Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T16:01:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandez_MaribelFernandez_D.pdf: 2528780 bytes, checksum: f2c8b7a6e63a773b6160e0d483156743 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os terminais dos cromossomos de Leishmania (Leishmania) amazonensis contêm repetições teloméricas mantidas pela enzima telomerase da seqüência 5'-TTAGGG-3', a qual é conservada também em outros tripanosomatídeos e outros eucariotos. Utilizando-se frações protéicas purificadas a partir de extratos S100 e nuclear, foi possível se detectar atividade de telomerase e três complexos proteína-DNA que se associam in vitro com seqüências teloméricas ricas em G do parasita. A atividade de telomerase de L. (L.) amazonensis foi detectada por ensaio TRAP ("Telomeric Repeat Amplification Protocol") e apresenta características comuns às telomerases já descritas em outros tripanosomatídeos. Os complexos proteína-DNA foram identificados por EMSA ("Electrophoretic Mobility Shift Assays") e ensaios de "UV cross-linking" e denominados LaGT1-3 (Leishmania amazonensis G-strand telomeric protein 1-3). Eles não são formados: i) com DNA telomérico na forma de dupla fita e com fita rica em C, ii) em experimentos de competição específica usando oligonucleotídeos de seqüências de DNA telomérico, ou iii) após o tratamento enzimático com proteinase K. LaGT1 foi o complexo mais específico, o qual é formado com todas as seqüências de DNA telomérico (Tel1-6, Tel30 e Tel36) e não se associa à seqüência telomérica de Tetrahymena. As proteínas que formam os três complexos associam-se com uma seqüência de RNA telomérico rica em G e um complexo similar a LaGT1 é formado com DNA telomérico na forma de dupla fita contendo uma projeção 3' simples fita terminal. A estimativa das constantes de dissociação (Kd) do complexo LaGT1 associado a seqüência telomérica na forma de DNA e dos complexos LaGT2 e LaGT3 associados a seqüências teloméricas na forma de DNA ou RNA, demonstra que estes se encontram na ordem de nM, característica comum a proteínas que ligam DNA na forma de simples fita. Os componentes protéicos dos complexos LaGT2 e LaGT3 foram purificados por cromatografia de afinidade e identificados após renaturação, como bandas de ~35 kDa e ~52 kDa, respectivamente. O componente protéico de < 15 kDa de LaGT1 foi purificado em gel como um complexo irradiado com luz UV de ~18-20 kDa. Os componentes protéicos de LaGT2 e LaGT3 e o complexo irradiado LaGT1 foram digeridos em gel com tripsina e os peptídeos trípticos resultantes foram analisados por espectrometria de massa utilizando-se as técnicas: "Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight" (MALDI-TOF) e "Liquid Chromatography Electrospray Ionization tandem Mass Spectrometry" (LC/ESIMS/MS), a análise dos espectros demonstrou que o componente protéico de ~35 kDa de LaGT2 é homólogo da proteína Rbp38 de Leishmania spp. enquanto, o componente protéico de ~52 kDa de LaGT3 é similar à subunidade 1 da proteína de replicação A (Rpa-1) de Leishmania spp. O componente protéico de < 15 kDa de LaGT1 provavelmente uma proteína de L. (L.) amazonensis que ainda não foi identificada. A identificação das proteínas por espectrometria de massa, possibilitou a clonagem dos genes que codificam às mesmas. Neste trabalho apresentamos a caracterização parcial do gene que codifica o componente protéico do complexo LaGT3: subunidade 1 da proteína de replicação A de L. (L.) amazonensis (LaRpa-1). A análise da sua organização genômica demonstrou que o mesmo encontra-se provavelmente em baixo número de cópias ou em cópia única no genoma do parasita e que ele se localiza em uma banda cromossômica de ~0,8 Mb. Foi realizada também a análise conformacional parcial da interação entre a proteína nativa renaturada LaRpa-1 e o DNA telomérico rico em G de L. (L.) amazonensis (oligonucleotídeo Tel6) por espectroscopia de fluorescência mostrando-se um aumento da intensidade da fluorescência quando ocorre essa interação / Abstract: The chromosomal ends of Leishmania (Leishmania) amazonensis contain conserved 5'- TTAGGG-3' telomeric repeats, that are maintained by telomerase. Using Telomeric Repeat Amplification Protocol (TR AP) we detected telomerase activity in protein fractions purified from S100 and nuclear extracts. Protein complexes that associate in vitro with telomeric DNA sequences, LaGT1-3 (Leishmania amazonensis G-strand telomeric protein), were identified and characterized by electrophoretic mobility shift assays (EMSA) and UV cross-linking using protein fractions purified from S100 and nuclear extracts. The three complexes did not form i) with double strand DNA (dsDNA) and the C-rich telomeric strand, ii) in competition assays using specific telomeric DNA oligonucleotides, or iii) after pre-treatment with proteinase K. LaGT1 was the most specific, it is formed with all DNA telomeric sequences (Tel1-6, Tel30 and Tel36) and did not bind a Tetrahymena telomeric sequence. All three LaGTs associated with an RNA sequence cognate to the telomeric G-rich strand and a complex similar to LaGT1 is formed with a dsDNA bearing a 3' G-overhang tail. The dissociation constants (Kd) for LaGT1 complexed with telomeric DNA sequence, and for LaGT2-3 complexed with telomeric DNA and RNA sequences were in the nM range. The protein components of LaGT2 and LaGT3 were purified by affinity chromatography and identified, after renaturation, as ~35 kDa and ~52 kDa bands, respectively. The < 15 kDa protein component of LaGT1 was gel-purified as a UV crosslinked complex of ~18-20 kDa. LaGT2 and LaGT3 protein bands and the irradiated LaGT1 complex were digested by trypsin and the resulting peptides were analysed by mass espectrometry techniques: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF) and by Liquid Chromatography Electrospray Ionization tandem Mass Spectrometry (LC/ESI-MS/MS). The fingerprint analysis showed that the ~35 kDa protein component of LaGT2 was homologous to the Leishmania spp. Rbp38 protein, whereas the ~52 kDa component of LaGT3 was similar to the putative subunit 1 of replication protein A of Leishmania spp. and the < 15 kDa protein component of LaGT1 was probably a novel Leishmania protein. The gene encoding the protein-forming complexe LaGT3 (LaRpa-1) were cloning and parcially caracterized, the genomic organization analysis of LaRPA-1 gene showed that it is present probably in low copy number or a single copy and was mapped on a chromosome of ~0,8 Mb. The partial conformational analysis of the interaction between nativeLaRpa-1 and the telomeric G-rich DNA (Tel6) was performed using fluorescence spectroscopy, this analysis showed an increase of the fluorescence when the interaction occurs / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Glaucia Maria Bovi Ambrosano / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-26T02:52:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Duz_Sergio_M.pdf: 2921729 bytes, checksum: b07f79128c98890fe5a8788baa6ddd32 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Desde 1949, quando BARR e BERTRAM descobriram incidentalmente, ao examinarem os neurônios de gatos, que havia um grânulo heteropicnótico, cujos estudos posteriores levaram à descoberta de que o cromocentro era peculiar ao núcleo neural das remeas, vários estudos foram desenvolvidos para investigar a presença da cromatina sexual em outros animais e no homem. Esta descoberta tem sido de inegável importância para a clínica e a prática médica. Assim considerada, sua contribuição à Odontologia Legal não poderia ser menosprezada, visto que a identificação sexual é um O escopo da presente pesquisa foi o de procurar determinar, tópico relevante para essa Ciência. através de exames histológicos da polpa dentária em dentes íntegros e hígidos, de pacientes jovens com idade entre 10 e 30 anos de idade, a existência de uma diferenciação quantitativa e qualitativa significante de cromatina sexual em pessoas de ambos os sexos, de tal modo que fosse possível determinar o sexo pelo exame desse material. As pessoas das quais foram colhidas as polpas dentárias eram clinicamente saudáveis e, aparentemente, sem qualquer evidência para desvio sexual. Assim, foram examinadas 50 polpas dentárias de pessoas do sexo masculino e 50 polpas dentárias oriundas de pessoas do sexo feminino, retiradas de pré-molares e terceiros molares que, por indicação ortodôntica, foram submetidos à extração. Os cortes histológicos dessas polpas dentárias, depois de fixados, foram corados pela hematoxilina férrica de HENDENHAIN. Um número de 100 células foi contado em cada preparo, determinando-se a presença de fibroblastos que continham ou não a presença de cromatina sexual. Os resultados encontrados pennitiram concluir que é possível a determinação do sexo em seres humanos, através da frequência da incidência da cromatina sexual pelo exame microscópico de fibroblastos da polpa dentária, tomando-se mais um dado pericial a ser adicionado aos procedimentos de identificação do indivíduo / Abstract: In 1949, BARR and BERTRAM accidentally discovered the presence of heteropycnotic granules in neurones of cats. Further studies revealed that chromo center was peculiar to the neural nucleus of females. Since then, several studies were made to investigate the presence of sex chromatin in other animals and in human beings. Such findings have been of utmost importance to medical practice. The contribution of such investigations to Forensic Odontology should not be underestimated, given the relevance of sex identification to this Science. The present study had the scope of determining the existence of significant qualitative and quantitative differentiation in the sex chromatin in a sample of white male and female subjects. The ultimate objective was to determine sex through analysis of that material. Histological tests were performed in the dental pulp of 50 male subjects and 50 female subjects, of ages between 10 and 30. The subjects in this sample were in good medical condition, without any visible sign of sexual abnormality. The teeth ITom which the pulp was extracted were in perfect condition. The pulp was extracted ITom premolars and third molars removed after orthodontic evaluation. Histological samples of the pulps, after fixation, were stained with HERDENHAIN'S ferric hematoxylin. One hundred cells were counted in each slide. In these cells the presence or absence of sex chromatin in fibroblasts was determined. Results allow the conclusion that human sex determination is possible when the incidence of sex chromatin in fibroblasts of dental pulp is analyzed in the microscope / Mestrado / Mestre em Odontologia Legal e Deontologia

Orientadores: Konradin Metze, Neucimar Jeronimo Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T17:14:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Adam_RandallLuis_M.pdf: 8685588 bytes, checksum: c7b962efb663ee1cbc15c6e696e897eb (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: textura nuclear pode ser avaliada por muitas abordagens. A imagem pode ser considerada como uma função matemática, e as variações da luminância entre cada ponto da imagem pode ser interpretada como freqüências espaciais. A transformada rápida de Fourier (FFT) foi utilizada para a análise da textura da cromatina em patologia. A análise de Fourier detecta eventos periódicos. Em processamento de imagens, a freqüência espacial expressa o ritmo das alterações de brilho que ocorrem numa seqüência de pontos. Em imagens, a distribuição das freqüências avalia sua periodicidade e a sua anisotropia ou predominância direcional. Padrões regulares de textura acumulam informação textural em regiões correspondentes à freqüência e direção.O modelo biológico utilizado permitiu a análise das alterações da cromatina de car diomiócitos durante o desenvolvimento de ratos da linhagem Wistar, entre 19 dias de vida fetal e 60 dias de vida pós-parto. O tecido micárdico foi fixado em formalina tamponada durante 24 horas a 4°C. A fim de se obter preparações citológicas, as amostras foram hidrolisadas numa solução de hidróxido de potássio por 18 horas.Os núcleos foram corados com hematoxilina. As imagens foram adquiridas utilizando o sistema KS-300, com a resolução de 10 pixels por micrômetro. A imagem transformada de um núcleo segmentado pela FFT é o resultado da (1) textura da cromatina, e (2) do efeito das bordas do contorno nuclear. Esta última pode dificultar o estudo do espectro da cromatina. Por isso este efeito foi eliminado através do amaciamento das bordas, selecionadas por 3 erosões e 12 dilatações morfológicas. Como fundo, foi utilizado a luminância média do núcleo.As concentrações da informação textural da imagem da cromatina nuclear corada com hematoxilina foram quantificadas. Esses parâmetros foram comparados com características biológicas (idade e atividade mitótica), avaliando-se o desempenho em discriminar os grupos de diferentes graus de desenvolvimento histológico do miocárdio. Foi calculado para cada núcleo, a área, a maior corda, parâmetros derivados da matriz de co-ocorrência, as distribuições angulares e anulares da energia e do momento de inércia. Parâmetros derivados da matriz de co-ocorrência e da imagem transformada puderam discriminar bem os grupos etários. As imagens espacial e espectral, intimamente relacionadas entre si, forneceram parâmetros com informação textural distinta, úteis no processo classificatório. A transformada de Fourier pode ser mais uma ferramenta para a avaliação da textura nuclear.A textura da cromatina tornou-se mais homogênea com o aumento da idade. Especificamente aos períodos espaciais entre 3,6 e 1, 8mm, o momento de inércia diminuiu rapidamente com a idade. As entropias da matriz de co-ocorrência e o perfil das imagens transformadas tornaram-se menores, refletindo então a diferenciação celular progressiva dos cardiomiócitos. Em resumo, o espectro de Fourier (após o amaciamento das bordas) é capaz de fornecer informações úteis sobre a textura da cromatina, como demonstrado para as alterações nucleares durante o desenvolvimento do coração do rato / Abstract: Not informed / Mestrado / Anatomia Patologica / Mestre em Ciências Médicas

Interstrand DNA crosslinks (ICLs) são importantes lesões genotóxicas que podem causar morte celular se não for devidamente reparadas. Diversas drogas antitumorais atuam através da indução de ICLs no DNA, e a resistência a essas drogas está muitas vezes relacionada à maior capacidade de células tumorais para reparar tais lesões. As ICLs são lesões complexas que requerem o envolvimento de diferentes vias de reparação, tais como BER NER, TLS e vias de reparação de DSBs (RH e NHEJ). Além disso, foi demonstrado que Pso2p desempenha um papel importante na reparação de ICLs. Muitos estudos também apontam para as alterações epigenéticas como essenciais para a sobrevivência da célula em resposta ao dano genotóxico, através da indução de checkpoints de ciclo celular e da modulação da eficiência (e, possivelmente, da escolha) das vias de reparação de DNA. Assim, a primeira parte desta Tese apresenta uma revisão dos mecanismos envolvidos na citotoxicidade dos ICLs induzidos pela furocumarina bifuncional 8-metoxipsoraleno (8-MOP) em Saccharomyces cerevisiae. A abordagem adotada discute a ação integrada de proteínas que atuam em vias de reparação de DNA envolvidas na remoção de ICLs, em combinação com fatores envolvidos no remodelamento da cromatina dependente de ATP. A fim de investigar o papel do remodelamento da cromatina em resposta a danos ao DNA induzidos pelo tratamento com furocumarinas mono e bifuncionais fotoativadas e ditelureto de difenila (DTDF), foram utilizadas linhagens de S. cerevisiae deficientes em diferentes proteínas relacionadas com a reparação do DNA e o remodelamento da cromatina. DTDF é um composto organotelurado proposto como um protótipo potencial para o desenvolvimento de novas drogas antitumorais. A sensibilidade do mutante pso2Δ ao DTDF, semelhante à observada para o 8-MOP, indica que este composto pode induzir lesões capazes de bloquear a replicação do DNA, tais como ligações cruzadas ou DSBs hairpin capped. Os resultados obtidos mostraram que os duplos mutantes pso2Δswr1Δ e rad52Δswr1Δ não são mais sensíveis aos agentes testados, DTDF, 3-CPS e 8-MOP, do que o mais sensível dos simples mutantes (pso2Δ e rad52Δ, respectivamente). Tendo em mente que Rad52p e Pso2p não têm interação epistática (aditiva ou sinergística) na reparação das lesões fotoinduzidas por 3-CPS e 8-MOP, sugere-se que Pso2p pode fornecer substrato para vias de reparação diferentes de HR, que poderiam ser NHEJ canônica e/ou MMEJ. O fato de que swr1Δ (deficiente em NHEJ) não aumenta a sensibilidade dos duplos mutantes, além da baixa sensibilidade observada para o mutante yku80Δ ao DTDF e à fotoadição de psoralenos, sugere que as lesões induzidas podem ser direcionadas para as vias HR ou MMEJ, ao invéz de NHEJ canônica. O envolvimento da via MMEJ sujeita a erros na reparação de lesões induzidas por DTDF pode explicar a indução de mutação frameshift, observada para este agente. Além disso, investigou-se a citotoxicidade induzida pelas drogas antitumorais cisplatina (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU) e sua combinação, em S. cerevisiae. Os resultados obtidos com os mutantes de reparação do DNA mostraram que a sensibilidade à CDDP + 5-FU parece refletir a sensibilidade de linhagens específicas a cada droga utilizada individualmente. Este resultado sugere que o efeito intensificado do tratamento combinado na terapia do câncer pode ser devido à ação de cada agente isoladamente, conforme observado em clones diferentes da população heterogênea de células transformadas. Os resultados referentes aos mutantes em remodelamento da cromatina demonstraram que o tratamento com CDDP + 5-FU provoca uma resposta mais eficaz na indução de morte celular, nos mutantes deficientes em CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ e hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, e hst3Δ), HML (dot1Δ) e HMT (erg6Δ), enquanto CDDP induz sensibilidade em mutantes HAT, além do mutante de HDAC hos3Δ, e o tratamento com 5-FU induz sensibilidade em HAT (gcn5Δ) e HDAC (sin3Δ e hos3Δ). Esses resultados apontam para o envolvimento de proteínas de remodelamento da cromatina como importantes alvos terapêuticos em resposta a agentes genotóxicos. Portanto, os resultados obtidos podem abrir novas perspectivas para a compreensão dos mecanismos envolvidos na resposta ao tratamento com CDDP + 5-FU, bem como auxiliar na escolha dos melhores protocolos terapêuticos. / Interstrand DNA crosslinks (ICLs) are important genotoxic lesions that can cause cell death if not properly repaired. Several antitumoral drugs act by inducing ICLs in DNA, and the resistance to these drugs is often related to an increased capacity of tumor cells to repair such lesions. The ICLs are complex lesions requiring involvement of different pathways for repair, such as BER, NER, TLS and DSB repair pathways (HR and NHEJ). In addition, Pso2p was shown to play an important role in ICLs repair. Many studies also point to the epigenetic changes as essential for cell survival in response to genotoxic damage, through induction of cell cycle checkpoints and modulating the efficiency (and possibly, the choice) of the DNA repair pathways. So, the first part of this Thesis gives a review of the mechanisms involved in the cytotoxicity of the ICLs induced by the bifunctional furocumarin 8-methoxypsoralen (8-MOP) in Saccharomyces cerevisiae. The adopted approach discusses the integrated action of proteins that work in the DNA repair pathways involved in ICLs removing in combination with factors involved in ATP-dependent chromatin remodeling. In order to investigate the role of the chromatin remodeling in response to DNA damage induced by treatment with mono- and bifunctional photoactivated furocumarins and diphenyl ditelluride (DPDT), we used S. cerevisiae strains deficient in different proteins related to DNA repair and chromatin remodeling. DPDT is organotellurium compound proposed as a potential prototype for development of new antitumoral drugs. The sensitivity of pso2Δ to DPDT, similar to that observed for 8-MOP, indicates that this compound could induce lesions able to block DNA replication, such as crosslinks or hairpin-capped DSBs. The obtained results showed that the double mutants pso2Δswr1Δ and rad52Δswr1Δ are not more sensitive to the tested DPDT, 3-CPS and 8-MOP agents than the more sensitive single mutant (pso2Δ and rad52Δ, respectively). Having in mind that Rad52p and Pso2p have non-epistatic interaction (additive or synergistic) in the repair of 3-CPS and 8-MOP photoinduced lesions, we suggest that Pso2p could provide substrate for repair pathway different from HR, which could be canonical NHEJ and/or MMEJ. The fact that swr1Δ (deficient in NHEJ) do not enhance the sensitivity of the double-mutants, in addition to the observed low sensitivity of the yku80Δ mutant to DPDT and psoralens photoaddition, suggests that the induced lesions could be directed to HR or MMEJ pathways rather than to canonical NHEJ. The involvement of the error-prone MMEJ in repair of DPDT-induced lesions could explain the observed frameshift mutation induction by this agent. Moreover, we investigated the cytotoxicity induced by the antitumoral drugs cisplatin (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU), and their combination in S. cerevisiae. The results obtained with DNA repair mutants showed that the sensitivity to cisplatin + 5-FU appears to reflect the sensitivity of the specific strains to each individual drug used. This finding suggests that the enhanced effect of the combined treatment in cancer therapy could be due to the action of each agent alone, as observed on different clones from the heterogeneous population of transformed cells. The results concerning chromatin remodeling mutants demonstrated that CDDP + 5-FU treatment causes a more effective response in the induction of cell death, in CR (ino80Δ), HATs (elp3Δ, gcn5Δ, hat2Δ and hpa2Δ), HDACs (sin3Δ, sir2Δ, hos2Δ , hst1Δ, hst2Δ, and hst3Δ), HML (dot1Δ) and HMT (erg6Δ) mutants, while CDDP induces sensitivity in HAT mutants, besides the HDAC mutant hos3Δ, and 5-FU treatment induces sensitivity in HAT (gcn5Δ) and HDACs (sin3Δ and hos3Δ). These results point to involvement of chromatin remodeling proteins as important therapeutic targets in response to genotoxic agents. Therefore, our findings could provide new insights for understanding the mechanisms involved in the response to treatment with CDDP + 5-FU, as well as to help in the choice of optimal therapeutic protocols.

Orientador : Maria Luiza Silveira Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T20:01:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoni_IsabelaCristina_M.pdf: 6731870 bytes, checksum: 9482bffd43760f239f28a81d1f606c89 (MD5) Previous issue date: 1984 / Resumo: A ligação do hycanthone, droga utilizada no tratamento da esquistossomose, a conhecida pela sua capacidade de penetração na molécula do DNA e de indução de quebras cromossômicas, foi investigada em áreas cromatinicas diferentes em termos de compactação, composição e fisiologia. Com base na observação visual de caracteristicas de basofilia e de anisotropia nucleares pode-se demonstrar urna ligação preferencial do hycanthone pela heterocromatina em núcleos dos túbulos de Malpighi de T. in6__tan_ klug. Entretanto, em outros sistemas ( Linfó citos de camundongo, células renais em culturas e células vegetais) a droga também pode se ligar à eucromatina, com pactada ou não. A droga, ao penetrar nos vários tipos de heterocromatina ( exceto na do T. in6__tan_ ), promove o seu afrouxamento, o que certamente favoreça ai maior incidência de quebras. As variações de ligação do hycanthoneao DNA nos tipos celulares estudados possivelmente se relacionam a diferenças em composição, arranjo e estabilidade dos complexos DNA-Droteina envolvidos / Abstract: Hycanthone is a drug used for the clinical trials of schistossomiasis, although inducing chro mosome breaks when it enters the DNA double helix . In this work the binding of hycanthone to chromatin areas dif fering in terms of composition and phisyology, was inves tigated. Based on visual observation of nu clear basophilia and anisotropy a preferential binding of hycanthone to heterochromatin could be demonstratatin the nuclei of the Malpighian tubules of T. in6e_tan_ Klug. However, in other cellular systems ( mouse lymphocytes, Kid ney cells in culture and plant cells ), the drug can also bind to euchromatin irrespective of its compactness leveI. When penetrating the various hete rochromatin types ( except in the case of T. in6e_tan_ he terochromatin ), the drug induces chromatin loosening,that certainly favors incidence of chromatin breaks. The varia tion of hycanthone b_nding to the DNA in the cell types' studied in this wo_k are possibly related to differences in composition, arrangement and stability of DNA-protein com plexes involved. / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : Benedicto de Campos Vidal / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T20:22:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pimentel_EdsonRosa_D.pdf: 8633645 bytes, checksum: 5daaeeebe7c497b60c7b6d3b1cf9cd04 (MD5) Previous issue date: 1983 / Resumo: Neste trabalho foram considerados alguns aspectos estruturais da fração rica em histona 'H IND. 5' (FR'H IND. 5') bem como a sua participação na estrutura da cromatina. Para isto foram empregados núcleos de eritrócitos de frango, dos quais se extraiu FR'H IND. 5' . Os métodos, tais como os processos extrativos, espectrofotometria de absorção, fluorometria, complexação com corantes, estudos de anisotropia e eleytroforese, permitiram determinar algumas características intrínsecas da FR'H IND. ', bem como diferenças em relação a histona 'H IND. 1' de timo de bezerro. Com a mesma finalidade, foram feitas observações ao microscópio de polarização do material nuclear tratado com NaCl 0,7M, e corado com azul de toluidina e sirius red. Ao microscópio eletrônico foram observados tanto complexos FR'H IND. 5'-DNA como material nuclear em NaCl 0,7M. As extrações levadas a efeito usando ácido perclórico 5%, NaCl 0,7M e NaCl 0,15M-HCl pH 1,85, mostraram que este último apresenta uma maior preferência para extrair FR'H IND. 5' do que os demais. As curvas espectrais de absorção de FR'H IND. 5' e de 'H IND. 1' de timo em meios ácidos e alcalino, não mostraram diferenças nos seus perfis. No entanto, foi relevante o fato de que estas histonas quando desnaturadas em meio básico apresentaram hipercromasia em relação às nativas, ocorrendo o inverso quando em meio ácido... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: This thesis deals with structural aspects of an 'H IND. 5' histone rich fraction ('H IND. 5'RF), as well as its importance in the chromatin structure. 'H IND. 5'RF was extracted from chicken erythrocyte nuclei. Some intrinsic characteristics of 'H IND. 5'RF a few differenciating qualities in relation to the 'H IND. 1' histone of the calf thymus were determined by the following methods: an extractive process; absorption espectrophotometry; fluorometry; dye binding as measured by anisotropy and electrophoresis. These were complemented by observations, carried out with the polarization microscope, of chromatin treated with 0,7 NaCl, and stained with toluidine blue or sirius red. 'H IND. 5'RF-DNA complexes and nuclear material in 0,7M NaCl were studied with the electron microscope. Extraction were made using 5% perchloric acid, 0,7M NaCl and 0,15M NaCl at pH 1,85. This last solution was shown to extract 'H IND. 5'RF preferencially. No differences were detected in the spectral absorption profiles of 'H IND. 5'RF and calf thymus 'H IND. 1' in acid or in alkaline medium. Its is remarkable, however, that the histones, when denatured in a basic medium, were hyperchromic in relation to these some proteins in their native state. In acid medium, the opposite occurred. Fluorescence spectral curves of 'H IND. 5' RF and calf thymus 'H IND. 1' solutions indicated a more intense fluorescence for 'H IND. 5'RF than for 'H IND. 1'. The fluorescence of denatured 'H IND. 5'RF was markedly diminished in relation to that in the native condition. No important difference was noted in their spectral absorption profiles... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Marion Burkhardt de Koivisto / Banca: Gisele Mingoti / Banca: Cássia Orlandi / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar o empacotamento da cromatina e morfometria da cabeça de espermatozoides criopreservados de touros Bos taurus indicus da raça Nelore de diferentes idades e a influência do grau de compactação da cromatina na produção in vitro de embriões (PIV). Foram utilizados 40 animais mantidos em centro de coleta e processamento de sêmen (CCPS) e distribuídos em três grupos: Grupo Jovens (entre 1,8 e 2 anos), Grupo Adultos (entre 3,5 e 7 anos) e Grupo Senis (entre 8 e 14,3 anos). Os ejaculados foram congelados de acordo com os padrões pré-estabelecidos do CCPS. Utilizou-se a coloração de azul de toluidina, que permite a avaliação simultânea da cromatina e morfometria da cabeça espermática, a cromomicina A3 (CMA3) para analisar a protaminação espermática e a PIV para o desenvolvimento embrionário. O azul de toluidina foi avaliado pela microscopia óptica e a CMA3 pelo citômetro de fluxo. Na PIV foram realizadas quatro repetições por grupo, com 25 a 30 oócitos em cada repetição. A análise seminal revelou que espermatozoides de touros jovens obtiveram maiores valores de área (A), perímetro (P) e largura (L) quando comparados a adultos e senis (Jovens: A=1848,5±119,79, P=10,23±0,29, L=1,95±0,1; Adultos: A=1672,9±104,46, P=9,86±0,33, L=1,81±0,06; Senis: A=1723,1±124,41, P=9,97±0,33, L=1,83±0,09; P<0,0001) e apresentaram maior deficiência de protaminação quando analisado pela CMA3 (Jovens: 1,57±0,76; Adultos: 1,09±0,63, Senis: 0,90±0,59; P<0,05). Da mesma forma, variáveis de tamanho (A, P, L) e protaminação espermática, avaliado pela CMA3, obtiveram correlação negativa com a idade e positiva com a elipsidade (P<0,05). Espermatozoides com anormalidades na cromatina obtiveram maior área quando comparado àqueles sem alteração de cromatina (P<0,0001). Não houve diferença significativa na PIV quando sêmen com maior e menor parcela de alteração de cromatina foi ... / Abstract: The aim of this study was to evaluate chromatin condensation and sperm head morphometry of cryopreserved semen samples from Bos taurus indicus bulls of different ages and the influence of the degree of chromatin condensation on in vitro embryo production (IVP). A total of 40 animals kept in an Artificial Insemination Centre were divided into three groups: Young Group (1.8 to 2 years), Adult Group (3.5 to 7 years) and Senile Group (8 to 14.3 years). The ejaculates were frozen in accordance with established standards of the Artificial Insemination Centre. The thawed semen samples were evaluated with toluidine blue, which analyzes the chromatin condensation and sperm head morphometry simultaneosly, chromomicin A3 (CMA3) to analyze the protamination and in vitro embryo production to analyze the embryonic development. The toluidine blue was evaluated by optical microscopy and the CMA3 by flow cytometry. Semen analyses revealed that spermatozoa of young bulls had higher values of area (A), perimeter (P) and width (W) when compared to adults and senile (Young: A = 1848.5 ± 119.79, P = 10. 23 ± 0.29, W = 1.95 ± 0.1; Adults: A = 1672.9 ± 104.46, P = 9.86 ± 0.33, W = 1.81 ± 0.06; Senile: A = 1723.1 ± 124.41, P = 9.97 ± 0.33, W = 1.83 ± 0.09; P<0.0001) and had higher protamination deficiency when analyzed with CMA3 (Young: 1.57 ± 0.76, Adults: 1.09 ± 0.63, Senile: 0.90 ± 0.59, P<0.05). Variable size (A, P, W) and sperm protamination evaluated by CMA3 showed negative correlation with age and a positive with ellipticity (P<0.05). Spermatozoa with abnormal chromatin obtained larger area when compared to those with normal chromatin (P<0.0001). There was no significant difference in IVP using semen with higher and lower altered chromatin condensation, evidencing that the proportion of spermatozoa with abnormal chromatin (4 to 16.15%) did not affect the embryonic development. Our results indicate that sperm head of young bulls are ... / Mestre

Orientador: José Luiz Laus / Coorientador: Alvio Isao Shiguematsu / Banca: Andreia Vitor Couto do Amaral / Banca: Antonio Carlos Alessi / Banca: Jayter Silva de Paula / Banca: Noeme Sousa Rocha / Resumo: A córnea atua como principal elemento refrativo do olho, para tal tem que manter-se transparente. O endotélio corneal é um peça chave para essa manutenção, possuindo mecanismos como a bomba de Na+ e K+ que ajudam a garantir a desturgescência corneal. Descompensações endoteliais constituem uma importante indicação de transplante da córnea, uma vez que as células endoteliais corneais apresentam limitada capacidade proliferativa. Entretanto, transplantes são procedimentos cirúrgicos complicados e de elevado custo. Alternativas e coadjuvantes medicamentosos vêm sendo estudadas. O fucoidam é uma substância que, dentre outras propriedades, promove migração e proliferação celular, portanto objetivou-se, com a presente pesquisa, avaliar seus efeitos sobre a morfologia, a ploidia e o metabolismo de células endoteliais da córnea de coelhos, após criolesão experimental. Para tal, foram realizadas avaliações quanto à morfologia e viabilidade celular empregando-se dupla marcação com corantes vitais (alizarina vermelha e azul de tripan) e ultraestrutural pela microscopia eletrônica de transmissão e de varredura. Outrossim, avaliou-se a morfometria in vivo e in vitro de seguintes parâmetros: número de células, densidade, hexagonalidade e coeficiente de variação celulares. Estudou-se o metabolismo dessas células empregando-se a imunofluorescência com observação em confocal dos anticorpos Ki-67, Na+K+/ATPase, n-Caderina e Zo-1, conjugados com Alexafluor-488. Visando-se a conseguirem conhecime... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The cornea as the main refractive element of the eye, which has to remain transparent. The corneal endothelium is a key piece for this maintenance, having mechanisms such as the Na + and K + pump that help to ensure corneal dysurgescence. Endothelial decompensations are an important indication for corneal transplantation, since the corneal endothelial cells have limited proliferative capacity. However, transplants are complicated and expensive surgical procedures. Alternatives and drug coadjuvants have been studied. Fucoidam is a substance that, among other properties, promotes cell migration and proliferation, therefore, the objective of this research was to evaluate its effects on the morphology, ploidy and metabolism of rabbit cornea endothelial cells after experimental cryoinjury. For this, evaluations were made for morphology and cell viability using double labeling with vital dye (alizarin red and tripan blue) and ultrastructural analysis by transmission and scanning electron microscopy. Morphometry (in vivo and in vitro) of the following parameters were also evaluated: cell number, cell density, hexagonality and coefficient of variation. The metabolism of these cells was studied using immunofluorescence with confocal observation of the Ki-67, Na + K + / ATPase, n-Caderin and Zo-1 antibodies, conjugated to Alexafluor-488. In order to obtain additional knowledge regarding the nuclear activity during the healing process of the corneal endothelium in the presence of fucoidam were analyzed, from the feulgen reaction, nuclear perimeter and area, in addition to the chromatin supraorganization. Cryoinjury resulted in worsening of all morphometric parameters, with cell decrease, cell density, the percentage of standard cells with 6 sides and increase in coefficient of variation, the recovery to normal values with time was better in eyes tre... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Os cromossomos politênicos da glândula salivar dos dípteros proporcionam condições excepcionalmente favoráveis à observação, em microscopia óptica, da estrutura da cromatina bem como da atividade gênica. Neste trabalho, a distribuição de modificações epigenéticas e de marcadores associados à atividade de transcrição foi estudada em cromossomos politênicos de larvas Rhynchosciara americana em condições normais de crescimento e também submetidas a tratamentos que levam ao estresse, um dos quais (anestesia por éter dietílico) realizado pela primeira vez nesta espécie. Na recuperação do estresse por anestesia, o locus do gene hsp70 apareceu transcricionalmente ativo embora, frequentemente, a marcação de RNA polimerase II não ocupava todo o volume do pufe como ocorre usualmente na resposta ao estresse por choque térmico, sugerindo descondensação parcial do locus. A localização cromossômica da proteína Sex-lethal, postulada como um fator de splicing genérico em espécies da família Sciaridae, foi estudada pela primeira vez em larvas submetidas ao estresse. A ausência da mesma em loci cromossômicos que estão ativos em transcrição em condições estressantes sugere que Sex-lethal não seja um fator de splicing genérico. Além disto, a localização desta proteína em regiões transcricionalmente inativas durante o estresse sugere que Sex-lethal cumpra funções ainda não descritas. Entre os dados de localização de histona H3 metilada em lisina 4, marcador epigenético usualmente associado à transcrição, destacou-se a forte marcação de uma região particular dentro da secção cromossômica A-9. Esta região, entretanto, apresenta sinais muito fracos de anti-híbrido DNA/RNA e de RNA polimerase II, sugerindo atividade transcricional muito baixa ou ausente. Observou-se também que o marcador epigenético conservado de heterocromatina, H3me3K9 (histona H3 trimetilada em lisina 9), não está presente na mesma; mas, por outro lado, detectou-se na região sinal significativo da proteína da heterocromatina de Sciara coprophila. Com o objetivo de conhecer sequências de DNA presentes na região, foi produzida uma biblioteca plasmidial produzida a partir de microdissecção cromossômica do sub-setor de A-9 seguida de DOP-PCR. O produto de amplificação foi usado como sonda em hibridação in situ e marcou, além da região microdissecada, extremidades cromossômicas não centroméricas, indicando que estas regiões compartilham sequências repetitivas. Algumas puderam ser identificadas após o seqüenciamento, tais como repetições em tandem e elementos genéticos móveis enquanto que outras não apresentaram similaridade significativa com sequências disponíveis em bancos de dados. Os dados obtidos sugerem que o sub-setor de A-9 analisado assemelha-se à heterocromatina, porém composta de uma combinação aparentemente não usual de marcadores epigenéticos / Polytene chromosomes of dipteran salivary glands provide optimal visualization of chromatin structure as well as gene activity at the cytological level. In this work, the distribution of epigenetic and transcription-associated markers was studied in polytene chromosomes of Rhynchosciara Americana larvae, either under during normal growth or stressful treatments, one of which (anaesthesia by ether) has been observed for the first time in this species. During the recovery from the anesthesia, the hsp70 gene locus was transcriptionally active although RNA polymerase II detection did not occupied the entire volume of the puff -as usually happens during the heat shock response-, suggesting partial puff decondensation. The chromosomal localization of the sciarid Sex-lethal protein, which was supposed to be a general splicing factor, was studied for the first time in stressed larvae and was not detected in transcriptionally active loci. Hence, the Sex-lethal protein may not be a general splicing factor. Moreover, Sex-lethal localization in transcriptionally inactive regions during stress situations suggests it plays still unknown roles. Antibodies to histone H3 methylated at lysine 4 -an epigenetic marker of transcription- labeled strongly at a particular region within chromosome section A-9. This region, in contrast, displays very low levels of both DNA/RNA hybrid and RNA polymerase II, suggesting, if any, poor transcriptional activity. Interestingly, the conserved epigenetic heterochromatin marker H3me3K9 (histone H3 trimethylated at lysine 9) is not significantly present in this region, even though the Sciara coprophila heterochromatin protein was clearly detected. In order to sample DNA sequences contained in this region, a plasmid library was produced by performing a microdissection of A-9 sub-section followed by DOP-PCR. The total microdissection product was used as a probe, and hybridized, in addition to the microdissected region, to non-pericentric chromosome ends, indicating that repetitive sequences are shared by these regions. Some sequences could be identify, after sequencing, such as tandem repeats and mobile elements, but others failed to display significant similarity to sequences deposited in databases. The results suggest that the sub-section analyzed resembles heterochromatin but being composed of an apparently unusual combination of epigenetic markers

Orientador: Valeria Valente / Banca: Ana Lucia Fachin Saltoratto / Banca: Cleverton Roberto de Andrade / Resumo: O câncer é um conjunto de alterações celulares que favorecem a proliferação descontrolada e a aquisição de propriedades metastáticas. A ativação de oncogenes e/ou a perda de genes supressores tumorais leva a desbalanços nos mecanismos de controle do ciclo celular e/ou na inativação das vias apoptóticas, contribuindo para a instabilidade genômica presente em todos os tipos tumorais. Relatos na literatura têm sugerido que o estresse replicativo oriundo desse aumento proliferativo exacerbado é um fator importante na formação e progressão de muitos tipos de câncer. Dentro dessa perspectiva, é plausível pensar que as células tumorais tenham desenvolvido certas competências que as permitam lidar com o estresse replicativo para continuar se propagando. Resultados prévios de nosso laboratório sugerem que a proteína centromérica HJURP (Holliday Junction Recognizing Protein) esteja envolvida nesse ganho de competência. Dessa forma, esse trabalho teve como objetivo a análise do papel dessa proteína frente ao estresse replicativo em linhagens de glioblastoma. Nossos resultados demonstraram que a superexpressão de HJURP confere um aumento na capacidade proliferativa celular da linhagem U87MG. Além disso, vimos que em baixas concentrações de camptotecina as células superexpressoras de HJURP possuíam um comportamento proliferativo muito semelhante à condição não tratada. Os ensaios de citotoxicidade revelaram uma maior capacidade de recuperação frente ao estresse replicativo exógeno nas sit... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cancer is characterized by a subset of features that supports uncontrolled cell proliferation and acquisition of metastatic properties. Oncogene activation and/ or the deactivation of tumor suppressor genes lead to disbalances in cell cycle control progression and/or inactivation of apoptotic pathways, followed by genomic instability present in all types of tumors. According to the literature, replicative DNA stress arising from uncontrolled cell growth is the major driver in the development and progression of many cancers. In this perspective, it is believed that cancer cells have developed some skills in order to deal with high levels of endogenous replicative stress for their continued proliferation. Previous results from our group suggest that the centromeric protein HJURP (Holliday Junction Recognizing Protein) is involved in this mechanism. Thus, in this work, we aimed to analyze the role of this protein in the cellular response to the replicative stress in glioblastoma U87MG cell line. Our data showed that cells who levels of HJURP were high, had an increase in cell growth. Besides that, we also observed that at lower camptothecin concentrations the curve proliferation of overexpressed HJURP cells had a similar behavior as the control cells. The cytotoxicity results demonstrated that cells overexpressing HJURP had a better replicative induced stress when compared to the control cells. Together, this data suggests... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre