Orientador: Maria Luiza Silveira Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T11:12:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Monteiro_AnaLuciaPereira_M.pdf: 14328575 bytes, checksum: d7759acb56e4a881940dfce7400daf2a (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: A concentração crítica de eletrólitos (CEC) da <' cromatina, considerada corno a concentração salina na qual o fenômeno de metacromasia é abolido, numa situação em que se emprega azul de toluidina corno corante catiônico e íons Mg2+ corno cátions inorgânicos, foi determinada em cromossomos politênicos de glândulas salivares do sciarídeo Trichosia pubescens, nas fases Ls, L7 e P1 do desenvolvimento larval. O objetivo era determinar se os valores de CEC variavam em áreas cromossômicas com diferente supra-estrutura e/ou composição nucleoprotéica. Constatou-se que a maioria das regiões cromossômicas em preparados fixados em etanol-ácido acético atingiram a CEC na concentração de MgCl2 O .10M e que sítios cromossômicos ricos em ribonucleoproteínas e/ ou pufes de RNA Edna exibiram valores superiores de CEC. Não foi detectado um padrão único de mudanças em valores de CEC ao longo da pufação, sugerindo-se complexidade e variações funcionais para tais pufes. As regiões heterocromáticas e/ ou sub-replicadas também tiveram valores de CEC superiores a O.10M devido aos seus diferentes níveis de condensação cromatínica, ou ao processo de síntese não sincronizada de DNA em comparação a outras regiões dos cromossomos. Os valores de CEC em cromossomos tratados com RNase foi mais elevado em decorrência da re-estruturação dos complexos nucleoprotéicos ou não formação de híbridos de DNA-RNA. O valor de CEC em cromossomos fixados em paraformaldeído foi superior aqueles obtidos nos preparados fixados em etanol-ácido acético (3: 1) , certamente devido ao diferente nível de preservação de proteínas promovido por estes fixadores. ­Numa variante do método de CEC, proposta para evidenciação de complexos ribonucleoprotéicos, a concentração de O.O5M de MgCl2 não foi ideal para cromossomos politênicos de Trichosia pubescens, diferindo de resultados já reportados para cromossomos politênicos de Drosophila aracataca. Micronucléolos distribuídos ao longo dos cromossomos ou dispersos no nucleoplasma, tiveram valores de CEC superiores em relação aos da maioria das regiões cromossômicas. Estes valores decresceram após tratamento com RNase, demonstrando que o RNA é o principal componente acontribuir com sítios de ligação às moléculas de azul de toluidina nessa estrutura / Abstract: The critical electrolyte u concentration (CEC) of chromatin, measured as the saline concentration which metachromasy is abolished, when employing toluidine blue as a cationic dye and Mg2_ ions as inorganic cations, was determined for the polytene chromosomes of salivary glands of the sciarid Trichosia pubescens. The Ls, L7 and P1 phases of larval development were studied. The objective was to determine the CEC values for various chromosome areas with different supra-structure and/or nucleoprotein composition. Most of the chromosome regions in preparations fixed with acetic acid-ethanol (1:3) attained the CEC concentration of O.10M MgCl2. Areas rich in ribonucleoprotein (RNP) and/or RNA and DNA puffs displayed high CEC values. A singular regular pattern of CEC values was not detected during puff development which, suggests the complexity and variable functions to these puffs. Heterochromatic and/or sub-replicated regions had CEC values above O.10M due to their different levels of chromatin condensation, or to the non synchronized process of DNA syntheses in comparison with the other chromosome regions. The CEC value of chromosomes treatmented with RNase was higher as aresult of the re-organization of nucleoprotein complexes or the non formation of DNA-RNA hybrids. The CEC value of paraformaldehyde fixed chromosomes was higher than that attained in the acetic acid-ethanol (1:3) fixed preparations, clearly due to the different levels of protein preparation confired by these fixatires '.' In a variant of the CEC method, proposed to evidentify nucleoprotein complexes, the concentration of O.O5M MgC12 was not ideal for polytene chromosomes of Trichosia pubescens, which differs form results already reported for Drosophila aracataca polytene chromosomes. Micronucleoli distributed along of the chromosomes or dispersed in the nucleoplasm had higher CEC values in relation to most of the chromosome regions. These values decrease after Rnase treatment, demonstrating that RNA is the principal component which contributes binding sites for toluidine blue molecules in this structure / Mestrado / Biologia Celular

Este estudio, se espera contribuya al conocimiento de la biología celular en los gametos de ovinos de la raza Junín por los pocos estudios en poblaciones espermáticas de estos ovinos, se han descrito las principales características de la membrana espermática como son su estructura y función, las cuales son importantes para establecer el grado de potencial fértil en las poblaciones de espermatozoides, el cual fue alto al correlacionar los efectos de la eosina y la prueba hipoosmótica con los valores de morfología y motilidad; valores éstos que indicarían que se usaron poblaciones de espermatozoides que permitan lograr resultados positivos en programas de mejora genética usando inseminación artificial y fecundación in vitro, además de conservar una fuente de recursos genéticos. Los objetivos del presente trabajo fueron evaluar la estabilidad de la cromatina en espermatozoides de ovino (5 machos) y asociarla con la integridad de membrana estructural y fisiológica, además de su relación con la tasa de preñez (75 borregas). El diseño experimental usado para evaluar los grados de compactación de la cromatina de espermatozoides de ovinos Junín fue el de Parcelas Divididas (Split Plot), que han interactuado con el tiempo de muestreo y las técnicas empleadas (BB, SDS y EDTA) que tuvieron una alta significancia entre los grados de compactación, así como entre los meses y el grado de compactación, sin importar cual es el animal evaluado. Los resultados muestran que las diferencias entre las técnicas no son significativas, pero si entre los grados de compactación (P menro 0.0001). La interrelación entre las técnicas y los grados de compactación es muy significativa (P menor 0.0001). La correlación entre la integridad de membrana estructural (eosina) y fisiológica (hiposmótico) con morfología y motilidad tienen un P menror 0.002. Con relación a la tasa de preñez, se tiene un P mayor 0.05, luego del empadre con los cinco ovinos machos se han obtenido altos porcentajes de parición (mayor 75%) lo que nos dice del potencial fértil en los machos cuyas muestras de semen se estudiaron. Se concluye, que en general, la técnica para ver los grados de compactación de la cromatina tiene una alta probabilidad en poder dar un diagnóstico inicial del futuro potencial fértil de poblaciones de espermatozoides en la especie ovina. / This study should contribute to knowledge of gametes cell biology in Junin rams, because few researchs on the sperm population of Junin ram. It has been described the main characteristic of the plasmatic membrane like its structure and physiology, both of them are important in order to state if there was activity of predicting fertility in sperm populations, that is was very high relationship between effects of eosin and hypoosmotic swelling test with values of morphology and motility, these values are common in test to evidence that we were working with sperm populations in order to achieve positives outcomes in genetic improvement programs using artificial insemination and in vitro fertilization, besides to conserve a source of genetics resources. The objective of this research was to evaluate nuclear chromatin stability in ram sperm (5 rams) and the association with structural and functional integrity of ram membrane beside its relation with pregnancy rate (75 sheeps). The experimental design was Split Plot to evaluate nuclear condensation of sperm chromatin in Junin rams, they are interacted with each month and used techniques (BB, SDS, and EDTA), they had high significance between nuclear condensation values, no matter which animal was evaluated. Besides differences between treatments are no significant but so between nuclear condensations values (P less 0.0001). The relationship between structural and functional integrity of membrane with morphology and motility was (P less 0.002). With regard to pregnancy rate (more 75%), it was said about fertility potencial of rams sperms populations that were studied. It was concluded in general that techniques to evaluate nuclear condensation values does have a high likelihood to give diagnosis about future potential of sperm populations in Junin ram.

Este estudio, se espera contribuya al conocimiento de la biología celular en los gametos de ovinos de la raza Junín por los pocos estudios en poblaciones espermáticas de estos ovinos, se han descrito las principales características de la membrana espermática como son su estructura y función, las cuales son importantes para establecer el grado de potencial fértil en las poblaciones de espermatozoides, el cual fue alto al correlacionar los efectos de la eosina y la prueba hipoosmótica con los valores de morfología y motilidad; valores éstos que indicarían que se usaron poblaciones de espermatozoides que permitan lograr resultados positivos en programas de mejora genética usando inseminación artificial y fecundación in vitro, además de conservar una fuente de recursos genéticos. Los objetivos del presente trabajo fueron evaluar la estabilidad de la cromatina en espermatozoides de ovino (5 machos) y asociarla con la integridad de membrana estructural y fisiológica, además de su relación con la tasa de preñez (75 borregas). El diseño experimental usado para evaluar los grados de compactación de la cromatina de espermatozoides de ovinos Junín fue el de Parcelas Divididas (Split Plot), que han interactuado con el tiempo de muestreo y las técnicas empleadas (BB, SDS y EDTA) que tuvieron una alta significancia entre los grados de compactación, así como entre los meses y el grado de compactación, sin importar cual es el animal evaluado. Los resultados muestran que las diferencias entre las técnicas no son significativas, pero si entre los grados de compactación (P menro 0.0001). La interrelación entre las técnicas y los grados de compactación es muy significativa (P menor 0.0001). La correlación entre la integridad de membrana estructural (eosina) y fisiológica (hiposmótico) con morfología y motilidad tienen un P menror 0.002. Con relación a la tasa de preñez, se tiene un P mayor 0.05, luego del empadre con los cinco ovinos machos se han obtenido altos porcentajes de parición (mayor 75%) lo que nos dice del potencial fértil en los machos cuyas muestras de semen se estudiaron. Se concluye, que en general, la técnica para ver los grados de compactación de la cromatina tiene una alta probabilidad en poder dar un diagnóstico inicial del futuro potencial fértil de poblaciones de espermatozoides en la especie ovina. / This study should contribute to knowledge of gametes cell biology in Junin rams, because few researchs on the sperm population of Junin ram. It has been described the main characteristic of the plasmatic membrane like its structure and physiology, both of them are important in order to state if there was activity of predicting fertility in sperm populations, that is was very high relationship between effects of eosin and hypoosmotic swelling test with values of morphology and motility, these values are common in test to evidence that we were working with sperm populations in order to achieve positives outcomes in genetic improvement programs using artificial insemination and in vitro fertilization, besides to conserve a source of genetics resources. The objective of this research was to evaluate nuclear chromatin stability in ram sperm (5 rams) and the association with structural and functional integrity of ram membrane beside its relation with pregnancy rate (75 sheeps). The experimental design was Split Plot to evaluate nuclear condensation of sperm chromatin in Junin rams, they are interacted with each month and used techniques (BB, SDS, and EDTA), they had high significance between nuclear condensation values, no matter which animal was evaluated. Besides differences between treatments are no significant but so between nuclear condensations values (P less 0.0001). The relationship between structural and functional integrity of membrane with morphology and motility was (P less 0.002). With regard to pregnancy rate (more 75%), it was said about fertility potencial of rams sperms populations that were studied. It was concluded in general that techniques to evaluate nuclear condensation values does have a high likelihood to give diagnosis about future potential of sperm populations in Junin ram.

O 5-Fluorouracil (5-FU) é um agente antitumoral amplamente empregado no tratamento de diversos tipos de cânceres. Embora haja muitos trabalhos publicados com este antineoplásico, estudos sobre seus mecanismos de ação ainda tornam-se necessários a fim de se obter protocolos clínicos mais eficazes. Desta forma, novos aspectos sobre seu mecanismo de citotoxicidade foram investigados neste trabalho. Na primeira parte foram avaliadas as vias de reparação de DNA que participam em resposta a danos induzidos pelo 5-FU e seus efeitos comparados com o seu metabólito ativo FdUMP em Saccharomyces cerevisiae. Os resultados apontam que as lesões induzidas pelo 5-FU podem ser processadas pela vias de reparo por excisão de bases (BER), reparação de bases mal-emparelhadas (MMR), reparo pós-replicativo (PRR) e recombinação homóloga (HR), enquanto que os danos induzidos pelo FdUMP seriam reconhecidos e removidos apenas pelas vias BER e MMR. Estas diferenças no recrutamento das vias de reparo relacionam-se aos diferentes tipos de lesões que são geradas pelos antimetabólitos: o 5-FU induz quebras de fita simples (SSBs) e duplas (DSBs), enquanto que o FdUMP forma principalmente SSBs. Na segunda parte foi investigada a participação de modeladores da cromatina na citotoxicidade do 5-FU em S. cerevisiae. Os resultados em conjunto sugerem que os remodeladores da cromatina dependentes de ATP e algumas acetiltransferases de histona podem influenciar na citotoxicidade do agente 5-FU, possivelmente atuando no relaxamento da cromatina, e assim facilitando os processos de reparação de DNA por HR e PRR. Na terceira parte foi avaliada a resposta ao dano no DNA por ATR/Chk1 e ATM/Chk2 em células tumorais humanas. Os resultados mostraram que o 5-FU ativa principalmente a via ATR/Chk1. Ao se investigar os efeitos do 5-FU em combinação com o AZD7762, um inibidor de Chk1/2, observou-se aumento de sensibilidade ao agente antitumoral, diretamente relacionado ao aumento de células em sub-G1, diminuição em G2/M e indução de mitose prematura. Os resultados em conjunto obtidos neste trabalho nos permitem uma melhor compreensão destes mecanismos de ação do 5-FU, e fornece subsídios para melhora de protocolos terapêuticos. / 5-Fluorouracil (5-FU) is an antitumor drug employed in the treatment of several cancer types. Despite many studies have been conduced with this antineoplasic drug, investigations concerning on its action mechanism become necessary in order to obtain more efficient clinical protocols. Therefore, new aspects about its cytotoxicity mechanism were investigated in this work. First, DNA repair pathways involved in the repair of 5-FU-induced lesions were evaluated and compared to the effects of its active metabolite FdUMP in Saccharomyces cerevisiae. Our data showed that lesions induced by 5-FU may be processed by base excision repair (BER), mismatch repair (MMR), post-replication repair (PRR) and homologous recombination (HR), while FdUMP lesions are recognized and removed only by BER and MMR. These differences in repair pathways recruitment are related to the different lesion types induced by the antimetabolites: 5-FU induces single- and double stranded breaks (SSBs and DSBs), while FdUMP induces mainly SSBs. In the second part we investigated the participation of chromatin remodeling in the 5- FU cytotoxicity in S. cerevisiae. Together, our data suggest that ATP-dependent chromatin remodeling and some histone acetyltransferases may influence 5-FU cytotoxicity, probably acting in chromatin relaxation and facilitating DNA repair process by HR and PRR. In the third part, the DNA damage response by ATR/Chk1 and ATM/Chk2 were evaluated in human tumor cells. The data showed that 5-FU activates mainly ATR/Chk1 pathway. When we investigate the effects of 5-FU in combination with AZD7762, the Chk1/2 inhibitor, we observed increased sensitivity to this antitumor agent, directly related to enhanced number of sub-G1 cells, decrease in the G2/M cells, and premature mitose induction. Our data permit a better comprehension of 5-FU action mechanisms and provide clues to improve the current therapeutics protocols.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-08-10T16:13:17Z No. of bitstreams: 1 2017_WanessaFelixCabral.pdf: 3821764 bytes, checksum: c37c36b987640585747add58dc37e633 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-05T12:52:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_WanessaFelixCabral.pdf: 3821764 bytes, checksum: c37c36b987640585747add58dc37e633 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-05T12:52:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_WanessaFelixCabral.pdf: 3821764 bytes, checksum: c37c36b987640585747add58dc37e633 (MD5) Previous issue date: 2017-10-05 / A cromatina é um complexo macromolecular formado por unidades repetitivas básicas, o nucleossomo. Este, por sua vez, é constituído por DNA e histonas. As Proteínas Ligantes de Nucleossomo (NBPs) são capazes de controlar a dinâmica de abertura e fechamento da cromatina e, dessa forma, regulam a expressão gênica e a manutenção do genoma. Acredita-se, com isso, que moléculas que se ligam à superfície nucleossomal possam ter profundo impacto na estrutura da cromatina. Uma classe de peptídeos, conhecida como stapled, é descrita por ter maior estabilidade que os peptídeos nativos frente à ação de proteases, bem como o aumento da sua penetrabilidade celular. Diante disso, esta pesquisa tem como objetivo o desenho e a síntese química de peptídeos miméticos ligantes de nucleossomo, e estabelecer a melhor metodologia de síntese em fase sólida no laboratório de pesquisa. Foram desenhados peptídeos stapled, baseados em estruturas atômicas e cristalográficas de NBPs, em especial a proteína RCC1 complexada ao nucleossomo, contendo uma restrição conformacional, um crosslink formado por hidrocarbonetos. Os peptídeos compostos por 19 aminoácidos foram sintetizados em fase sólida (SPPS) pela inserção de aminoácidos α,α-dissubstituídos. A reação de metátese (RCM) foi escolhida para a formação do macrociclo utilizando catalisadores de Grubbs contendo rutênio. Além disso, alguns desses peptídeos foram purificados com sucesso e analisados por dicroísmo circular. / The chromatin is a macromolecular complex formed by basic repeating units, the nucleosome, which is composed of DNA and histones. Nucleosome Binding Proteins (NBPs) are able to control the opening and closing dynamics of chromatin, and thus regulate gene expression and genome maintenance. It is plausible to believe that molecules that bind to the nucleosomal surface can have a profound impact on the clinical outcome. A class of peptides known as stapled is described by increasing the stability of their native peptides to the action of proteases, as well as increasing their cellular penetrability. The present work aims at the design and chemical synthesis of nucleosome binding mimetic peptides, optimizing solid phase synthesis methodology in the research laboratory. Stapled peptides were designed based on atomic and crystallographic structures of NBPs, in particular protein RCC1 complexed to the nucleosome, containing a conformational constraint, a crosslink formed by hydrocarbons. Peptides composed of 19 amino acids were synthesized in solid phase (SPPS) by the insertion of α,α-disubstituted amino acids. The metathesis reaction (RCM) was chosen for macrocycle formation using ruthenium-containing Grubbs catalysts. In addition, some of these peptides were successfully purified and analyzed by circular dichroism.

O 5-Fluorouracil (5-FU) é um agente antitumoral amplamente empregado no tratamento de diversos tipos de cânceres. Embora haja muitos trabalhos publicados com este antineoplásico, estudos sobre seus mecanismos de ação ainda tornam-se necessários a fim de se obter protocolos clínicos mais eficazes. Desta forma, novos aspectos sobre seu mecanismo de citotoxicidade foram investigados neste trabalho. Na primeira parte foram avaliadas as vias de reparação de DNA que participam em resposta a danos induzidos pelo 5-FU e seus efeitos comparados com o seu metabólito ativo FdUMP em Saccharomyces cerevisiae. Os resultados apontam que as lesões induzidas pelo 5-FU podem ser processadas pela vias de reparo por excisão de bases (BER), reparação de bases mal-emparelhadas (MMR), reparo pós-replicativo (PRR) e recombinação homóloga (HR), enquanto que os danos induzidos pelo FdUMP seriam reconhecidos e removidos apenas pelas vias BER e MMR. Estas diferenças no recrutamento das vias de reparo relacionam-se aos diferentes tipos de lesões que são geradas pelos antimetabólitos: o 5-FU induz quebras de fita simples (SSBs) e duplas (DSBs), enquanto que o FdUMP forma principalmente SSBs. Na segunda parte foi investigada a participação de modeladores da cromatina na citotoxicidade do 5-FU em S. cerevisiae. Os resultados em conjunto sugerem que os remodeladores da cromatina dependentes de ATP e algumas acetiltransferases de histona podem influenciar na citotoxicidade do agente 5-FU, possivelmente atuando no relaxamento da cromatina, e assim facilitando os processos de reparação de DNA por HR e PRR. Na terceira parte foi avaliada a resposta ao dano no DNA por ATR/Chk1 e ATM/Chk2 em células tumorais humanas. Os resultados mostraram que o 5-FU ativa principalmente a via ATR/Chk1. Ao se investigar os efeitos do 5-FU em combinação com o AZD7762, um inibidor de Chk1/2, observou-se aumento de sensibilidade ao agente antitumoral, diretamente relacionado ao aumento de células em sub-G1, diminuição em G2/M e indução de mitose prematura. Os resultados em conjunto obtidos neste trabalho nos permitem uma melhor compreensão destes mecanismos de ação do 5-FU, e fornece subsídios para melhora de protocolos terapêuticos. / 5-Fluorouracil (5-FU) is an antitumor drug employed in the treatment of several cancer types. Despite many studies have been conduced with this antineoplasic drug, investigations concerning on its action mechanism become necessary in order to obtain more efficient clinical protocols. Therefore, new aspects about its cytotoxicity mechanism were investigated in this work. First, DNA repair pathways involved in the repair of 5-FU-induced lesions were evaluated and compared to the effects of its active metabolite FdUMP in Saccharomyces cerevisiae. Our data showed that lesions induced by 5-FU may be processed by base excision repair (BER), mismatch repair (MMR), post-replication repair (PRR) and homologous recombination (HR), while FdUMP lesions are recognized and removed only by BER and MMR. These differences in repair pathways recruitment are related to the different lesion types induced by the antimetabolites: 5-FU induces single- and double stranded breaks (SSBs and DSBs), while FdUMP induces mainly SSBs. In the second part we investigated the participation of chromatin remodeling in the 5- FU cytotoxicity in S. cerevisiae. Together, our data suggest that ATP-dependent chromatin remodeling and some histone acetyltransferases may influence 5-FU cytotoxicity, probably acting in chromatin relaxation and facilitating DNA repair process by HR and PRR. In the third part, the DNA damage response by ATR/Chk1 and ATM/Chk2 were evaluated in human tumor cells. The data showed that 5-FU activates mainly ATR/Chk1 pathway. When we investigate the effects of 5-FU in combination with AZD7762, the Chk1/2 inhibitor, we observed increased sensitivity to this antitumor agent, directly related to enhanced number of sub-G1 cells, decrease in the G2/M cells, and premature mitose induction. Our data permit a better comprehension of 5-FU action mechanisms and provide clues to improve the current therapeutics protocols.

O 5-Fluorouracil (5-FU) é um agente antitumoral amplamente empregado no tratamento de diversos tipos de cânceres. Embora haja muitos trabalhos publicados com este antineoplásico, estudos sobre seus mecanismos de ação ainda tornam-se necessários a fim de se obter protocolos clínicos mais eficazes. Desta forma, novos aspectos sobre seu mecanismo de citotoxicidade foram investigados neste trabalho. Na primeira parte foram avaliadas as vias de reparação de DNA que participam em resposta a danos induzidos pelo 5-FU e seus efeitos comparados com o seu metabólito ativo FdUMP em Saccharomyces cerevisiae. Os resultados apontam que as lesões induzidas pelo 5-FU podem ser processadas pela vias de reparo por excisão de bases (BER), reparação de bases mal-emparelhadas (MMR), reparo pós-replicativo (PRR) e recombinação homóloga (HR), enquanto que os danos induzidos pelo FdUMP seriam reconhecidos e removidos apenas pelas vias BER e MMR. Estas diferenças no recrutamento das vias de reparo relacionam-se aos diferentes tipos de lesões que são geradas pelos antimetabólitos: o 5-FU induz quebras de fita simples (SSBs) e duplas (DSBs), enquanto que o FdUMP forma principalmente SSBs. Na segunda parte foi investigada a participação de modeladores da cromatina na citotoxicidade do 5-FU em S. cerevisiae. Os resultados em conjunto sugerem que os remodeladores da cromatina dependentes de ATP e algumas acetiltransferases de histona podem influenciar na citotoxicidade do agente 5-FU, possivelmente atuando no relaxamento da cromatina, e assim facilitando os processos de reparação de DNA por HR e PRR. Na terceira parte foi avaliada a resposta ao dano no DNA por ATR/Chk1 e ATM/Chk2 em células tumorais humanas. Os resultados mostraram que o 5-FU ativa principalmente a via ATR/Chk1. Ao se investigar os efeitos do 5-FU em combinação com o AZD7762, um inibidor de Chk1/2, observou-se aumento de sensibilidade ao agente antitumoral, diretamente relacionado ao aumento de células em sub-G1, diminuição em G2/M e indução de mitose prematura. Os resultados em conjunto obtidos neste trabalho nos permitem uma melhor compreensão destes mecanismos de ação do 5-FU, e fornece subsídios para melhora de protocolos terapêuticos. / 5-Fluorouracil (5-FU) is an antitumor drug employed in the treatment of several cancer types. Despite many studies have been conduced with this antineoplasic drug, investigations concerning on its action mechanism become necessary in order to obtain more efficient clinical protocols. Therefore, new aspects about its cytotoxicity mechanism were investigated in this work. First, DNA repair pathways involved in the repair of 5-FU-induced lesions were evaluated and compared to the effects of its active metabolite FdUMP in Saccharomyces cerevisiae. Our data showed that lesions induced by 5-FU may be processed by base excision repair (BER), mismatch repair (MMR), post-replication repair (PRR) and homologous recombination (HR), while FdUMP lesions are recognized and removed only by BER and MMR. These differences in repair pathways recruitment are related to the different lesion types induced by the antimetabolites: 5-FU induces single- and double stranded breaks (SSBs and DSBs), while FdUMP induces mainly SSBs. In the second part we investigated the participation of chromatin remodeling in the 5- FU cytotoxicity in S. cerevisiae. Together, our data suggest that ATP-dependent chromatin remodeling and some histone acetyltransferases may influence 5-FU cytotoxicity, probably acting in chromatin relaxation and facilitating DNA repair process by HR and PRR. In the third part, the DNA damage response by ATR/Chk1 and ATM/Chk2 were evaluated in human tumor cells. The data showed that 5-FU activates mainly ATR/Chk1 pathway. When we investigate the effects of 5-FU in combination with AZD7762, the Chk1/2 inhibitor, we observed increased sensitivity to this antitumor agent, directly related to enhanced number of sub-G1 cells, decrease in the G2/M cells, and premature mitose induction. Our data permit a better comprehension of 5-FU action mechanisms and provide clues to improve the current therapeutics protocols.

Orientadores: Maria Luiza Silveira Mello, Benedicto de Campos Vidal / Tese(doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T22:01:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Taboga_SebastiaoRoberto_D.pdf: 10018541 bytes, checksum: 9e8e4476731b4e33b98f8dcc0534ee08 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: Uma expressiva fração da população masculina brasileira tem sido diagnosticada com lesões na próstata ou com sintomas de prostatismo. O presente trabalho teve como objetivo a caracterização dos núcleos e da matriz extracelular, com enforque à morfologia, citoquímica, cariometria e imunocitoquímica de lesões prostáticas humanas. Foram examinadas biópsias de ressecções trans-uretrais e punção por agulha fina de um total de 26 pacientes com hiperplasia nodular prostática (HNP) e 25 pacientes com adenocarcinomas (AC) de pacientes da Região Norte do Estado de São Paulo. Dos casos acima estudados, 12 pacientes com regiões livres de comprometimento histopatológico foram considerados controles ou regiões normais (NOR). Cortes histológicos de 6-8flm de espessura foram submetidos às colorações pela hematoxilina-eosina para as análises da distribuição da cromatina e cariometria (área e perímetro nucleares e fator forma de 200 núcleos para cada paciente estudado); azul de toluidina pH 4,0 e suas variantes para estudos citoquímicos de ácidos nucléicos; Reação de Feulgen para estudo do DNA; Reação imunocitoquímica para detecção de Apoptose - Apoptag e Impregnação argêntica de Gõmõri para o estudo da matriz estracelular. Da análise das lâminas e das medidas nucleares pôde-se concluir que existem diferenças visuais, principalmente nos adenocarcinomas, onde predomina um acentuado pleiomorfismo nuclear. As diferenças cariométricas observadas, foram significativas para os valores de área e perímetro nucleares e não significativas para o fator forma, entre as três classes, utilizando-se o teste estatístico não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Para a comparação das populações amostrais utilizou-se as medianas dos valores obtidos na cariometria, como mostra a tabela abaixo. Classes Área nuclear (m2) Perímetro nuclear (m) Fator Forma NOR 44,30 24,80 0,94 HNP 37,14 22,52 0,92 AC 60,86 29,70 0,93 valor p p=0,0001 p=0,0001 p=0,0513(ns) (ns)não significativo Entretanto, nas categorias internas da classificação dos adenocarcinomas, segundo a graduação clássica proposta por Gleason, na versão combinada e considerando apenas o primeiro dígito da graduação, não se detectaram diferenças significativas (p=O,838 para área; p=O,6076 para perímetro e p=O,9202 para fator forma). Nestas categorias vale ressaltar a grande heterogeneidade do universo amostral Assim conclui-se que os dados de morfometria não podem ser utilizados como parâmetros discriminatórios isoladamente, sem levar em. conta a histoaquitetura do tumor. Da análise dos cortes corados pelo azul de toluidina na sua variante para detecção de apoptose e da imunocitoquímica para detecção de apoptose, pôde-se concluir não serem detectadas células apoptóticas nas regiões normais e nos adenocarcinomas, mas serem detectados corpos apoptóticos nas hiperplasias, principalmente em áreas onde estaria ocorrendo a regressão do ácino hiperplástico. Isto pode sugerir que o fenômeno apoptótico seja um modulador da recuperação localizada da hiperplasia, podendo ser inclusive um parâmetro auxiliar para o acompanhamento diagnóstico durante o tratamento. Da análise dos cortes submetidos à impregnação argêntica, pôde-se concluir que as fibras colágenas na matriz extracelular do estroma prostático, em sua dinâmica supra-molecular, respondem a estímulos externos ao estroma, modificando a disposição e o grau de compactação fibrilar. Na hiperplasia nodular prostática parece não haver modificações na integridade molecular do colágeno, pois a sua afinidade pela prata e birrefringência não são alteradas. Nos adenocarcinomas com alto grau de indiferenciação, fibras colágenas finas, ramificadas e fortemente argirófilas e birrefringentes são detectadas nas regiões de proliferação tumora!. E no estroma adjacente, hospedeiro do tumor, placas hialinas de matriz extracelular sugerem degradação ou remodelação dos componentes da matriz / Abstract: An expresive fraction of the Brasilian male population has been diagnosed with prostatic lesions or presents prostatism symptons. The present work aimed at characterizing the nuclei and the extracellular matrix, emphazing the morphology, cytochemistry, kariometrics and immunocitochemistry in some human prostatic lesions. Transurethral resections and fine needle aspiration of patients presenting prostatic nodular hyperplasia (PNH - 26 cases) or adenocarcinoma (AC - 25 cases), from the north region of the São Paulo State were examined. Twelve of these cases presented regions with no histopathological alterations which were considered normal and employed as control (Ct). Six to eigth micrometers thick histological sections were stained by hematoxylin and eosin for the analysis of chromatin distribution and kariometry (nuclear area and perimeter and form factor - 200 measurements for each patient); toluidine blue at pH 4.0 and its modifications for the cytochemical study of nucleic acids; Feulgen reaction for DNA; immunocytochemistry for detection of apoptosis (Apoptag kit) and Gõmõri' s silver impregnation for study of fibrilar collagens. The analysis showed the existence of visual differences in the nuclear phenotype among the studied cases, in special in AC, which showed a amked nuclear pleomorphism. Karyometry showed significative differences in area and perimeter values but form factor, amongst the three classes, by the use of the Kruskal-Wallis non-parametric statistical testo The median values employed for comparision between the samples are shown in the table below. Classes Nuclear area (m2) Nuclear perimeter (m) F orm factor Ct 44.30 24.80 0.94 PHN 37.14 22.52 0.92 AC 60.86 29.70 0.93 P value p=0.0001 p=O.OOOl p=0.0513(ns) (ns)non-significant The different classifications of the adenocarcinomas, according to the GIeason grading, in the combined version and considering only the first grading, showed no significative differences (p=O.838 for the area, p=O.6076 for perimeter and p=O.9202 for the form factor). It is worth to refer to the Iarge heterogeneity of the nuclear popuIation. It is concluded that morphometrics cannot be used isoIatedly to discriminate prostatic Iesions, without considerations of the tumor histoarchitecture. The use of toIuidine bIue staining modification for detection ofapoptosis and the Apoptag test demonstrated the absence of apoptotic cells and in adenocarcinomas but in hyperpIasia, especially in areas of regressing hyperpIastic acina. This is suggestive that apoptosis may represent a factor invoIved in Iocalized recover of hyperpIasia and its detection is IikeIy to represent an additionaI parameter for the follow up after treatment. The anaIysis of silver impregnated tissue sections allowed for the conclusion that collagen fibers of the prostatic stroma, in their supramoIecuIar dynamics, respond to externaI stimuli, modifying their disposition and fibrillar compactation. In PNH, there is no modifications in collagen moIecuIar integrity, since the silver affinity and birefringence are similar to controIs. In AC with high degree of non-differentiation, thin and branched collagen fibers, strongIy argyrophilic and birefrlngent are detectedin regions of cell proliferation. In the adjacent stroma, host of the tumor, hya1ine pIaques are probabIe signs of matrix degradation or remodellation / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Ciências

Orientadores: Maria Luiza Silveira Mello, Benedicto de Campos Vidal / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T19:44:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_AlbertodaSilva_M.pdf: 627420 bytes, checksum: c7ae5072d55029daa401be8461a2a684 (MD5) Previous issue date: 2004 / Mestrado

Orientador: Marion Burkhardt De Koivisto / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a qualidade espermática, compactação/integridade e deficiência de protamina da cromatina de espermatozoides, somado às características reprodutivas de acordo com a idade. Procurou-se avaliar a interferência da idade nas variáveis analisadas e a evolução das mesmas ao longo de quatro coletas mensais. Foram selecionados 43 touros de elite Bos taurus indicus da raça Gir com idades iniciais entre 18 e 42 meses e divididos em três grupos: jovens (18,5-24,7 meses de idade, n=15), jovens adultos (25,2-28,6 meses de idade, n=16) e adultos (29,1-42,0 meses de idade, n=12). Nessa primeira avaliação as características reprodutivas foram incluídas (Fertilidade, Classificação Andrológica por Pontos e Índice de Classificação de Touros). Em seguida 38 dos 43 touros foram divididos em 3 grupos (mesmas faixas etárias): jovens (n=12), jovens adultos (n=13) e adultos (n=13). Após descongelamento, as amostras foram submetidas às técnicas de coloração do azul de toluidina, para avaliar concomitantemente condensação/integridade da cromatina e morfometria da cabeça espermática, e coloração pela cromomicina A3 (CMA3), para investigar deficiência de protamina espermática. Animais do grupo jovem apresentaram espermatozoides com maior heterogeneidade da compactação da cromatina (CV) (2,52±0,31%) que animais do grupo jovem adulto (1,75±0,10 %). Além disso, o grupo jovem apresentou alteração de cromatina em todas as coletas (Dif > 2 e/ou CV > 5%). O grupo jovem adulto ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate sperm quality, condensation/integrity and protamine deficiency of sperm's chromatin packaging, as well as the behavior of reproductive characteristics according to age. For that, two approaches were done: 1st) evaluate how age would interfere in the analyzed variables, 2nd) evaluate how the variables would evolve along four monthly collections. On the 1st approach, 43 elite Gir bulls (Bos taurus indicus) with initial ages between 18 and 42 months were divided into three groups: young (18.5-24.7 months, n=15), young adult (25.2-28.6 months, n=16) and adult (29.1-42.0 months, n=12). Results of reproductive characteristics evaluation (Fertility, Andrological Classification by Points and Bull Classification Index) were included in this first approach. For the 2nd approach, 38 of the 43 bulls were divided into three groups (using the same criteria described before): young (n=12), young adult (n=13) and adult (n=13). After thawing, semen samples were evaluated trough the toluidine blue method, for chromatin condensation/integrity and sperm head morphometry assessment and chromomicin A3 (CMA3) to analyze protamine deficiency. Animals from the young group presented spermatozoa with higher heterogeneity of chromatin compaction (CV) (2.52±0.31 %) than animals from the young adult group (1.75±0.10 %). Young bulls also presented chromatin alteration in all the four collections ((Dif > 2 and/or CV > 5%). The young adult group showed higher fertility i... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre