A cromoblastomicose é uma micose crônica que causa lesões granulomatosas e supurativas que atingem a pele e o tecido subcutâneo. Micose cosmopolita e freqüentemente observada no Brasil. As lesões aumentam progressivamente e posteriormente podem desenvolver um processo crônico e que geralmente não respondem a uma terapia convencional. Entretanto o mecanismo de defesa da resposta imune adaptativa, principalmente das células T na cromoblastomicose ainda não está definido. Em nosso estudo avaliamos a produção de citocinas e a resposta linfoproliferativa de diferentes amostras de sangue de pacientes com cromoblastomicose e indivíduos saudáveis in vitro após estimulação com antígenos do fungo. Além disso, nos acompanhamos esses pacientes sob terapia antifúngica em diferentes períodos de tratamento. Este estudo mostrou que a forma grave da cromoblastomicose é caracterizada pelo aumento na produção de IL-10 e deficiência na proliferação das células T após estimulação com antígenos do fungo. Ao contrario, pacientes com a forma leve da doença foram capazes de secretar predominantemente IFN-γ, que é uma citocina importante para defesa do hospedeiro. Em adição eles secretaram menores quantidades de IL-10 e suas células T proliferaram eficientemente in vitro após estimulação do fungo. Os pacientes avaliados após 6 meses de terapia antifúngica as células T proliferaram e secretaram altos níveis de IFN-γ eficientemente após estimulação. Ao contrário, pacientes com 12 meses de tratamento ocorreu um aumento na produção de IL-10 uma diminuição nos níveis de linfoproliferação. Interessantemente, os monócitos obtidos desses pacientes durante a doença foram capazes expressar moléculas co-estimulatorias (CD80 e CD86) e também aumento nos níveis de HLA-DR após estimulação com LPS. Além disso, monócitos desses pacientes secretam altos níveis de IL-12 e TNF-α, sugerindo que a suscetibilidade desses pacientes não apresentam uma deficiência na apresentação de antígeno por monócitos. Em suma, em nossos resultados mostraram que alta secreção de IFN-γ e eficiente proliferação de células T de pacientes com cromoblastomicose está diretamente relacionada com a forma leve da doença, enquanto que a produção de IL-10 e diminuição na proliferação de células T caracterizam a forma grave da doença. / Chromoblastomycosis is a chronic granulomatous and suppurative disease that causes lesions mainly in skin and subcutaneous tissues. Although found worldwide, this mycosis is frequently observed in tropical countries such as Brazil. The skin lesions increase slowly and progressively in a chronic process that usually relapse even after canonical treatment. However, the mechanism of the host adaptive immune response, specially the role of T cells, in chromoblastomycosis is still unclear. In studies here, we evaluated the cytokine production and T cell response of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from different patients and healthy controls upon in vitro stimulation with fungal antigens. Moreover, we performed a follow-up study in patients undergoing long-term antifungal treatment. We collected PBMC samples from patients with an active form (either severe or mild skin lesions) of chromoblastomycosis and PBMC samples from healthy individuais. In PBMC from patients with a severe form of the disease we found a predominant production of IL-10 over IFN-gamma and a deficiency in T cell proliferation upon fungal antigen stimulation. In contrast, PBMC from patients in a mild form of the disease were able to secrete predominantly IFN-gamma, a cytokine important for host defense. In addition, they secreted low amounts of IL-10 and their T cells efficiently proliferated under in vitro stimulation with the fungal antigens. Surprisingly, the patients undergoing 6 months antifungal therapy PBMC from patients secreted higher amounts of IFN-gamma and their T cells proliferated efficiently upon stimulation. On the contrary, PBMC from patients after 12m of treatment showed an increase in IL-10 secretion followed by an inefficient T cell proliferation. Interestingly, monocytes obtained from patients during chronic phase of the disease were able to up-regulate their co-stimulatory molecules (CD80 and CD86) as well as their HLA-DR upon in vitro fungal stimulation. Moreover, monocytes from these patients secreted high amounts of pro-inflammatory cytokines IL-12 and TNF-alfa, suggesting that susceptibility of patients must be due to a immune deficiency other than a monocyte deactivation. Altogether, our data clearly show that a higher secretion of IFN-gamma and an efficient T cell proliferation of PBMC from infected individuals can distinguish the mild from the severe form of the chromoblastomycosis

Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-10-06T16:52:55Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInvitroAtividade.pdf: 1920798 bytes, checksum: 88c8f860d81e6ace39ccf869e95faa94 (MD5) / Rejected by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br), reason: on 2017-10-10T17:06:29Z (GMT) / Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-10-17T18:46:53Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInvitroAtividade.pdf: 1920798 bytes, checksum: 88c8f860d81e6ace39ccf869e95faa94 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-11-24T17:01:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInvitroAtividade.pdf: 1920798 bytes, checksum: 88c8f860d81e6ace39ccf869e95faa94 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-24T17:01:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AvaliacaoInvitroAtividade.pdf: 1920798 bytes, checksum: 88c8f860d81e6ace39ccf869e95faa94 (MD5) Previous issue date: 2017-08-29 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A cromoblastomicose (CBM) é uma micose por implantação, crônica, de distribuição cosmopolita, causada por fungos melanizados. Após implantação transcutânea, os propágulos dos agentes da CBM apresentam uma plasticidade celular e morfológica única, ocorrendo a diferenciação celular, resultando nas células muriformes. O tratamento dessa micose é um desafio pela ausência de um antifúngico padrão. Vários métodos de terapia são utilizados (físicos e farmacológicos), isoladamente ou associados, no entanto, com pouco sucesso de cura clínica. A região amazônica tem uma vasta biodiversidade de vegetais que precisam ser melhor caracterizados quanto à sua composição química e aplicabilidade no tratamento de diferentes doenças. Nessa variedade de plantas, o fruto da Malpighia glabra Linn. (acerola) apresenta um alto teor de vitamina C, apresentando também vitaminas do complexo B, A, antocianinas e flavonoides, que destacam-se por apresentarem diferentes ações biológicas e terapêuticas já demonstradas tanto em in vitro quanto in vivo. Um grande interesse está atualmente centrado nas atividades biológicas de um destes flavonoides, a quercetina, pois exerce múltiplas atividades farmacológicas, apresentando propriedades biológicas únicas que podem melhorar o desempenho mental e/ou físico, e reduzir o risco de diferentes infecções. Este estudo teve como objetivo avaliar a atividade antifúngica in vitro do extrato da M. glabra em conídios e nas células muriformes de cepas de Fonsecaea spp. O extrato da M. glabra apresentou atividade antifúngica tanto em conídios quanto em células muriformes das cepas avaliadas. Além do extrato bruto, os conídios de diferentes cepas também foram sensíveis a diferentes diluições do extrato. Foram avaliadas a concentração inibitória mínima (CIM) e a concentração fungicida mínima (CFM). A média geométrica da CIM da quercetina para os conídios foi de 4,75 μg/mL e a média geométrica da CFM foi de 11,31 μg/mL, isso sugere que a quercetina apresenta ação fungistática. São necessários mais estudos para que futuramente a M. glabra ou a quercetina, isolada ou associada com outro componente isolado do extrato, possa ser usada para o tratamento da CBM. / Chromoblastomycosis (CBM) is a mycosis by implantation, chronic, with a cosmopolitan distribution, caused by melanized fungi. After transcutaneous implantation, the propagules of the CBM agents present a unique cellular and morphological plasticity. The cellular differentiation results in the appearance of muriform cells. The treatment of this mycosis is a challenge due to the absence of a standard antifungal, resulting in several therapy methods (physical and pharmacological), used isolated or associated, with little clinical cure success. Amazon region has a vast biodiversity of vegetables that need to be better characterized as to their chemical composition and applicability in the treatment of different diseases. In this variety of plants, the fruit of Malpighia glabra Linn. (acerola) has a high content of vitamin C, also presenting vitamins of the complex B, A, anthocyanins and flavonoids, which stand out for having different biological and therapeutic actions already demonstrated both in vitro and in vivo. A major interest is currently focused on the biological activities of quercetin, belonging to the class of flavonoids, as it exerts multiple pharmacological activities, presenting unique biological properties that can improve mental and/or physical performance and reduce the risk of different infections. This study aims to evaluate the in vitro antifungal activity of M. glabra extract in conidia and muriform cells of Fonsecaea spp. The extract of M. glabra presented antifungal activity in both, conidia and muriform cells, of the evaluated strains. Much interest is now centered on biological activities of the flavonoid quercetin. In addition to the crude extract, the conidia of different strains were also sensitive to different dilutions of the extract. The minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum fungicidal concentration (MFC) were evaluated. The geometric mean of the quercetin MIC for the conidia was 4.75 μg/mL and the geometric mean of the CFM was 11.31 μg/mL. Further study is needed so that M. glabra or quercetin, isolated or associated with another isolated component of the extract, may be used for the treatment of CBM in the future.

A cromoblastomicose é uma micose subcutânea, com alto índice de morbidade, causada por fungos demácios, sendo o mais recorrente agente etiológico o Fonsecaea pedrosoi. Já foi descrito em todos continentes e é mais recorrente em países de clima quente, sua incidência é de grande importância no Brasil. Raramente os indivíduos se curam, pois, não há terapia padrão por conta da baixa eficácia das terapêuticas antifúngicas atuais contra a cromoblastomicose. Pouco se sabe sobre a relação parasita hospedeiro desta infeção. Os métodos de diagnóstico laboratorial se limitam a visualização das estruturas fúngicas presentes nos tecidos do hospedeiro. Decorrente da falta de informação sobre a cromoblastomicose uma doença de tamanha morbidade, surge à necessidade de estudar melhor a resposta imunológica e seus antígenos. Nosso trabalho mostrou que algumas proteínas secretadas em meio nutricionalmente pobre (exoantígenos) se mostraram imunorreativas, contra os soros de camundongos BALB/c com diferentes tempos de infecção, assim como proteínas derivadas da ruptura do fungo total através da sonicação. A proteína que se mostrou majoritariamente imunorreativa foi a de aproximadamente 50KDa, outros trabalhos descrevem proteínas de alta relevância com peso molecular próximo deste, sugerindo uma possível relação entre os achados. O sequenciamento destas bandas mostrou homologia significante com enoyl redutase, uma enzima envolvida na síntese de ácidos graxos. / The chromoblastomycosis is a subcutaneous mycosis with high morbidity, caused mostly by Fonsecaea pedrosoi, a dematious fungus. The chromoblastomycosis has been described in all continents and is more recurrent in hot climate countries, with a greatest incidence in Brazil. The host rarely heal because the therapy is low efficacy of current antifungal therapies against chromoblastomycosis. Little is known about the relationship of Fonsecaea pedrosoi with the host. The diagnostic methods is limited to visualize fungal structures, present in the host tissues. Arising from lack of information about the chromoblastomycosis, is necessary to characterize new antigens. Our work has shown that some secreted proteins in medium (exoantigens) were immunoreactive against sera from infected mice, with different times of infection, as well as proteins derived from the fungus rupture by sonication. The antigen has approximately 50 kDa. Other studies describe proteins with high relevance close this molecular weight, suggesting a possible relationship between the findings. The sequencing of these bands showed significant homology with enoyl reductase, an enzyme involved in fatty acid synthesis.

Submitted by Samira Prince (prince@ufpa.br) on 2012-10-16T14:35:41Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_InducaoEscleroticasInvitro.pdf: 4920627 bytes, checksum: 52f08a5bbe8c483f745c2bd5ced67a47 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2012-10-16T18:01:59Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_InducaoEscleroticasInvitro.pdf: 4920627 bytes, checksum: 52f08a5bbe8c483f745c2bd5ced67a47 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-16T18:01:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_InducaoEscleroticasInvitro.pdf: 4920627 bytes, checksum: 52f08a5bbe8c483f745c2bd5ced67a47 (MD5) Previous issue date: 2009 / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A cromoblastomicose (CBM) é uma doença fúngica crônica que acomete a pele, caracterizada pelo desenvolvimento de lesões polimórficas, que apresentam infiltrado inflamatório granulomatoso na presença de células escleróticas, patognomônicas desta doença. Um dos objetivos deste estudo foi avaliar a indução de células escleróticas por meios naturais, com biomassas de Bactris gasipaes e de Theobroma grandiflorum, cujas respectivas espécies induziram in vitro células escleróticas similares àquelas encontradas nos tecidos de lesões humanas, em 10 e 2 dias, respectivamente, o que viabilizou a produção de um meio indutor em pó, já disponibilizado a outros grupos que estudam a CBM. Outro objetivo foi avaliar a imunopatologia da CBM nos pacientes, antes e durante a utilização de itraconazol (ITZ). Para isto, foi utilizada a técnica de ELISA para as citocinas TNF-, IL-4 e IL-10 circulantes, e a imunohistoquímica de biópsias das lesões em diferentes tempos de tratamento – que permitiu analisar as alterações quantitativas e qualitativas dos tipos celulares durante 12 meses do tratamento com ITZ na dose de 200 mg/dia – com anticorpos anti-CD20, anti-CD8 e anti-CD68. Quanto as citocinas, a IL-10 circulante não mostrou nenhuma mudança significativa, enquanto IL-4 e TNF-α apresentaram um aumento da titulação ao longo de 12 meses de tratamento. Em relação à imunofenotipagem, houve uma diminuição significativa no processo inflamatório e nos infiltrados celulares durante 3 e 6 meses do tratamento, enquanto que apenas aos 12 meses houve a regressão significativa do número de escleróticas. A Imunofenotipagem revelou que os macrófagos estão localizados principalmente nas áreas centrais do granuloma, enquanto que as células TCD8+ estão na periferia e as células TCD20+ encontram-se homogeneamente distribuídas, com um aumento significativo após 6 meses do tratamento, retornando aos níveis iniciais após um ano. Os macrófagos e linfócitos citotóxicos são recrutados para o sítio de infecção durante o tratamento, apresentando um aumento significativo após 12 meses de tratamento com ITZ. Estes resultados demonstram que a formação do granuloma na CBM é semelhante àqueles observados em outras doenças infecciosas granulomatosas, e que a presença de IL-4 e IL-10 podem estar relacionadas com a persistência do fungo nas lesões e com a dificuldade de cura observada nestes pacientes. / Chromoblastomycosis (CBM) is a chronic fungal disease witch affects the skin, characterized for slowing development of polymorphic skin, that present infiltrated inflammatory granulomatous in the presence of sclerotics cells, characteristic of this illness. One of the objectives of this study was to evaluate the induction of scleroticts cells for natural mediums, with biomasses of Bactris gasipaes and Theobroma grandiflorum, whose respective species had induced in vitro similar sclerotics cells to those found in tissue of patients, in 10 and 2 days, respectively, what it made possible the production of a powder medium inductor, already donated to other groups that study the CBM. Another objective was to evaluate the histopathology of the CBM in the patients, before and during the use of itraconazole (ITZ). For this, the technique of ELISA for the cytokines was used TNF-α, circulating IL-4 and IL-10, and the immunohistochemestry of biópsias in different times of treatment - that it allowed to analyze the quantitative and qualitative alterations of the cellular types during 12 months of the treatment with ITZ in the 200 dose of mg/dia - with antibodies anti- CD20, anti-CD8 and anti-CD68. How much the cytokines, the circulating IL-10 did not show significant change, while IL-4 and TNF-α had presented an increase of the levels throughout 12 months of treatment. In relation to the immunophenotyping, it had a significant reduction in the inflammatory process and the cellular infiltrated during 3 and 6 months of the treatment, whereas only to the 12 months had the significant regression of the number of sclerotics cells. The immunophenotyping disclosed that the macrophages are mainly located in the areas central areas of granuloma, whereas cells TCD8+ are in the periphery and cells TCD20+, which were found throughout the tissues, with a significant increase after 6 months of the treatment, returning to the initial levels after one year. The cytotoxic macrophages and lymphocytes were having presented a significant increase after 12 months of treatment with ITZ. These results demonstrate that the formation of granuloma in the CBM is similar to those observed in other granulomatous infectious disease, and that the presence of IL-4 and IL-10 can be related with the persistence of fungi in the injuries and with the difficulty of cure observed in these patients.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2013-03-04T18:46:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseInteracaoVitro.pdf: 11076207 bytes, checksum: d5fc5bd6532bdaceb159c5cb59308b40 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2013-03-05T15:37:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseInteracaoVitro.pdf: 11076207 bytes, checksum: d5fc5bd6532bdaceb159c5cb59308b40 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-05T15:37:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_AnaliseInteracaoVitro.pdf: 11076207 bytes, checksum: d5fc5bd6532bdaceb159c5cb59308b40 (MD5) Previous issue date: 2008 / A cromoblastomicose e uma infeccao subcutanea cronica, granulomatosa, causada pela implantacao traumatica de diversas especies de fungos demaceos, sendo Fonsecaea pedrosoi o principal agente etiologico. O Brasil possui a segunda maior prevalencia mundial da doenca, sendo o estado do Para a maior area endemica. Histologicamente, a cromomicose e caracterizada pela presenca de celulas gigantes, onde podem ser observadas celulas escleroticas fagocitadas por macrofagos. O objetivo do presente estudo foi analisar os diferentes aspectos da interacao de macrofagos peritoneais de camundongos BALB/c e C57/BL6 com conidios ou celulas escleroticas de F. pedrosoi, determinando os indices de infeccao, fagocitose e fusao celular. Os resultados mostraram indices de fagocitose e infeccao maiores em conidios do que em celulas escleroticas para BALB/c (p<0.05), ocorrendo efeito inverso no indice de fusao, com a formacao de celulas gigantes do tipo Langhans na interacao com celulas escleroticas e celulas gigantes do tipo corpo estranho na interacao com conidios. Os macrofagos de BALB/c em interacao com conidios produziram mais TNF-α que o controle nos tempos de 3 a 72h; e mais IL-10 apos 3h. Macrofagos interagindo com celulas escleroticas produziram mais TNF-α que o controle nos tempos de 1h e 3h; e a quantidade de IL- 10 foi maior apos 72h de interacao. No co-cultivo de macrofagos de C57/BL6 com conidios observou-se a presenca de vacuolos aumentados apos 24h, enquanto na interacao com celulas escleroticas, os macrofagos se desprenderam da laminula nos tempos posteriores a 24 h. A quantidade de TNF-α e maior na interacao de conidios comparado ao controle em 1 e 72 h; e a quantidade de IL-10, no tempo de 48h. Ja na interacao com celulas escleroticas, apenas a quantidade de IL-10 diferiu do controle, sendo maior nos tempos de 1 a 48h. Estes dados sugerem que a resposta e macrofagos ao fungo e diferente entre os camundongos de BALB/c e C57/BL6, diferindo tambem a resposta de um mesmo tipo de macrofago para cada forma fungica, sendo as celulas escleroticas aparentemente mais imunogenicas que os conidios. / Chromoblastomycosis (CBM) is a chronic, subcutaneous, granulomatous infection caused by traumatic implantation in the skin of several dematiaceous fungi, usually Fonsecaea pedrosoi. Brazil has second highest disease prevalence in the world and Para State is the most endemic area. Histologically, CBM is characterized by the presence of multinucleated giant cells and sclerotic cells can be found engulfed by macrophages. The objective of this study was to analyze the different aspects of interaction between peritoneal macrophages from BALB/c or C57/BL6 mice with F. pedrosoi conidia or sclerotic cells, calculating infection, phagocytosis and cellular fusion rates. The results showed phagocytosis and infection rates with conidia higher than sclerotic cells to BALB/c (p <0.05), while the rate of cellular fusion was higher for sclerotic cells interaction, with Langhans giant cells formation, in comparison to foreign-body giant cells after interaction with conidia. Macrophages from BALB/c co-cultured with conidia produced more TNF-α than control group after 3 to 72 hours, and more IL-10 after 3h. Macrophages interacting with sclerotic cells produced more TNF-α than control group after 1h and 3h, and the amount of IL-10 was higher after 72h of interaction. In the co-culture of C57/BL6 macrophages with conidia, the presence of large vacuoles after 24h was observed, while in the coculture with sclerotic cells, macrophages were detached from coverslip glasses after 24 h. Our results indicate higher levels of TNF-α after interaction of conidia compared to controls at 1 and 72 h and increase of IL-10 after 48h. However, after interaction with sclerotic cells, only IL-10 differed from control, being higher after 1 to 48 hours. All of these data suggest that macrophage response to fungus is different between BALB/c and C57/BL6 mice, differing also on the response of the same type macrophage for each fungal form, sclerotic cells apparently being more immunogenic than conidia.

Este estudo avaliou pacientes portadores de cromoblastomicose, sendo feita uma categorização clínica em dois grupos, de acordo com a forma clínica da lesão dermatológica: o primeiro composto por indivíduos com lesões elevadas e o segundo formado por casos com lesões planas, com biópsias realizadas antes e depois dos tratamentos. Através de critérios semiquantitativos, os elementos anatomopatológicos foram analisados, constatando-se a presença do padrão granulomatoso chamado granuloma micótico misto organizado, com baixa intensidade em lesões planas e alta em elevadas. Evidenciou-se que pacientes com lesões planas evoluíram bem clinicamente, com exames micológicos negativos e sem recidivas (bons respondedores), porém aqueles com lesões elevadas apresentaram evolução clínica desfavorável, com exames micológicos positivos e doença recidivante ou recalcitrante, apesar dos tratamentos recebidos (maus respondedores). E, entre os componentes histopatológicos reacionais à invasão fúngica, verificou-se associação significativa para fibrose, podendo levar a um pior prognóstico. Estes achados clínicos e histopatológicos conferem a esta patologia uma idéia de polaridade, à guisa dos fenômenos das formas polares da hanseníase, da fagocitose, e dos agentes de baixa virulência. Os autores propõem uma classificação morfológica dos granulomas da CBM em dois tipos polares: granuloma micótico misto organizado (GMMO) polar com alta intensidade dos elementos celulares (que corresponderia ao polar não tuberculóide) e GMMO polar com baixa intensidade (que corresponderia ao polar tuberculóide). / Patients with chromoblastomycosis were studied and dichotomized into two groups according to the clinical lesions: flat and elevated ones which were biopsied before and after treatments. Histopathological structures underwent through semiquantitatively analisys evidencing the mixed organized mycotic granuloma with low intensity of histopathological elements in flat lesions and high in elevated ones. Flat lesions have improved clinically with negative micological studies (good responders) while elevated lesions’ patients did not (bad responders). It was found significant association between evidence of fungus and fibrosis with a poor prognosis. Clinical and histopathological findings suggest a polarity concept to this disease based on the fenomenal polar forms of hanseniasis, fagocitosis and the low virulence agents. The authors proposed a morphological classification of the chromoblastomycosis’ granulomas into two polar types: polar mixed organized mycotic granuloma (MOMG) with high intensity of the cellular elements (like the polar non tuberculoid type) and the polar MOMG with low intensity (like the polar tuberculoid type).

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-03-20T12:36:20Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AvaliacaoSuscetibilidadeInVitro.pdf: 1683274 bytes, checksum: 9513eec5b0e41bedde9a08f37813a32c (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-03-24T11:41:21Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AvaliacaoSuscetibilidadeInVitro.pdf: 1683274 bytes, checksum: 9513eec5b0e41bedde9a08f37813a32c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-24T11:41:21Z (GMT). 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O principal objetivo deste trabalho foi avaliar a suscetibilidade in vitro de isolados clínicos de Fonsecaea spp. frente a nove antifúngicos, correlacionando as Concentrações Inibitórias Mínimas (CIM) do itraconazol (ITZ) com a evolução clínica e os tipos de lesões, além de quantificar os níveis plasmáticos de ITZ e Hidroxi-ITZ (ITZOH) em pacientes atendidos na Unidade de Referência Especializada em Dermatologia Sanitária do Estado do Pará Dr. Marcello Candia. Os 38 isolados clínicos de Fonsecaea foram avaliados em relação ao ITZ, cetoconazol (CTZ), posaconazol (PCZ), voriconazol (VCZ), fluconazol (FCZ), anfotericina B (ANF B), caspofungina (CAS), terbinafina (TBF) e 5-fluorocitosina (5-FLU), de acordo com as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, documento M38-A2). A CIM para cada fármaco utilizado foi obtida após 5 dias de incubação a 30°C, e dentre os fármacos testados, o PCZ foi o mais efetivo (CIM 0.28 μg/ml, CFM 4.35 μg/ml) podendo ser uma alternativa terapêutica em isolados não sensíveis ao ITZ. Os resultados da correlação entre a CIM do ITZ e a evolução clínica demonstraram que os pacientes com piora tiveram um valor médio ± erro padrão da média (0.90 ± 0.10 μg/ml) superior aos sem melhora (0.45 ± 0.05 μg/ml) com melhora (0.59 ± 0.05 μg/ml) e cura (0.45 ± 0.05 μg/ml), com diferença significativa (p < 0.05) entre os grupos. Não houve correlação entre o CIM do ITZ e os tipos de lesões dos pacientes. Observamos uma grande variabilidade interindividual entre os níveis plasmáticos de ITZ e ITZOH, sendo importante destacar que o ITZOH estava até 3 vezes mais elevado no plasma dos pacientes (p < 0.001), o que pode contribuir para atividade antifúngica do tratamento e sugere uma importante contribuição deste metabólito na terapia. Por fim, avaliamos três pacientes que foram submetidos a altas doses de ITZ, 600 mg/dia, com aumento significativo dos níveis plasmáticos de ITZOH (p=0.0148) e uma concentração >1000 ng/ml na somatória ITZ+ITZOH, considerada satisfatória para a maioria das infecções fúngicas, além de apresentarem melhora do quadro clínico. Em resumo, nossos dados 1) confirmam F. pedrosoi como o principal agente etiológico da CBM no Pará; 2) não evidenciam correlação entre as lesões, as espécies e a sensibilidade ao ITZ; 3) demonstram que ITZ, VCZ e PCZ foram os fármacos com menor CIM, sendo que o PCZ apresentou a menor CFM; 4) correlacionam o metabólito ITZOH com a evolução clínica dos pacientes e; 5) indicam que o uso de altas doses de até 600 mg/dia de ITZ podem ser usadas em pacientes que não respondem a doses terapêuticas menores. / Chromoblastomycosis (CBM) is a fungal infection by implantation in the skin, with a chronic evolution, caused by traumatic inoculation of dematiaceous fungi. Pará state is one of the most important endemic areas in Brazil, and F. pedrosoi is the most prevalent agent. The low cure rate is consequence of the lack of a standardized treatment regimen and there are a few works related to susceptibility of black fungi to the drugs available for treatment. The main objective of this study was to evaluate in vitro susceptibility of clinical isolates of Fonsecaea spp. against nine antifungals, correlating itraconazole (ITZ) minimal inhibitory concentrations (MIC) and minimal fungicidal concentrations (MFC) with clinical outcome and the types of lesions. Furthermore, plasma levels of ITZ and ITZOH were measured in patients treated in Dr Marcello Candia Reference Unit in Sanitary Dermatology (UREMC, Pará State). Thirty-eight clinical isolates of Fonsecaea spp. were evaluated against ITZ, ketoconazole (CTZ), posaconazole (PCZ), voriconazole (VCZ), fluconazole (FCZ), amphotericin B (ANF B), caspofungin (CAS), terbinafine (TBF) and 5-fluorocytosine (5-FLU), according to the protocol of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, M38-A2 document). After 5 days of incubation at 30°C, MICs were determined visually evaluating fungal growth in different drug concentrations, in comparison to the drug-free control wells. PCZ was the most effective (MIC 0.28 μg/ml, MFC 4.35 μg/ml) drug. The correlation between the MIC to ITZ and clinical outcome results demonstrate that patients with worsening had a media value ± SEM (0.90 ± 0.10 μg/ml) superior to no improvement (0.45 ± 0.05 μg/ml) or improvement (0.59 ± 0.05 μg/ml) and cure (0.45 ± 0.05 μg/ml), with a significant difference (p < 0.05) among the groups. There was no correlation between ITZ CIM and types of lesions. We observed a large inter-individual variability of ITZ and ITZOH plasma levels. ITZOH was up to 3 times higher in the plasma of patients (p < 0.001), which can contribute to the antifungal treatment and suggests an important participation of this metabolite in therapy. Lastly, we evaluated three patients who underwent high dose 600 mg/day ITZ with a significant increase of ITZOH (p= 0.0148) plasma levels. In summary, our data 1) confirmed F. pedrosoi as the main agent of CBM in Pará; 2) did not show correlation between the lesions, species and ITZ sensitivity; 3) Showed that ITZ, VCZ and PCZ are the drugs with lower CIM, wherein PCZ had the lowest MFC; 4) correlated the metabolite ITZOH with the clinical evolution of patients and; 5) indicated that the use of high doses of up to 600 mg/day ITZ can be used in patients who do not respond to lower therapeutic doses.

Este estudo avaliou pacientes portadores de cromoblastomicose, sendo feita uma categorização clínica em dois grupos, de acordo com a forma clínica da lesão dermatológica: o primeiro composto por indivíduos com lesões elevadas e o segundo formado por casos com lesões planas, com biópsias realizadas antes e depois dos tratamentos. Através de critérios semiquantitativos, os elementos anatomopatológicos foram analisados, constatando-se a presença do padrão granulomatoso chamado granuloma micótico misto organizado, com baixa intensidade em lesões planas e alta em elevadas. Evidenciou-se que pacientes com lesões planas evoluíram bem clinicamente, com exames micológicos negativos e sem recidivas (bons respondedores), porém aqueles com lesões elevadas apresentaram evolução clínica desfavorável, com exames micológicos positivos e doença recidivante ou recalcitrante, apesar dos tratamentos recebidos (maus respondedores). E, entre os componentes histopatológicos reacionais à invasão fúngica, verificou-se associação significativa para fibrose, podendo levar a um pior prognóstico. Estes achados clínicos e histopatológicos conferem a esta patologia uma idéia de polaridade, à guisa dos fenômenos das formas polares da hanseníase, da fagocitose, e dos agentes de baixa virulência. Os autores propõem uma classificação morfológica dos granulomas da CBM em dois tipos polares: granuloma micótico misto organizado (GMMO) polar com alta intensidade dos elementos celulares (que corresponderia ao polar não tuberculóide) e GMMO polar com baixa intensidade (que corresponderia ao polar tuberculóide). / Patients with chromoblastomycosis were studied and dichotomized into two groups according to the clinical lesions: flat and elevated ones which were biopsied before and after treatments. Histopathological structures underwent through semiquantitatively analisys evidencing the mixed organized mycotic granuloma with low intensity of histopathological elements in flat lesions and high in elevated ones. Flat lesions have improved clinically with negative micological studies (good responders) while elevated lesions’ patients did not (bad responders). It was found significant association between evidence of fungus and fibrosis with a poor prognosis. Clinical and histopathological findings suggest a polarity concept to this disease based on the fenomenal polar forms of hanseniasis, fagocitosis and the low virulence agents. The authors proposed a morphological classification of the chromoblastomycosis’ granulomas into two polar types: polar mixed organized mycotic granuloma (MOMG) with high intensity of the cellular elements (like the polar non tuberculoid type) and the polar MOMG with low intensity (like the polar tuberculoid type).

Este estudo avaliou pacientes portadores de cromoblastomicose, sendo feita uma categorização clínica em dois grupos, de acordo com a forma clínica da lesão dermatológica: o primeiro composto por indivíduos com lesões elevadas e o segundo formado por casos com lesões planas, com biópsias realizadas antes e depois dos tratamentos. Através de critérios semiquantitativos, os elementos anatomopatológicos foram analisados, constatando-se a presença do padrão granulomatoso chamado granuloma micótico misto organizado, com baixa intensidade em lesões planas e alta em elevadas. Evidenciou-se que pacientes com lesões planas evoluíram bem clinicamente, com exames micológicos negativos e sem recidivas (bons respondedores), porém aqueles com lesões elevadas apresentaram evolução clínica desfavorável, com exames micológicos positivos e doença recidivante ou recalcitrante, apesar dos tratamentos recebidos (maus respondedores). E, entre os componentes histopatológicos reacionais à invasão fúngica, verificou-se associação significativa para fibrose, podendo levar a um pior prognóstico. Estes achados clínicos e histopatológicos conferem a esta patologia uma idéia de polaridade, à guisa dos fenômenos das formas polares da hanseníase, da fagocitose, e dos agentes de baixa virulência. Os autores propõem uma classificação morfológica dos granulomas da CBM em dois tipos polares: granuloma micótico misto organizado (GMMO) polar com alta intensidade dos elementos celulares (que corresponderia ao polar não tuberculóide) e GMMO polar com baixa intensidade (que corresponderia ao polar tuberculóide). / Patients with chromoblastomycosis were studied and dichotomized into two groups according to the clinical lesions: flat and elevated ones which were biopsied before and after treatments. Histopathological structures underwent through semiquantitatively analisys evidencing the mixed organized mycotic granuloma with low intensity of histopathological elements in flat lesions and high in elevated ones. Flat lesions have improved clinically with negative micological studies (good responders) while elevated lesions’ patients did not (bad responders). It was found significant association between evidence of fungus and fibrosis with a poor prognosis. Clinical and histopathological findings suggest a polarity concept to this disease based on the fenomenal polar forms of hanseniasis, fagocitosis and the low virulence agents. The authors proposed a morphological classification of the chromoblastomycosis’ granulomas into two polar types: polar mixed organized mycotic granuloma (MOMG) with high intensity of the cellular elements (like the polar non tuberculoid type) and the polar MOMG with low intensity (like the polar tuberculoid type).

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-12-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Mato Grosso (FAPEMAT) / A ausência de um modelo animal adequado de infecção crônica para estudo da cromoblastomicose experimental e o desconhecimento sobre as formas fúngicas infectantes de Fonsecaea pedrosoi estimularam a realização da presente investigação. Inicialmente, diferentes formas micelianas de F. pedrosoi, hifas, conídios e células conidiogênicas, foram testadas quanto ao seu potencial infectivo em camundongos BALB/c. Cada estrutura demonstrou capacidade distinta de sobrevida frente à resposta tecidual do hospedeiro. A transformação in vivo do inóculo fúngico para corpos escleróticos somente foi verificada nas infecções com células conidiogênicas. Neutrófilos parecem ser importantes no controle de F. pedrosoi, possivelmente pela degranulação e liberação de produtos tóxicos, enquanto macrófagos podem ser mais relevantes nos processos de clearance. A inoculação do fungo em único sítio produziu resposta inflamatória com formação de abscesso rico em fagócitos, ocorrendo eliminação da infecção em até dois meses. No entanto, coestímulo antigênico em dois sítios distintos, tais como pata s.c. e peritônio, respectivamente, com células fúngicas viáveis e inviáveis, nas diferentes linhagens de camundongos e animais knockouts, provocou a formação de lesões multifocais ricas em histiócitos e infecção persistente por F. pedrosoi, ocorrendo cura clínica e micológica desses animais, em geral, após 4 meses. Nos animais coestimulados, quando o foco primário (abscesso rico em neutrófilos) desaparecia, a migração de neutrófilos se intensificava para o sítio secundário (lesões focais ativas), culminando com a eliminação fúngica. Tais dados corroboraram para hipótese de atuação individualizada da resposta imune em focos múltiplos, porém com resolução, sistemicamente, coordenada das lesões. Após imunização das mucosas e infecção da pata com células de F. pedrosoi também foi verificada maior duração das lesões infecciosas, indicando que a apresentação antigênica de sítios distintos poderia estar envolvida com mecanismos tolerogênicos aos antígenos fúngicos. Camundongos CD4 KO que receberam duplo-estímulo, embora manifestassem agravamento das lesões nos períodos iniciais pós-inoculação fúngica, controlaram a infecção mais tardiamente. Progressão exarcebada e agravamento da infecção foram verificados em animais KO CD8 coestimulados. Camundongos co-estimulados apresentaram lesões com perfil anatomopatológico similar, no entanto, os animais IL-10 KO não desenvolveram infecção prolongada após coestimulação. Animais XID coestimulados desenvolveram infecção crônica, o que demonstrava a possibilidade das células B1 atuarem antagonicamente à resposta imunossupressora. Em outro estudo, selecionamos uma cepa bacteriana com propriedades antagônicas aos fungos filamentosos, identificada como B. subtilis, para ser utilizada em ensaios de interação com a cepa de F. pedrosoi. Em cocultivos, verificamos alterações celulares, como modificação das hifas para formas artroconidiadas, produção de clamidoconídios terminais e indução da síntese de melanina fúngica. Tais células cocultivadas foram inoculadas em camundongos, sendo os clamidoconídios terminais mais resistentes in vivo a ação dos fagócitos. No último experimento, utilizamos culturas axênicas de F. pedrosoi, mantidos em cultivos por seis meses. Formas fúngicas variadas, tais como células arredondadas, clamidoconídios terminais e intercalares, com parede celular composta por múltiplas camadas, foram analisadas por microscopia óptica e eletrônica. Essas células fúngicas foram inoculadas em camundongos BALB/c, produzindo infecção crônica, principalmente em grupo de animais infectados em dois sítios. Por fim, nossos achados evidenciaram que o desenvolvimento de um modelo murino adequado para cromoblastomicose depende de fatores ligados ao parasito e hospedeiro. Células fúngicas ou formas, potencialmente, infectantes devem ser utilizadas de modo preferencial no desenvolvimento dos modelos experimentais, devendo os mecanismos de imunossupressão, como a coestimulação antigênica, ser empregados como “ferramenta auxiliar” para ampliar as chances de sucesso na obtenção de lesões crônicas em animais hígidos. / This study was prompted by the lack of a satisfactory chronic infection animal model for studies of experimental chromoblastomycosis and the fact that very little is known about the infective fungal forms of Fonsecaea pedrosoi. First, we investigated the infective potential of different mycelial forms of F. pedrosoi, hyphae, conidia and conidiogenous cells, in BALB/c mice. The extent to which each structure could survive the host tissue response was found to vary. In vivo transformation of the fungal inoculum into muriform cells was only observed when the mice were infected with conidiogenous cells. Neutrophils appeared to play an important role in the control of F. pedrosoi, possibly by degranulating and releasing toxic products, while macrophages may be of greater importance in clearance. Fungal inoculation of a single site led to an inflammatory response accompanied by the formation of abscesses rich in phagocytes. The fungus was eliminated efficiently in up to two months. However, antigenic co-stimulation with viable and nonviable fungal cells in two different sites, such as the footpad (s.c.) and peritoneum, led to the formation of multifocal lesions rich in histiocytes and to prolonged F. pedrosoi infection in different strains of mice and knockout animals. Clinical and mycological cure in these animals generally occurred after 4 months. When the primary focus in the co-stimulated animals (an abscess rich in neutrophils) disappeared, neutrophil migration to the secondary site (active multifocal lesions) increased, culminating in the elimination of the fungi. These data support the hypothesis that multifocal infections show individual immune responses, while systemic resolution of lesions is coordinated as a whole. After the mucosae had been immunized and footpads had been infected with F. pedrosoi cells, infectious lesions were found to be more prolonged, indicating that antigen presentation at different sites may be involved in peripheral tolerance mechanisms. Although lesions in co-stimulated CD4 KO mice worsened during the initial period following inoculation with the fungus, the mice were found to control the infection later. Exacerbated inflammatory progression and a worsening of the infection were observed in co-stimulated CD8 KO animals. Lesions in co-stimulated KO mice had a similar pathologic profile, but IL-10 KO animals did not developed prolonged infection after co-stimulation. Co-stimulated xid mice developed chronic infection, showing that B1 cells may have an antagonistic effect on the immunosuppressive response. In another study, we selected the bacterial strain B. subtilis, which has known antagonistic properties against filamentous fungi, for use in interaction assays with the F. pedrosoi strain. The main cell changes observed after co-culture were the transformation of hyphae into arthroconidial forms and the production of terminal chlamydoconidia. The induction of synthesis of fungal melanin was also observed. Fungal cells from co-cultures were inoculated into mice. The chlamydoconidia from these co-cultures were more resistant in vivo to the actions of phagocytes. In the final experiment, we used axenic F. pedrosoi cultures that had been maintained for six months. Various fungal forms, such as round cells and terminal and intercalary chlamydoconidia, with cell walls made up of multiple layers, were found in aged cultures. When inoculated into BALB/c mice, these fungal forms produced chronic infection, primarily in the group of animals infected at two sites. Our findings show that the development of a satisfactory murine model of chromoblastomycosis depends on factors associated with the parasite and the host. Potentially infective fungal cells should preferably be used when developing experimental models, and immunosuppression mechanisms such as antigenic costimulation should be used as “auxiliary tools” to increase the likelihood of obtaining chronic lesions in healthy animals. / CNPq: 14170/2004-9 / FAPEMAT: 002.138/2007 / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações