%) or glycinegg yolk-milk extender (control). The sperm motility was evaluated using a computer-assisted sperm analysis (CASA); the membrane integrity was verified using the fluorescent stains (propidium iodide and carboxyfluorescein diacetate) and the capacitation status determined by CTC technique. There was a significant treatment effect in all parameters involving sperm motility, membrane integrity and spermatic capacitation. The addition of OEP 0.5% or 1% to the egg yolk-Tris extender improved (P<0.05) the motility and membrane integrity and the percentage of uncapacited spermatozoa compared to the control. Then, the TRIS 1 extender was selected to be used at experiment 2. Experiment 2: the Exp 2 aimmed to determine the effect of antioxidants addition to the extender. Semen was collected and these treatments were applied: T1 - egg yolk-Tris extender (control), T2- TRO+ (T1 extender +Trolox, 50mM/108 spermatozoa), T3- CAT+ (T1 extender + catalase, 50mg/mL) and T4 TRO/CAT+ (T1 extender + trolox and catalase on the concentrations used in T2 and T3). Motility was determined by CASA system, plasmatic and acrosomal 4 membrane integrity and mitochondrial function were evaluated with PI, FITCPSA and JC-1 association...(Complete abstract, click electronic address below)

O objetivo do experimento foi avaliar o efeito da suplementação de touros adultos com sabões cálcicos de ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) sobre as características qualitativas do sêmen pré e pós-descogelação. Foram utilizados vinte touros com idades entre 4 e 10 anos, das raças Angus, Braford, Brangus e Hereford distribuídos aleatoriamente em dois grupos com dez touros cada um. Os tratamentos avaliados foram: sabões cálcicos ou suplementação energética. Os touros foram mantidos em piquetes individuais e alimentados durante 77 dias com dietas isoenergéticas elaboradas com: forragem verde, concentrado comercial, sal mineral e sabões cálcicos ou suplemento energético. Os touros recebendo o tratamento com sabões cálcicos (SF) receberam 200 g/dia de Megalac-E® e os do tratamento com suplemento energético (SE) receberam 750 g/dia de raspa de mandioca (Manihot esculenta, Crantz). A coleta do sêmen foi realizada a cada 15 dias utilizando vagina artificial e as amostras de sêmen avaliadas quanto ao volume, concentração, motilidade, morfologia, avaliação da integridade do acrossoma e diferenciação de espermatozóides vivos de mortos por meio de coloração tripa azul/giemsa, avaliação da integridade da membrana da cauda por meio de teste hipoosmóstico (HO) e longevidade dos espermatozóides por meio de teste de termorresistência (TTR). Também foram coletadas amostras de sangue para avaliação das concentrações de testosterona. O tipo de suplemento energético não afetou o volume e a concentração de espermatozóides, nem a concentração de testosterona no sangue. O sêmen de touros suplementados com sabões cálcicos de PUFA apresentou valores superiores quanto à motilidade espermática (83.3% vs. 75.3%), percentagem de espermatozóides vivos (94,8% vs. 91,8%) e número de espermatozóides com acrossoma íntegro (98,0% vs. 96,6%). Interações significativas foram encontradas entre tratamento e coleta para percentagens de espermatozóides normais (p = 0.0344) e percentagens de espermatozóides positivos ao HO (p = 0.0168). Não foi encontrada diferença significativa entre os grupos para percentagens de motilidade dos espermatozóides pós-congelação, nem motilidade após o teste de termorresistência (TTR) aos 30 minutos e aos 60 minutos. Os resultados do HO do grupo recebendo suplemento funcional não foi diferente do grupo com suplemento energético. Durante o período de suplementação o grupo com suplemento funcional teve percentagens maiores de espermatozóides vivos (51,5% vs. 42,2%) e com acrossoma íntegro (48,0% vs. 39,2%) quando comparado com o grupo que recebeu suplemento energético. A suplementação com sabões cálcicos de PUFA em touros pode influenciar positivamente nas características qualitativas do ejaculado conferindo maior resistência aos espermatozóides submetidos a processos de criopreservação. / The aim of this experiment was evaluate of the effect of the supplementation of adult bulls with calcium soaps of polyunsaturated fatty acids (PUFA) on the qualitative characteristics of the semen subjected to cryopreservation and thawing. Twenty adult bulls Angus, Hereford, Brangus and Braford were randomly assigned into two groups; they were subjected to two types of treatment: (SF) calcium soap; (SE) and energy source. The bulls were kept in individual pens and, during 77 days, they were fed on isoenergetic diets prepared with green grass, commercial concentrate, mineral salt, and calcium soaps of PUFA or energy supplement. The treatment supplemented with calcium soaps of PUFA received 200 g/d of Megalac-E®; and the treatment supplemented with other energy source received 750 g/d from cassava meal (Manihot esculenta, Crantz). During the period of the experiment, five collections of semen were performed with artificial vagina; the semen samples were evaluated considering the following variables: seminal volume, sperm concentration, sperm motility, morphology, evaluation of acrosome intact and differentiation of live and dead spermatozoa by staining tripan blue/giemsa, evaluation of the integrity membrane sperm through hypoosmotic swelling test (HO) and evaluation of longevity of sperm using the heat resistance tests (TTR). Two blood samplings were performed for assessing the concentration of blood testosterone. The results regarding the volume, sperm concentration and blood testosterone concentrations did not differ significantly between treatments during the experimental period. The group supplemented with calcium soaps of PUFA presented improvements in the percentages of sperm motility (83.3% vs. 75.3%). The percentages of live sperm (94,8% vs. 91,8%) and those with intact acrosome (98,0% vs. 96,6%) were higher compared with the group that received energy supplement. No significant differences were found between treatments in the percentages of the post-freezing motility and the motility of sperm subjected to TTR after 30 minutes and after 60 minutes showed no significant differences between treatments. The results of HO were not different between the groups with functional and energy supplement. During the supplementation period, the group with functional supplement presented higher percentages of live sperm (51,5% vs. 42,2%) and sperms with intact acrosome (48,0% vs. 39,2%) when compared with the group that received energy supplement. Supplementation with calcium soaps of PUFA can provide better features and higher resistance to sperm when submitted to the process of cryopreservation and thawing.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:54:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 289860 bytes, checksum: d97d6956fc0d5d33352d2b0b1f1b87c8 (MD5) Previous issue date: 2010-07-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The experiment was performed at the Caprinocutura Department of Animal Science, Federal University of Viçosa, in Viçosa-MG. The goal was to add in the thawing of goat semen, solutions of Ringer's lactate, sodium citrate and 2.92% and TRIS solution to verify the stability and persistence of sperm motility and strength as well as changes in the plasma membrane. Semen was collected from adult male goats were healthy with history of normal fertility, during the natural breeding season (March-April 2010). We evaluated the physical characteristics of semen at collection and the thawing of straws, which have undergone a process of cooling medium. Even after thawing were performed three additional tests: test of heat resistance (TTR), supravital and bonding sperm in egg yolk. All average values for fresh semen as the volume (mL), motility (%), strength (0-5), sperm concentration (x10 9 total) and morphology (% normal) were consistent with that recommended by the Brazilian College of Animal Reproduction (CBRA), being 1.0 ± 0.04, 83.1 ± 0.54 3.9 ± 0.08, 3.3 ± 0.2 and 90.8 ± 0.85, respectively. The parameters motility (33.1 ± 1.8%) and strength (3.0 ± 0.1) semen analysis in the post-thawing (5 minutes) also attended what is established by CBRA the beginning of the TTR, but the period of survival of semen did not exceed 90 minutes after thawing, decreasing sharply over time. The treatment control was the with highest motility after thawing (42.2 ± 2.0) and the treatment received the TRIS solution showed greater persistence (90 minutes) and less abrupt decline in motility parameters and force in relation to other treatments. In all treatments, after 30 minutes of TTR, the parameters were lower than those recommended by the CBRA. One possible explanation for the TRIS solution have allowed persistence and less abrupt decline in motility and strength parameters may bedue to the increase in volume and dilution of the elements that could be being toxic to sperm (free radicals) and also the addition of fructose ( substratro energy), TRIS and citric acid (buffering agent).Additional tests (test of binding of sperm in egg yolk and supravital test) performed in this study showed no difference between treatments (P> 0.05). A positive correlation between motility and supravital test, the test can be considered a ratification of motility assessed subjectively by the researcher. No significant difference was found between the morphologic alterations observed after cryopreservation compared to fresh semen. It was concluded therefore that the addition of Ringer lactate, sodium citrate 2.92% and TRIS solution did not allow greater persistence of motility and vigor after thawing. We suggest the in vivo tests to verify whether the survival time after addition of diluents presented is sufficient to achieve fertilization, since it can count on the assistance of the female external factors (nutrition and aid in movement of sperm). It is further recommended the use of fluorescent probes to assess sperm to better verify the membrane integrity of sperm, since sperm motility in this study had motility after thawing, but their membranes could be altered to the point of not supporting the challenge of temperature (37 °C) for long periods. / O experimento foi realizado no Setor de Caprinocutura do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal de Viçosa, no município de Viçosa-MG. O objetivo foi adicionar, no descongelamento de sêmen caprino, as soluções de Ringer com lactato, citrato de sódio 2,92% e solução TRIS, para verificar a estabilidade e persistência da motilidade e vigor dos espermatozóides, assim como alterações da membrana plasmática. O sêmen foi coletado de machos caprinos adultos, sadios, com histórico de fertilidade normal, durante a estação de monta natural (março a abril de 2010). Foram avaliadas as características físicas do sêmen no momento da coleta e no descongelamento das palhetas, as quais passaram por um processo de resfriamento médio. Ainda após o descongelamento, foram realizados três testes complementares: teste de termorresistência (TTR), supravital e de ligação do espermatozóide na gema de ovo. Todos os valores médios obtidos para o sêmen fresco quanto a volume (mL), motilidade (%), vigor (0-5), concentração espermática (x109 totais), e morfologia (% normais) foram condizentes ao preconizado pelo Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (CBRA), sendo de 1,0±0,04; 83,1±0,54; 3,9±0,08; 3,3±0,2 e 90,8±0,85, respectivamente. Os parâmetros motilidade (33,1±1,8%) e vigor (3,0±0,1) do sêmen analisado no pós-descongelamento (5 minutos) também atenderam o que é estabelecido pelo CBRA no início do TTR; porém, o período de sobrevivência do sêmen não ultrapassou os 90 minutos após o descongelamento, diminuindo bruscamente com o passar do tempo. O tratamento controle foi o que obteve maior motilidade no descongelamento (42,2±2,0) e o tratamento que recebeu a solução TRIS apresentou maior persistência (90 minutos) e diminuição menos abrupta dos parâmetros motilidade e vigor, em relação aos outros tratamentos. Em todos os tratamentos, após 30 minutos de TTR, os parâmetros estavam aquém do preconizado pelo CBRA. Uma possível explicação para a solução TRIS ter permitido persistência e diminuição menos abrupta dos parâmetros motilidade e vigor pode ser devido o aumento de volume e diluição dos elementos que poderiam estar sendo tóxicos aos espermatozóides (radicais livres) e, também, a adição de frutose (substratro energético), TRIS e ácido cítrico (agentes tamponantes). Os testes complementares (teste de ligação do espermatozóide na gema de ovo e teste supravital) realizados neste trabalho não apresentaram diferença entre tratamentos (P>0,05). Foi encontrada correlação positiva entre a motilidade e o exame supravital, podendo o teste ser considerado uma ratificação dos valores de motilidade aferidos subjetivamente pelo pesquisador. Não foi encontrada diferença significativa entre as alterações morfológicas observadas após a criopreservação em relação ao sêmen fresco. Concluiu-se, assim, que a adição das soluções Ringer lactato, citrato de sódio 2,92% e solução TRIS não permitiu maior persistência da motilidade e vigor após o descongelamento. Sugere-se a realização de testes in vivo a fim de verificar se o tempo de sobrevivência apresentado após adição dos diluentes é suficiente para se realizar a fertilização, uma vez que se pode contar com o auxílio de fatores inerentes a fêmea (nutrição e auxílio na movimentação do espermatozóide). Recomenda-se ainda, o uso de sondas fluorescentes naavaliação espermática para se verificar melhor a integridade da membrana dosespermatozóides, pois os espermatozóides neste trabalho possuíam motilidade após o descongelamento, mas as suas membranas poderiam estar alteradas a ponto de não suportarem o desafio da temperatura (37 ºC) por longo período.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA14MA122.pdf: 692452 bytes, checksum: e25e927c8d8beb4236a0bb259e17524a (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Oxidative stress and premature sperm capacitation, generated during cryopreservation of ram semen, reduces their viability, especially after cervical insemination. The use of seminal plasma (SP) and negative pressure have produced protection and the reversion of such damages. Two experiments evaluated these potential enhancers of cryotolerance, and a third experiment compared 2 methods of cervical AI. In experiment 1 ram semen was subjected to the treatments: (TC) control or negative pressure of 200mBar (P200); 500mBar (P500) and 800mBar (P800). In experiment 2, the PS from rams, stallions and bulls was lyophilized (L) and its protein measured. From each SP 600&#956;g of protein per mL was aded to the freezing diluent used, compounding the experimental groups: control (TC), ovine PS (PSLO), bovine PS (PSLB) and equine PS (PSLE). Experiment 3 evaluated 2 methods of AI, the superficial cervical AI (G1), and deep intrauterine or cervical AI with clamping the vaginal fornix (G2). The in vitro data were subjected to ANOVA and test T, and the pregnancy rate to the chi square test, all with 5% significance level. In the experiment 1 higher progressive motility (PM) was observed in TC (49%) compared to P200 (40.9%), P500 (38.9%) and P800 (38.9%) treatments. In PM during the test the thermal resistance (TTR), MP after percoll (PP), acrosome integrity (IAC), IAPP and membrane integrity (MI), there was no difference between the groups. In cleavage rate P800 (34.5%) was less than P200 (51.2%) and P500 (50.9%) did not differ from the control (44.3%). In conclusion the P500 is the most appropriate for use in ram semen cryopreservation, enabling high rates of cleavage after heterologous IVF, maintain membrane integrity. Experiment 2 evaluated MP, MPPP and cleavage rate after heterologous IVF in all groups, with the best group compared with the control in: CASA system; acrossoma integrity (FITC-PSA), membrane stability (M540), chromatin integrity (acridine orange), apoptosis (annexin) and potential of mitochondria (Mitotracker). Also the PSLE showed higher cleavage rate (71.37%), indicating a greater ability to oocyte penetration. The PSLE showed higher VCL (PC-163.5&#956;m/s, PSLE-186.2&#956;m/s) and ALH (PC9&#956;m PSLE-8.2&#956;m) in CASA evaluation, compared to control. In flow cytometry the annexin test revealed a greater amount of non-apoptotic viable cells in PSLE (38.9%), compared to TC (32.1%). In experiment 3 there was no difference in pregnancy rates after superficial (33.3%) or deep and intrauterine (52.2%) IA, possibly due to the reduced number of animals used / O estresse oxidativo e a precoce capacitação espermática, gerados na criopreservação do sêmen ovino, reduzem sua viabilidade, principalmente na inseminação cervical. O uso de plasma seminal (PS) e a pressão negativa têm produzido a proteção e reversão desses danos. Dois experimentos avaliaram esses potenciais melhoradores da criotolerância, e um terceiro avaliou dois métodos de IA cervical. No experimento 1 o sêmen ovino foi submetido aos tratamentos: controle (TC), pressão de 200mBar (P200); 500mBar (P500) e 800mBar (P800). No experimento 2 o PS de carneiros, garanhões e touros foi liofilizado (L) e sua proteína dosada. De cada PS, o equivalente a 600&#956;g de proteína por mL, foi adicionado ao diluente de congelamento, compondo os grupos experimentais: controle (TC), PS ovino (PSLO), PS bovino (PSLB) e PS equino (PSLE). O experimento 3 avaliou 2 métodos de IA, a cervical superficial (G1) e a cervical profunda com pinçamento do fundo de saco vaginal (G2). Os dados in vitro foram submetidos a análise de variância e teste T, e a taxa de prenhez ao chi-quadrado, todos com significância de 5%. No experimento 1, maior motilidade progressiva (MP) foi observada no TC (49%) frente aos tratamentos P200 (40,9%), P500 (38,9%) e P800 (38,9%). Na MP durante o teste de termo resistência (TTR), MP após percoll (PP), integridade de acrossoma (IAC), IACPP, integridade de membrana (IM) e IMPP, não houve diferença entre os grupos. Na clivagem P800 (34,5%) foi inferior a P200 (51,2%) e P500 (50,9%), não diferindo do controle (44,3%). Conclui-se que a P500 é a mais adequada para uso com sêmen ovino, não reduzindo a viabilidade após o congelamento e proporcionando elevada taxa de clivagem após FIV heteróloga. O experimento 2 avaliou MP, MPPP e clivagem após FIV heteróloga de todos os grupos, sendo o melhor grupo comparado ao controle através de: sistema CASA, integridade de acrossoma (FITC-PSA), estabilidade de membrana (M540); integridade de cromatina (acridina orange); apoptose (anexina) e potencial de mitocôndria (mitotracker). O PSLE apresentou a maior taxa de clivagem (71,37%), evidenciando sua maior capacidade de penetração nos oócitos. Observou-se superioridade do PSLE nosparâmetros VCL (PC-163,5&#956;m/s, PSLE-186,2&#956;m/s) e ALH (PC-9&#956;m, PSLE- 8,2&#956;m) do CASA, em relação ao controle. Na citometria de fluxo, o teste da anexina revelou maior quantidade de células viáveis não apoptóticas com o PSLE (38,9%) em relação ao TC (32,1%). No experimento 3 não houve diferença na prenhez após IA superficial (33,3%) e profunda (G2 52,2%), possivelmente devido ao número reduzido de animais

O sangue do cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido usado como fonte de células-tronco hematopoiéticas (CTH) para reconstituir a função medular (hematopoiese). A maioria das vezes, esta modalidade de transplante requer a criopreservação das CTH, que permanecem congeladas até uma possível utilização futura. Na criopreservação de CTH, o reagente químico dimetilsulfóxido (DMSO) tem sido utilizado como um crioprotetor. No entanto, tem sido provado que DMSO tem efeitos tóxicos para o corpo humano. Muitos organismos na natureza possuem uma capacidade de sobreviver ao congelamento e à desidratação acumulando dissacarídeos, como a trealose e sacarose, por isso a trealose, tem sido investigada como um crioprotetor alternativo para diversos tipos celulares. Outro dano muito comum durante o congelamento é a formação de espécie reativas de oxigênio (ERO) que diminui a viabilidade celular, por isso a adição de bioantioxidantes na solução de criopreservação das células é passo muito importante. Este estudo foi dividido em duas fases na primeira foram avaliados os resultados obtidos com a adição de antioxidantes na solução de criopreservação das células de SCUP e na segunda fase avaliou-se a hipótese que a solução de criopreservação contendo trealose intracelular e extracelular melhora a recuperação e a viabilidade das células-tronco do SCUP, após a criopreservação. SCUP foi processado e submetido à criopreservação em soluções contendo na primeira fase: soluções com diferentes concentrações de DMSO (10%, 5% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (5%, 2,5%) com um dos dissacarídeos (60mmol/L) e ácido ascórbico e/ou catalase (10mg/mL); e na segunda fase: soluções contendo diferentes concentrações de DMSO (10% e 2,5%), assim como as combinações de DMSO (2,5%) com trealose intra (a trealose foi introduzida na célula por meio de lipossomas) e extracelular e soluções contendo trealose intra e extracelular sem DMSO, armazenados por duas semanas em N2L, e descongeladas. As células descongeladas foram avaliadas por citometria de fluxo, pelo ensaio metabólico pelo MTT e de unidades formadoras de colônias (UFC). Na primeira fase do estudo, a catalase, melhorou a preservação das células CD34+ e CD123+, a UFC e a viabilidade celular, em comparação com a solução padrão de criopreservação. Já na segunda fase do estudo, após as análises de todos os testes vimos que a solução que continha trealose intra/extracelular e DMSO mostrou uma capacidade de manutenção da viabilidade/integridade celular superior a todas as outras testadas. A solução que continha trealose intra e extracelular sem DMSO, obteve um resultado comparável com seu controle (2,5%DMSO), porém quando avaliamos a solução que continha apenas trealose intracelular não obtivemos resultados satisfatórios. A catalase pode atuar sobre a redução dos níveis ERO na solução de criopreservação das CTH de SCUP, diminuindo os danos por ele causados e a trealose deve estar presente em ambos os lados das células durante o processo de congelamento. Portanto, em testes clínicos futuros, ela poderá ser um potencial crioprotetor das células-tronco de SCUP, podendo substituir totalmente o DMSO da solução de criopreservação, minimizando com os efeitos colaterais provenientes da infusão de produtos criopreservados nos pacientes. / The umbilical cord blood (UCB) has been used as a source of primitive hematopoietic stem cells (HSC) to reconstitute the hematopoiesis. Most often, it is required the cryopreservation of HSC, which remain frozen in banks for possible future use. For cryopreservation of HSC, the chemical reagent dimethylsulfoxide (DMSO) has been used as a cryoprotectant. Many organisms in nature have a capacity of survive freezing and dehydration by accumulating disaccharides, so the trehalose, has been actively investigated as an alternative cryoprotector, other damage which is very common during freezing is oxygen free radicals formation which decreases the cellular viability after thawing, so the addition of bioantioxidants in the solution of cryopreservation of cells is very important. This study was divided into two phases: first, we evaluated the results obtained with the addition of antioxidants in the solution for cryopreservation of cord blood cells and the second phase: evaluate the hypothesis that the cryopreservation solution containing intracellular and extracellular trehalose improves recovery and viability of cord blood stem cells after cryopreservation. UBC was processed and subjected to cryopreservation solutions containing for the first phase: solutions with different concentrations of DMSO (10%, 5% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (5%, 2.5 %) with a disaccharide (60 mmol/L), ascorbic acid and/or catalase (10mg/mL), and for the second phase: solutions containing different concentrations of DMSO (10% and 2.5%), as well as combinations of DMSO (2.5%) with intracellular trehalose (trehalose was introduced into the cell by means of liposomes) and solutions containing extra and intracellular trehalose without DMSO, stored for two weeks in N2L, and thawed. The thawed cells were assessed by flow cytometry, MTT and colony forming units (CFU) assays. In the first phase of the study our analysis showed catalase improved the preservation CD34+ and CD123+ cells, cell viability and CFU compared to standard cryopreservation solution. In the second phase, after testing of all test we observed that the solution containing intra/extracellular trehalose and DMSO showed superior capacity of maintaining the cell viability/integrity in relation to the others, the solution containing intra-and extracellular trehalose without DMSO, obtained a result that can be compared with its control (2.5% DMSO), and that the solution containing only intracellular trehalose did not generate satisfactory results. The catalase can act on reducing the levels of reactive oxygen species in the solution for cryopreservation of HSC of UCB reducing the damage it caused, trehalose must be present on both sides of the cells during the freezing process. Future clinical trials are needed to confirm that it may be a potential cryoprotectant of stem cells from cord blood, which can totally replace the DMSO in cryopreservation solution, eliminating the side effects from the infusion of cryopreserved products in patients already suffering from the disease base.

O plasma rico em plaquetas (PRP) é utilizado na medicina equina para o tratamento de lesões ósseas, articulares, tendíneas e ligamentares. No entanto o PRP deve ser preparado no momento de cada aplicação, pois seu tempo máximo de utilização após o preparo é de apenas oito horas. O objetivo deste estudo foi avaliar o resfriamento e criopreservação como métodos de armazenamento do PRP equino utilizando dois crioprotetores: dimetil sulfóxido (DMSO) e trealose, na tentativa de manter a viabilidade plaquetária após o armazenamento a baixas temperaturas. Duas amostras de PRP foram preparadas a partir da centrifugação do sangue de seis pôneis saudáveis e foram destinadas à criopreservação a -196º C ou ao resfriamento a 4º C. Cada amostra de PRP preparada foi dividida em quatro alíquotas: fresca, com DMSO, com trealose ou sem crioprotetor. As amostras frescas foram avaliadas quanto à contagem plaquetária, determinação do volume plaquetário médio (VPM), concentração plaquetária em relação ao sangue total e quantificação do fator de crescimento de transformação beta 1 (TGF-β1). As amostras criopreservadas e resfriadas ficaram armazenadas por 14 dias e foram então submetidas às mesmas análises laboratoriais. O número de plaquetas e concentração plaquetária foram similares entre as amostras frescas e resfriadas com ou sem crioprotetor, mas foram superiores nas amostras frescas em relação às amostras criopreservadas. Observou-se aumento do VPM em todas as amostras armazenadas, indicando que as plaquetas sofreram lesões durante o armazenamento. A liberação de TGF-β1 foi superior no PRP fresco em relação ao PRP resfriado ou criopreservado, não havendo diferença entre as amostras que continham ou não crioprotetores. A adição dos crioprotetores DMSO e trealose não impediu as lesões plaquetárias de armazenamento. Por outro lado, tanto as amostras resfriadas quanto as criopreservadas liberaram quantidades significativas de TGF-β1. / Platelet rich plasma (PRP) is used in equine medicine for treatment of bone, joint, tendon and ligament injuries. However the PRP must be prepared at the time of each application, since its maximum time of use after the preparation is only eight hours. The objective of this study was to evaluate cooling and cryopreservation of equine PRP as storage methods using two cryoprotectants: dimethyl sulfoxide (DMSO) and trehalose, in an attempt to maintain platelet viability after storage at low temperatures. Two PRP samples were prepared from the blood centrifugation of six healthy ponies and were intended for cryopreservation at -196 ° C or cooling at 4 ° C. Each prepared PRP sample was divided into four aliquots: fresh, DMSO, trehalose or without cryoprotectant. The fresh samples were evaluated for platelet count, determination of mean platelet volume (MVP), platelet concentration in relation to whole blood and quantification of transforming growth factor beta 1 (TGF-β1). The cryopreserved and cooled samples were stored for 14 days and then submitted to the same laboratory tests. The number of platelets and platelet concentrations were similar between fresh and cooled samples with or without cryoprotectant, but were higher in fresh samples than in cryopreserved samples. An increase in MPV was observed in all stored samples, indicating that platelets suffered lesions during storage. The release of TGF-β1 was higher in fresh PRP than in cold or cryopreserved PRP, with no difference between samples containing or not cryoprotectants. The addition of DMSO and trehalose cryoprotectants did not prevent platelet storage lesions. On the other hand, both the cooled and cryopreserved samples released significant amounts of TGF-β1.

Embriões bovinos produzidos in vitro (PIV) apresentam diferenças quando comparados aos produzidos in vivo. Esta particularidade reduz as taxas de viabilidade in vitro e in vivo após a criopreservação, limitando o emprego comercial da preservação dos embriões PIV. Várias estratégias vêm sendo propostas para aumentar a viabilidade e desenvolvimento desses embriões criopreservados. Alguns estudos utilizam a exposição dos embriões a um estresse subletal, como a alta pressão hidrostática (HHP), previamente a procedimentos que reduzem a viabilidade embrionária, o que aumenta a tolerância desses indivíduos à criopreservação. Os objetivos deste experimento foram determinar as taxas de viabilidade de blastocistos bovinos PIV previamente expostos à alta pressão gasosa (HGP) de 27,5 MPa por 120 min e após submetidos à congelação ou vitrificação. A avaliação da viabilidade foi mediante determinação das taxas de re-expansão e eclosão após criopreservação.Oócitos morfologicamente viáveis obtidos a partir de ovários de frigorífico foram maturados in vitro durante 24 h a 38,5 °C, em atmosfera de 5% de CO2 com umidade relativa do ar saturada e fecundados (dia 0) com sêmen criopreservado capacitado in vitro Após 20 h, os presuntivos zigotos foram submetidos a cultivo in vitro em meio SOF condicionado a 38,5 °C, em atmosfera de 5% de CO2, 5% O2 e 90% N2, com umidade relativa do ar saturada. Os blastocistos (dia 7) foram divididos aleatoriamente em 4 grupos: expostos à HGP e congelados, PC; controle congelação, CC; expostos à HGP e vitrificados, PV; controle vitrificação, CV. Os embriões foram expostos ou não à HGP de 27,5 MPa por 120 min e em seguida colocados em cultivo por 120 min. Após esse período os blastocistos foram submetidos à congelação ou à vitrificação. A taxa de re-expansão dos blastocistos avaliada em 24 h do grupo CV (59,6%) foi maior que a dos embriões dos grupos CC (45,2%) e PC (46,3%) (P<0,05), mas não diferiu da taxa de re-expansão dos embriões do grupo PV (48,1%). As taxas de eclosão foram: PC, 21,5%; CC, 24,6%; PV, 35,3%; CV, 30,8%. Os blastocistos do grupo PV apresentaram maiores taxas de eclosão do que os embriões do grupo PC. Em conclusão, o tratamento com HGP não interferiu no desenvolvimento in vitro dos blastocistos que foram submetidos à congelação ou à vitrificação. Levando em consideração os blastocistos eclodidos sobre o total de re-expandidos, o tratamento com HGP incrementou a taxa de eclosão in vitro dos embriões que foram submetidos à vitrificação. / In vitro bovine embryos (IVP) present differences when compared to those produced in vivo. This particularity reduces in vitro and in vivo survival rates after cryopreservation, limiting the commercial use of IVP embryos preservation. Several strategies have been proposed to increase viability and development of these cryopreserved embryos. Some studies use embryo exposure to sublethal stress prior to in vitro procedures, such as high hydrostatic pressure (HHP), which increases tolerance of these individuals to a new stressor, such as cryopreservation. Objectives of this experiment were to determine viability rates of bovine blastocysts produced in vitro previously exposed to high gaseous pressure (HGP) of 27.5 MPa for 120 minutes and after subjected to freezing or vitrification. Morphologically viable oocytes obtained from bovine ovaries were matured in vitro for 24 hours at 38.5°C in 5% CO2 atmosphere with saturated air humidity and in vitro fertilized (day 0) with cryopreserved semen (inseminating dose 1x106 / ml) After 20 hours, presumptive zygotes were cultured in vitro at 38.5°C in an atmosphere of 5% CO2, 5% O2 e 90% N2 with saturated air humidity. Blastocysts obtained on day 7 were divided into 4 groups: exposed to HGP and frozen (FP); freezing control (FC); exposed to HGP and vitrified (VP); vitrification control (VC). These groups were exposed or not to 27.5 MPa HGP for 120 minutes then in vitro cultured for more 120 min. After this period, blastocysts were subjected to freezing or vitrification. Re-expansion rate was higher (P<0.05) for CV (59,6%) compared to CC (45,2%) and CV (46,3%), not differing from PV (48,1%). Blastocysts from group VP presented higher hatching rates than embryos from group FP (P<0.05) (35,3% vs. 21,5%, respectively). In conclusion, exposure of blastocysts to HGP before vitrification or conventional freezing did not interfered on in vitro embryo survival rates. However, considering hatched blastocysts over the total re-expanded, HGP increased hatching rates of vitrified embryos.

O Transplante de Células Tronco Hematopoiéticas (TCTH) baseia-se no princípio de infusão de Células Tronco Hematopoiéticas (CTH) CD34 + num receptor condicionado. Sabe-se que tais células são capazes de gerar uma nova hematopoiese bem como que o benefício do aumento de dose de CD34 + estende-se de aproximadamente 2 x 106 CD34/Kg a 5 x 106 CD34/Kg do receptor. A determinação do número de CD34 baseia-se no número total de CD34, porém sabe-se que apenas uma pequena porção celular do grupo de CD34 está associada à recuperação medular. Uma maneira de refinar a detecção desse grupo de células quando comparado com a quantificação do CD34 total, é a análise citométrica dos padrões de tamanho e granularidade citoplasmática. No contexto do TCTH autólogo e algumas vezes no TCTH alogênico, onde a infusão das células precursoras é feita com intervalo superior a três dias após a sua coleta, o congelamento das CTH CD34 +as faz-se necessário para que as células permaneçam viáveis. O agente crioprotetor mais comumente usado é o Dimetilsulfóxido (DMSO), que em temperaturas extremamente baixas protege as CTH da morte celular, porém em temperatura ambiente torna-se tóxico. As reações adversas do receptor no momento da infusão são atribuídas, em geral, ao DMSO. Portanto existem diferentes protocolos de congelamento de CTH que usam diferentes concentrações desse agente, com o intuito de reduzir as reações adversas e, ao mesmo tempo, evitar a morte celular decorrente de temperaturas baixas. Alguns estudos concluem que a viabilidade das CTH congeladas pode ser mantida com concentrações baixas de DMSO ou com celularidade elevada nos produtos congelados. Além do DMSO, a albumina e o Hidroxetilamido (HES) são usados como adjuvantes na proteção celular ao frio. Alguns protocolos de criopreservação usam apenas o DMSO enquanto outros indicam a necessidade do uso dos três agentes juntos. Não há consenso a respeito do protocolo de criopreservação ideal. Um expressivo número de trabalhos sugere o uso do DMSO 5 a 10% juntamente com a albumina 20% e HES 6% em enxertos com celularidade até 3 x 108 células nucleadas/ml, porém existem sugestões de protocolos diferentes desse padrão que usam o DMSO como agente único assim como concentrações menores de DMSO. Com relação ao efeito tóxico do DMSO, os eventos adversos do paciente no momento da infusão são atribuídos diretamente a ele. Porém evidências recentes apontam outras possíveis causas: citocinas liberadas durante o período de armazenamento e infundidas com o enxerto e micro-agregados leucocitários decorrentes da elevada celularidade do enxerto. O presente estudo pretendeu verificar a viabilidade das CTH através da medida da Anexina-V e 7-AAD pela técnica de citometria de fluxo usando-se diferentes concentrações de DMSO, bem como comparou tal desfecho entre amostras que foram congeladas apenas com DMSO e amostras congeladas com DMSO, HES e albumina. Além disso, foram verificados os níveis de citocinas inflamatórias nos enxertos e sua relação com a concentração de DMSO. / Bone Marrow Transplantation (BMT) is based on the principle of hematopoietic CD34 stem cells infusion in a conditioned recipient. It is known that such cells are capable of generating a new hematopoiesis, as well as known that the benefit of the increase of CD34 dose is goes best when it is between from 2 and to 5 x 106 CD34 by patient’s body weight. The CD34 determination is based on the total CD34 number. However it is known that only a small portion of the CD34 population is related to the marrow repopulating capacity. An alternative way of detecting such cells when compared to total CD34 dose is the cytometric analysis of citoplasmatic granularity and size patterns. In the autologous BMT context and, sometimes in the allogeneic type where the graft infusion occurs more than three days after the graft harvest, the CD34 cells freezing is necessary to keep their viability. The crioprotective agent most commonly used is the DMSO, which at extremely low temperatures this agent protects the CD34 cells from dying. However at temperatures above 30°C it became toxic and causing adverse events in the patient receiving them. The adverse reactions at the infusion moment in general are linked to DMSO, thus there are some different cryopreservative protocols using different DMSO concentrations aiming to reduce the incidence of collateral damage and at the same time avoid the CD34 from dying at low temperatures. Some studies conclude that CD34 viability can be maintained with the use of high mononuclear cellularity in the graft or with low DMSO concentrations. Besides DMSO, albumin and Hydroxietilstarch (HES) are cryoprotectants adjuvants. Some Cryopreservation protocols only use DMSO as cryoprotective agent, while others indicate the three agents together. There is no consensus about the ideal cryopreservation protocol. An important number of studies suggests the use of DMSO 5 to 10% with albumin 20% and HES 6% in grafts with cellularity number of no more than 3 x 108 cells/ml, however there are some new different protocols that use DMSO alone and at lower concentrations. As to adverse events during the infusion moment, it is known that DMSO causes the effects. However, there are evidences that other causes could cause these events: cytokines released during the storage freezing time and infused with the graft and leukocyte micro-clots caused by the high cellularity in the graft. The present study aimed to study the viability of CD34 cells using the Annexin-V and 7-AAD apoptosis reagents through the flow cytometry technique in different DMSO concentrations as well as compared such outcome among the samples only frozen with DMSO and samples frozen with DMSO, HES and albumin. Besides, it was verified the inflammatory cytokine levels and their relationship with the DMSO concentration.

O objetivo do experimento foi avaliar o efeito da suplementação de touros adultos com sabões cálcicos de ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) sobre as características qualitativas do sêmen pré e pós-descogelação. Foram utilizados vinte touros com idades entre 4 e 10 anos, das raças Angus, Braford, Brangus e Hereford distribuídos aleatoriamente em dois grupos com dez touros cada um. Os tratamentos avaliados foram: sabões cálcicos ou suplementação energética. Os touros foram mantidos em piquetes individuais e alimentados durante 77 dias com dietas isoenergéticas elaboradas com: forragem verde, concentrado comercial, sal mineral e sabões cálcicos ou suplemento energético. Os touros recebendo o tratamento com sabões cálcicos (SF) receberam 200 g/dia de Megalac-E® e os do tratamento com suplemento energético (SE) receberam 750 g/dia de raspa de mandioca (Manihot esculenta, Crantz). A coleta do sêmen foi realizada a cada 15 dias utilizando vagina artificial e as amostras de sêmen avaliadas quanto ao volume, concentração, motilidade, morfologia, avaliação da integridade do acrossoma e diferenciação de espermatozóides vivos de mortos por meio de coloração tripa azul/giemsa, avaliação da integridade da membrana da cauda por meio de teste hipoosmóstico (HO) e longevidade dos espermatozóides por meio de teste de termorresistência (TTR). Também foram coletadas amostras de sangue para avaliação das concentrações de testosterona. O tipo de suplemento energético não afetou o volume e a concentração de espermatozóides, nem a concentração de testosterona no sangue. O sêmen de touros suplementados com sabões cálcicos de PUFA apresentou valores superiores quanto à motilidade espermática (83.3% vs. 75.3%), percentagem de espermatozóides vivos (94,8% vs. 91,8%) e número de espermatozóides com acrossoma íntegro (98,0% vs. 96,6%). Interações significativas foram encontradas entre tratamento e coleta para percentagens de espermatozóides normais (p = 0.0344) e percentagens de espermatozóides positivos ao HO (p = 0.0168). Não foi encontrada diferença significativa entre os grupos para percentagens de motilidade dos espermatozóides pós-congelação, nem motilidade após o teste de termorresistência (TTR) aos 30 minutos e aos 60 minutos. Os resultados do HO do grupo recebendo suplemento funcional não foi diferente do grupo com suplemento energético. Durante o período de suplementação o grupo com suplemento funcional teve percentagens maiores de espermatozóides vivos (51,5% vs. 42,2%) e com acrossoma íntegro (48,0% vs. 39,2%) quando comparado com o grupo que recebeu suplemento energético. A suplementação com sabões cálcicos de PUFA em touros pode influenciar positivamente nas características qualitativas do ejaculado conferindo maior resistência aos espermatozóides submetidos a processos de criopreservação. / The aim of this experiment was evaluate of the effect of the supplementation of adult bulls with calcium soaps of polyunsaturated fatty acids (PUFA) on the qualitative characteristics of the semen subjected to cryopreservation and thawing. Twenty adult bulls Angus, Hereford, Brangus and Braford were randomly assigned into two groups; they were subjected to two types of treatment: (SF) calcium soap; (SE) and energy source. The bulls were kept in individual pens and, during 77 days, they were fed on isoenergetic diets prepared with green grass, commercial concentrate, mineral salt, and calcium soaps of PUFA or energy supplement. The treatment supplemented with calcium soaps of PUFA received 200 g/d of Megalac-E®; and the treatment supplemented with other energy source received 750 g/d from cassava meal (Manihot esculenta, Crantz). During the period of the experiment, five collections of semen were performed with artificial vagina; the semen samples were evaluated considering the following variables: seminal volume, sperm concentration, sperm motility, morphology, evaluation of acrosome intact and differentiation of live and dead spermatozoa by staining tripan blue/giemsa, evaluation of the integrity membrane sperm through hypoosmotic swelling test (HO) and evaluation of longevity of sperm using the heat resistance tests (TTR). Two blood samplings were performed for assessing the concentration of blood testosterone. The results regarding the volume, sperm concentration and blood testosterone concentrations did not differ significantly between treatments during the experimental period. The group supplemented with calcium soaps of PUFA presented improvements in the percentages of sperm motility (83.3% vs. 75.3%). The percentages of live sperm (94,8% vs. 91,8%) and those with intact acrosome (98,0% vs. 96,6%) were higher compared with the group that received energy supplement. No significant differences were found between treatments in the percentages of the post-freezing motility and the motility of sperm subjected to TTR after 30 minutes and after 60 minutes showed no significant differences between treatments. The results of HO were not different between the groups with functional and energy supplement. During the supplementation period, the group with functional supplement presented higher percentages of live sperm (51,5% vs. 42,2%) and sperms with intact acrosome (48,0% vs. 39,2%) when compared with the group that received energy supplement. Supplementation with calcium soaps of PUFA can provide better features and higher resistance to sperm when submitted to the process of cryopreservation and thawing.

O Transplante de Células Tronco Hematopoiéticas (TCTH) baseia-se no princípio de infusão de Células Tronco Hematopoiéticas (CTH) CD34 + num receptor condicionado. Sabe-se que tais células são capazes de gerar uma nova hematopoiese bem como que o benefício do aumento de dose de CD34 + estende-se de aproximadamente 2 x 106 CD34/Kg a 5 x 106 CD34/Kg do receptor. A determinação do número de CD34 baseia-se no número total de CD34, porém sabe-se que apenas uma pequena porção celular do grupo de CD34 está associada à recuperação medular. Uma maneira de refinar a detecção desse grupo de células quando comparado com a quantificação do CD34 total, é a análise citométrica dos padrões de tamanho e granularidade citoplasmática. No contexto do TCTH autólogo e algumas vezes no TCTH alogênico, onde a infusão das células precursoras é feita com intervalo superior a três dias após a sua coleta, o congelamento das CTH CD34 +as faz-se necessário para que as células permaneçam viáveis. O agente crioprotetor mais comumente usado é o Dimetilsulfóxido (DMSO), que em temperaturas extremamente baixas protege as CTH da morte celular, porém em temperatura ambiente torna-se tóxico. As reações adversas do receptor no momento da infusão são atribuídas, em geral, ao DMSO. Portanto existem diferentes protocolos de congelamento de CTH que usam diferentes concentrações desse agente, com o intuito de reduzir as reações adversas e, ao mesmo tempo, evitar a morte celular decorrente de temperaturas baixas. Alguns estudos concluem que a viabilidade das CTH congeladas pode ser mantida com concentrações baixas de DMSO ou com celularidade elevada nos produtos congelados. Além do DMSO, a albumina e o Hidroxetilamido (HES) são usados como adjuvantes na proteção celular ao frio. Alguns protocolos de criopreservação usam apenas o DMSO enquanto outros indicam a necessidade do uso dos três agentes juntos. Não há consenso a respeito do protocolo de criopreservação ideal. Um expressivo número de trabalhos sugere o uso do DMSO 5 a 10% juntamente com a albumina 20% e HES 6% em enxertos com celularidade até 3 x 108 células nucleadas/ml, porém existem sugestões de protocolos diferentes desse padrão que usam o DMSO como agente único assim como concentrações menores de DMSO. Com relação ao efeito tóxico do DMSO, os eventos adversos do paciente no momento da infusão são atribuídos diretamente a ele. Porém evidências recentes apontam outras possíveis causas: citocinas liberadas durante o período de armazenamento e infundidas com o enxerto e micro-agregados leucocitários decorrentes da elevada celularidade do enxerto. O presente estudo pretendeu verificar a viabilidade das CTH através da medida da Anexina-V e 7-AAD pela técnica de citometria de fluxo usando-se diferentes concentrações de DMSO, bem como comparou tal desfecho entre amostras que foram congeladas apenas com DMSO e amostras congeladas com DMSO, HES e albumina. Além disso, foram verificados os níveis de citocinas inflamatórias nos enxertos e sua relação com a concentração de DMSO. / Bone Marrow Transplantation (BMT) is based on the principle of hematopoietic CD34 stem cells infusion in a conditioned recipient. It is known that such cells are capable of generating a new hematopoiesis, as well as known that the benefit of the increase of CD34 dose is goes best when it is between from 2 and to 5 x 106 CD34 by patient’s body weight. The CD34 determination is based on the total CD34 number. However it is known that only a small portion of the CD34 population is related to the marrow repopulating capacity. An alternative way of detecting such cells when compared to total CD34 dose is the cytometric analysis of citoplasmatic granularity and size patterns. In the autologous BMT context and, sometimes in the allogeneic type where the graft infusion occurs more than three days after the graft harvest, the CD34 cells freezing is necessary to keep their viability. The crioprotective agent most commonly used is the DMSO, which at extremely low temperatures this agent protects the CD34 cells from dying. However at temperatures above 30°C it became toxic and causing adverse events in the patient receiving them. The adverse reactions at the infusion moment in general are linked to DMSO, thus there are some different cryopreservative protocols using different DMSO concentrations aiming to reduce the incidence of collateral damage and at the same time avoid the CD34 from dying at low temperatures. Some studies conclude that CD34 viability can be maintained with the use of high mononuclear cellularity in the graft or with low DMSO concentrations. Besides DMSO, albumin and Hydroxietilstarch (HES) are cryoprotectants adjuvants. Some Cryopreservation protocols only use DMSO as cryoprotective agent, while others indicate the three agents together. There is no consensus about the ideal cryopreservation protocol. An important number of studies suggests the use of DMSO 5 to 10% with albumin 20% and HES 6% in grafts with cellularity number of no more than 3 x 108 cells/ml, however there are some new different protocols that use DMSO alone and at lower concentrations. As to adverse events during the infusion moment, it is known that DMSO causes the effects. However, there are evidences that other causes could cause these events: cytokines released during the storage freezing time and infused with the graft and leukocyte micro-clots caused by the high cellularity in the graft. The present study aimed to study the viability of CD34 cells using the Annexin-V and 7-AAD apoptosis reagents through the flow cytometry technique in different DMSO concentrations as well as compared such outcome among the samples only frozen with DMSO and samples frozen with DMSO, HES and albumin. Besides, it was verified the inflammatory cytokine levels and their relationship with the DMSO concentration.