El treball realitzat en aquesta Tesi consisteix en l'anàlisi de diferents mecanismes que participen en la regulació de les activitats HAT i HDAC cel·lulars. Podríem distingir dos tipus de modulació d'aquestes activitats: (1) senyals extracel·lulars- antigen T, (2) senyals intracel·lulars- mitosi. Es coneix que aquests dos processos tenen respostes per part de la cèl·lula a nivell de cromatina. A grans trets, en els capítols 1A i 1B es presenten dos treballs que tenen com a objectiu l'estudi de l'antigen T quan interacciona amb l'acetiltransferasa CBP i la desacetilasa HDAC1. D'altra banda, en el capítol 2 s'ha analitzat l'establiment de diversos patrons de modificacions posttraduccionals de les histones per al manteniment de l'activitat transcripcional dels gens quan la cèl·lula entra a Mitosi. Per últim, en el capítol 3 es presenta un altre tipus de regulació d'aquestes activitats, l'autoacetilació de l'acetiltransferasa PCAF. Així doncs, tres mecanismes diferents per al control d'unes activitats molt importants per la cèl·lula eucariota, que són crucials per al manteniment de l'equilibri acetilació i desacetilació de la cromatina.1. L'antigen T de SV40 modula les activitats acetiltransferasa i desacetilasa d'histones.Les acetiltransferases i desacetilases d'histones juguen un paper clau en l'activació de la transcripció gènica, la proliferació i diferenciació cel·lulars modulant l'estructura de la cromatina; no obstant, es coneixen poques coses de la seva pròpia regulació. En el treball que es presenta al capítol 1A, s'ha analitzat la regulació de les activitats acetiltransferasa de cèl·lules CV1 i de cèl·lules CV1COS. A nivell global l'antigen T incrementa l'acetilació de les histones i l'activació de les activitats enzimàtiques que regulen aquesta modificació (HATs) (Figures 1 i 2). L'activitat acetiltransferasa de CBP és superior en les cèl·lules que expressen l'antigen T. D'altra banda, l'existència de la interacció entre l'antigen T i CBP (interacció descrita a la literatura {Avantaggiati, 1996 #39; Eckner, 1996 #24}) modula positivament la capacitat de l'acetiltransferasa d'activar la transcripció gènica del promotor pGal4-Hsp70-luciferasa (Figura 5). El capítol 1B aborda les conseqüències funcionals de la interacció entre l'antigen T i la desacetilasa d'histones HDAC1. La transcripció del promotor Timidina Quinasa quan és activat pel coactivador CBP, pateix una repressió transcripcional per acció de l'antigen T (Figura 1) com s'havia descrit anteriorment {Avantaggiati, 1996 #39; Eckner, 1996 #24}. Aquesta repressió transcripcional suggereix la presència d'un complex repressor amb activitat desacetilasa. En els experiments de transfeccions transitòries utilitzant TSA s'observa una desrepressió de l'activitat transcripcional d'aquest promotor (Figura 2). Paral·lelament, els nostres resultats demostren que l'antigen T interacciona in vitro amb HDAC1 (Figura 4). En aquest capítol es fa palesa la versatilitat de la proteïna viral, al poder participar en la regulació de dues activitats cel·lulars oposades.2. Paper de les modificacions de les histones en la senyalització i l'activació dels gens durant Mitosi.S'havia descrit que durant la mitosi, hi ha una inhibició de la transcripció de forma generalitzada {Prescott, 1962 #390}, tot i així, hi ha alguns promotors que mantenen llocs d'hipersensibilitat a la DNasa I o al KMNO4 {Michelotti, 1997 #414}. Les modificacions post-traduccionals de les histones sorgeixen com a candidates al marcatge dels gens durant la mitosi {Jeppesen, 1997 #360; Kouskouti, 2005 #264}. En l'anàlisi global de les modificacions de les histones relacionades amb l'activació transcripcional: acetilació de H3 (K9, k14) i H4 (K5, K8, K12, K16) o dimetilació i trimetilació de la histona H3K4, es va observar que aquests senyals es mantenen units als cromosomes mitòtics (Figura 1). En l'anàlisi local de tres tipus de gens es va poder observar que tant l'acetilació de H3 i H4 com la metilació de H3K4 eren marques que es mantenien als promotors i gens de GAPDH i Hsp70 (constitutiu i induïble). L'anàlisi del gen de la Ciclina B1, actiu durant mitosi determina que l'activació transcripcional d'aquest gen estava relacionada amb un augment en la di- i la trimetilació de H3K4 (Figura 5). / "REGULATION OF HAT AND HDAC ACTIVITIES IN RESPONSE TO INTRACELLULAR AND EXTRACELLULAR SIGNALS"Mitosis is a critical phase of the cell cycle: genetic information has to divide and to be transmitted into the daughter cells. Therefore, chromosomes are highly condensed, and the most cellular transcriptional activity becomes repressed.Histone acetylation is a dynamic process that is regulated by two classes of enzymes, the histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs). These two activities are implicated in remodeling chromatin, so they become very important during mitosis. In the last few years accumulating evidence have shown HATs and HDACs activities as key enzymes on transcriptional activity of genes. These enzymes gain great importance immediately after exit mitosis, when transcriptional activity recovers. What's about these enzymes during mitosis? Do they become inactive? Are they displaced from chromatin or do they remain bound to it?In this work we have analyzed the global localization, subcellular distribution and activity of these enzymes during mitosis. Finally we have studied the acetylation and methylation levels on promoters and coding regions of selected genes during mitosis. The results show that the basal levels of acetylation are maintained at the promoters during mitosis.

Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-30Bitstream added on 2015-04-09T12:48:26Z : No. of bitstreams: 1 000815808.pdf: 368367 bytes, checksum: 730f4d89fb923e167df061884d63fd71 (MD5) / O objetivo deste estudo foi avaliar o empacotamento da cromatina e morfometria da cabeça de espermatozoides criopreservados de touros Bos taurus indicus da raça Nelore de diferentes idades e a influência do grau de compactação da cromatina na produção in vitro de embriões (PIV). Foram utilizados 40 animais mantidos em centro de coleta e processamento de sêmen (CCPS) e distribuídos em três grupos: Grupo Jovens (entre 1,8 e 2 anos), Grupo Adultos (entre 3,5 e 7 anos) e Grupo Senis (entre 8 e 14,3 anos). Os ejaculados foram congelados de acordo com os padrões pré-estabelecidos do CCPS. Utilizou-se a coloração de azul de toluidina, que permite a avaliação simultânea da cromatina e morfometria da cabeça espermática, a cromomicina A3 (CMA3) para analisar a protaminação espermática e a PIV para o desenvolvimento embrionário. O azul de toluidina foi avaliado pela microscopia óptica e a CMA3 pelo citômetro de fluxo. Na PIV foram realizadas quatro repetições por grupo, com 25 a 30 oócitos em cada repetição. A análise seminal revelou que espermatozoides de touros jovens obtiveram maiores valores de área (A), perímetro (P) e largura (L) quando comparados a adultos e senis (Jovens: A=1848,5±119,79, P=10,23±0,29, L=1,95±0,1; Adultos: A=1672,9±104,46, P=9,86±0,33, L=1,81±0,06; Senis: A=1723,1±124,41, P=9,97±0,33, L=1,83±0,09; P<0,0001) e apresentaram maior deficiência de protaminação quando analisado pela CMA3 (Jovens: 1,57±0,76; Adultos: 1,09±0,63, Senis: 0,90±0,59; P<0,05). Da mesma forma, variáveis de tamanho (A, P, L) e protaminação espermática, avaliado pela CMA3, obtiveram correlação negativa com a idade e positiva com a elipsidade (P<0,05). Espermatozoides com anormalidades na cromatina obtiveram maior área quando comparado àqueles sem alteração de cromatina (P<0,0001). Não houve diferença significativa na PIV quando sêmen com maior e menor parcela de alteração de cromatina foi ... / The aim of this study was to evaluate chromatin condensation and sperm head morphometry of cryopreserved semen samples from Bos taurus indicus bulls of different ages and the influence of the degree of chromatin condensation on in vitro embryo production (IVP). A total of 40 animals kept in an Artificial Insemination Centre were divided into three groups: Young Group (1.8 to 2 years), Adult Group (3.5 to 7 years) and Senile Group (8 to 14.3 years). The ejaculates were frozen in accordance with established standards of the Artificial Insemination Centre. The thawed semen samples were evaluated with toluidine blue, which analyzes the chromatin condensation and sperm head morphometry simultaneosly, chromomicin A3 (CMA3) to analyze the protamination and in vitro embryo production to analyze the embryonic development. The toluidine blue was evaluated by optical microscopy and the CMA3 by flow cytometry. Semen analyses revealed that spermatozoa of young bulls had higher values of area (A), perimeter (P) and width (W) when compared to adults and senile (Young: A = 1848.5 ± 119.79, P = 10. 23 ± 0.29, W = 1.95 ± 0.1; Adults: A = 1672.9 ± 104.46, P = 9.86 ± 0.33, W = 1.81 ± 0.06; Senile: A = 1723.1 ± 124.41, P = 9.97 ± 0.33, W = 1.83 ± 0.09; P<0.0001) and had higher protamination deficiency when analyzed with CMA3 (Young: 1.57 ± 0.76, Adults: 1.09 ± 0.63, Senile: 0.90 ± 0.59, P<0.05). Variable size (A, P, W) and sperm protamination evaluated by CMA3 showed negative correlation with age and a positive with ellipticity (P<0.05). Spermatozoa with abnormal chromatin obtained larger area when compared to those with normal chromatin (P<0.0001). There was no significant difference in IVP using semen with higher and lower altered chromatin condensation, evidencing that the proportion of spermatozoa with abnormal chromatin (4 to 16.15%) did not affect the embryonic development. Our results indicate that sperm head of young bulls are ...

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Artes, Programa de Pós-graduação em Arte, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-01-21T19:36:21Z No. of bitstreams: 1 2015_GabrielaGuimarãesStarlingdeSouza.pdf: 2940956 bytes, checksum: 71e943bac17000987e03035c2ed1db29 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-04-13T21:29:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_GabrielaGuimarãesStarlingdeSouza.pdf: 2940956 bytes, checksum: 71e943bac17000987e03035c2ed1db29 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-13T21:29:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_GabrielaGuimarãesStarlingdeSouza.pdf: 2940956 bytes, checksum: 71e943bac17000987e03035c2ed1db29 (MD5) / A presente dissertação é o resultado de um aprofundamento nos aspectos processuais e conceituais de minha pesquisa artística, a qual aborda a pintura sob o enfoque espacial, matérico e cromático. A investigação de procedimentos como a colagem e a assemblage tornam-se pertinente pela ênfase dada aos procedimentos de montagem e combinação de materiais provenientes de diversos contextos. O conceito de bricolagem formulado pelo antropólogo Claude Lévi-Strauss (1962) e trazido para o contexto das artes plásticas pelo semioticista Jean-Marie Floch complementa o aspecto conceitual da colagem e da assemblage como estratégias de reconstrução de significados. A semiótica visual, que tem como referência o autor A. J. Greimas (1984), é um dos pilares teóricos desse trabalho, o qual aborda a obra de arte como um texto e privilegia o fazer interpretativo e o ponto de vista do sujeito na construção do objeto de pesquisa. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This dissertation is the result of an in-depth analysis of the procedural aspects and conceptual aspects of my artistic research, which addresses the paint under the focus space, material and color. The research procedures such as collage and assemblage become relevant by the emphasis given to assembly procedures and combination of materials from different contexts. The concept of bricolage formulated by anthropologist Claude Levi-Strauss (1962) and brought to the context of the arts by semiotician Jean-Marie Floch complements the conceptual aspect of bonding and the assemblage as strategies for reconstruction of meanings. The Visual Semiotics, which has as a reference the author A. J. Greimas (1984), is one of the pillars of this theoretical work, which deals with the work of art as a text and favors make interpretative and the point of view of the subject in the construction of the research object.

Orientador: José Luiz Laus / Coorientador: Marcela Aldrovani / Banca: Cristiane dos Santos Honsho / Banca: Ivan Ricardo Martinez Pádua / Resumo: Alterações na organização estrutural da cromatina estão sendo associadas ao desenvolvimento e à fisiopatologia de diversas afecções oftálmicas. Com o advento da epigenética, emergiu o conceito de que parte dessas alterações pode ser revertida por fármacos. Visando-se avaliar a organização estrutural da cromatina em células da conjuntiva palpebral de cães com ceratoconjuntivite seca (CCS), antes e após tratamento com pomada de ciclosporina A (CsA) 0,2%, a presente pesquisa foi dividida em duas fases. Na fase I estudaram-se núcleos de células epiteliais e de linfócitos colhidos da conjuntiva palpebral de cães com e sem CCS. Foram incluídos na pesquisa 64 olhos de 32 cães domésticos, distribuídos em dois grupos: grupo controle, composto por 16 cães saudáveis (32 olhos, valores de Schirmer ≥ 15 mm/min); grupo CCS, abrangendo 16 cães (32 olhos, valores de Schirmer ≤ 10 mm/min) com CCS bilateral nunca antes tratados com imunomoduladores, sem oftalmopatias concorrentes e livres de alterações sistêmicas. As células foram colhidas por citologia esfoliativa e coradas pela reação de Feulgen. Os seguintes parâmetros foram estudados por vídeo-análise de imagens: área nuclear, perímetro nuclear, fator de circularidade relativa do núcleo (RNRF), densidade óptica integrada (IOD = conteúdo de DNA), densidade óptica (OD = compactação de cromatina); e desvio padrão de valores densitométricos (SDtd = textura de cromatina). Os resultados mostraram que a CCS enseja alterações nos parâmetros nuclea... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Changes in the structural organization of chromatin are being associated with the development and pathophysiology of various ophthalmic conditions. With the advent of epigenetics, the concept emerged that part of these alterations can be reversed by drugs. To evaluate the structural organization of chromatin in palpebral conjunctival cells of dogs with keratoconjunctivitis sicca (KCS), before and after treatment with 0.2% cyclosporine A (CsA) ophthalmic ointment, the present research was divided into two phases. In stage I, epithelial cells and lymphocyte from the palpebral conjunctiva of dogs with and without KCS were studied. The study included 64 eyes of 32 domestic dogs, distributed into two groups: control group, composed of 16 healthy dogs (32 eyes, Schirmer values ≥ 15 mm / min); KCS group, formed of 16 dogs (32 eyes, Schirmer values ≤ 10 mm / min) with bilateral CCS never previously treated with immunomodulatory drugs, and without concurrent ophthalmic or systemic disorders. Cells were collected by brush cytology and stained by the Feulgen reaction. The following parameters were studied by video image analysis: nuclear area, nuclear perimeter, relative nuclear roundness factor (RNRF), integrated optical density (IOD = DNA content), optical density (OD = chromatin compaction). The results showed that KCS causes alterations in the nuclear parameters of the epithelial cells and the lymphocytes from the palpebral conjunctiva. Compared with the control, the epithelial cell... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Os cromossomos politênicos da glândula salivar dos dípteros proporcionam condições excepcionalmente favoráveis à observação, em microscopia óptica, da estrutura da cromatina bem como da atividade gênica. Neste trabalho, a distribuição de modificações epigenéticas e de marcadores associados à atividade de transcrição foi estudada em cromossomos politênicos de larvas Rhynchosciara americana em condições normais de crescimento e também submetidas a tratamentos que levam ao estresse, um dos quais (anestesia por éter dietílico) realizado pela primeira vez nesta espécie. Na recuperação do estresse por anestesia, o locus do gene hsp70 apareceu transcricionalmente ativo embora, frequentemente, a marcação de RNA polimerase II não ocupava todo o volume do pufe como ocorre usualmente na resposta ao estresse por choque térmico, sugerindo descondensação parcial do locus. A localização cromossômica da proteína Sex-lethal, postulada como um fator de splicing genérico em espécies da família Sciaridae, foi estudada pela primeira vez em larvas submetidas ao estresse. A ausência da mesma em loci cromossômicos que estão ativos em transcrição em condições estressantes sugere que Sex-lethal não seja um fator de splicing genérico. Além disto, a localização desta proteína em regiões transcricionalmente inativas durante o estresse sugere que Sex-lethal cumpra funções ainda não descritas. Entre os dados de localização de histona H3 metilada em lisina 4, marcador epigenético usualmente associado à transcrição, destacou-se a forte marcação de uma região particular dentro da secção cromossômica A-9. Esta região, entretanto, apresenta sinais muito fracos de anti-híbrido DNA/RNA e de RNA polimerase II, sugerindo atividade transcricional muito baixa ou ausente. Observou-se também que o marcador epigenético conservado de heterocromatina, H3me3K9 (histona H3 trimetilada em lisina 9), não está presente na mesma; mas, por outro lado, detectou-se na região sinal significativo da proteína da heterocromatina de Sciara coprophila. Com o objetivo de conhecer sequências de DNA presentes na região, foi produzida uma biblioteca plasmidial produzida a partir de microdissecção cromossômica do sub-setor de A-9 seguida de DOP-PCR. O produto de amplificação foi usado como sonda em hibridação in situ e marcou, além da região microdissecada, extremidades cromossômicas não centroméricas, indicando que estas regiões compartilham sequências repetitivas. Algumas puderam ser identificadas após o seqüenciamento, tais como repetições em tandem e elementos genéticos móveis enquanto que outras não apresentaram similaridade significativa com sequências disponíveis em bancos de dados. Os dados obtidos sugerem que o sub-setor de A-9 analisado assemelha-se à heterocromatina, porém composta de uma combinação aparentemente não usual de marcadores epigenéticos / Polytene chromosomes of dipteran salivary glands provide optimal visualization of chromatin structure as well as gene activity at the cytological level. In this work, the distribution of epigenetic and transcription-associated markers was studied in polytene chromosomes of Rhynchosciara Americana larvae, either under during normal growth or stressful treatments, one of which (anaesthesia by ether) has been observed for the first time in this species. During the recovery from the anesthesia, the hsp70 gene locus was transcriptionally active although RNA polymerase II detection did not occupied the entire volume of the puff -as usually happens during the heat shock response-, suggesting partial puff decondensation. The chromosomal localization of the sciarid Sex-lethal protein, which was supposed to be a general splicing factor, was studied for the first time in stressed larvae and was not detected in transcriptionally active loci. Hence, the Sex-lethal protein may not be a general splicing factor. Moreover, Sex-lethal localization in transcriptionally inactive regions during stress situations suggests it plays still unknown roles. Antibodies to histone H3 methylated at lysine 4 -an epigenetic marker of transcription- labeled strongly at a particular region within chromosome section A-9. This region, in contrast, displays very low levels of both DNA/RNA hybrid and RNA polymerase II, suggesting, if any, poor transcriptional activity. Interestingly, the conserved epigenetic heterochromatin marker H3me3K9 (histone H3 trimethylated at lysine 9) is not significantly present in this region, even though the Sciara coprophila heterochromatin protein was clearly detected. In order to sample DNA sequences contained in this region, a plasmid library was produced by performing a microdissection of A-9 sub-section followed by DOP-PCR. The total microdissection product was used as a probe, and hybridized, in addition to the microdissected region, to non-pericentric chromosome ends, indicating that repetitive sequences are shared by these regions. Some sequences could be identify, after sequencing, such as tandem repeats and mobile elements, but others failed to display significant similarity to sequences deposited in databases. The results suggest that the sub-section analyzed resembles heterochromatin but being composed of an apparently unusual combination of epigenetic markers

Foi estudado a influência das estações não reprodutiva e reprodutiva, dos crioprotetores glicerol e etilenoglicol e do processo de congelação e descongelação sobre a motilidade, o vigor, a morfologia e o complexo DNA-proteína de espermatozóides em garanhões, comparando o sêmen fresco, o exposto a congelação e descongelação sem crioprotetores, o exposto aos crioprotetores sem congelação e o exposto aos crioprotetores com congelação e descongelação. Foram utilizados seis garanhões da raça Mangalarga Paulista, colhendo 12 ejaculados de cada animal na estação não reprodutiva (1) e 12 ejaculados na estação reprodutiva (2), analisando a motilidade, o vigor, a concentração, a morfologia e a patologia do complexo DNA-Proteína. A patologia do complexo DNA-Proteína foi avaliada em sêmen fixado com etanol-ácido-acético glacial 3:1 (v/v), tratado com HCL 4N a 25oC e corado com azul de toluidina a 0,025% em tampão Mcllvaine, empregando microscopia óptica com aumento de 1000x. Os resultados mostraram que a motilidade, o vigor, a morfologia e a anomalia do complexo DNA-Proteína dos espermatozóides diferem entre os grupos congelado e não congelado (P<0,05). Para o grupo fresco, a taxa de patologia do complexo DNA-Proteína apresentou diferença significativa (P<0,05) entre as estações 1 e 2. O processo de congelação e descongelação exerce influência negativa sobre o complexo DNA-Proteína de espermatozóides em garanhões. / To study the effects of freezing and thawing on DNA-protein complexes in spermatozoa, 12 ejaculate were collected from each of 6 stallions (Mangalarga Paulista breed) in each of two consecutive breeding seasons. Motility, vigor, concentration, morphology and incidence of the DNA-protein complex pathologies of spermatozoa were evaluated and compared among fresh semen, semen expose to freezing and thawing without cryoprotectants and semen exposed to the cryoprotectors glycerol and ethylene glycol left at room temperature or frozen. Incidence of the DNA-protein complex pathologies was evaluated in semen smear fixed in na ethanol-acetic-acid mixture (3:1, v/v) for 1 minute, washed in 70% ethanol for 3 minutes and air dried. To induce nuclear metachromasy, smears were treated with 4N HCL at 25ot for 20 minutes followed by rinsing in distilled water. Preparation were stained with a 0.025% toluidine blue solution in Mailvaine buffer for 15 minutes. Frequency of spermatozoa exhibiting nuclear metachromasy was determined in 1000 cells/animal by light microscopy at 1000X magnification. Motility, vigor, morphology and DNA-protein complex pathologies of spermatozoa were different for semen frozen compared to not frozen (P<0.05). For fresh semen, there were effects of seasons on the incidence of DNA-protein complex pathologies (P<0.05) For semen frozen without cryoprotectants there were significant effects seasons (P<0.05) The process of cryopreservation and thawing influences negatively the DNA-protein complexes in stallion spermatozoa.

Galectina-3 é uma lectina animal que apresenta afinidade por b- galactosídeos e que tem sido associada à progressão tumoral e metástase. A expressão de galectina-3 encontra-se alterada durante a progressão tumoral de diferentes neoplasias. Em tumores como carcinoma de tiróide e bexiga a expressão de galectina-3 encontra-se aumentada, enquanto que em tumores como carcinoma de mama e ovário a expressão desta lectina encontra-se diminuída. Neste trabalho nós utilizamos um modelo de progressão tumoral de melanoma murino para investigar os mecanismos envolvidos na perda de expressão de galectina-3. Este modelo é composto por uma linhagem de melanócitos imortalizados (melan-a) e duas linhagens de melanoma de crescimento vertical (Tm1 e Tm5) estabelecidas após submeter a linhagem melan-a a inúmeros ciclos de de-adesão. Enquanto melan-a acumula grandes quantidades de galectina-3, as linhagens Tm1 e Tm5 deixaram de expressar o gene de galectina-3. Análise da região 5\' do gene de galectina-3 demonstrou que esta região apresentava grande conteúdo de dinucleotídeos CpG e vários sítios SP1. O seqüenciamento desta região após tratamento do DNA com bissulfito de sódio mostrou que esta região estava totalmente metilada nas linhagens Tm1 e Tm5 e desmetilada na linhagem melan-a. O tratamento da linhagem Tm1 com 5-Aza-2\'-deoxicitidina (5-Aza-CdR), um inibidor da DNA metiltransferase, provocou um decréscimo significativo nos níveis de metilação da região 5\' do gene de galectina-3 que por sua vez levou a re-expressão do RNAm e da proteína. O tratamento de Tm1 com os inibidores de histono deacetilases tricostatina A e 4-ácido-fenilbutírico em combinação com 5-Aza-CdR não aumentou os níveis de expressão do gene de galectina-3 e curiosamente, reverteu o efeito induzido por 5-Aza-CdR. Em adição, a expressão da enzima DNMT1 apresentou um discreto aumento nas linhagens Tm1 e Tm5 em relação a melan-a. Em conjunto esses resultados sugerem que mecanismos epigenéticos como a metilação estão envolvidos no controle de expressão do gene de galectina- 3 ao longo da progressão tumoral de melanoma murino. / Galectin-3 is a b-galactoside-binding animal lectin, shown to be involved in tumor progression and metastasis. Galectin-3 expression has been found altered along tumor progression of different tumors. In some types of cancers such as thyroid carcinoma and bladder carcinoma, galectin-3 expression has been found increased, whereas in tumors such as breast carcinoma and ovary carcinoma the expression of this lectin has been found decreased along tumor progression. In this study, we have used a murine melanoma model to investigate the mechanisms responsible for the loss of galectin-3 gene expression. This model consists of a cell line of immortalized melanocytes (melan-a) and two cell lines of vertical growth phase melanoma (Tm1 and Tm5) established after submitting melan-a cells to several deadhesion cycles. While melan-a expressed high amounts of galectin-3, both Tm1 and Tm5 cells lost galectin-3 gene expression. Analysis of the 5\' upstream region of the galectin-3 gene demonstrated the presence of a high CpG content and several SP1 binding sites. Bisulfite sequencing of this region showed that it was fully methylated in Tm1 and Tm5 cells and unmethylated in melan-a cells. Treatment of Tm1 cells with 5-aza-2\'-deoxycytidine (5-Aza-CdR), a DNA methyltransferase inhibitor, led to a marked decrease in the methylation levels of the 5\' upstream region of the galectin-3 gene, which led to transcription of the galectin-3 gene. Treatment of Tm1 cells with the histone-deacetylase inhibitors trichostatin A and 4- acid-phenilbutyrate in combination with 5-Aza-CdR did not increase the levels of galectin-3 gene expression and intriguingly, reverted the effect of 5-Aza-CdR alone. In addition, the expression of DNMT1 showed a modest, but significant increase in Tm1 and Tm5 cells as compared with melan-a cells. Altogether these results indicate that epigenetic mechanisms such as methylation play a role in the regulation of the galectin-3 gene expression along murine melanoma progression.

Submitted by Izabella Pazzoto Alves null (izapazzoto@hotmail.com) on 2017-03-29T18:48:37Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado - Alves, IP 2017.pdf: 1322169 bytes, checksum: 9b200f325b4ed42b13b4e4aafcd85329 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-03-30T18:04:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alves_ip_me_jabo.pdf: 1322169 bytes, checksum: 9b200f325b4ed42b13b4e4aafcd85329 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-30T18:04:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alves_ip_me_jabo.pdf: 1322169 bytes, checksum: 9b200f325b4ed42b13b4e4aafcd85329 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A avaliação de espermatozoides em tecnologias de reprodução assistida raramente analisa a integridade do DNA, crucial para o desenvolvimento embrionário. A técnica do azul de toluidina permite identificar alterações da cromatina com avaliação concomitante da morfometria espermática. O método foi descrito em diversas espécies, mas ao conhecimento dos autores, ainda não foi relatado em gatos. O objetivo deste estudo foi verificar a aplicabilidade da técnica de coloração de azul de toluidina em avaliar as anormalidades de DNA de espermatozoides epididimários (cabeça, corpo e cauda) de gatos. Investigar ainda se houve correlação entre as variáveis: condensação do DNA, morfologia e morfometria da cabeça espermática. Para este propósito, os índices de alteração de DNA obtidos pela técnica de azul de toluidina e laranja de acridina foram comparados, observando correlação de 65,38% (p<0,001). A estabilidade da cromatina aumentou significativamente da região da cabeça (92,06%) do epidídimo para a cauda (97,94%, p=0,0023), mas não houve diferença entre as regiões do corpo e da cauda, demonstrando que os espermatozoides provenientes destas regiões já possuem maturidade reprodutiva. Não houve correlação entre a anormalidade do DNA e a morfologia espermática como nas demais espécies, mas sim com a morfometria. Observou-se diminuição significativa do tamanho da cabeça do espermatozoide durante a passagem pelas três regiões epididimárias (p < 0,0001). A porcentagem de espermatozoides com cromatina descondensada diminuiu significativamente da região da cabeça até a cauda do epidídimo (26,36%, 15,69%, 3,38%, respectivamente, p<0,0001). Assim, concluímos que existe correlação entre área da cabeça do espermatozoide felino e condensação da cromatina. / Sperm selection in assisted reproductive technologies rarely evaluates the DNA integrity, which is crucial to the embryo’s development. The toluidine blue technique allows identification of chromatin alterations, simultaneously with evaluation of sperm morphometry. The method has been described in many species, but to the authors’ knowledge, it has yet to be described in cats. The objective of this study was to verify the applicability of the toluidine blue technique in analyzing DNA abnormalities of epididymal sperm (caput, corpus and cauda) in cats and further investigating if there was correlation between the variables: DNA condensation, morphology and morphometry of the sperm head. For this purpose, the DNA alteration indexes obtained by both toluidine blue and acridine orange techniques were compared and a 65.38% (p < 0.001) correlation was observed. The chromatin stability increased significantly in the head region of the epididymis (92.06%) in relation to the cauda (97.94%, p = 0.0023), however there was no difference between the caput and cauda regions, which demonstrates that sperm coming from these region are already mature. There was no correlation between the DNA abnormality and the sperm morphology as observed in other species, however there was correlation to morphometry. A significant decrease of the sperm head size was observed during the passage of the three epididymal regions (p < 0.0001). The percentage of sperm with deficient chromatin condensation decreased significantly from caput region to cauda of the epididymis (26.36%, 15.69%, 3.38%, respectively, p < 0.0001). Therefore, the evaluation of sperm head size can predict the quality of chromatin condensation.

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-02-13T16:00:10Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rogério Orfaly Addad da Silva - 2006.pdf: 843452 bytes, checksum: 27a7d9be950071d5241ff583004bbe06 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-02-13T16:00:31Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rogério Orfaly Addad da Silva - 2006.pdf: 843452 bytes, checksum: 27a7d9be950071d5241ff583004bbe06 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-13T16:00:31Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rogério Orfaly Addad da Silva - 2006.pdf: 843452 bytes, checksum: 27a7d9be950071d5241ff583004bbe06 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2006-12-08 / Thirty six Nelore bulls with age between 30 and 120 months were used to evaluation of the seminal quality and the reproductive aptitude. The animals had been kept in extensive conditions, with feeding the grass, receiving mineral supplementation and serving a herd with 3,782 females of some categories (heifers and cows). Data enclosed measured of scrotal circumference and evaluation of the semen collected by eletroejaculation and evaluated the physical characteristics (volume, mass activity, motility, strong), morphologic (major, minor and total defects) and spermatic structure integrity (integrity of plasmatic membrane, acrosome and chromatin) in this period had been carried through that preceded three consecutive mating season (2003, 2004 and 2005). The data had been submitted analyze of variance, the averages compared for test SNK and the coefficient of correlation of Pearson was calculated using the SAS. The bulls presented scrotal circumference of 33.8 ± 2.8cm, 15.6 ± 8.5% of total spermatic defects, 40.1 ± 23.1% of gametes with normal membrane and acrosome and 8.8 ± 3.8% of fragmented chromatin. The relations between scrotal circumference, physical and morphologic characteristics, spermatic integrity and the reproductive performance of the herd had been low and not significant (P< 0.05). In sexually mature bulls the integrity of plasmatic membrane, acrosome and nuclear chromatin had not been the most frequent trouble of the spermatic morphology. / Foram utilizados 36 touros da raça Nelore com idade entre 30 e 120 meses, para avaliação da qualidade seminal e da aptidão reprodutiva. Os animais foram mantidos em condições extensivas, com alimentação a pasto, recebendo suplementação mineral e servindo um rebanho com 3782 fêmeas de várias categorias (novilhas, vacas primíparas e pluríparas). Foram realizadas colheitas de dados que abrangiam medidas de circunferência escrotal e avaliação do sêmen colhido por eletroejaculação e avaliadas as características físicas (volume, turbilhonamento, motilidade, vigor), morfológicas (defeitos maiores, menores e totais) e de integridade espermática (integridade de membrana plasmática, de acrossoma e de cromatina) no período que antecedeu três estações de monta consecutivas (2003, 2004 e 2005). Os dados foram submetidos a analise de variância, as médias comparadas pelo teste SNK e o coeficiente de correlação de Pearson foi calculado utilizando o SAS. Os touros apresentaram circunferência escrotal de 33,8 ± 2,8cm, 15,6 ± 8,5% de defeitos espermáticos totais, 40,1 ± 23,1% de gametas com membrana e acrossoma íntegros e 8,8 ± 3,8% de cromatina fragmentada. As relações entre circunferência escrotal, as características físicas, morfológicas e de integridade espermática e o desempenho reprodutivo do rebanho foram baixas e não significativas (P>0,05). Em touros sexualmente maduros a integridade de membrana plasmática, acrossoma e fragmentação de cromatina nuclear não foram os distúrbios mais freqüentes da morfologia espermática.

Foi estudado a influência das estações não reprodutiva e reprodutiva, dos crioprotetores glicerol e etilenoglicol e do processo de congelação e descongelação sobre a motilidade, o vigor, a morfologia e o complexo DNA-proteína de espermatozóides em garanhões, comparando o sêmen fresco, o exposto a congelação e descongelação sem crioprotetores, o exposto aos crioprotetores sem congelação e o exposto aos crioprotetores com congelação e descongelação. Foram utilizados seis garanhões da raça Mangalarga Paulista, colhendo 12 ejaculados de cada animal na estação não reprodutiva (1) e 12 ejaculados na estação reprodutiva (2), analisando a motilidade, o vigor, a concentração, a morfologia e a patologia do complexo DNA-Proteína. A patologia do complexo DNA-Proteína foi avaliada em sêmen fixado com etanol-ácido-acético glacial 3:1 (v/v), tratado com HCL 4N a 25oC e corado com azul de toluidina a 0,025% em tampão Mcllvaine, empregando microscopia óptica com aumento de 1000x. Os resultados mostraram que a motilidade, o vigor, a morfologia e a anomalia do complexo DNA-Proteína dos espermatozóides diferem entre os grupos congelado e não congelado (P<0,05). Para o grupo fresco, a taxa de patologia do complexo DNA-Proteína apresentou diferença significativa (P<0,05) entre as estações 1 e 2. O processo de congelação e descongelação exerce influência negativa sobre o complexo DNA-Proteína de espermatozóides em garanhões. / To study the effects of freezing and thawing on DNA-protein complexes in spermatozoa, 12 ejaculate were collected from each of 6 stallions (Mangalarga Paulista breed) in each of two consecutive breeding seasons. Motility, vigor, concentration, morphology and incidence of the DNA-protein complex pathologies of spermatozoa were evaluated and compared among fresh semen, semen expose to freezing and thawing without cryoprotectants and semen exposed to the cryoprotectors glycerol and ethylene glycol left at room temperature or frozen. Incidence of the DNA-protein complex pathologies was evaluated in semen smear fixed in na ethanol-acetic-acid mixture (3:1, v/v) for 1 minute, washed in 70% ethanol for 3 minutes and air dried. To induce nuclear metachromasy, smears were treated with 4N HCL at 25ot for 20 minutes followed by rinsing in distilled water. Preparation were stained with a 0.025% toluidine blue solution in Mailvaine buffer for 15 minutes. Frequency of spermatozoa exhibiting nuclear metachromasy was determined in 1000 cells/animal by light microscopy at 1000X magnification. Motility, vigor, morphology and DNA-protein complex pathologies of spermatozoa were different for semen frozen compared to not frozen (P<0.05). For fresh semen, there were effects of seasons on the incidence of DNA-protein complex pathologies (P<0.05) For semen frozen without cryoprotectants there were significant effects seasons (P<0.05) The process of cryopreservation and thawing influences negatively the DNA-protein complexes in stallion spermatozoa.