Orientador: Marion Burkhardt de Koivisto / Banca: Maricy Apparício Ferreira / Banca: Janaína Torres Carreira / Resumo: A avaliação de espermatozoides em tecnologias de reprodução assistida raramente analisa a integridade do DNA, crucial para o desenvolvimento embrionário. A técnica do azul de toluidina permite identificar alterações da cromatina com avaliação concomitante da morfometria espermática. O método foi descrito em diversas espécies, mas ao conhecimento dos autores, ainda não foi relatado em gatos. O objetivo deste estudo foi verificar a aplicabilidade da técnica de coloração de azul de toluidina em avaliar as anormalidades de DNA de espermatozoides epididimários (cabeça, corpo e cauda) de gatos. Investigar ainda se houve correlação entre as variáveis: condensação do DNA, morfologia e morfometria da cabeça espermática. Para este propósito, os índices de alteração de DNA obtidos pela técnica de azul de toluidina e laranja de acridina foram comparados, observando correlação de 65,38% (p<0,001). A estabilidade da cromatina aumentou significativamente da região da cabeça (92,06%) do epidídimo para a cauda (97,94%, p=0,0023), mas não houve diferença entre as regiões do corpo e da cauda, demonstrando que os espermatozoides provenientes destas regiões já possuem maturidade reprodutiva. Não houve correlação entre a anormalidade do DNA e a morfologia espermática como nas demais espécies, mas sim com a morfometria. Observou-se diminuição significativa do tamanho da cabeça do espermatozoide durante a passagem pelas três regiões epididimárias (p < 0,0001). A porcentagem de espermatozoides com cr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sperm selection in assisted reproductive technologies rarely evaluates the DNA integrity, which is crucial to the embryo's development. The toluidine blue technique allows identification of chromatin alterations, simultaneously with evaluation of sperm morphometry. The method has been described in many species, but to the authors' knowledge, it has yet to be described in cats. The objective of this study was to verify the applicability of the toluidine blue technique in analyzing DNA abnormalities of epididymal sperm (caput, corpus and cauda) in cats and further investigating if there was correlation between the variables: DNA condensation, morphology and morphometry of the sperm head. For this purpose, the DNA alteration indexes obtained by both toluidine blue and acridine orange techniques were compared and a 65.38% (p < 0.001) correlation was observed. The chromatin stability increased significantly in the head region of the epididymis (92.06%) in relation to the cauda (97.94%, p = 0.0023), however there was no difference between the caput and cauda regions, which demonstrates that sperm coming from these region are already mature. There was no correlation between the DNA abnormality and the sperm morphology as observed in other species, however there was correlation to morphometry. A significant decrease of the sperm head size was observed during the passage of the three epididymal regions (p < 0.0001). The percentage of sperm with deficient chromatin condensation decre... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Interstrand DNA crosslinks (ICLs) são importantes lesões genotóxicas que podem causar morte celular se não for devidamente reparadas. Diversas drogas antitumorais atuam através da indução de ICLs no DNA, e a resistência a essas drogas está muitas vezes relacionada à maior capacidade de células tumorais para reparar tais lesões. As ICLs são lesões complexas que requerem o envolvimento de diferentes vias de reparação, tais como BER NER, TLS e vias de reparação de DSBs (RH e NHEJ). Além disso, foi demonstrado que Pso2p desempenha um papel importante na reparação de ICLs. Muitos estudos também apontam para as alterações epigenéticas como essenciais para a sobrevivência da célula em resposta ao dano genotóxico, através da indução de checkpoints de ciclo celular e da modulação da eficiência (e, possivelmente, da escolha) das vias de reparação de DNA. Assim, a primeira parte desta Tese apresenta uma revisão dos mecanismos envolvidos na citotoxicidade dos ICLs induzidos pela furocumarina bifuncional 8-metoxipsoraleno (8-MOP) em Saccharomyces cerevisiae. A abordagem adotada discute a ação integrada de proteínas que atuam em vias de reparação de DNA envolvidas na remoção de ICLs, em combinação com fatores envolvidos no remodelamento da cromatina dependente de ATP. A fim de investigar o papel do remodelamento da cromatina em resposta a danos ao DNA induzidos pelo tratamento com furocumarinas mono e bifuncionais fotoativadas e ditelureto de difenila (DTDF), foram utilizadas linhagens de S. cerevisiae deficientes em diferentes proteínas relacionadas com a reparação do DNA e o remodelamento da cromatina. DTDF é um composto organotelurado proposto como um protótipo potencial para o desenvolvimento de novas drogas antitumorais. A sensibilidade do mutante pso2Δ ao DTDF, semelhante à observada para o 8-MOP, indica que este composto pode induzir lesões capazes de bloquear a replicação do DNA, tais como ligações cruzadas ou DSBs hairpin capped. Os resultados obtidos mostraram que os duplos mutantes pso2Δswr1Δ e rad52Δswr1Δ não são mais sensíveis aos agentes testados, DTDF, 3-CPS e 8-MOP, do que o mais sensível dos simples mutantes (pso2Δ e rad52Δ, respectivamente). Tendo em mente que Rad52p e Pso2p não têm interação epistática (aditiva ou sinergística) na reparação das lesões fotoinduzidas por 3-CPS e 8-MOP, sugere-se que Pso2p pode fornecer substrato para vias de reparação diferentes de HR, que poderiam ser NHEJ canônica e/ou MMEJ. O fato de que swr1Δ (deficiente em NHEJ) não aumenta a sensibilidade dos duplos mutantes, além da baixa sensibilidade observada para o mutante yku80Δ ao DTDF e à fotoadição de psoralenos, sugere que as lesões induzidas podem ser direcionadas para as vias HR ou MMEJ, ao invéz de NHEJ canônica. O envolvimento da via MMEJ sujeita a erros na reparação de lesões induzidas por DTDF pode explicar a indução de mutação frameshift, observada para este agente. Além disso, investigou-se a citotoxicidade induzida pelas drogas antitumorais cisplatina (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU) e sua combinação, em S. cerevisiae. Os resultados obtidos com os mutantes de reparação do DNA mostraram que a sensibilidade à CDDP + 5-FU parece refletir a sensibilidade de linhagens específicas a cada droga utilizada individualmente. Este resultado sugere que o efeito intensificado do tratamento combinado na terapia do câncer pode ser devido à ação de cada agente isoladamente, conforme observado em clones diferentes da população heterogênea de células transformadas. Os resultados referentes aos mutantes em remodelamento da cromatina demonstraram que o tratamento com CDDP + 5-FU provoca uma resposta mais eficaz na indução de morte celular, nos mutantes deficientes em CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ e hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, e hst3Δ), HML (dot1Δ) e HMT (erg6Δ), enquanto CDDP induz sensibilidade em mutantes HAT, além do mutante de HDAC hos3Δ, e o tratamento com 5-FU induz sensibilidade em HAT (gcn5Δ) e HDAC (sin3Δ e hos3Δ). Esses resultados apontam para o envolvimento de proteínas de remodelamento da cromatina como importantes alvos terapêuticos em resposta a agentes genotóxicos. Portanto, os resultados obtidos podem abrir novas perspectivas para a compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta ao tratamento com CDDP + 5-FU, bem como auxiliar na escolha dos melhores protocolos terapêuticos. / Interstrand DNA crosslinks (ICLs) are important genotoxic lesions that can cause cell death if not properly repaired. Several antitumoral drugs act by inducing ICLs in DNA, and the resistance to these drugs is often related to an increased capacity of tumor cells to repair such lesions. The ICLs are complex lesions requiring involvement of different pathways for repair, such as BER, NER, TLS and DSB repair pathways (HR and NHEJ). In addition, Pso2p was shown to play an important role in ICLs repair. Many studies also point to the epigenetic changes as essential for cell survival in response to genotoxic damage, through induction of cell cycle checkpoints and modulating the efficiency (and possibly, the choice) of the DNA repair pathways. So, the first part of this Thesis gives a review of the mechanisms involved in the cytotoxicity of the ICLs induced by the bifunctional furocumarin 8-methoxypsoralen (8-MOP) in Saccharomyces cerevisiae. The adopted approach discusses the integrated action of proteins that work in the DNA repair pathways involved in ICLs removing in combination with factors involved in ATP-dependent chromatin remodeling. In order to investigate the role of the chromatin remodeling in response to DNA damage induced by treatment with mono- and bifunctional photoactivated furocumarins and diphenyl ditelluride (DPDT), we used S. cerevisiae strains deficient in different proteins related to DNA repair and chromatin remodeling. DPDT is organotellurium compound proposed as a potential prototype for development of new antitumoral drugs. The sensitivity of pso2Δ to DPDT, similar to that observed for 8-MOP, indicates that this compound could induce lesions able to block DNA replication, such as crosslinks or hairpin-capped DSBs. The obtained results showed that the double mutants pso2Δswr1Δ and rad52Δswr1Δ are not more sensitive to the tested DPDT, 3-CPS and 8-MOP agents than the more sensitive single mutant (pso2Δ and rad52Δ, respectively). Having in mind that Rad52p and Pso2p have non-epistatic interaction (additive or synergistic) in the repair of 3-CPS and 8-MOP photoinduced lesions, we suggest that Pso2p could provide substrate for repair pathway different from HR, which could be canonical NHEJ and/or MMEJ. The fact that swr1Δ (deficient in NHEJ) do not enhance the sensitivity of the double-mutants, in addition to the observed low sensitivity of the yku80Δ mutant to DPDT and psoralens photoaddition, suggests that the induced lesions could be directed to HR or MMEJ pathways rather than to canonical NHEJ. The involvement of the error-prone MMEJ in repair of DPDT-induced lesions could explain the observed frameshift mutation induction by this agent. Moreover, we investigated the cytotoxicity induced by the antitumoral drugs cisplatin (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU), and their combination in S. cerevisiae. The results obtained with DNA repair mutants showed that the sensitivity to cisplatin + 5-FU appears to reflect the sensitivity of the specific strains to each individual drug used. This finding suggests that the enhanced effect of the combined treatment in cancer therapy could be due to the action of each agent alone, as observed on different clones from the heterogeneous population of transformed cells. The results concerning chromatin remodeling mutants demonstrated that CDDP + 5-FU treatment causes a more effective response in the induction of cell death, in CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ and hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, and hst3Δ), HML (dot1Δ) and HMT (erg6Δ) mutants, while CDDP induces sensitivity in HAT mutants, besides the HDAC mutant hos3Δ, and 5-FU treatment induces sensitivity in HAT (gcn5Δ) and HDACs (sin3Δ and hos3Δ). These results point to involvement of chromatin remodeling proteins as important therapeutic targets in response to genotoxic agents. Therefore, our findings could provide new insights for understanding the mechanisms involved in the response to treatment with CDDP + 5-FU, as well as to help in the choice of optimal therapeutic protocols.

The study of chromatin structure in several simple sperm models of increasing complexity was performed. Species demonstrating different types of sperm nuclear protein transitions and structural changes in spermatic chromatin during spermiogenesis were selected as models for comparison: "H" (non-histone proteins are removed), "H->P" (protamine displaces histones), and "H->Pp->P" (precursor protamine displaces histones, and subsequently is converted into the mature protamine). This study has an evolutionary focus, in which a primitive sperm model is identified, from which more complex models may have risen during evolution. The final sperm characteristics achieved are considered to be caused by the changes the immature sperm cell undergoes during the process of spermiogenesis, and are correlated to an adaptation to the fertilization biology of each species. A broader understanding of the variety of sperm shapes, their chemical variability, and the spermatic chromatin condensation patterns pertaining to species of these simple spermiogenic models has been achieved. In this study, the diversity in sperm characteristics is extrapolated to the function the sperm cell has to pass on its genetic material to achieve fertilization of the egg of its own species.For three different models using four marine species, protein transitions, chromatin condensation, and acetylation patterns were described during spermiogeneis. Specifically, changes in chromatin architecture and its protein complement was extensively studied using mainly transmission electron microscopy, inmunocytochemistry using anti-histone, anti-precursor protamine, and anti-acetyl group antibodies, as well as high resolution polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and western blotting. A model of specialized sperm chromatin (crustacean type) has been included in this study, since for decades this type of chromatin has remained poorly understood. Crustacean type sperm, once believed to have nuclei void of basic DNA-associated proteins, was found to contain histones, and is considered a derivation of the "H" model. Three species of brachyuran crabs from two different families were used to compositionally and ultrastructurally study this unusually decondensed mature sperm chromatin. Characterization of the histones from these sperm using HPLC and amino acid analysis confirm that the basic proteins extracted from sperm of these crabs are indeed typical and canonical histones, though some appear modified by post-translational modifications such as acetylation, which has never before been described in mature sperm. Additionally, in Maja brachydactyla, histones H3 and H2B appear in stoichiometric amounts different to what would be found in somatic chromatin. By performing micrococcal nuclease digestions, the presence of nucleosomes (or nucleosome-like particles) in the sperm of these species was confirmed, and demonstrated that histones are found interacting with the sperm DNA. Further, the histone/DNA ratio was evaluated in two Cancer species, and it was determined that these sperm only contain slightly over half the amount of basic protein per DNA unit compared to other sperm types. These results concerning the composition of the crustacean-type sperm chromatin help to explain its decondensed nature.

A assinatura digital é um histograma representativo de conjuntos de características de textura da cromatina do núcleo celular observado por microscopia óptica convencional. A assinatura digital é obtida através de análise de imagem computadorizada. Tal método permite o estudo do núcleo celular em material citológico e tecidos histológicos normais ou que apresentem alterações morfológicas relacionadas a processos patológicos. O objetivo principal deste trabalho foi caracterizar núcleos celulares de forma específica desenvolvendo um método de visualização de parâmetros de textura de cromatina (assinatura nuclear digital) que permitisse ainda avaliar alterações teciduais através do grau de desvio da normalidade apresentado por seus núcleos. Foram estudadas 93 características descritivas da distribuição espacial e estatísitca da textura de cromatina de imagens digitais de alta resolução de 5.045 núcleos celulares provenientes de 32 espécimes de tecido prostático. A próstata foi utilizada por ser o protótipo de desenvolvimento do laboratório de imagens biomédicas do Centro de Ciências Ópticas da Universidade do Arizona, nos Estados Unidos. Foram desenvolvidos e padronizados métodos para visualização de características de textura nuclear (assinaturas digitais) e de áreas de tecido (assinaturas de padrão histológico) e para quantificação do grau de desvio de células e áreas de tecido de interesse em relação à população notmal de referência (distância padronizada da população celular normal). Tal método, que pode ser utilizado sem restrições em qualquer material colhido e preparado por técnicas convencionais para estudo citológico ou histológico demonstrou sensibilidade para detectar alterações subvisuais na textura da cromatina de células aparentemente normais, próximas de lesões pré-neoplásicas e neoplasias malignas. Tais potencialidades podem aumentar a sensibilidade diagnóstica dos métodos de investigação baseados nesse tipo de material. / The digital signature is a histogram representing a set of nuclear chromatin texture features under conventional microscopy. It is obtained by computerized image analysis procedures and allows the study of cytologic and histologic material. The main goal of this project was to characterize nuclei in a specific manner by developing a chromatin texture signature and to characterize histologic tissue by means of their composition of nuclei with di verse degrees of deviation from normal. A set of 93 features descriptive of the spatial and statistical distribution of nuclear chromatin was computed for each of 5,045 nuclei from 32 specimens of prostatic tissue ranging from normal appeating tissue to intraepithelial lesions and adenocarcinoma. The prostate is the organ used as prototype to develop the digital signature technology at the Arizona Optical Sciences Center, USA. Standardized methods to visually inspect nuclear chromatin texture features (digital signatures) and tissue areas (histologic pattem signature) were developed. And a standardized distance from normal numerical profile was developed. The digital signature can be applied without any restriction to ali cytologic and histologic material sampled by biopsy, exfoliative and aspirative techniques. The digital signatures are also capable of detecting subtle changes of the chromatin pattern of normal appearing cells at the vicinity of precursor lesions and carcinomas. Such potentíal may have a positive impact on the sensitivity of methods based on citologic and histologic studies.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-09-12T19:56:50Z No. of bitstreams: 1 2016_ViníciusAlvesFernandes.pdf: 4594049 bytes, checksum: 48f78b5328fa30fbeae24f268a04373c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-20T21:41:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_ViníciusAlvesFernandes.pdf: 4594049 bytes, checksum: 48f78b5328fa30fbeae24f268a04373c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-20T21:41:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_ViníciusAlvesFernandes.pdf: 4594049 bytes, checksum: 48f78b5328fa30fbeae24f268a04373c (MD5) / A cromatina é essencial para manutenção da fisiologia celular por desempenhar papel-chave na regulação da transcrição, reparo e replicação do DNA. Para tanto, esta deve ser altamente dinâmica, permitindo alterações entre estados compactados e relaxados. O primeiro nível de compactação da cromatina é o nucleossomo, formado pelo DNA e um octâmero de histonas. Moléculas que se ligam ao nucleossomo tem potencial para modular a cromatina. Diversas evidências apontam para o colesterol, lipídio importante para o funcionamento basal das células, como uma molécula ligante de cromatina. Recentemente, foi demonstrado que o colesterol pode modular a estrutura das fibras de cromatina reconstituídas in vitro. Juntos, estes dados sugerem que o colesterol possui um efeito modulador da arquitetura da cromatina por se ligar diretamente ao nucleossomo. Entretanto, os detalhes moleculares da ação do colesterol sobre a estrutura da cromatina ainda não foram esclarecidos. O objetivo deste estudo foi investigar, in silico, a ligação do colesterol ao nucleossomo e observar seu impacto ao nível atômico. Logo, metodologias capazes de tratar interações moleculares com resolução atomística são fundamentais, como a dinâmica molecular (DM) e docking molecular. Aqui identificamos vários sítios de ligação do colesterol distribuídos pelo nucleossomo. Após 200 ns de DM, seis moléculas de colesterol amostradas permaneceram ligadas ao nucleossomo. Para cada sítio investigado, a energia livre de ligação, estimada pelo método LIE (Linear Interactions Energy), indica o favorecimento do complexo entre o colesterol e o nucleossomo. Foi observado um impacto nas flutuações atômicas de vários aminoácidos formadores dos sítios de ligação. Dentre estes, alguns são conhecidamente importantes para modulação da estrutura da cromatina. Além disso, houve redução significativa do número de moléculas de água nas interfaces de interação colesterol-nucleossomo, especialmente em regiões hidrofóbicas essenciais para a manutenção estrutural do nucleossomo. Esses resultados sugerem que o colesterol pode afetar a arquitetura da cromatina através da interação direta com o nucleossomo nos múltiplos sítios de ligação. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chromatin is essential for maintenance of cell physiology playing a key role in transcription regulation, DNA repair and replication. Therefore, it must be highly dynamic, allowing changes between compacted and relaxed states. The first level of chromatin compaction is the nucleosome, formed by DNA and histone octamer. Molecules that bind to the nucleosome have the potential to modulate chromatin. Several evidences indicate that cholesterol, important lipid for cell function, may bind to chromatin. Recently, it was demonstrated that in vitro cholesterol may modulate the structure of reconstituted chromatin fibers. Together, these data suggest that cholesterol may modulate chromatin architecture by direct binding to the nucleosome. However, the molecular details of cholesterol’s action on chromatin structure remain unclear. The aim of this study was an in silico investigation of the cholesterol binding to the nucleosome and its impact at the atomic level. Therefore, methodologies capable of handling molecular interactions with atomistic resolution are critical, such as molecular dynamics (MD) and molecular docking. Here, we identified several cholesterol binding sites distributed over the nucleosome. After 200 ns of MD, six sampled cholesterol molecules remained bound to the nucleosome. For every site, the estimated absolute free energies obtained by the LIE method, favour cholesterol binding thus explaining the stability of the molecular complex. Cholesterol impacts the atomic fluctuations of several amino acids forming the binding sites. Among these, some are well-known to modulate the chromatin structure. Furthermore, a significant reduction in the number of water molecules in cholesterol-nucleosome interfaces was observed, especially at key hydrophobic regions for nucleosome structural maintenance. These results suggest that cholesterol may affect the chromatin's architecture via direct interaction with the nucleosome through multiple binding sites.

Orientador: Mary Massumi Itoyama / Banca: Maria Tercília Vilela de Azeredo-Oliveira / Banca: Fernanda Cristina Alcântara dos Santos / Resumo: Heteroptera é uma Subordem da Ordem Hemiptera, que possui cerca de 40 mil espécies distribuídas em oitenta famílias, dentre elas está a família Pentatomidae que se destaca por ser uma das maiores famílias com cerca de 4.100 espécies, representando, aproximadamente, 11% do total de espécies de Heteroptera. As espécies de Pentatomidae Chinavia impicticornis, Edessa meditabunda, E. collaris e Thyanta perditor foram estudadas nesse trabalho devido ao sua importância econômica, tendo em vista que são espécies fitófagas que causam grandes perdas em diversas culturas. Os machos das espécies foram coletados na região de São José do Rio Preto, os testículos foram fixados e posteriormente processados para analise em microscopia eletrônica de transmissão, os blocos obtidos foram trimados, cortados, contrastados e analisados com microscópio eletrônico de transmissão Leo - Zeiss, do Centro de Microscopia e Microanálise (IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto, SP) e com o microscópio eletrônico de transmissão Jeol JEM - 100 CXII da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP). As eletromicrografias das espécies estudadas apresentaram características ultraestruturais semelhantes às encontradas para diversos indivíduos de diferentes ordens, dentre essas características estão a formação do acrossomo, a partir de uma grande vesícula secretada pelo complexo de Golgi e que se localiza na região apical/lateral do núcleo. O núcleo, também, sofre transformações semelhantes às relatadas para grande parte dos insetos passando de um estado grande e esférico com a cromatina dispersa para um estado pequeno e fusiforme e com a cromatina extremamente condensada. Outra estrutura observada foi o adjunto do centríolo que se mostrou uma estrutura eletrondensa na região basal do núcleo. Também foi observada a migração das mitocôndrias para um polo celular... / Abstract: Heteroptera is a suborder of the Hemiptera order, which has approximately 40,000 species distributed in eighty families, among them is the Pentatomidae family that stands out for being one of the largest families with approximately 4,100, representing approximately 11% of the total species of Heteroptera. The species of Pentatomidae Chinavia impicticornis, Edessa meditabunda, E. collaris and Thyanta perditor were studied in this work because of their economic importance, given that they are phytophagous species that cause great losses in several crops. Males of the species were collected in the region of São José do Rio Preto, the testes were fixed and then processed for analysis by transmission electron microscopy, the obtained blocks were trimmed, cut, contrasted and analyzed with transmission electron microscope Leo - Zeiss, of the Centro de Microscopia e Microanálise (IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto, SP) and the transmission electron microscope Jeol JEM - 100 CXII of Faculdade de Medicina of Ribeirão Preto (FMRP-USP). The species have similar ultrastructural characteristics to those found in many individuals of different orders, among these features is the acrosome formation from a large vesicle secreted by Golgi apparatus and located in the apical/lateral area of the nucleus. The nucleus also undergoes changes similar to those reported for most insects, passing of a great and spherical state with chromatin dispersed to a small and fusiform state and highly condensed chromatin. Another structure was observed the centriolar adjunct that showed electrodense structure in the basal region of the nucleus. We also observe the migration of mitochondria for the cell and its subsequent fusion was observed forming the mitochondrial complex or "Nebenkern", which later splits to form two symmetrical mitochondrial derivatives, with the presence of paracrystalline structures / Mestre

Interstrand DNA crosslinks (ICLs) são importantes lesões genotóxicas que podem causar morte celular se não for devidamente reparadas. Diversas drogas antitumorais atuam através da indução de ICLs no DNA, e a resistência a essas drogas está muitas vezes relacionada à maior capacidade de células tumorais para reparar tais lesões. As ICLs são lesões complexas que requerem o envolvimento de diferentes vias de reparação, tais como BER NER, TLS e vias de reparação de DSBs (RH e NHEJ). Além disso, foi demonstrado que Pso2p desempenha um papel importante na reparação de ICLs. Muitos estudos também apontam para as alterações epigenéticas como essenciais para a sobrevivência da célula em resposta ao dano genotóxico, através da indução de checkpoints de ciclo celular e da modulação da eficiência (e, possivelmente, da escolha) das vias de reparação de DNA. Assim, a primeira parte desta Tese apresenta uma revisão dos mecanismos envolvidos na citotoxicidade dos ICLs induzidos pela furocumarina bifuncional 8-metoxipsoraleno (8-MOP) em Saccharomyces cerevisiae. A abordagem adotada discute a ação integrada de proteínas que atuam em vias de reparação de DNA envolvidas na remoção de ICLs, em combinação com fatores envolvidos no remodelamento da cromatina dependente de ATP. A fim de investigar o papel do remodelamento da cromatina em resposta a danos ao DNA induzidos pelo tratamento com furocumarinas mono e bifuncionais fotoativadas e ditelureto de difenila (DTDF), foram utilizadas linhagens de S. cerevisiae deficientes em diferentes proteínas relacionadas com a reparação do DNA e o remodelamento da cromatina. DTDF é um composto organotelurado proposto como um protótipo potencial para o desenvolvimento de novas drogas antitumorais. A sensibilidade do mutante pso2Δ ao DTDF, semelhante à observada para o 8-MOP, indica que este composto pode induzir lesões capazes de bloquear a replicação do DNA, tais como ligações cruzadas ou DSBs hairpin capped. Os resultados obtidos mostraram que os duplos mutantes pso2Δswr1Δ e rad52Δswr1Δ não são mais sensíveis aos agentes testados, DTDF, 3-CPS e 8-MOP, do que o mais sensível dos simples mutantes (pso2Δ e rad52Δ, respectivamente). Tendo em mente que Rad52p e Pso2p não têm interação epistática (aditiva ou sinergística) na reparação das lesões fotoinduzidas por 3-CPS e 8-MOP, sugere-se que Pso2p pode fornecer substrato para vias de reparação diferentes de HR, que poderiam ser NHEJ canônica e/ou MMEJ. O fato de que swr1Δ (deficiente em NHEJ) não aumenta a sensibilidade dos duplos mutantes, além da baixa sensibilidade observada para o mutante yku80Δ ao DTDF e à fotoadição de psoralenos, sugere que as lesões induzidas podem ser direcionadas para as vias HR ou MMEJ, ao invéz de NHEJ canônica. O envolvimento da via MMEJ sujeita a erros na reparação de lesões induzidas por DTDF pode explicar a indução de mutação frameshift, observada para este agente. Além disso, investigou-se a citotoxicidade induzida pelas drogas antitumorais cisplatina (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU) e sua combinação, em S. cerevisiae. Os resultados obtidos com os mutantes de reparação do DNA mostraram que a sensibilidade à CDDP + 5-FU parece refletir a sensibilidade de linhagens específicas a cada droga utilizada individualmente. Este resultado sugere que o efeito intensificado do tratamento combinado na terapia do câncer pode ser devido à ação de cada agente isoladamente, conforme observado em clones diferentes da população heterogênea de células transformadas. Os resultados referentes aos mutantes em remodelamento da cromatina demonstraram que o tratamento com CDDP + 5-FU provoca uma resposta mais eficaz na indução de morte celular, nos mutantes deficientes em CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ e hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, e hst3Δ), HML (dot1Δ) e HMT (erg6Δ), enquanto CDDP induz sensibilidade em mutantes HAT, além do mutante de HDAC hos3Δ, e o tratamento com 5-FU induz sensibilidade em HAT (gcn5Δ) e HDAC (sin3Δ e hos3Δ). Esses resultados apontam para o envolvimento de proteínas de remodelamento da cromatina como importantes alvos terapêuticos em resposta a agentes genotóxicos. Portanto, os resultados obtidos podem abrir novas perspectivas para a compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta ao tratamento com CDDP + 5-FU, bem como auxiliar na escolha dos melhores protocolos terapêuticos. / Interstrand DNA crosslinks (ICLs) are important genotoxic lesions that can cause cell death if not properly repaired. Several antitumoral drugs act by inducing ICLs in DNA, and the resistance to these drugs is often related to an increased capacity of tumor cells to repair such lesions. The ICLs are complex lesions requiring involvement of different pathways for repair, such as BER, NER, TLS and DSB repair pathways (HR and NHEJ). In addition, Pso2p was shown to play an important role in ICLs repair. Many studies also point to the epigenetic changes as essential for cell survival in response to genotoxic damage, through induction of cell cycle checkpoints and modulating the efficiency (and possibly, the choice) of the DNA repair pathways. So, the first part of this Thesis gives a review of the mechanisms involved in the cytotoxicity of the ICLs induced by the bifunctional furocumarin 8-methoxypsoralen (8-MOP) in Saccharomyces cerevisiae. The adopted approach discusses the integrated action of proteins that work in the DNA repair pathways involved in ICLs removing in combination with factors involved in ATP-dependent chromatin remodeling. In order to investigate the role of the chromatin remodeling in response to DNA damage induced by treatment with mono- and bifunctional photoactivated furocumarins and diphenyl ditelluride (DPDT), we used S. cerevisiae strains deficient in different proteins related to DNA repair and chromatin remodeling. DPDT is organotellurium compound proposed as a potential prototype for development of new antitumoral drugs. The sensitivity of pso2Δ to DPDT, similar to that observed for 8-MOP, indicates that this compound could induce lesions able to block DNA replication, such as crosslinks or hairpin-capped DSBs. The obtained results showed that the double mutants pso2Δswr1Δ and rad52Δswr1Δ are not more sensitive to the tested DPDT, 3-CPS and 8-MOP agents than the more sensitive single mutant (pso2Δ and rad52Δ, respectively). Having in mind that Rad52p and Pso2p have non-epistatic interaction (additive or synergistic) in the repair of 3-CPS and 8-MOP photoinduced lesions, we suggest that Pso2p could provide substrate for repair pathway different from HR, which could be canonical NHEJ and/or MMEJ. The fact that swr1Δ (deficient in NHEJ) do not enhance the sensitivity of the double-mutants, in addition to the observed low sensitivity of the yku80Δ mutant to DPDT and psoralens photoaddition, suggests that the induced lesions could be directed to HR or MMEJ pathways rather than to canonical NHEJ. The involvement of the error-prone MMEJ in repair of DPDT-induced lesions could explain the observed frameshift mutation induction by this agent. Moreover, we investigated the cytotoxicity induced by the antitumoral drugs cisplatin (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU), and their combination in S. cerevisiae. The results obtained with DNA repair mutants showed that the sensitivity to cisplatin + 5-FU appears to reflect the sensitivity of the specific strains to each individual drug used. This finding suggests that the enhanced effect of the combined treatment in cancer therapy could be due to the action of each agent alone, as observed on different clones from the heterogeneous population of transformed cells. The results concerning chromatin remodeling mutants demonstrated that CDDP + 5-FU treatment causes a more effective response in the induction of cell death, in CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ and hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, and hst3Δ), HML (dot1Δ) and HMT (erg6Δ) mutants, while CDDP induces sensitivity in HAT mutants, besides the HDAC mutant hos3Δ, and 5-FU treatment induces sensitivity in HAT (gcn5Δ) and HDACs (sin3Δ and hos3Δ). These results point to involvement of chromatin remodeling proteins as important therapeutic targets in response to genotoxic agents. Therefore, our findings could provide new insights for understanding the mechanisms involved in the response to treatment with CDDP + 5-FU, as well as to help in the choice of optimal therapeutic protocols.

A assinatura digital é um histograma representativo de conjuntos de características de textura da cromatina do núcleo celular observado por microscopia óptica convencional. A assinatura digital é obtida através de análise de imagem computadorizada. Tal método permite o estudo do núcleo celular em material citológico e tecidos histológicos normais ou que apresentem alterações morfológicas relacionadas a processos patológicos. O objetivo principal deste trabalho foi caracterizar núcleos celulares de forma específica desenvolvendo um método de visualização de parâmetros de textura de cromatina (assinatura nuclear digital) que permitisse ainda avaliar alterações teciduais através do grau de desvio da normalidade apresentado por seus núcleos. Foram estudadas 93 características descritivas da distribuição espacial e estatísitca da textura de cromatina de imagens digitais de alta resolução de 5.045 núcleos celulares provenientes de 32 espécimes de tecido prostático. A próstata foi utilizada por ser o protótipo de desenvolvimento do laboratório de imagens biomédicas do Centro de Ciências Ópticas da Universidade do Arizona, nos Estados Unidos. Foram desenvolvidos e padronizados métodos para visualização de características de textura nuclear (assinaturas digitais) e de áreas de tecido (assinaturas de padrão histológico) e para quantificação do grau de desvio de células e áreas de tecido de interesse em relação à população notmal de referência (distância padronizada da população celular normal). Tal método, que pode ser utilizado sem restrições em qualquer material colhido e preparado por técnicas convencionais para estudo citológico ou histológico demonstrou sensibilidade para detectar alterações subvisuais na textura da cromatina de células aparentemente normais, próximas de lesões pré-neoplásicas e neoplasias malignas. Tais potencialidades podem aumentar a sensibilidade diagnóstica dos métodos de investigação baseados nesse tipo de material. / The digital signature is a histogram representing a set of nuclear chromatin texture features under conventional microscopy. It is obtained by computerized image analysis procedures and allows the study of cytologic and histologic material. The main goal of this project was to characterize nuclei in a specific manner by developing a chromatin texture signature and to characterize histologic tissue by means of their composition of nuclei with di verse degrees of deviation from normal. A set of 93 features descriptive of the spatial and statistical distribution of nuclear chromatin was computed for each of 5,045 nuclei from 32 specimens of prostatic tissue ranging from normal appeating tissue to intraepithelial lesions and adenocarcinoma. The prostate is the organ used as prototype to develop the digital signature technology at the Arizona Optical Sciences Center, USA. Standardized methods to visually inspect nuclear chromatin texture features (digital signatures) and tissue areas (histologic pattem signature) were developed. And a standardized distance from normal numerical profile was developed. The digital signature can be applied without any restriction to ali cytologic and histologic material sampled by biopsy, exfoliative and aspirative techniques. The digital signatures are also capable of detecting subtle changes of the chromatin pattern of normal appearing cells at the vicinity of precursor lesions and carcinomas. Such potentíal may have a positive impact on the sensitivity of methods based on citologic and histologic studies.

Orientador: José Luiz Laus / Coorientador: Marcela Aldrovani / Banca: Priscila Cardoso Cristovam / Banca: Márcia Rita Fernandes Machado / Resumo: A córnea de pacientes diabéticos pode desenvolver defeitos epiteliais que comprometem a visão e causam dor. Os efeitos do diabetes sobre algumas características das células epiteliais corneais, notadamente os fenótipos nucleares, são ainda desconhecidos. A sericina é um polímero extraído do casulo do bicho-da- seda, que, aparentemente, promove reparação corneal em ratos. Com esta pesquisa estudou-se a produção lacrimal, o limiar de sensibilidade corneal (Cochet-Bonnet) e a pressão dos olhos de ratos com três semanas de diabetes induzido por aloxana (glicemia sérica ≥ 400 mg/dL). Os efeitos da instilação diária (a cada 6 horas, por quatro dias) de sericina 10% sobre a cinética de reepitelização de córneas cauterizadas (com álcali), em ratos diabéticos, foram estudados e comparados aos efeitos de placebo (solução salina balanceada) e de soro equino (uma opção terapêutica vigente). A pesquisa traz, também, informações sobre o tamanho dos núcleos (área e perímetro), o estado de compactação e a textura da cromatina, o conteúdo de DNA (ploidia) e a distribuição das regiões organizadoras de nucléolos impregnadas por íons prata (AgNORs) em células epiteliais corneais de ratos diabéticos (hiperglicêmicos) e de não diabéticos (normoglicêmicos). Os núcleos das células que reepitelizaram as córneas cauterizadas, após tratamento com sericina 10%, solução salina balanceada ou soro, foram avaliados. Os resultados mostraram que os olhos dos ratos diabéticos diferiram dos de não diabéticos ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The cornea of diabetic patients can develop epithelial defects that promote vision deficit and pain. The effects of diabetes/hyperglycemia on some characteristics of corneal epithelial cells, notably the nuclear phenotypes are still unknown. The sericin is a polymer extracted from the cocoons of the silkworm, which seems to promote reepithelization of burned cornea in rats. In this study, tear production, corneal touch threshold (Cochet-Bonnet) and intraocular pressure of alloxan-induced diabetes rats with three weeks of hyperglycemia (serum glucose ≥ 400 mg/dL) were studied. In addition, the effects of daily instillation (every 6 hours for 4 days) of 10% sericin over re-epithelization kinetics of burned corneas from diabetic were also studied and compared to the effects of placebo (balanced salt solution) and horse serum (an actual therapeutic option). The research also brings information about the size of the nuclei (area and perimeter), the state of compactation and the texture of chromatin, the DNA content (ploidy) and the distribution of silver-stained nucleolar organizing regions (AgNORs) of epithelial cells in corneas of diabetic (hyperglycemic) and non-diabetic rats (normoglycemic). Nuclear phenotypes of cells that participated of the re-epithelization of the burned corneas after treatment with10%sericin, balanced salt solution or serum were studied. Results showed that the eyes of diabetic rats did not differ from the ones from non-diabetic ones, just like the tear production and intraocular pressure, but differences regarding the corneal touch threshold (2.07 ± 0.52 cm in the corneas of diabetic vs. 4.00 ± 0.56 cm in non-diabetics; p = 0.01) were found. Regarding re-epithelization kinetics, the healing time of the burns were 30 hours for corneas treated with 10% sericin or serum and 36 hours in those receiving 0balanced sa... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A assinatura digital é um histograma representativo de conjuntos de características de textura da cromatina do núcleo celular observado por microscopia óptica convencional. A assinatura digital é obtida através de análise de imagem computadorizada. Tal método permite o estudo do núcleo celular em material citológico e tecidos histológicos normais ou que apresentem alterações morfológicas relacionadas a processos patológicos. O objetivo principal deste trabalho foi caracterizar núcleos celulares de forma específica desenvolvendo um método de visualização de parâmetros de textura de cromatina (assinatura nuclear digital) que permitisse ainda avaliar alterações teciduais através do grau de desvio da normalidade apresentado por seus núcleos. Foram estudadas 93 características descritivas da distribuição espacial e estatísitca da textura de cromatina de imagens digitais de alta resolução de 5.045 núcleos celulares provenientes de 32 espécimes de tecido prostático. A próstata foi utilizada por ser o protótipo de desenvolvimento do laboratório de imagens biomédicas do Centro de Ciências Ópticas da Universidade do Arizona, nos Estados Unidos. Foram desenvolvidos e padronizados métodos para visualização de características de textura nuclear (assinaturas digitais) e de áreas de tecido (assinaturas de padrão histológico) e para quantificação do grau de desvio de células e áreas de tecido de interesse em relação à população notmal de referência (distância padronizada da população celular normal). Tal método, que pode ser utilizado sem restrições em qualquer material colhido e preparado por técnicas convencionais para estudo citológico ou histológico demonstrou sensibilidade para detectar alterações subvisuais na textura da cromatina de células aparentemente normais, próximas de lesões pré-neoplásicas e neoplasias malignas. Tais potencialidades podem aumentar a sensibilidade diagnóstica dos métodos de investigação baseados nesse tipo de material. / The digital signature is a histogram representing a set of nuclear chromatin texture features under conventional microscopy. It is obtained by computerized image analysis procedures and allows the study of cytologic and histologic material. The main goal of this project was to characterize nuclei in a specific manner by developing a chromatin texture signature and to characterize histologic tissue by means of their composition of nuclei with di verse degrees of deviation from normal. A set of 93 features descriptive of the spatial and statistical distribution of nuclear chromatin was computed for each of 5,045 nuclei from 32 specimens of prostatic tissue ranging from normal appeating tissue to intraepithelial lesions and adenocarcinoma. The prostate is the organ used as prototype to develop the digital signature technology at the Arizona Optical Sciences Center, USA. Standardized methods to visually inspect nuclear chromatin texture features (digital signatures) and tissue areas (histologic pattem signature) were developed. And a standardized distance from normal numerical profile was developed. The digital signature can be applied without any restriction to ali cytologic and histologic material sampled by biopsy, exfoliative and aspirative techniques. The digital signatures are also capable of detecting subtle changes of the chromatin pattern of normal appearing cells at the vicinity of precursor lesions and carcinomas. Such potentíal may have a positive impact on the sensitivity of methods based on citologic and histologic studies.