Made available in DSpace on 2015-03-26T13:32:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 540797 bytes, checksum: 8f31a791537c94182ffb7cf0199e9e42 (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Bees are essential for the maintenance of biodiversity. They are also responsible for a large percentage of world food production. The species Apis mellifera is considered of great economic value due to its products for human consumption. The creation of insect-resistant transgenic products has increased the chances for the contact between bees and the Cry proteins derived from the bacterium Bacillus thuringiensis, which can be toxic to bees. Therefore, it is very important to study the hazards of toxicity. The study of these proteins in bees can be conducted by using survival analysis techniques, in which the response variable is the time until the occurrence of the event of interest, called failure time. If failure does not occur, time is called censoring, which is some partial information. The main interest is to estimate parameters to describe the survival or hazards, at a given time. In general, when there are covariates that may affect the survival time, adjustment can be performed by the Cox Regression Model, also known as proportional hazards model, through the assumption of proportional hazards among individuals over time. Chapter I, which deals with an adaptation of the Cox Regression model known as Fragility Model, not only explains the hazard of failure from individuals due to the effect of covariates, but also describes the existence of an unobserved random variable that groups individuals in natural or artificial conglomerates. The survival times were modeled to explain the hazard of failure by immature workers of A. mellifera under the effect of covariates; the colony was used as a random variable; and the ingestion of Cry1Ac protein, as fixed explanatory variable. Three different diets were tested to evaluate the toxicity of Cry1Ac on A. Mellifera: pure artificial (D0), artificial diluted in water with Cry1Ac (D2) and artificial diluted in water (D2). The individuals were collected from five different colonies maintained in Viçosa, Minas Gerais, Brazil. The random variable colony (frailty) was significant, which indicates statistical differences in the lifespans of bees from different colonies. Considering this diversity of frailty, the artificial diet diluted in water showed a higher hazard of failure, significantly different from the effect of the control diet (artificial pure). Therefore, the survival of the bee larvae was decreased due to the addition of water to the diet, which diluted the feed. However, the Cry1Ac-protein-based diet showed no significant hazard of failure when compared with the control. An alternative technique to the Cox model is presented in Chapter II of this work. When no proportional hazards of the individuals over time are observed within the sample, it is necessary to stratify or perform some other weakening of the proportional hazard condition. It can be used the Quantile Regression, which studies the relationship between the dependent variable and the explanatory variables in the conditional quantiles by minimizing the weighted mean absolute errors. This technique has properties of equivariance, invariance for monotomic transformations and robustness in the presence of outliers. Thus, by means of equivariance, they can be applied to data with censoring. It was found that, in the same set of biosafety data from the Cry1Ac protein, in honeybees called A. Mellifera, the hazards of failure by individuals are not proportionalities for the different diets studied. The survival times of bees were adjusted by quantile regression, by using the Portnoy estimator for 14 quantiles. In quantiles {0.10; 0.15; 0.30; 0.40}, the coefficients are negative values significantly different from zero. For such, in these quantiles, the individuals fed with pure diet (D0) had longer survival time compared to those fed with a diet containing Cry1Ac protein (D1). This was observed among younger individuals, since the lifespan of the larvae lifespans in these quantiles are below the average time of life. The coefficients for the quantiles {0.35; 0.50; 0.60} presented statistically significant negative effect. Therefore, water addition to the diet affected the survival of larvae approximately at the average lifespans. / As abelhas são seres indispensáveis para a manutenção da biodiversidade e além disso, são responsáveis por grande porcentagem da produção mundial de alimentos. A Apis mellifera é considerada espécie de grande valor econômico, devido a seus produtos para o consumo humano. Atualmente, com a criação de transgênicos resistentes a insetos, aumentou a possibilidade das abelhas entrarem em contato com as proteínas Cry derivada da bactéria Bacillus thuringiensis, que pode ser toxica às abelhas, tornando o estudo dos riscos de toxicidade importante. Portanto, o estudo dessas proteínas nas abelhas pode ser realizada por meio das técnicas da análise de sobrevivência. Nestas técnicas a variável resposta é o tempo até a ocorrência do evento de interesse, denominado tempo de falha, e se a falha não ocorrer, o tempo é denominado censura, que é uma informação parcial. O principal interesse é estimar parâmetros para descrever a sobrevivência ou riscos, num certo tempo determinado. Usualmente quando existem covariáveis que possam influir no tempo de sobrevivência o ajuste pode ser realizado pelo Modelo Regressão de Cox, também conhecido como de modelo de riscos proporcionais, pela suposição dos riscos proporcionais entre os indivíduos ao longo do tempo. No Capítulo I deste trabalho é realizada uma adaptação da Regressão de Cox conhecida como Modelo de Fragilidade, que além de explicar o risco do indivíduo falhar por influência de covariáveis, também descreve a existência de alguma variável aleatória não observada que agrupa indivíduos em conglomerados naturais ou artificiais. Os tempos de sobrevivência foram modelados para explicar o risco de falhar das operárias imaturas de A. mellifera sob o efeito de covariáveis, sendo a colônia utilizada como variável aleatória e a ingestão da proteína Cry1Ac como variável explicativa fixa. Para avaliar a toxicidade de Cry1Ac sobre A. mellifera, foram testadas três diferentes dietas: artificial pura (D0), artificial diluída em água com Cry1Ac (D2) e artificial diluída em água (D2). Os indivíduos foram coletados de cinco colônias diferentes mantidas em Viçosa, Minas Gerais, Brasil. A variável aleatória colônia (fragilidade) foi significativa, indicando diferenças estatísticas nos tempos de vida das abelhas provenientes de diferentes colônias. Dentro dessa diversidade de fragilidade, a dieta artificial diluída em água apresentou risco maior de falhar, significativamente diferente do efeito da dieta controle (artificial pura). Portanto, a sobrevivência das larvas de abelhas foi diminuída em virtude da adição de água na dieta, pela diluição do alimento. No entanto, a dieta baseada na proteína Cry1Ac não mostrou risco de falha significativo quando comparado com o controle. Uma técnica alternativa ao Modelo de Cox é apresentada no Capítulo II deste trabalho. Quando se verifica que os riscos dos indivíduos, ao longo do tempo dentro da amostra, não são proporcionais, é necessário estratificar ou realizar um outro procedimento na análise. Uma alternativa que pode ser utilizada é a Regressão Quantílica, que estuda a relação entre a variável dependente e as variáveis explicativas nos quantis condicionais, por meio da minimização de erros absolutos ponderados. Esta técnica possui propriedades de equivariância, invariância para transformações monotômicas e robustez na presença de outlier. Assim, pela equivariância podem ser aplicados aos dados com censura. Foi verificado que no mesmo conjunto de dados de biossegurança da proteína Cry1Ac em abelhas denominadas A. mellifera que os riscos de falhar dos indivíduos não são proporcionalidades para as diferentes dietas estudadas. Os tempos de sobrevivência das abelhas foram ajustados pela regressão quantílica, utilizando o estimador de Portnoy para 14 quantis. Nos quantis {0,10; 0,15; 0,30; 0,40} os coeficientes são valores negativos significativamente diferentes de zero. Por tanto, nestes quantis os indivíduos alimentados com a dieta pura (D0) tiveram maior tempo de sobrevivência, que aqueles que têm incorporado à proteína Cry1Ac na dieta (D1), isto aconteceu entre os indivíduos mais novos, já que nesses quantis os tempos de vida das larvas são inferiores ao tempo de vida mediano. Os coeficientes para os quantis {0,35; 0,50;0,60} apresentaram efeito negativo estatisticamente significativos, por tanto a incorporação da água na dieta influiu na sobrevivência das larvas aproximadamente nos tempos medianos de vida.

The genetically modified cotton to produce toxins from the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt) has the objective of offering plant resistance against lepidopteran larvae. The cotton crop cultivated in the Semiarid region can be subjected to the condition of water stress. Thus, this work investigated the expression of the Cry1Ac toxin in two varieties of Bt-cotton Acala 90B and NuOpal cultivated under the conditions of irrigated and water stress. In addition, the oviposition and feeding preference of adults and larvae of the cotton leafworm, Alabama Argillacea (Hübner), caged on these plants were studied. Cotton plants were cultivated under controlled conditions of irrigation to obtain water stress treatment in microparcels inside an open-sided greenhouse. Higher levels of Cry1Ac expression was found on top leaves of Bt-cotton for both varieties under water stress condition, and similar levels between plants with and without water stress in the other plant parts such as bracts, flower petals, and boll. Adults of A. argillacea did not exhibited preference for oviposition between Bt and non-Bt cotton plants. Likewise, 3- and 10-d-old A. argillacea larvae did not show food preference under a choice test comparing leaves of non-Bt and Bt-cotton plants. Otherwise, adults of A. argillacea showed lower oviposition on plants under water stress, and their larvae did not complete development fed non-Bt varieties cultivated under water stress condition. These results indicated that adults and larvae of A. argillacae do not recognize Bt-cotton plants to lay eggs and to feed, respectively. Further, cotton plants under water stress showed greater Cry1Ac toxin concentration on top leaves, interfered with the oviposition of A. argillacea irrespective of plant genotypes Bt and non-Bt, and with the larval development on non-Bt plants. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O algodoeiro geneticamente modificado para a produção de toxinas da bactéria Bacillus thuringiensis (=Bt) tem como principal objetivo oferecer a planta resistência contra larvas de lepidópteros. O cultivo do algodoeiro Bt no Semiárido pode estar submetido a diferentes condições edafoclimáticas, principalmente, ao estresse hídrico. Assim, este estudo investigou a produção da toxina Cry1Ac em algodoeiro Bt variedades Acala 90B e NuOpal com plantas submetidas ou não ao estresse hídrico e a preferência para oviposição e alimentação de Alabama Argillacea (Hübner) confinadas sobre essas plantas. Plantas de algodão foram cultivadas em microparcelas em casa telada e submetidas ao controle de irrigação para a obtenção de plantas com estresse hídrico. A produção de Cry1Ac foi maior em folhas de plantas Bt de ambas as variedades submetidas ao estresse hídrico, e similar nas demais partes como brácteas, pétalas e casca de maçãs. Mariposas de A. argillacea não apresentaram preferência para ovipositar entre plantas de algodão Bt e não-Bt. Da mesma forma, as larvas com três ou 10 dias de idade não apresentaram preferência para alimentar em folhas de variedades não-Bt comparadas a Bt, em testes com chance de escolha. Por outro lado, mariposas de A. argillacea preferiram ovipositar em plantas sem estresse hídrico e larvas não completaram o desenvolvimento em plantas não-Bt sob estresse hídrico de ambas as variedades. Estes resultados mostram que tanto mariposas quanto as larvas de A. argillacea não foram capazes de reconhecer plantas de algodão Bt para ovipositar e alimentar, respectivamente. Também, que plantas de algodoeiro submetidas ao estresse hídrico apresentam diferenças quanto à quantidade da toxina Cry1Ac nas folhas, interferiram com a preferência de oviposição de A. argillacea, bem como com o seu desenvolvimento larval.

Submitted by Natalia de Souza Gonçalves (natalia.goncalves@ufpe.br) on 2016-09-23T13:38:34Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese - Paulo Geovani Silva Martins - 2016.pdf: 11199647 bytes, checksum: e9d2a3a59d3656debcafdd36c106889f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-23T13:38:34Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese - Paulo Geovani Silva Martins - 2016.pdf: 11199647 bytes, checksum: e9d2a3a59d3656debcafdd36c106889f (MD5) Previous issue date: 2016-03-11 / CAPES / A cultura da cana-de-açúcar possui importância econômica para o Brasil pela produção de açúcar e etanol. No entanto, parte da produção é ameaçada pelo ataque de insetos-praga, destacando-se a broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis), que causa graves perdas econômicas. O controle biológico é alternativo ao controle químico e consiste no emprego de inimigos naturais como patógenos, que regulam a população de insetos-praga em níveis nãoprejudiciais. Dentre os patógenos destaca-se a bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) que produz toxinas, codificadas pelos genes cry, no formato de cristais proteicos com atividade entomotóxica para diversas ordens de insetos. O presente trabalho teve como objetivo o isolamento e caracterização de novas estirpes de Bt com potencial entomotóxico para controle biológico da D. saccharalis em cana-de-açúcar. Amostras de solo coletadas possibilitaram o isolamento de 97 colônias bacterianas com características fenotípicas compatíveis para Bt. O DNA extraído foi amplificado com primers para os genes cry1, cry2 e cry9, ativos contra dípteros e lepidópteros. Em 11,4% e 12,4% dos isolados foram constatados os genes cry2 e cry9, respectivamente, e 10 destes patogenicidade variando entre 3,47% a 20,05% para D.saccharalis. Após comparação dos perfis proteômicos dos isolados Bt.Pri 4.7, Bt.Pri 4.29, Bt.CDi 1.3 e Bt.CDi 1.11, de maior e menor potencial patogênico de cada classe gênica, foram identificadas proteínas como a shikimato quinase, envolvida na produção de toxinas em Bt, e que auxiliam o entendimento da patogênese deste microorganismo. / Sugarcane production has economical importance to Brazil, especially due to production of sugar and ethanol. However, a proportion of the production is lost owing to damage of pest insects, including sugarcane borer (Diatraea saccharalis), which cause severe economical lost in the sugar/ethanol industry. Biological control, alternatively to chemical control, which cause damage to human health and environment, is based on use of natural enemies such as pathogens that regulated pest insects population to a non-prejudicial level. Among pathogens, especially bacteria Bacillus thuringiensis (Bt) that produce toxins, encoding by cry genes, which are protein crystal with entomotoxicity activity for diverse insect orders. The present work aims to isolate and characterize new strains of Bt with potential entomotoxicity to biological control of D. saccharalis in sugarcane. Soil samples collected allowed the isolation of 97 bacterial colonies phenotypically compatible to Bt. DNA extracted was used in PCR reaction using primers to amplify cry1, cry2 and cry9 genes, with activity against Lepidoptera and Diptera. In 11.4 and 12.4% of the strains was observed fragments with pattern expected for cry2 and cry9 genes, respectively, and ten isolated shown pathogenicity ranging from 3.47% to 15.62% for D.saccharalis. After comparing the proteomic profiles of the isolates Bt.Pri 4.7 Bt.Pri 4.29, Bt.CDi 1.3 and Bt.CDi 1.11 of major and minor pathogenic potential of every gene class proteins were identified as shikimate kinase, involved in the production of Bt toxins, and assist the understanding of the pathogenesis of this microorganism.

Made available in DSpace on 2016-12-23T14:37:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luiz Flavio Viana Silveira.pdf: 245277 bytes, checksum: 26301d89e5bb37d0ef6f45525b380723 (MD5) Previous issue date: 2008-12-18 / A cultura do mamão tem grande importância econômica para o Brasil, sendo o maior produtor mundial, com área colhida de 36.650 hectares e 24% da produção mundial, e, para o Espírito Santo, segundo maior produtor, com 39,7% do total nacional, e responsável por 74% na exportação. O ataque de pragas nessa cultura pode reduzir consideravelmente a produção e a qualidade do produto colhido, sendo que, uma das principais pragas é o ácaro rajado Tetranychus urticae Koch (1836). O uso do controle químico de forma descontrolada leva a sérias conseqüências como a presença de resíduos em frutos acima do permitido e surgimento de populações resistentes. Faz-se necessário o uso de alternativas de manejo do ácaro, como o controle biológico, que vem sendo utilizado como ferramenta no manejo de diversas pragas de importância agrícola no mundo. Por isso, o objetivo deste trabalho foi selecionar isolados de Bacillus thuringiensis Berliner (1911) (Bt) que sejam patogênicos para o ácaro rajado na cultura do mamão. Foram avaliados 120 isolados de B. thuringiensis Berliner (1911) quanto à patogenicidade em T. urticae Koch (1836). Cada isolado, contendo 3 x 108 esporos viáveis/mL de água destilada autoclavada, constituiu em um tratamento com 8 repetições, em arenas de folhas de feijão-de-porco Canavalia ensiformes com 4,5 cm de diâmetro. Cada repetição continha 10 fêmeas adultas do ácaro e após 5 dias da transferência, a mortalidade foi quantificada e posteriormente corrigida pela fórmula de Abbott (1925). Os resultados foram submetidos ao teste de Scott Knott, ao nível de 5%. Os testes em condições de laboratório mostraram que há ação tóxica de Bacillus thuringiensis em Tetranychus urticae.

Bactérias endofíticas provavelmente desenvolveram uma relação com planta hospedeira através de processos coevolucionários, podendo influenciar de alguma forma na fisiologia da planta. Na literatura, há muitos relatos sobre espécies de Bacillus endofíticos, no entanto, poucos se referem a espécie B. thuringiensis (Bt). Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi isolar, identificar e caracterizar Bt de mandioca. Todos os isolados identificados como Bt produziram cristais pontuais e apenas um isolado, IIRAC22, produziu cristais amorfos maiores. Esse isolado apresentou genes cry4A, cry4B e cry10 e toxicidade a larvas de Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus, evidenciando ser Bt var. israelensis. Todos os isolados produziram quitinase, sugerindo que elas podem ter ação controladora sobre fungos fitopatogênicos e insetos. Houve também produção de pectinase, enzimas envolvidas na penetração de planta hospedeira e estabelecimento como endófito. Esses Bt endofíticos podem levar ao desenvolvimento de produtos biotecnológicos para controle de insetos. / Endophytic bacteria probably developed a relationship with their plant host through coevoltionary processes what could influence in the physiology of the plant. In the literature, there are many reports about endophytic Bacillus species, however, few reports cite endophytic B. thuringiensis (Bt). Thus, the aim of the present work was to isolate, identify and characterize Bt from cassava. All the isolates identified as Bt were able to produce punctual crystals, but only one isolate, IIRAC22, produced large amorphous crystals. This isolate presented cry4A, cry4B and cry10 genes and toxicity against larvae of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus, evidencing to be Bt var. israelensis. All the isolates produced quitinase, suggesting that they can control phytopathogeni fungi and insects. There was also pectinase production, enzyme involved in the penetration of plant hosts and establishment as endophytes. These endophytic Bt can take to the development of biotechnological products for the control of insect.

O algodão transgênico Bollgard® (algodão Bt) contém o gene cry1Ac da bactéria Bacillus thuringiensis, que confere a planta resistência a Lepidopteros. A expressão deste gene na planta pode acarretar efeitos ecológicos adversos à microbiota do solo e da rizosfera. Em casa-de-vegetação, a comunidade bacteriana associada ao algodão Bt foi comparada a do algodão convencional, em dois tipos de solos e quatro estádios fenológicos. Amostras de rizosfera foram avaliadas por técnicas dependentes e independentes de cultivo. As técnicas de contagem de bactérias e DGGE permitiram observar os efeitos do algodão Bt na densidade e diversidade de Pseudomonas e bactérias totais, durante os estádios iniciais de desenvolvimento da planta. A toxina Cry foi detectada na rizosfera de algodão Bt, em todo ciclo da cultura. Nas fases de formação do botão floral e abertura das maçãs, a atividade microbiana foi maior na rizosfera do algodão Bt. Esses resultados indicam o potencial do ambiente rizosférico em reestabelecer à estrutura da comunidade bacterina após um impacto temporal. / The transgenic cotton Bollgard® (Bt cotton) contains the cry1Ac gene from the Bacillus thuringiensis bacterium, which confers the plant resistance against some insects. The expression of this gene in the plant can cause adverse ecological effects on soil and rhizosphere microbiota. In a greenhouse experiment, the bacterial community associate to Bt cotton was compared to non-transgenic parental cultivar plants, in two types of soil at different plant development stages. Rhizosphere communities were evaluated by culture-dependent and independent approaches. Results reveal the effect of the Bt cotton in the density and diversity of Pseudomonas and total bacteria, during initial plant development stages. The Cry toxin was detected in the rhizosphere of Bt cotton, during all plant cycle. In the phases of flower formation and fruit opening, the microbial activity was greater in the rhizosphere of Bt cotton. These results show the potential of the rhizosphere to reestablish the original structure of the bacterial community after a temporary impact.

Les propriétés insecticides du Bacillus thuringiensis, découvert par ShigentaneIshiwatari, ont été utilisées pendant des décennies comme biopesticides et cette utilisation a augmenté rapidement en raison de préoccupations au sujet des effets environnementaux négatifs des pesticides chimiques. Actuellement, la toxine Bt dans la forme de biopesticides et des plantes transgéniques Bt peut compléter ou remplacer les pesticides chimiques. Il y a peu d’indication que la toxine Bt a un effet nocif pour l'environnement ou la santé humaine. Néanmoins, il ya des préoccupations que les cultures transgéniques commerciales peuvent avoir des effets néfastes sur l'environnement. Après son introduction dans le sol l'exsudation racinaire et la dégradation des résidus végétaux, la toxine Bt interagit avec les particules de sol. Les interactions de la toxine Bt avec des particules de sol influencent sa mobilité, sa biodisponibilité, sa persistance et sa toxicité.Dans cette étude, nous visons à établir l'importance relative des facteurs biologiques et physico-chimiques dans la détermination de la dynamique des protéines Cry détectables dans les sols, de clarifier si la protéine adsorbée conserve ses propriétés insecticides et d'identifier les propriétés du sol qui déterminent le devenir des protéines Cry dans le sol. Les résultats montrent que les protéines Cry ont une forte affinité sur la surface du sol. Cependant, il y avait peu de relation entre l'affinité pour le sol ou le rendement d'extraction et les propriétés du sol, y compris la teneur en argile, teneur en carbone organique et le pH du sol. Il y avait peu de rapport entre l'affinité et le rendement d'extraction. Les protéines diffèrent à la fois dans leur affinité pour les sols et leurs rendements d'extraction.Une évaluation du rôle du sol et des facteurs environnementaux dans le sort des protéines Cry de la formulation de biopesticides commerciale a montré un déclin rapide de la protéine Cry détectable soumise aux rayons du soleil sous la condition de laboratoire, alors que peu d'effet a été observé dans des conditions de terrain. La demi-vie des protéines dans le sol dans des conditions naturelles était d'environ 1 semaine. Des effets de la température forts ont été observés, mais ils diffèrent pour les biopesticides et la protéine purifiée, indiquant différentes étapes limitantes. Pour le biopesticide, la baisse observée était ralenties par des facteurs biologiques, y compris éventuellement sporulation. En revanche pour des protéines purifiées, augmentation de la température améliorée des changements conformationnels de la protéine adsorbée du sol, conduisant à une fixation et, par conséquent diminué efficacité d'extraction qui a diminué avec le temps. En outre, l'étude de la persistance de diverses protéines Cry dans les sols contrastés a été réalisée par immuno-détection et dosage biologique a montré que la toxine extractible diminue avec incubation allant jusqu'à quatre semaines. L'activité insecticide était toujours maintenue à l'état adsorbé, mais a disparue après deux semaines d'incubation à 25°C. La baisse de la protéine extractible et la toxicité était beaucoup plus faible à 4°C à 25°C. La stérilisation du sol n'a pas eu d'effet significatif sur la persistance de la toxine Cry indiquant que le déclin observé était provoqué par la fixation en fonction du temps de la protéine adsorbée ce qui diminue la quantité de toxine Cry extractable, la dégradation de la protéine par l’activité microbienne jouant un rôle plus mineur.L’exposition des insectes aux protéines Cry sous la forme adsorbé pourrait avoir un impact significatif sur les insectes cibles et même les insectes non cibles, et devrait être plus étudiée afin de déterminer son impact potentiel. / The insecticidal properties of Bacillus thuringiensis, discovered by Shigentane Ishiwatari, have been used for decades as biopesticides and this use has been increasing rapidly because of concerns about the negative environmental effects of chemical pesticides. Currently, Bt toxin in the form of both biopesticides and Bt transgenic plantsmay supplement or replace chemical pesticide. There is little evidence to demonstrate that Bt toxin has any harmful effect to the environment or to human health. Nevertheless, there are concerns that commercial transgenic crops may have harmful impacts on the environment. After release into soil via root exudation and breakdown of plant residues, Bt toxin interacts with soil particles. The interactions of Bt toxin with soil particles influence its mobility, its bioavailability, its persistence and its toxicity. In this study, we aim to establish the relative importance of biological and physicochemical factors in the determination of the dynamics of detectable Cry proteins in soils, to clarify if adsorbed protein maintains its insecticidal properties and to identify the soil properties that determine the fate of Cry proteins in soil. The results show that Cry proteins have strong affinity on soil surface. However, there was little relationship between affinity for soil or the extraction yield and soil properties including clay content, organic carbon content and soil pH. There was little relationship between the affinity and the extraction yield. The proteins differ in both their affinity for soil and their extraction yields.An assessment of role of soil and environmental factors in the fate of Cry protein from commercial biopesticide formulation showed a rapid decline of detectable Cry protein subjected to direct sunlight under the laboratory condition, whereas, little effect was observed under field conditions. The half-life of proteins in soil under natural conditions was about one week. Strong temperature effects were observed, but theydiffered for biopesticide and purified protein, indicating different limiting steps. For biopesticide, the observed decline was due to biological factors, possibly including sporulation. In contrast for purified proteins, increased temperature enhanced conformationalchanges of the soil-adsorbed protein, leading to fixation and hence extraction efficiency decreased that decreased with time. Moreover, the study of persistence of various Cry proteins in contrasting soils was carried out by immuno-detection and bioassay showed that extractable toxin decreased with incubation of up to four weeks. Insecticidal activity was still retained in the adsorbed state, but lost after two weeks of incubation at 25°C. The decline in extractable protein and toxicity was much lower at 4°C than 25°C. There was no significant effect of soil sterilization to persistence of Cry toxin indicating that decrease in detectable Cry toxin in soil may be time-dependent fixation of adsorbed protein as well as decreasing solubilization in larva midgut, but not microbial breakdown.Exposition to Cry in the adsorbed form could have a significant impact on target and even non target insects and should be investigation to determine the potential impact.

O algodão transgênico Bollgard® (algodão Bt) contém o gene cry1Ac da bactéria Bacillus thuringiensis, que confere a planta resistência a Lepidopteros. A expressão deste gene na planta pode acarretar efeitos ecológicos adversos à microbiota do solo e da rizosfera. Em casa-de-vegetação, a comunidade bacteriana associada ao algodão Bt foi comparada a do algodão convencional, em dois tipos de solos e quatro estádios fenológicos. Amostras de rizosfera foram avaliadas por técnicas dependentes e independentes de cultivo. As técnicas de contagem de bactérias e DGGE permitiram observar os efeitos do algodão Bt na densidade e diversidade de Pseudomonas e bactérias totais, durante os estádios iniciais de desenvolvimento da planta. A toxina Cry foi detectada na rizosfera de algodão Bt, em todo ciclo da cultura. Nas fases de formação do botão floral e abertura das maçãs, a atividade microbiana foi maior na rizosfera do algodão Bt. Esses resultados indicam o potencial do ambiente rizosférico em reestabelecer à estrutura da comunidade bacterina após um impacto temporal. / The transgenic cotton Bollgard® (Bt cotton) contains the cry1Ac gene from the Bacillus thuringiensis bacterium, which confers the plant resistance against some insects. The expression of this gene in the plant can cause adverse ecological effects on soil and rhizosphere microbiota. In a greenhouse experiment, the bacterial community associate to Bt cotton was compared to non-transgenic parental cultivar plants, in two types of soil at different plant development stages. Rhizosphere communities were evaluated by culture-dependent and independent approaches. Results reveal the effect of the Bt cotton in the density and diversity of Pseudomonas and total bacteria, during initial plant development stages. The Cry toxin was detected in the rhizosphere of Bt cotton, during all plant cycle. In the phases of flower formation and fruit opening, the microbial activity was greater in the rhizosphere of Bt cotton. These results show the potential of the rhizosphere to reestablish the original structure of the bacterial community after a temporary impact.

Bactérias endofíticas provavelmente desenvolveram uma relação com planta hospedeira através de processos coevolucionários, podendo influenciar de alguma forma na fisiologia da planta. Na literatura, há muitos relatos sobre espécies de Bacillus endofíticos, no entanto, poucos se referem a espécie B. thuringiensis (Bt). Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi isolar, identificar e caracterizar Bt de mandioca. Todos os isolados identificados como Bt produziram cristais pontuais e apenas um isolado, IIRAC22, produziu cristais amorfos maiores. Esse isolado apresentou genes cry4A, cry4B e cry10 e toxicidade a larvas de Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus, evidenciando ser Bt var. israelensis. Todos os isolados produziram quitinase, sugerindo que elas podem ter ação controladora sobre fungos fitopatogênicos e insetos. Houve também produção de pectinase, enzimas envolvidas na penetração de planta hospedeira e estabelecimento como endófito. Esses Bt endofíticos podem levar ao desenvolvimento de produtos biotecnológicos para controle de insetos. / Endophytic bacteria probably developed a relationship with their plant host through coevoltionary processes what could influence in the physiology of the plant. In the literature, there are many reports about endophytic Bacillus species, however, few reports cite endophytic B. thuringiensis (Bt). Thus, the aim of the present work was to isolate, identify and characterize Bt from cassava. All the isolates identified as Bt were able to produce punctual crystals, but only one isolate, IIRAC22, produced large amorphous crystals. This isolate presented cry4A, cry4B and cry10 genes and toxicity against larvae of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus, evidencing to be Bt var. israelensis. All the isolates produced quitinase, suggesting that they can control phytopathogeni fungi and insects. There was also pectinase production, enzyme involved in the penetration of plant hosts and establishment as endophytes. These endophytic Bt can take to the development of biotechnological products for the control of insect.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_ana_paula_de_lara.pdf: 4627911 bytes, checksum: 887ee69dd56b73509c1a603e3b25aebd (MD5) Previous issue date: 2013-03-08 / Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive bacteria, ubiquitous, facultative anaerobic, and form spores. During sporulation produce a parasporal crystals inclusion. Within these inclusions there are δ-endotoxin proteins well known for its insecticides proprieties. Among them, the Cry (crystal) is wide employed for biological control of plagues. The δ-endotoxin has an advantage of been more specific than chemical insecticides, thus been consider more favorable for the environment. The aim of this study was to obtain the Cry 11Aa recombinant protein of Bacillus thuringiensis var. israelensis in Escherichia coli, active for use in biocontrol. Two expression E. coli strains were tested: BL 21 (DE3) C41 and BL 21 (DE3) Ril. The protein Cry 11Aa was expressed and secreted in a soluble form by the two strains. The expression was demonstrated by Western Blot using anti-histidin monoclonal antibody. The strain BL 21 (DE3) C41 express the protein Cry 11Aa ~3.6 times more than the strain Rill, and showed a biologic efficiency of 95% of mortality for Culex quinquefaciatus larvae. The data obtained in this study suggest that the protein recombinant Cry 11Aa expressed in E. coli has a potential to be used in biological control. / Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva, de ocorrência ubíqua, anaeróbica facultativa, formadora de esporos. Produz cristais, como inclusões parasporal durante a esporulação. Estas inclusões contêm proteínas chamadas de δ-endotoxinas, que são bem conhecidas pelas suas propriedades inseticidas. Dentre elas as toxinas Cry (crystal) são largamente empregadas no controle biológico de pragas. As δ-endotoxinas têm a vantagem de serem mais específicos do que os inseticidas químicos sintéticos, portanto, são considerados como agentes de controles favoráveis ao meio ambiente. O objetivo deste estudo foi a obtenção da proteína Cry 11Aa recombinante de Bacillus thuringiensis var. israelensis em Escherichia coli, ativa, para utilização no controle biológico.Duas cepas de E. coli de expressão foram testadas: BL 21 (DE3) C41 e BL 21 (DE3) Ril. A proteína Cry 11Aa foi expressa e secretada na forma solúvel pelas duas cepas. A expressão foi demonstrada por Western blot utilizando-se anticorpo monoclonal anti-histidina. A cepa BL 21 (DE3) C41 expressou a proteína Cry 11Aa ~3.6 vezes mais que a cepa BL 21 (DE3) Ril, e apresentou, em teste biológico, uma eficácia de 95% de mortalidade sobre larvas de Culex quinquefaciatus. Com os dados obtidos neste trabalho podemos sugerir que a proteína recombinante Cry 11Aa expressa em E. coli é um potencial candidato para ser utilizado no controle biológico.