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Cette étude est consacrée à l'analyse des propriétés électrostatiques et structurales des protéines diffractant à haute résolution. Les travaux se déclinent en deux aspects principaux qui sont, d'une part, l'analyse d'un point de vue fondamental des propriétés dérivées de leur distribution de charge des structures des protéines, et, d'autre part, l'application pratique des méthodes de la cristallographie haute résolution des macromolécules à deux enzymes.Grâce à une analyse structurale et électrostatique de la protéine PfluDING, le mode de fixation du phosphate a été mis en évidence à deux pH différents. En particulier, cette étude a permis de démontrer la présence d'une liaison hydrogène diffuse assurant un mode de fixation identique quelque soit le pH. La seconde enzyme étudiée est la protéine DFPase, capable de dégrader les organophosphorés. La structure de la DFPase obtenue par diffraction X haute résolution et la structure affinée contre des données neutroniques ont été comparées. L'analyse pointe les différences d'interprétation des deux modèles, et permet de proposer un nouveau mécanisme d'action.Les aspects plus fondamentaux de cette étude portent sur les éléments de structure secondaire des protéines : leurs propriétés électrostatiques en termes de moments électriques (moments dipolaires et quadripolaires des hélices et des feuillets), et le réseau des interactions (dont les liaisons H) assurant la cohésion des hélices ont été analysés. Il a été démontré comment certaines interactions entre liaisons peptidiques au sein d'hélices, classiquement représentées comme des liaisons hydrogène, devaient être considérés comme des contacts purement électrostatiques / This study is about the electrostatic and structural properties of proteins diffracting at high X-ray resolution. Two different aspects are tackled which are 1) the analysis of properties derived from their charge distribution, parting from a fundamental point of view and 2) the application of methods used in high resolution macromolecular crystallography to two enzymes of major interest.After the analysis of the structure and electrostatic properties of PfluDING protein, the binding mode of a phosphate ion, located in the active site, was elucidated at two different pH values. Particularly, this study demonstrates that a diffuse hydrogen bond assures the protonation state of the phosphate ion, which is thus identical at each pH value. The second enzyme studied is the proteine DFPase which is capable of hydrolysing nerve agents. A high resolution X-ray structure and a medium resolution neutron structure where compared. The analysis points out the differences between the two models and a new catalytic mechanism could be proposed.The more fundamental aspects of this study are about the secondary structural elements of proteins: their electrostatic properties in terms of electrostatic moments (dipole and quadrupole moments of helices and sheets) as well as the hydrogen bond network assuring the cohesion of helices have been analyzed. It has been shown that certain interactions between peptide units within helices, represented usually as hydrogen bonds, should actually be considered as pure electrostatic contacts

La structure de trois oxydoréductases (la glutathion peroxydase (Gpx), la thiorédoxine (Trx) et la glutarédoxine (Grx)) de Populus trichocarpa × deltoides (le peuplier) a été caractérisée par diffraction des rayons X. Les Gpxs forment un groupe d’enzymes qui régulent la concentration des espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les cellules, et qui les protègent des effets d’un stress oxydant. Contrairement à leurs homologues d’origine animale, les Gpxs végétales ne dépendent pas du glutathion (GSH) mais des Trx pour leur fonctionnement. Dans cette étude, j'ai résolu les structures des formes réduite et oxydée de la Gpx5 de peuplier et montré que des changements conformationnels drastiques sont nécessaires pour passer d’une forme à l’autre. Les Trxs régulent diverses protéines cibles par la réduction de leur pont disulfure. Mon objectif était de comprendre le mécanisme catalytique d’une nouvelle isoforme, la PtTrxh4, dont la capacité à accepter des électrons de la Grx a été récemment démontrée. Cette PtTrxh4 contient trois cystéines, la première localisée dans une extension en position N-terminale (Cys4) et deux situées dans le site actif classique (WC1GPC2) de la Trx. Les résolutions des structures de l’enzyme sauvage et du mutant C4S m’ont permis de proposer un mécanisme catalytique en quatre étapes en accord avec les études enzymatiques. Les Grxs sont des protéines qui utilisent des électrons du GSH en particulier pour catalyser des réactions d'échange de thiol-disulfure. Ici, je présente la structure de la PtGrxS12 (en complexe avec le GSH), la première structure de la Grx végétale de sous-classe 1 ayant un site actif de motif atypique 28WCSYS32. / Three oxidoreductases (glutathione peroxidase, GPX; thioredoxin, Trx and glutaredoxin, Grx) from Populus trichocarpa × deltoides (poplar tree) were characterized using X-ray crystallography approach. GPXs are a group of enzymes that regulate the levels of oxygen species in cells, and protect them against oxidative damage. In this study, I have determined the crystal structures of the reduced and oxidized form of poplar GPX5 (PtGPX5). Comparison of both redox structures indicates that a drastic conformational change is necessary to bring the two distant cysteine residues together to form an intramolecular disulfide bond. Trxs regulate various protein partners through the thiol-disulfide(s) reduction. The aim of this study is thus to precisely describe the catalytic mechanism of a new isoform of Trx, PtTrxh4, since it has been demonstrated recently to be reduced by Grx. PtTrxh4 contains three cysteines; one localized in an N-terminal extension (Cys4) and two in the usual Trx active site (WC1GPC2). Two crystal structures of PtTrxh4 solved in this study, wild-type and C61S mutant, allow us to propose a four-step disulfide cascade catalytic mechanism in accordance with enzymatic studies. Grxs are highly conserved redox-proteins that utilize electrons from GSH particularly to catalyze thiol-disulfide exchange reactions. Here, I present the structure of glutathionylated PtGrxS12, the first structure of plant Grx of subclass 1 with an atypical 28WCSYS32 active site. Protein structures solved here shed lights to our understanding of the redox mechanism in plant and to the enzyme-substrate interactions.

Un procédé de traitement de surface avant projection plasma d’alumine, développé pour des substrats en acier C40E, a été étendu à des substrats en nickel. Afin de remplacer l’étape de sablage, une pré-oxydation sous CO2 a été réalisée, ayant pour objectif de créer une couche de protoxyde de nickel avec une épaisseur contrôlée. Cette couche d’oxyde permet d’augmenter significativement l’adhérence du dépôt d’alumine sur le substrat nickel. La formation de cette couche de protoxyde a été suivie par une étude de la cinétique d’oxydation. L'observation des interfaces alumine/nickel au MET a mis en évidence que des relations d'hétéroépitaxie entre le monoxyde de nickel et l’alumine sont à l’origine d'une adhésion chimique forte du dépôt. Cette forte adhérence (environ 105 MPa) a pu être quantifiée à l’aide d’un test de traction modifié (ASTM C633-13), dont le développement a été mis en place pour des échantillons en acier C40E pré-oxydés. / A surface treatment process, developed for C40E steel substrates before alumina plasma spraying, has been extended to nickel substrates. As an alternative to sand blasting, nickel substrates were pre-oxidized under CO2, to create a protoxide nickel layer of controlled thickness. This oxide layer significantly increases the alumina coating adherence on nickel substrates. A kinetic study of nickel oxidation under CO2has been realized, in order to better control the nickel preoxidation. TEM investigations of alumina/nickel interfaces showed a heteroepitaxial growth of alumina on nickel monoxide, which justify the strong alumina coatings adhesion. This high adherence (around 105 MPa) has been measured using a modified tensile test (ASTM C633-13), specifically set up for pre-oxidized steel C40E substrates.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Biochimie : Lyon 1 : 2005. / Titre provenant de l'écran titre. 205 réf. bibliogr.

L'exploration récente des fonds marins a révélé l'existence d'une vie microbienne abyssale bien plus diverse et abondante que l'état de nos connaissances sur les limites du vivant ne le laissait penser. Ainsi on estime que plus de 60 % de la biosphère subit des conditions de pression jugées a priori défavorable au fonctionnement de la machinerie cellulaire. Ces pressions peuvent atteindre 1000 bars dans les fosses sous-marines les plus profondes. La découverte récente de Pyrococcus yayanosii CH1, premier organisme hyperthermophile et piézophile strict, a relancé la question de l'adaptation aux fortes pressions.Au cours de cette thèse cette question de l'adaptation à la haute pression a été abordée à travers les protéines par l'étude de deux familles enzymatiques, les malate déshydrogénases et les glyoxylate hydroxypyruvate réductases, provenant d'organismes piézophiles et non piézophiles.Les études comparatives associant enzymologie, biophysique et cristallographie des protéines présentées dans cette thèse révèlent des différences de comportements significatives vis à vis de la pression, chez des protéines d'une même famille enzymatique. Nos analyses montrent que ces différences portent sur différents aspects de la dynamique fonctionnelle des protéines. Nous montrons donc ainsi que la pression peut "potentiellement" représenter un paramètre discriminant susceptible de faire l'objet d'une adaptation.Le travail réalisé a permis de poser les bases d'une méthode de comparaison exhaustive des propriétés des protéines vis à vis de la pression afin de détecter les traces d'une adaptation piézophile sur d'autres systèmes protéiques. / The recent discovery of marine biodiversity shows that a large part of the biosphere is a high-pressure environment. The existence of a specific pressure adaptation is still an open question. Recently, the first obligate piezophilic hyperthermophilic microorganism was isolated from hydrothermal vent. This finding suggests the existence of a specific enzyme adaptation with respect to high pressure.To deeper understanding protein adaptation with respect to high pressure, we examine the enzymatic properties of two family enzymes, malate deshydrogenases and glyoxylate hydroxypyruvate reductases arising from piezophilic and non-piezophilic organisms.Using an integrated approach combining enzymology, biophysics and X-ray crystallography, we reveal significantly different behaviors with respect to high pressure. Our analysis show that these differences involved the dynamic component of the enzyme. These results suggest that pressure could be a discriminating parameter susceptible to induce an adaptative response.This thesis work allows to set the foundations of a protein-properties comparative method with respect to high pressure to reveal piezophilic adaptation in other protein systems.

Le manuscrit présente des travaux relatifs à la caractérisation structurale, électrique et magnétique des matériaux manganites poly-cristallin, les manganites qui présentent un intérêt industriel croissant compte tenu de ses nombreux domaines d'application et sa complexité du point de vu fondamentale; ces matériaux sont des systèmes dont les électrons sont fortement corrélés par la présence de plusieurs interactions en compétition. Les principaux objectifs de la thèse étaient de mieux comprendre l'effet de la substitution aléatoire sur le site A de la structure double pérovskite (famille Ruddlesden – Popper A2MnO4 dérivée de pérovskite AMnO3), principalement sur les propriétés magnétique. Cette étude a été effectuée sur toute la gamme de température, étude des phénomènes critique au pont de transition et l'étude de la susceptibilité magnétique a haut température. Enfin, une étude d'autres matériaux présentant des propriétés cristallographiques et physique très intéressantes de type RMX5. Les résultats ainsi obtenu permettent des progrès significatifs dans la compréhension de ces matériaux. / The manuscript presents the work on the structural, electrical and magnetic materials manganites poly-crystalline manganites that have a growing industrial interest due to its many applications and the complexity of fundamental point of view, these materials are systems which electrons are strongly correlated with the presence of several competing interactions. The main objectives of the thesis were to better understand the effect of random substitution on the A site of the perovskite structure twice (family Ruddlesden - Popper A2MnO4 derived from perovskite AMnO3), mainly on the magnetic properties. This study was conducted over the entire temperature range, ie, the study of phenomena Spin Glass at very low temperatures, the study of critical phenomena at the transition point and the study of the magnetic susceptibility at high temperature. Finally, a study of other materials having physical and crystallographic properties very interesting type RMX5.

Les polyoxovanadates fonctionalisés (POVs) présentent des structures de type cœur – cluster super-octahédral à l’échelle nanométrique, des propriétés électroniques et magnétiques facinantes, de nombreux isomers possédant des propriétés thermodynamiques de type réduction – oxydation et des applications catalytiques prometteuses. Parmi ces différentes propriétés, nous nous sommes intéressées aux propriétés de transfert de charge et de fluorescence. Cependant, comprendre des comportements de transfert de charge, et des mécanismes de fluorescence de ces héxavanadates fonctionnalisées est un encore véritable challenge.La diffraction des rayons X haute résolution permet l’analyse des propriétés électroniques et topologiques, et représente une méthode performante pour étudier les liaisons chimiques et la réactivité chimique, basées sur la détermination des propriétés électroniques et électrostatiques. Par conséquent ces propriétés ont été déterminées pour des polyoxovanadates et sont discutées au niveau atomique.Dans ce manuscrit, nous présentons les résultats de : i) la densité électronique expérimentale, la topologie et les propriétés électrostatiques de deux hexavanadates fonctionnalisées (V6), [(C4H9)4N]2[V6O13{(OCH2)3CCH2OCCH2CH3}2] (V6-C3) and Na2[V6O13{(OCH2)3CCH2OH}2]·3.5H2O (V6OH) ; ii) les calculs théoriques ab initio, d’une série de composés fonctionnalisées (V6) et du décavanadate (V10). Les informations chimiques déduites de l’analyse de la densité électronique sont utilisées pour une meilleure compréhension de la distribution de la densité de charge, des propriétés de fluorescences, du comportement en terme de fonctionnalisation, et des propriétés biologiques. / The functionalized polyoxovanadates (POVs) exhibit nanoscale superoctahedral cluster-core structures, fascinating electronic and magnetic properties, various thermodynamically stable redox isomers, and potential catalytic capabilities. Among of the various properties, we are interested in the charge transfer and fluorescent properties. However, understanding such a charge transfer behavior and fluorescence mechanism of these functionalized hexavanadates is still a formidable challenge.High resolution X-ray crystallography allows the analysis of the electronic and topological properties, and provides a method to study the chemical bonding and chemical reactivity based on charge density and the electrostatic properties determination. Experimental and theoretical charge density analysis of functionalized polyoxovanadates has been carried out and the related properties have been discussed at the atomic level.In this manuscript, we present the results of: i) experimental charge density and related electronic and topological properties of two functionalized hexavanadates (V6), [(C4H9)4N]2[V6O13{(OCH2)3CCH2OCCH2CH3}2] (V6-C3) and Na2[V6O13{(OCH2)3CCH2OH}2]·3.5H2O (V6OH); ii) theoretical calculations on a series of functionalized V6 compounds, and decavanadate (V10). The chemical information from charge density analysis is used for a better understanding of the charge density distribution, charge transfer, fluorescent properties, functionalization behavior, and biological activities.

Depuis 1991, année de mon recrutement au CNRS, mon activité de recherche est centrée sur l'étude d'une famille d'enzymes intervenant dans la biosynthèse protéique : les aminoacyl-tRNA synthétases. Mon travail s'est articulé autour de l'étude de leur organisation fonctionnelle et de la compréhension des bases moléculaires de la reconnaissance spécifique entre ces enzymes et leurs substrats. Des approches multidisciplinaires (biologie moléculaire, biochimie, cristallographie aux rayons X, enzymologie et génétique) ont été mises en œuvre pour une exploration globale de ces problèmes. Nous avons pu progresser dans la connaissance de deux enzymes modèles : l'aspartyl-tRNA synthétase et l'arginyl-tRNA synthétase, deux enzymes appartenant respectivement à la classe II et à la classe I des aminoacyl-tRNA synthétases. Nous avons localisé les sites de fixation des différents substrats, proposé des mécanismes catalytiques et sélectionné in vivo des variants d'aminoacyl-tRNA synthétases et de tRNAs aux propriétés de reconnaissance modifiées.

Les conversions enzymatiques des antigènes du système des groupes sanguins ABO et de l'antigène majeur de xénotransplantation α3Gal représentent des alternatives thérapeutiques afin d'améliorer l'approvisionnement des hôpitaux en sang de groupe O et la transplantation d'organes. La famille GH110 des glycoside hydrolases comprend des enzymes actives sur les antigène B et α3Gal à pH neutre et fonctionnant avec un mécanisme catalytique par inversion. La sous‐famille GH110_A regroupe des membres actifs exclusivement sur l'antigène B, tandis que la sous‐famille GH110_B regroupe des membres actifs sur les antigènes B et α3Gal. Le travail présenté dans ce manuscrit décrit les études structurales et fonctionnelles de deux α‐galactosidases, BtGal110A (GH110_A) et BtGal110B (GH110_B), de la famille GH110 provenant de la bactérie commensale Bacteroides thetaiotaomicron et représentatives des chacune des ces deux sous‐familes. La spécificité de substrat et la grande efficacité catalytique de ces enzymes à pH neutre ont été confirmées grâce à des oligosaccharides mimant l'extrémité des antigènes B et α3Gal. BtGal110A et BtGal110B se replient en hélice β droite et se distinguent d'autres protéines au repliement similaire par la présence de deux domaines additionnels qui adoptent un repliement en demi tonneau β et participent à l'architecture du site actif. La machinerie catalytique de BtGal110A et BtGal110B est constituée de trois acides aspartiques, semblable à celle des enzymes des familles GH28 et GH49, qui partagent la même repliement en hélice β. / Enzymatic conversions of the ABO blood group antigens and of the major xenotransplantation α3Gal antigen represent therapeutic alternatives intended to improve supply of hospitals with requested blood type O and organs. The family GH110 of glycoside hydrolases includes enzymes active towards B and α3Gal antigen within neutral pH and employs an inverting catalytic mechanism. The GH110_A subfamily gathers enzymes with exquisite substrate specificity towards the B antigen, while the GH110_B subfamily gathers enzymes active towards the B and the α3Gal antigens. The present manuscript describes the functional and structural studies of two α‐galactosidases BtGal110A (GH110_A) and BtGal110B (GH110_B) from the commensal bacteria Bacteroides thetaiotaomicron, two representative members of each of these two subfamilies. The substrate specificity and high catalytic efficiency of these enzymes at neutral pH were confirmed using oligosaccharides corresponding to the terminal carbohydrate sequences of the B and α3Gal antigens. BtGal110A and BtGal110B contain a right‐handed β‐helix, but he presence of two additional domains tfolded as half β‐barrels, which participate to the architecture of the active site distinguishes BtGal110A and BtGal110B fro other related glycoside hydrolases. The catalytic machinery consists of three aspartic acids, reminiscent of that of enzymes from the GH28 and GH49 families, which share a similar β‐helix fold. Our observations support the membership of family GH110 to the clan‐N of glycoside hydrolases.