Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-03-05T17:40:23Z No. of bitstreams: 1 2009_CarlaTatianadeMirandaHonorato.pdf: 1189980 bytes, checksum: 080332f15aa1d206d495e2b3ce7e77a4 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2010-03-08T13:53:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_CarlaTatianadeMirandaHonorato.pdf: 1189980 bytes, checksum: 080332f15aa1d206d495e2b3ce7e77a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-08T13:53:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_CarlaTatianadeMirandaHonorato.pdf: 1189980 bytes, checksum: 080332f15aa1d206d495e2b3ce7e77a4 (MD5) Previous issue date: 2009 / As secreções cutâneas dos anfíbios são reconhecidas como uma rica fonte de peptídeos biologicamente ativos há bastante tempo. Devido as suas propriedades antimicrobianas e ao seu mecanismo de ação que independe da interação com um receptor específico, cada vez mais, os peptídeos isolados dessas secreções vêm sendo considerados como uma opção alternativa aos antibióticos disponíveis comercialmente. Muitas linhagens bacterianas têm apresentado resistência a tais drogas e o fato dos peptídeos antimicrobianos de anuros estarem disponíveis em quantidades satisfatórias na natureza tem facilitado a pesquisa nessa área. O presente estudo teve como objetivo geral proceder à análise peptidômica da secreção cutânea do anuro Eupemphix nattereri com ênfase na prospecção de peptídeos antimicrobianos para aplicações terapêuticas. Como resultados do presente estudo, foram isolados e caracterizados três peptídeos antimicrobianos, denominados nattererinas. As nattererinas identificadas foram sintetizadas quimicamente e apresentaram atividade citolítica contra bactérias Gram positivas e Gram-negativas e baixa atividade hemolítica. Dentre suas propriedades estruturais, podemos ressaltar tratar-se de peptídeos catiônicos (com 30 resíduos de aminoácidos) que adquirem conformação em α-hélice na presença de TFE 50% (v/v). A pesquisa nessa área é de extrema importância, visto que a caracterização dos componentes presentes na secreção cutânea de anuros pode ajudar em identificações taxonômicas, bem como, fomentar a indústria farmacêutica com modelos para o desenho de novas drogas terapêuticas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Amphibian skin secretions have been knowledge as a rich source of antimicrobial peptides for a long time. The outcome of antibiotic resistant bacterial species is an increasing problem, which encourages the search of new compounds in nature, for example, over anurans’ skin secretion. Due to its antimicrobial properties and mechanism of action, which is independent of specific receptors, these peptides have been considered as an alternative to the available antibiotics. The present study describes peptidômica analysis of the cutaneous secretion from the frog Eupemphix nattereri, focusing on antimicrobial peptides. As results of the present work, three antimicrobial peptides, named nattererins, were isolated and characterized. The identified nattererins were synthesized and tested against Gram-positive and Gram-negatives bacteria showing antimicrobial activity and low hemolytic activity. Nattererins are cationic peptides (30 amino acid residues long) and adopt an α-helical conformation in the presence of TFE 50% (v/v). Regarding the obtained results, naturally occurring bioactive peptides from amphibian skin can be a source of pharmaceutically interesting compounds, which endorses a higher investment in this kind of study. In addition, these peptides also can help in the taxonomy of anurans species.

Peroxissome proliferator-activated receptor-alfa (PPAR-?) é um fator de transcrição nuclear envolvido na regulação do metabolismo de lipídeos e da inflamação. PPAR? pode estar relacionado com a modulação da cicatrização de feridas cutâneas, que é um processo multifatorial, dependente de mecanismos de sinalização celular e de inflamação. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi analisar o papel do receptor PPAR? na cicatrização de feridas cutâneas induzidas experimentalmente e a sua relação com o metabolismo sistêmico após tratamento com agonista do PPAR?. Para tanto, foram realizadas feridas na pele da região dorsal de camundongos 129/SvEv, que foram tratados diariamente com o agonista de PPAR?, Gemfibrozil, por via oral ou tópica. Os animais foram acompanhados durante 240h pós-cirúrgico (p.c.) para a análise do reparo cutâneo e alterações metabólicas que poderiam ser induzidas pela ativação de PPAR?. Os camundongos tratados apresentaram melhor cicatrização após ativação de PPAR? com 100 ou 50 mg/kg/dia de agonista por via oral ou tópica, respectivamente. O tratamento oral induziu cicatrização mais rápida somente após 24h, 48h e 72h p.c., enquanto que os animais tratados com Gemfibrozil tópico apresentaram cicatrização mais precoce em todos os tempos avaliados. A indução de feridas alterou o metabolismo sistêmico dos camundongos que demonstraram significativa perda de peso e redução de triglicérides, independentemente do tratamento. Porém, a ativação de PPAR? não alterou a glicemia ou a função hepática. Na análise histopatológica das feridas foi verificado infiltrado inflamatório, composto principalmente por neutrófilos e outras células polimorfonucleares. Entretanto, o tratamento com Gemfibrozil tópico levou a um menor infiltrado inflamatório e diferenciada deposição de colágeno após 10 dias p.c. Além disso, houve diminuição do acúmulo de neutrófilos, macrófagos e eosinófilos quando comparados aos animais que receberam apenas o veículo. O tratamento tópico promoveu menor acúmulo de linfócitos TCD4+, TCD8+ e T??, e ainda diferenciado influxo de células dendríticas para a lesão. No entanto, não houve diferença em relação a células T reguladoras nos linfonodos drenantes, mas os animais tratados apresentaram diminuição de Foxp3 nas células CD4+CD25-. Em conclusão, PPAR? atua no reparo cutâneo, e sua ativação local acelera a cicatrização por meio da modulação da inflamação na pele. Finalmente, os resultados sugerem que PPAR? pode ser alvo importante para novas terapias que visam melhorar a cicatrização de feridas, especialmente quando ativado no local da lesão. / Peroxissome proliferator-activated receptor alpha (PPAR?) is a nuclear transcription factor involved in the regulation of lipid metabolism and inflammation. PPAR? may be associated to the modulation of wound healing, which is a multifactorial process dependent on mechanisms of cell signaling and inflammation. Then this work aimed to analyze the role of PPAR? receptor in experimental cutaneous wound healing and its relationship to the systemic metabolism of mice treated with a PPAR? agonist. For this, skin wounds were performed in the dorsal region of 129/SvEv mice, treated daily with the PPAR? agonist, Gemfibrozil, by oral or topical route. Mice were followed for 240h post-surgery (p.s.) for skin repair and metabolic changes that could be induced by PPAR? activation. There was improved wound healing in mice treated with 100 or 50 mg/Kg of PPAR? agonist by oral or topical route respectively. The oral treatment induced a better repair in the early 24h, 48h and 72h p.s. while mice treated by topical application of Gemfibrozil presented faster healing in all times evaluated. Wound\'s induction affected the systemic metabolism of mice leading to significant weight loss. PPAR? agonist did not alter glucose, triglycerides or liver function, although all injured animals had a significant decrease on triglycerides levels in the early times p.s., independent on the treatment. In histopathological examination of the wounds it was observed inflammatory infiltrate, composed mainly of neutrophils and other polymorphonuclear cells. However, topical treatment with PPAR? agonist led to lower inflammatory infiltrate and differentiated collagen deposition 10 days p.s. Furthermore, there was decrease of neutrophil, macrophages and eosinophils influx when compared to untreated mice. Topical treatment led to decrease in the TCD4+, TCD8+ e T?? lymphocytes accumulation in the lesions, and differentiated dendritic cell influx to the wounds. However there was no difference regarding CD4+CD25+ T cells in lymph nodes, but treated mice showed decrease Foxp3 expression. In conclusion, the triglycerides serum level was altered in the course of wound healing and may be associated to skin lesion, while PPAR? agonist acts in wound repair by accelerating healing and modulating neutrophil influx to the skin. Finally, our results suggested that PPAR? may be an important target for novel therapies aimed at improved wound healing, especially when administered topically.

Estudos recentes têm demonstrado o efeito das isoflavonas da soja, em especial da genisteína (GEN), aplicada topicamente, na prevenção do envelhecimento cutâneo. Esse efeito tem sido relacionado com as suas atividades inibidora de tirosina quinase, antioxidante e estrogênica. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi desenvolver nanoemulsões de uso tópico contendo GEN. Em uma primeira etapa, foi validada metodologia para a quantificação da GEN por CLAE, utilizando um sistema isocrático com detecção no UV em 327 ou 270 nm. Na segunda etapa, nanoemulsões constituídas de GEN, lecitina de gema de ovo, triglicerídeos de cadeia média (TCMGEN) ou octildodecanol (ODDGEN) e água foram preparadas por emulsificação espontânea. Esse procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões monodispersas com diâmetro de gotícula de 263 e 282 nm, viscosidade de 1,5 e 1,8 cP e potencial zeta de -44 e -42 mV, para TCMGEN e ODDGEN, respectivamente. A quantidade de GEN associada com ambas as formulações foi próxima de 100 % (para 1 mg/mL). A reduzida solubilidade da GEN no TCM e ODD (230 e 138 μg/g, respectivamente) sugere o efeito da lecitina na sua associação com as nanoemulsões. Considerando que os estudos de DSC demonstraram a interação da GEN com TCM, ODD e lecitina, a GEN parece estar localizada tanto no núcleo oleoso como na interface das nanoemulsões. Em uma última etapa, foi realizado o estudo de permeação cutânea da GEN a partir das formulações utilizando células de difusão de Franz. Foi demonstrada a reduzida permeação da GEN (~ 7,5 μg.cm-2.h-1). Existe uma redução significativa da permeabilidade da GEN a partir dos núcleos óleos (~ 3,5 – 5 μg.cm-2.h-1) ou nanoemulsões (~ 3 – 3,5 μg.cm-2.h-1), indicando a afinidade da GEN pelos veículos utilizados. O conjunto dos resultados obtidos demonstra a influência dos componentes das formulações sobre as propriedades físico-químicas das nanoemulsões, bem como no perfil de permeação cutâneo da GEN. / Recent studies have shown the effect of soy isoflavones, especially genistein (GEN), topically administrated, in preventing skin aging. This effect has been related to tyrosine kinase inhibition, antioxidant and estrogenic activities. In this context, the aim of the present work was the development of topic nanoemulsions containing GEN. First, it has been validated an isocratic method to quantify GEN by HPLC with UV detection at 327 and 270 nm. In a second step, nanoemulsions composed by GEN, egg lecithin, medium chain triglycerides (TCMGEN) or octyldodecanol (ODDGEN) and water were prepared by spontaneous emulsification. This procedure yielded monodisperse emulsions with a typical mean droplet size of 263 and 282 nm, viscosity of 1.5 and 1.8 cP and ζ-potential -44 and -42 mV, for TCMGEN and ODDGEN, respectively. The amount of GEN associated with both formulations was close to 100 % (to 1 mg/mL). The low solubility of GEN in TCM and ODD (230 and 138 μg/g, respectively) suggests the role of lecithin on their association with nanoemulsions. Since DSC experiments have demonstrated GEN interactions with TCM, ODD and lecithin, GEN molecules seem to be located in to the oil core and at the interface of nanoemulsions. In a last step, the permeation of GEN from formulations using ear pigskin mounted in Franz diffusion cells was performed. It was shown that GEN permeation was low (~ 7.5 μg.cm-2.h-1). There was a significant reduction of the GEN permeability from oils (~ 3.5 - 5 μg.cm-2.h-1) or nanoemulsions (~ 3 – 3.5 μg.cm-2.h-1), showing the affinity of GEN to the vehicles. In conclusion, the overall results show the effect of the nanoemulsion components on both physicochemical properties of the nanoemulsions and GEN skin permeation profile.

A pele dos anfíbios, assim como de outros animais, atua como primeira proteção contra agentes patogênicos. A comunidade microbiológica ali residente é composta de algumas espécies de bactérias, e estas, possuem ação antifúngica contra patógenos conhecidos, inclusive Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), o suposto agente principal de declínios de populações de anfíbios em diversas partes do mundo. Uma vez que as variáveis químicas e físicas de um ecossistema influenciam o crescimento, sobrevivência e atividade metabólica dos microorganismos, a microbiota cutânea que atua como barreira de proteção nos anfíbios contra agente infecciosos, provavelmente é afetada quando determinados parâmetros ecofisiológicos são alterados em ambientes florestais fragmentados, modulando assim a vulnerabilidade das populações de anfíbios aos agentes patogênicos. Nossa pesquisa esteve focada na caracterização das comunidades microbianas residentes da pele dos anfíbios em dois contextos de paisagem: fragmento e área contínua. Os parâmetros utilizados para essas análises foram a densidade microbiana e a riqueza de morfotipos de colônias bacterianas. O potencial inibitório do crescimento de patógenos também foi testado em ensaios do tipo cross-strak. As diferenças de densidade e riqueza microbiana entre as paisagens e a presença de táxons típicos de ambiente, apontam para o ambiente como um componente importante na determinação dos perfis das comunidades microbianas dos anfíbios estudados. Essas mudanças são muito provavelmente conseqüências, mas para o entendimento da extensão e natureza de tais conseqüências são necessários estudos adicionais. / The skin of amphibians, as well as that of other animals, acts as a first protection barrier against pathogens. The microbial community resident in the amphibian skin is composed of some species of bacteria that may have antibacterial or antifungal action against known pathogens, including Batrachochytrium dendrobatidis, the alleged principal agent Tleading to declines of amphibian populations around the world. Because the chemical and physical variables of the landscape influence the growth, survival and metabolic activity of microorganisms, the function of skin as a protective barrier against infectious agents in amphibians, is likely affected by parameters that are altered in fragmented forest habitats. Thus, it is important to understand how environmental conditions affect the skin microbiota of amphibians, and the possible induced changes on vulnerability of amphibians to pathogens. Our research aimed to characterize the microbial communities living skin of amphibians in two contexts of landscape: fragment and continuous area. The parameters used for this analysis were density and richness of microbial morphotypes of bacterial colonies. The potential inhibition of pathogen growth was also evaluated using a cross-streak test, and some taxa in these communities were identified using international protocols. The observed differences in microbial density and richness across landscapes, and the presence of bacterial taxa typical of given environments, point out to the role of environmental change as an important component determining the profiles of microbial communities living on the skin of amphibians. These changes are very likely consequential, but understanding the scope and nature of consequences require additional study.

Anfíbios possuem uma microbiota cutânea que os protege contra patógenos. Essa proteção se dá pela produção de moléculas antimicrobianas e pela competição por espaço e nutrientes contra patógenos. Alterações na composição da microbiota, causadas por fatores bióticos e abióticos do ambiente e por fatores ecofisiológicos do hospedeiro, podem afetar a resistência dos anfíbios à doenças. Assim, é possível que ambientes artificiais, por conter condições ambientais diferentes dos naturais e por alterarem aspectos ecofisiológicos dos indivíduos, devem modular a microbiota cutânea de animais mantidos e nascidos em cativeiro. Nós avaliamos diferenças inter e intra-populacionais no perfil da comunidade bacteriana de Scinax alcatraz entre três grupos: indivíduos selvagens; indivíduos nascido em cativeiro; e indivíduos mantidos em cativeiro por dois anos. Também verificamos o efeito temporal de ambientes artificiais no perfil da microbiota cutânea entre e dentre indivíduos selvagens mantidos em cativeiro ao longo de 312 dias. Os parâmetros microbiológicos utilizados foram riqueza de morfotipos bacterianos e abundância de colônias bacterianas. As diferenças encontradas entre populações apontam para o ambiente como um importante modulador da microbiota cutânea. No entanto, as diferenças encontradas entre indivíduos de uma mesma população apontam para a importância de aspectos fisiológicos do hospedeiro na modulação. Por fim, a avaliação temporal foi importante para mostrar que tanto aspectos ambientais quanto aspectos ecofisiológicos atuam juntos na modulação da comunidade bacteriana cutânea de anfíbios mantidos em cativeiro / Amphibians harbor a skin microbiota that provides protection against pathogens. This protection happens by production of antimicrobial substances and by competition for space and nutrients against pathogens. Changes in the microbiota composition, caused by biotic and abiotic factors of the environment and ecophysiology factors of the host, may affect disease resistance of amphibians. As artificial environments contain different environmental conditions compared to natural ones and may alter physiological aspects of individuals, it may modulate the cutaneous microbiota of captive animals. Our study evaluated inter- and intra-population differences in the profile of bacterial community of Scinax alcatraz from three distinct groups: wild individuals; individuals born in captivity and individuals kept in captivity for two years. We also investigated the temporal effects of artificial environments on the cutaneous microbiota profile between and within wild individuals kept in captivity over 312 days. Microbiological parameters analyzed were richness of bacterial morphotypes and abundance of bacterial colonies. The differences found between populations show that the environment may be an important modulator of the microbial community. However the differences between individuals within a population demonstrate the importance of physiological aspects of the host for the composition of the microbiota. Finally, the temporal evaluation performed was important to show that both environmental and ecophysiological aspects act together in modulating the cutaneous microbiota community of amphibians kept in captivity

Orientadores: Daniele Ribeiro de Araujo, Eneida de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T03:33:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stoco_SheilaMaria_M.pdf: 3477145 bytes, checksum: 52055c23ee448699937dcc50fc0739fc (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Durante muito tempo, acreditou-se que a função primordial da pele era comportar-se como barreira a agentes químicos, físicos e microbiológicos. Hoje, entretanto, esta concepção mudou e verifica-se que a pele apresenta-se como uma estratégia para a administração cutânea de fármacos, possibilitando a utilização de formas farmacêuticas auto-administráveis, o que facilita a adesão ao tratamento quando se necessita de administrações repetidas. A ropivacaína (RVC), objeto desse estudo, é um anestésico local que além de induzir menor toxicidade ao sistema nervoso central e cardiovascular, não apresenta inconvenientes quanto aos efeitos adversos como metemoglobinemia e potencial alergênico causados pela benzocaína e lidocaína. Dessa forma, este trabalho teve por objetivo desenvolver formulações contendo o anestésico local RVC para uso tópico, uma vez que não há forma comercial disponível. Sendo assim, a RVC foi associada a diferentes promotores de absorção ou a carreadores como nanopartículas de alginato-quitosana. Fatores como baixo potencial tóxico, alta permeabilidade através da pele, rápido início de ação e efeito prolongado do bloqueio anestésico foram avaliados para possível aplicação clínica. Os resultados de permeação in vitro mostraram que as formulações de RVC com promotores de absorção (mentol, polietilenoglicol-PEG 600, polietilenoglicol-PEG 400 e PEG 600 associado a Span® 20) apresentaram rápido início de ação. A duração do bloqueio sensorial (tail flick) induzido por essas formulações foi significativo, com tempo de analgesia superior a 400 minutos, o que reflete um período desejável e satisfatório para aplicação tópica. No entanto, em termos de potencial citotóxico, as formulações com PEG 600 e PEG 600 associado a Span® 20 evidenciaram viabilidade celular inferior a 50 % tanto em cultura de fibroblastos quanto em cultura celular de melanoma. Esses dados de citoxicidade mostram potencial irritativo para a pele e podendo inviabilizar essas formulações em termos de aplicação na prática clínica. A formulação com mentol não foi avaliada em termos de citotoxicidade em decorrência da insolubilidade do mentol nos meios de cultura DMEM (fibroblastos) e RPMI 1640 (células de melanoma). A RVC (2%) encapsulada em nanopartículas de alginato-quitosana mostrou o melhor perfil de permeação dentre todas as formulações desenvolvidas neste trabalho tanto em relação à velocidade de permeação e tempo para início de ação. Com referência ao potencial tóxico, a RVC 2% encapsulada em nanopartículas apresentou valores de viabilidade celular que assinalam citotoxicidade inferior a 50% tanto em fibroblastos quanto em células de melanoma Esses dados indicam baixo potencial irritativo na pele e possibilidade de aplicação clínica. Além disso, a avaliação farmacológica mostrou que o tempo de analgesia foi superior a 600 minutos, o qual confirma a efetividade anestésica da formulação desenvolvida para anestesia tópica. Dessa forma, os resultados demonstram que a incorporaçao de RVC em nanopartículas de alginato-quitosana apresenta viabilidade para aplicação clínica devido aos excelentes resultados observados, os quais evidenciam boa penetração através da pele, rápido inicio de ação, toxicidade dérmica reduzida e tempo de analgesia prolongado / Abstract: For a long time, the main function of the skin was acting as a barrier to chemical, physical and microbiological agents. However, nowadays, this concept has changed and the skin is presented as an important strategy as route of administration for several drugs, allowing the use of self-administered dosage forms, which enhances the compliance to the treatment, specially when frequent administrations are necessay. Ropivacaine (RVC), object of this study, is a local anesthetic able to induces less toxicity effects to the cardiovascular and to the central nervous system without inducing adverse effects such as methemoglobinemia neither allergenic potential similar to those of benzocaine and lidocaine. Thus, this work aimed to develop local anesthetic formulations containing the RVC, since there is no topical formulation commercially available for this drug. Therefore, RVC was associated with different permeation enhancers or nanocarriers such as alginate-chitosan nanoparticles. Factors such as low toxic potential, high permeability across the skin, fast onset of action and prolonged effect of anesthesia were evaluated for possible clinical application. Results from in vitro permeation showed that RVC formulations with absorption enhancers (menthol, polyethylene glycol-PEG 400, PEG 600 and PEG 600 associated with Span® 20) showed fast onset of action. The duration of sensory block (tail flick) induced by these formulations was significant, with a time of analgesia than 400 minutes, a period which reflects desirable and suitable for topical application. However, in terms of cytotoxic potential, the formulations with PEG 600 and PEG 600 associated with Span® 20 showed cell viability below 50% both in culture of fibroblasts and melanoma cells. These data show cytotoxicity to skin irritant and can derail these formulations in terms of application in clinical practice. The menthol formulation was not evaluated in terms of cytotoxicity due to the insolubility of menthol in the DMEM culture medium (fibroblasts) and RPMI 1640 (melanoma cells). RVC 2% encapsulated in alginate-chitosan nanocapsules showed the best permeation profile of all the formulations developed in this work in terms of permeation rate and time to onset of action. Regarding to the toxic potential, RVC 2% encapsulated in nanoparticles showed values of cell viability lower than 50% cytotoxicity in melanoma cells and fibroblasts cultures. These data indicate low toxic potential to the skin and possible advantages on clinical application. In addition, the tail-flick test showed that the duration of analgesia was greater than 600 minutes, which confirms the effectivity of this anesthetic formulation for topical anesthesia. Our results demonstrated that RVC encapsulated in alginate-chitosan nanoparticles presented potential for clinical application due to the excellent results regarding to penetration through the skin, fast onset of action, reduced dermal toxicity and prolonged duration of analgesia / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

A pele dos anfíbios atua como primeira barreira de proteção contra microorganismos invasores. Além dos componentes mecânicos, essa proteção deve incluir mecanismos bioquímicos e biológicos derivados tanto da comunidade microbiana ali residente quanto da secreção de moléculas bioativas a partir de glândulas dérmicas. Os objetivos gerais deste estudo foram: caracterizar a comunidade microbiana hospedada pela espécie Proceratophrys boiei e analisar a sua relação com comunidades microbianas ambientais; avaliar se nessa espécie a microbiota e a secreção cutâneas podem ser entendidas como um componente de proteção; avaliar a estabilidade de tais componentes a partir de diferentes populações em fragmentos florestais. Especificamente, as seguintes hipóteses foram testadas: 1. A composição da microbiota ambiental varia entre os fragmentos e micro-hábitats de Floresta Atlântica amostrados e tem relação com alguns parâmetros ambientais analisados; 2. A diversidade da microbiota cutânea de P. boiei é relacionada à diversidade da microbiota nos ambientes que ocupa. Ademais, em termos de composição, a microbiota cutânea é um subconjunto da microbiota ambiental que ocorre nos seus micro-hábitats; 3. A riqueza e abundância de bactérias da microbiota cutânea de P. boiei varia entre os diferentes remanescentes de Floresta Atlântica; 4. A riqueza e a abundância de bactérias presente na pele de P. boiei com atividade antimicrobiana varia entre populações ou locais de amostragem; 5. Existe efeito antimicrobiano das secreções sobre alguns patógenos e os perfis das secreções cutâneas diferem entre populações de P. boiei. Os resultados mostraram que a microbiota cutânea de P. boiei apresenta variações entre indivíduos e populações. Além disso, a qualidade do hábitat pode ser importante para a composição de bactérias hospedadas. Existe um compartilhamento de bactérias entre a microbiota cutânea de P. boiei e os micro-hábitats solo e água, ocupados por essa espécie, porém as comunidades dérmicas compõem-se principalmente por bactérias não detectadas nas amostras ambientais analisadas. Foi observada certa estabilidade na estrutura da microbiota cutânea de P. boiei quando analisadas populações distintas, mas variações na distribuição de morfotipos bacterianos em uma mesma localidade ocorre. Microbiota cutânea e secreções dérmicas de P. boiei podem prevenir infecções na pele, dada a atividade antimicrobiana demonstrada nesta pesquisa. Contudo, variações nos espectros de ação foram observadas em ambos os componentes, assim como, diferenças populacionais nas abundâncias e percentuais de bactérias produtoras de antimicrobianos. O estudo também demonstrou que certas características independem do contexto ambiental ocupado pelas populações, uma evidência de que o microambiente da pele dessa espécie oferece condições e certa estabilidade para a colonização de comunidades bacterianas específicas. A sustentabilidade de populações dessa espécie pode estar relacionada às interações entre hospedeiro, microrganismos e ambiente. / The skin of amphibians acts as first barrier of protection against invading microorganisms. Besides the mechanical components, this protection probably include biochemical and biological mechanisms derived from both the resident microbial community and the secretion of bioactive molecules from dermal glands. The aims of this study were to characterize the microbial community hosted by Proceratophrys boiei and analyse its relationship with environmental microbial communities; evaluate whether microbiota and skin secretion of this species can be understood as a protection component; evaluate the stability of these components through different populations in forest fragments. Specifically, the following hypotheses have guided this research: 1. The composition of environmental microbiota varies among microhabitats and fragments of Atlantic Forest and relates to some environmental parameters; 2. The diversity of skin microbiota of P. boiei relates to the diversity of microbes in the environment it occupies. Furthermore, in terms of composition, the skin microbiota is a subset of environmental microbes that occurs in its microhabitat; 3. The richness and abundance of bacteria from the skin microbiota of P. boiei varies between different remnants of Atlantic Forest; 4. The richness and abundance of bacteria present on the skin P. boiei with antimicrobial activity varies between populations or sampling sites; 5. There is antimicrobial activity of the skin secretions against some pathogens and its profiles differ between populations of P. boiei. The results showed variations on the microbial skin of P. boiei between individuals and populations and the quality of habitats could be important for the composition of hosted community. There is a sharing of bacteria between the skin microbiota of P. boiei and the microbial communities of microhabitats soil and water. However, mainly bacteria not detected in environmental samples composes the dermal communities. We observed some stability in the structure of the skin microbiota when analysed different populations, but variations in the distribution of bacterial morphotypes occurs in all sites. Skin microbiota and dermal secretions of P. boiei can prevent infection through the skin, according to the antimicrobial activity demonstrated in this study. There were variations in the action spectrum for both components, but population differences were mainly in abundance and percentage of bacteria producing antibiotics. This research showed the importance of the microbiota and skin secretion of P. boiei as components of protection and the importance of the environment for the composition of these associated communities. At the same time, we have shown that certain characteristics are independent of the environmental context occupied by the population, evidence that the microenvironment of the skin provides a certain stability for the colonization of specific bacterial communities. The sustainability of populations of this species may relates to interactions between host organisms and the environment.

Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-11-19T16:43:27Z No. of bitstreams: 1 carolina_om_aguiar_ioc_bp_0029_2010.pdf: 1531544 bytes, checksum: df1c3ac611efc557a24493255fa19eff (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-19T16:43:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carolina_om_aguiar_ioc_bp_0029_2010.pdf: 1531544 bytes, checksum: df1c3ac611efc557a24493255fa19eff (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose tegumentar americana é uma doença infecciosa causada, no Brasil, principalmente pela Leishmania (Viannia) braziliensis, onde ocorre o acometimento de pele e mucosas. A resposta imune protetora na leishmaniose é mediada por células T antígenos específicos. A freqüência destas células é muito mais elevada nas lesões do que no sangue periférico, o que demonstra que os eventos imunopatogênicos mais importantes devem estar ocorrendo no sítio infeccioso. O infiltrado inflamatório é do tipo granulomatoso, composto predominantemente por linfócitos, macrófagos e plasmócitos, com padrão de distribuição heterogêneo, o que não tem possibilitado uma boa correlação com o prognóstico da doença. As análises in situ também vêm mostrando resultados controversos em relação à distribuição das subpopulações CD4+ e CD8+. Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos que determinam a formação do infiltrado inflamatório das lesões e como a função efetora influencia a patogênese ou a cura da leishmaniose. Assim, o presente trabalho teve como objetivo estudar o perfil fenotípico dos linfócitos das lesões cutâneas de leishmaniose em termos de migração, memória e ativação celular. Os resultados apresentados neste trabalho mostram que há um menor percentual de linfócitos T CLA+ no sangue periférico de pacientes de leishmaniose do que indivíduos sadios. A estimulação com antígenos de Leishmania aumenta o percentual de células T CLA+ nos pacientes de leishmaniose, mas o mesmo não ocorre com o percentual de células T CD62L+, sugerindo que os antígenos parasitários podem modular positivamente a migração de células para o sitio cutâneo. Corroborando com a hipótese de migração dos linfócitos para o sitio da infecção, foi demonstrado que há um maior percentual de células T CLA+ nas lesões do que sangue periférico. Uma vez que os linfócitos imigraram para as lesões, as células presente nesse sítio infeccioso demonstram ter um fenótipo de células de memória efetora, de células ativadas e expressam molécula associada à citotoxicidade. Os diferentes perfis imunológicos encontrados foram correlacionados com os dados clínicos dos pacientes (tempo de evolução, área da lesão e tamanho da IDRM), a fim de avaliar a influência dessas células na patogênese da leishmaniose. Os percentuais de linfócitos T e de células T CD8+ associadas à função citotóxica, e a freqüência de células T de lesão específicas a Leishmania, assim como os percentuais de células TCD4+CD69+ e TCD3+CD244+ parecem influenciar na patogênese da doença, por se correlacionarem com a área e com tempo de evolução das lesões, respectivamente. Os dezenove pacientes estudados pertenciam a áreas endêmicas diferente, sendo assim divididos: Rio de Janeiro (RJ) e Bahia (BA). Os pacientes das áreas endêmicas da BA e RJdiferiam no tempo de evolução das lesões, onde: pacientes da BA foram classificados como lesões recentes por terem tempo mediano de evolução de 30 dias, e pacientes do RJ com lesões tardias por terem tempo mediano de evolução de 81 dias. Os pacientes BA e RJ exibem diferentes moléculas de ativação células TCD4 ativadas, onde os pacientes BA têm maiores percentuais de células TCD4+CD25+ e os pacientes RJ tem maiores percentuais de células TCD4+CD69+, mas o mesmo não ocorre com as células TCD8+ ativadas. Esses dados sugerem lesões de pacientes BA e RJ devem ser influenciadas diferentemente por células TCD4 ativadas. É possível que células TCD4+CD69+ e TCD4+CD25+ devam ter funcionalidades diferentes, mas essa hipótese deve ser futuramente avaliada nos pacientes citados acima. As quimiocinas CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α e CCL5/RANTES estão presentes nas lesões de leishmaniose causadas pela L.braziliensis. Em conjunto, esses resultados demonstram que a infecção por Leishmania influencia a migração de linfócitos para a pele, com a modulação de moléculas de migração na superfície celular e com a produção de quimiocinas capazes de atrair essas células para o local da infecção. E que linfócitos presentes no infiltrado inflamatorio com fenótipo de ativação e citotoxicidade podem influenciar napatogênese da leishmaniose cutânea / American tegumentary leishmaniasis is an infectious disease, and in Brazil, is caused mainly by Leishmania (Viannia) braziliensis. The disease manifests as localized cutaneous leishmaniasis or mucosal leishmaniasis. Immune protector response is mediated by specific T cells. The frequency of these cells is high in lesions than in peripheral blood, and suggests that more important immunological events occur in the infectious site. The inflammatory infiltrate is granulomatous type, and compose mainly by macrophages, plasmocytes and lymphocytes, with heterogeneous distribution. The histopathological pattern has no correlation with disease prognostic. In situ analyses have shown controversial results about TCD4+ and TCD8+ cells. Although, little is known about the mechanism that lead the inflammatory infiltrate formation and how effector cells influence in leishmaniasis pathogenesis or cure. The objective of present work was analysed leishmaniasis lesions T cell composition in terms of homing, memory and activation molecules expression. Lower levels of CLA T cells were observed in blood of LC patients than in healthy subjects. Leishmanial antigens upregulated CLA in T cells from cutaneous leishmaniasis patients but not from healthy subjects. In contrast, CD62L is not affected. Corroborating with T cell migration to infection sites, an enrichment of CLA+ cells was observed lesion in comparison with blood. Once infiltrate to lesions, T cells express activation and citotoxic molecules, and effector memory phenotype. The frequency of Leishmania specific T cell lesions, percentual of TCD3+ cells and TCD8+CD244+ cells are associated with lesion area. The percentual of TCD4+CD69+ cells and TCD3+CD244+ cells are correlated with duration of illness. The patients analysed were grouped by endemic area of study, Bahia or Rio de Janeiro. Different endemic area patients have different duration of illness: recent lesion was observed in Bahia´s patients and late lesion was evaluated in Rio de Janeiro´s patients. Bahia and Rio de Janeiro patients´ had different TCD4 activation pattern, where Bahia patients had higher levels of TCD4CD25 T cells and Rio de Janeiro patients had higher levels of TCD4CD69 T cells. In this work, was proposed TCD4/TCD8 ration classification, where than patients with similar levels of TCD4 and TCD8 cells have a equilibrated response with less activated and citotoxic T cells. CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1α and CCL5/RANTES are present is cutaneous leishmaniasis lesions caused by L.braziliensis. All these results showed Leishmania infection can influence the migration pattern to skin, modulating the homing moleculesand chemokine production.Activated and citotoxic T lymphocytes can influence the leishmaniasis pathogenesis

A pele dos anfíbios atua como primeira barreira de proteção contra microorganismos invasores. Além dos componentes mecânicos, essa proteção deve incluir mecanismos bioquímicos e biológicos derivados tanto da comunidade microbiana ali residente quanto da secreção de moléculas bioativas a partir de glândulas dérmicas. Os objetivos gerais deste estudo foram: caracterizar a comunidade microbiana hospedada pela espécie Proceratophrys boiei e analisar a sua relação com comunidades microbianas ambientais; avaliar se nessa espécie a microbiota e a secreção cutâneas podem ser entendidas como um componente de proteção; avaliar a estabilidade de tais componentes a partir de diferentes populações em fragmentos florestais. Especificamente, as seguintes hipóteses foram testadas: 1. A composição da microbiota ambiental varia entre os fragmentos e micro-hábitats de Floresta Atlântica amostrados e tem relação com alguns parâmetros ambientais analisados; 2. A diversidade da microbiota cutânea de P. boiei é relacionada à diversidade da microbiota nos ambientes que ocupa. Ademais, em termos de composição, a microbiota cutânea é um subconjunto da microbiota ambiental que ocorre nos seus micro-hábitats; 3. A riqueza e abundância de bactérias da microbiota cutânea de P. boiei varia entre os diferentes remanescentes de Floresta Atlântica; 4. A riqueza e a abundância de bactérias presente na pele de P. boiei com atividade antimicrobiana varia entre populações ou locais de amostragem; 5. Existe efeito antimicrobiano das secreções sobre alguns patógenos e os perfis das secreções cutâneas diferem entre populações de P. boiei. Os resultados mostraram que a microbiota cutânea de P. boiei apresenta variações entre indivíduos e populações. Além disso, a qualidade do hábitat pode ser importante para a composição de bactérias hospedadas. Existe um compartilhamento de bactérias entre a microbiota cutânea de P. boiei e os micro-hábitats solo e água, ocupados por essa espécie, porém as comunidades dérmicas compõem-se principalmente por bactérias não detectadas nas amostras ambientais analisadas. Foi observada certa estabilidade na estrutura da microbiota cutânea de P. boiei quando analisadas populações distintas, mas variações na distribuição de morfotipos bacterianos em uma mesma localidade ocorre. Microbiota cutânea e secreções dérmicas de P. boiei podem prevenir infecções na pele, dada a atividade antimicrobiana demonstrada nesta pesquisa. Contudo, variações nos espectros de ação foram observadas em ambos os componentes, assim como, diferenças populacionais nas abundâncias e percentuais de bactérias produtoras de antimicrobianos. O estudo também demonstrou que certas características independem do contexto ambiental ocupado pelas populações, uma evidência de que o microambiente da pele dessa espécie oferece condições e certa estabilidade para a colonização de comunidades bacterianas específicas. A sustentabilidade de populações dessa espécie pode estar relacionada às interações entre hospedeiro, microrganismos e ambiente. / The skin of amphibians acts as first barrier of protection against invading microorganisms. Besides the mechanical components, this protection probably include biochemical and biological mechanisms derived from both the resident microbial community and the secretion of bioactive molecules from dermal glands. The aims of this study were to characterize the microbial community hosted by Proceratophrys boiei and analyse its relationship with environmental microbial communities; evaluate whether microbiota and skin secretion of this species can be understood as a protection component; evaluate the stability of these components through different populations in forest fragments. Specifically, the following hypotheses have guided this research: 1. The composition of environmental microbiota varies among microhabitats and fragments of Atlantic Forest and relates to some environmental parameters; 2. The diversity of skin microbiota of P. boiei relates to the diversity of microbes in the environment it occupies. Furthermore, in terms of composition, the skin microbiota is a subset of environmental microbes that occurs in its microhabitat; 3. The richness and abundance of bacteria from the skin microbiota of P. boiei varies between different remnants of Atlantic Forest; 4. The richness and abundance of bacteria present on the skin P. boiei with antimicrobial activity varies between populations or sampling sites; 5. There is antimicrobial activity of the skin secretions against some pathogens and its profiles differ between populations of P. boiei. The results showed variations on the microbial skin of P. boiei between individuals and populations and the quality of habitats could be important for the composition of hosted community. There is a sharing of bacteria between the skin microbiota of P. boiei and the microbial communities of microhabitats soil and water. However, mainly bacteria not detected in environmental samples composes the dermal communities. We observed some stability in the structure of the skin microbiota when analysed different populations, but variations in the distribution of bacterial morphotypes occurs in all sites. Skin microbiota and dermal secretions of P. boiei can prevent infection through the skin, according to the antimicrobial activity demonstrated in this study. There were variations in the action spectrum for both components, but population differences were mainly in abundance and percentage of bacteria producing antibiotics. This research showed the importance of the microbiota and skin secretion of P. boiei as components of protection and the importance of the environment for the composition of these associated communities. At the same time, we have shown that certain characteristics are independent of the environmental context occupied by the population, evidence that the microenvironment of the skin provides a certain stability for the colonization of specific bacterial communities. The sustainability of populations of this species may relates to interactions between host organisms and the environment.

A hipovitaminose de vitamina D é um problema global de saúde e a sua deficiência compromete funções importantes ao corpo humano. A suplementação oral, políticas de fortificação em alimentos e mudanças dos hábitos de vida são medidas efetivas para solucionar este problema. Porém, pessoas com doença de Crohn, celíaca, fibrose cística, bypass gástrico e que fazem uso de medicamentos sequestradores de ácido biliares possuem a absorção intestinal de vitamina D comprometida. A via transdérmica pode ser uma alternativa de administração de vitamina D3, porém poucas referências bibliográficas abordam sobre o assunto. A proposta do presente estudo é o desenvolvimento de sistemas transdérmicos com a combinação de promotores de permeação químicos: lecitina de soja, palmitato de isopropila, etoxidiglicol (Transcutol® CG), propilenoglicol e etanol, acrescidos do ingrediente ativo vitamina D3, a validação analítica para quantificação do ativo em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), a avaliação da estabilidade, segurança, retenção e permeação cutânea. A validação do método analítico de quantificação da vitamina D3 em CLAE foi considerada específica, linear, precisa e exata. O limite de detecção foi 20 ng/mL e de quantificação 40 ng/mL. Os testes de estabilidade foram realizados (preliminar, acelerado e normal) e a melhor condição de armazenamento foi a geladeira (5,0 ± 2,0 ºC) durante 90 dias. A condição de radiação luminosa foi a menos adequada, o que indica que o armazenamento deve ser realizado em frascos protegidos da luz (âmbar). No teste de segurança de irritação (HET-CAM) as formulações testadas foram consideradas não irritantes. No teste de retenção e permeação cutânea a solubilidade da vitamina D3 foi avaliada para garantir a sink condition do líquido receptor escolhido: Phosfate Buffer Saline (PBS) com etanol a 50% e a integridade da pele foi garantida com o teste de perda de água transepidérmica (TEWL). A formulação desenvolvida com a presença de todos os promotores de permeação avaliados (F1) e o controle, apenas com a presença do etanol e o propilenoglicol, foram avaliados. A F1 permaneceu na superfície da pele, por possuir maior afinidade com a fase oleosa da formulação e houve tendência de hidratação desta formulação. O controle demonstrou uma retenção cutânea em 4 h no estrato córneo e em 24 h na epiderme e derme. Concluiu-se que a formulação desenvolvida é estável, segura e a vitamina D3 ficou retida na pele, o que indica o uso tópico da mesma. A alta lipofilicidade foi a justificativa dos resultados apresentados e futuros estudos podem ser realizados com derivados menos lipofílicos da vitamina D para avaliar a via transdérmica. / Hypovitaminosis D is a global health issue and vitamin D deficiency compromises important functions to the human body. Oral supplementation, fortification food and changes in live style are effective measures to solve this problem. However, people with Crohn\'s disease, celiac disease, cystic fibrosis, gastric bypass and who use bile acid-binding medications have compromised intestinal vitamin D absorption. The transdermal route may be an alternative for vitamin D3 administration, but few references refer to the subject. The purpose of the present study is the development of transdermal systems with the combination of penetrations enhancers (soybean lecithin, isopropyl palmitate, ethoxydiglycol (Transcutol® CG), propylene glycol and ethanol) with vitamin D3, the analytical validation for quantification of the active in High Performance Liquid Chromatography (HPLC), stability assessment, safety, skin retention and permeation. The validation of the analytical method for quantification of vitamin D3 in HPLC was considered specific, linear, precise and accurate. The limit of detection was 20 ng/mL and 40 ng/mL. Stability assessment was performed and the appropriate storage condition was the refrigerator (5.0 ± 2.0 ° C) for 90 days. The indirect solar radiation condition was not adequate, which indicates that the storage should be performed in light-protected bottles (amber). In the irritation safety test (HET-CAM) the formulations tested were considered non-irritant. In the skin permeation and retention test the solubility of vitamin D3 was evaluated to guarantee the sink condition of the receptor fluid: Phosfate Buffer Saline (PBS) with 50% ethanol and skin integrity was guaranteed with Transepidermal Water Loss (TEWL). The developed formulation with the presence of all penetrations enhancers evaluated (F1) and the control formulation with the presence of ethanol and propylene glycol were assessed. F1 remained on the surface of the skin, because it had greater affinity with the oily phase of the formulation and there was tendency of hydration to this formulation. The control formulation demonstrated skin retention in 4 hours in the stratum corneum and in 24 hours in the epidermis and dermis. The study concluded that the formulation developed is stable, safe and vitamin D3 was retained in the skin, which indicates the topical use. High lipophilicity was the explanation of the presented results and future studies can be carried out with less lipophilic derivatives of vitamin D to evaluate the transdermal route.