No description available.

ABSTRACT Mixed function oxygenase system participates in biosynthesis of endogenous and metabolism of exogenous substances (e.g. drugs or chemical procarcinogens) in an organism. Substrates are biotransformed by terminal oxygenases - cytochromes P450 (P450). Catalytic properties of certain P450s (e.g. studied isoform 2B4) are altered in the presence of a redox partner - cytochrome b5 (cyb5). Both cytochromes are anchored by hydrophobic domains in a lipid membrane of endoplasmic reticulum whereas their catalytic domains are exposed to cytosol. Two zero-length cross-linking approaches were employed to extend present knowledge of P450 2B4 and cyb5 protein structure and protein-protein interactions: (1) interlinking of carboxylate and primary amine groups of amino acids by water soluble 1- ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC), and (2) photo-initiated cross-linking by photo-labile methionine analog (pMet), which links to any amino acid after activation by UV-irradiation, either in hydrophilic or hydrophobic environment. pMet was incorporated to methionine site(s) of cyb5 during recombinant expression in E. coli, which was carried out in limit medium supplemented with amino acid analog. Optimization of experimental conditions led to ~20-30% substitution of the natural amino acid. Covalent...

No description available.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / L'échec de la transplantation est dû en partie aux dormnages causés par la préservation à froid et la réperfiision à chaud lors de l'intervention. Parmi les hypothèses retenues pour expliquer ces dommages, on retient la formation des radicaux libres et les perturbations du pH, du calcium et du volume cellulaire. L'ajout de certaines substances dans le milieu de préservation a permis de prolonger de 6h à 24h la survie de l'organe. Malgré le développement de solutions de préservation qui diminuent le gonflement cellulaire des foies à transplanter, les dommages de la reperfusion chaude ne sont pas abolis. Il se peut donc, que l'hypothermie anoxique altère les mécanismes de régulation du volume cellulaire et que ces perturbations contribuent aux dommages observés lors de la reperfusion du greffon chez le receveur. Afin de vérifier cette hypothèse, nous avons vérifié dans le premier chapitre si les conditions de la préservation à froid suivie du réchauffement entravaient la diminution ou l'augmentation compensatrice de volume observé respectivement après un choc hypotonique (retrait de 50 mmol de NaC1). Notre étude démontre que les hépatocytes préservés dans la solution de l'Université de Wisconsin (UM.) ont été moins résistants aux stress osmotiques, ce qui peut rendre les cellules moins aptes à répondre aux stimulations physiologiques comme l'accumulation des acides aminés, spécialement lors des demandes métaboliques et l'alimentation parentérale riche en acides aminés. Ceci devrait être confirmé dans les conditions in vivo. Cependant, nos résultats supportent la notion que la perturbation du volume cellulaire homéostasique peut correspondre au dysfonctionnement primaire observé dans 15% des cas lors de la transplantation hépatique. Subséquemment, nous avons étudié l'impact de la préservation et la réperfusion à chaud sur le transport hépatique d'acides aminés couplés au Na ( 1 0 mM). Nous avons mesuré par la technique de vidéoplanimétrie les changements initiaux de volume qui reflètent l'accumulation des acides aminés. Nous avons constaté qu'en fonction du temps de préservation les transporteurs sont affectés différemment. Le gonflement induit par la proline, substrat spécifique du système ASC est très sensible à la préservation à froid dans la solution U.W. chutant de 50 % après 24h de préservation comparée avec le contrôle sans préservation, en opposition à la glutamine ou à l'analogue de l'alanine. Ceci nous a conduit à proposer que le gonflement induit par la proline représente un index fonctionnel sensible de l'intégrité des cellules du foie. Dans le second chapitre, nous avons comparé l'efficacité de la solution U.W. et la solution Sodium-Lactobionate-Sucrose (SLS) dans leurs capacités à maintenir la viabilité cellulaire et une fonction différenciée des cellules du foie (gonflement induit par l'addition de 10 mM de Proline, substrat spécifique du système ASC). Enfin, dans le troisième chapitre, nous avons comparé l'effet de ces deux solutions (U.W./SLS) sur le métabolisme des médicaments et l'activité catalytique du cytochrome P-450 au niveau des cellules isolées de foie de rat. Cette activité catalytique est calculée par la mesure de la concentration totale du cytochrome P-450 et des métabolites de la théophylline générés après 4h d'incubation. La théophylline est utilisée car elle est métabolisée par plusieurs isoformes du cytochrome P-450: cytochrome P-450 1A2, 2D6, 2E1 et 3A4 dont l'aboutissement est le 1,3-DMU qui est son métabolite majeur. Nous avons noté que la majorité de perturbations observées dans notre modèle in vitro est entre 10 et 24 h de préservation à froid des hépatocytes dans les deux solutions (U.W./SLS). Ceci correspond à la période 12 h de préservation à froid des foies humains dans la solution U.W., qui représente un facteur de risque relatif pour un mauvais pronostic, responsable de dysfonctionnement primaire observé dans 15% des cas lors de la transplantation hépatique. Nos données démontrent clairement que la préservation à froid des hépatocytes dans la solution SLS, préparée au laboratoire à coût très réduit, donne des résultats équivalent à ceux de la solution U.W. (commercialisée par Dupont) quant à sa capacité à maintenir la viabilité cellulaire, l'intégrité fonctionnelle des cellules du foie et le métabolisme des médicaments. Ceci suggère que la solution SLS, qui n'est qu'une variante de la solution U.W., est suffisante pour obtenir les effets bénéfiques de préservation de la solution élaborée expérimentalement (Belzer et Southard, 1988). Donc certains composants de la solution U.W. ne peuvent apporter aucun impact bénéfique comparé à la solution SLS à composition beaucoup plus simple. Une approche intéressante pourrait être établie sur une solution aussi simple que la SLS à laquelle des agents pharmacologiques et cytoprotecteurs peuvent être ajoutés. Ceci permettra de maintenir l'efficacité des fonctions hépatiques et d'améliorer la survie des greffes du foie, menant ainsi à un meilleur pronostic de la transplantation du foie.

No / The identification of an agent that is selectively activated by a cytochrome P450 (CYP) has the potential for tissue specific dose intensification as a means of significantly improving its therapeutic value. Towards this goal, we disclose evidence for the pathway of activation of a duocarmycin analogue, ICT2700, which targets CYP1A1 for biological activity.

L'arsenal thérapeutique utilisé dans le traitement de l'hypertension artérielle est vaste, généralement efficace et sécuritaire. Pourtant, les études populationnelles démontrent que les médicaments antihypertenseurs permettent une maîtrise adéquate de la tension artérielle dans moins de 50% des patients hypertendus. Parmi les causes pouvant expliquer ce phénomène, on note l'existence d'une grande variabilité interindividuelle dans la réponse aux agents antihypertenseurs. L'identification des facteurs responsables de cette variabilité permettrait de personnaliser davantage les approches thérapeutiques actuelles afin d'en améliorer les bénéfices cliniques. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse de doctorat se rapportent aux déterminants génétiques de la réponse aux agents antihypertenseurs. Trois études cliniques ont ainsi été réalisées afin d'évaluer l'impact de polymorphismes génétiques sur l'efficacité et l'innocuité d'agents de classes pharmacologiques différentes. La première étude a mis en évidence le rôle joué par le polymorphisme Met235Thr du gène de l'angiotensinogène dans le taux de réponse au losartan, un agent antihypertenseur de la classe des antagonistes des récepteurs à l'angiotensine Il. Les résultats de cette étude ont également démontré l'influence qu'exerce ce polymorphisme sur la tension artérielle de base, notamment chez les femmes homozygotes DO pour le polymorphisme de délétion / insertion de l'intron 16 du gène de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ECA). La deuxième étude clinique a permis d'identifier un groupe de patients présentant une susceptibilité accrue pour la toux sèche secondaire aux inhibiteurs de l'ECA. Les patients doubles homozygotes pour le polymorphisme d'insertion / délétion de l'intron 1 du gène du récepteur de type 2 à la bradykinine (+9/+9) et pour celui d'insertion / délétion de l'intron 16 du gène de l'ECA (DD), ont développé la toux caractéristique de cette classe de médicaments dans près de 80% des cas. Enfin, la troisième étude a démontré que les variations génétiques du cytochrome P450 206 étaient associées à d'importants changements dans le métabolisme du nébivolol, un bêta-bloqueur de 3ième génération fortement hydroxylé par cette enzyme. L'étude n'a néanmoins révélé aucune variation significative dans les effets antihypertenseurs de ce médicament. En conclusion, les résultats de ces trois études apportent des éléments nouveaux dans la compréhension des déterminants génétiques de la réponse aux agents antihypertenseurs. La poursuite de ces études pourra éventuellement aider les cliniciens à personnaliser davantage l'utilisation des agents antihypertenseurs chez leurs patients.

Les patients admis aux soins intensifs (SI) souffrent de comorbidités qui affectent leur pronostic. Deux problèmes sont potentiellement associés aux sédatifs et compliquent le séjour de 35 à 50% des malades : le délirium, un état confusionnel aigu; et le coma ‘iatrogénique’, une altération de la conscience induite pharmacologiquement. L’importance de l’association entre clinique et médicaments a un intérêt pour prévenir ces syndromes cliniques morbides. Nous voulions étudier le délirium et le coma iatrogénique, les doses administrées de midazolam et de fentanyl, leurs niveaux plasmatiques, les variantes génétiques de métabolisme et de transport et les facteurs inflammatoires et ce, chez 100 patients admis aux soins intensifs. Nos données soulignent l’importance des interactions médicamenteuses dans l’incidence du coma iatrogénique, et réfutent l’association entre les benzodiazépines et le délirium. Ces résultats clarifient la pathophysiologie du délirium, corroborent le manque d’association délirium-benzodiazépines avec un marqueur biologique, c.-à-d. les niveaux sériques, et ouvrent le débat quant aux agents les plus utiles pour traiter l’anxiété et le délirium. Finalement, plusieurs caractéristiques pharmacocinétiques des benzodiazépines administrées aux soins intensifs publiées récemment complètent les données de notre étude quant à la sédation en soins critiques. Un chapitre sur l’importance de la pharmacogénomique en soins intensifs et un débat publié quant au pro et con de l'utilisation des benzodiazépines aux SI, sont soumis en complément de l’étude clinique décrite ci-haut effectuée dans le cadre de cette maîtrise. / Critically ill patients suffer from co-morbid conditions that impact on their prognosis. Two problems complicate Intensive Care Unit (ICU) stay in 35-50% of patients and are potentially associated with sedatives: delirium, an acute confusional state, and 'iatrogenic' coma, when consciousness is altered pharmacologically. Establishing the association between these clinical syndromes and administering sedatives is key in planning effective prevention of these morbid complications. We studied iatrogenic delirium and coma in 100 ICU patients given midazolam and/or fentanyl, and tallied drug doses, measured plasma levels, genetic variations in metabolism and transport and inflammatory factors. Our data highlight the role drug-drug interactions play in iatrogenic coma, and refute the association between benzodiazepines and delirium. These results clarify the pathophysiology of delirium, corroborate the lack of delirium-benzodiazepine association with a benzodiazepine biological marker, i.e. serum levels, and open the debate as to which agents are useful for treating anxiety and delirium. Recent publications addressing benzodiazepine pharmacokinetics in critical care complement our data in the field of critical care sedation. A chapter on the importance of pharmacogenomics in intensive care, and a published pro-con debate as to benzodiazepine use in critical care are submitted in addition to the clinical study mentioned above as part of this master’s thesis.

INTRODUÇÃO. A Imunodeficiencia comum variável (ICV) é uma doença heterogênea caracterizada pela redução dos niveis de IgG, IgA e/ou IgM e da função de anticorpo. As manifestações clínicas incluem a presença de infecções recorrentes ou crônicas, doenças inflamatórias/autoimunes e incidência aumentada de malignidades como linfomas e carcinomas, caracterizando-se, consequentemente, por um estado de ativação imune persistente e alterações do metabolismo oxidativo. Tanto a paraoxonase 1(PON1) quanto o polimorfismo do citocromo p450 (CYP) 2E1 têm importante participação nos processos oxidativos, controlando a extensão dos danos causados por alterações na concentração de oxidantes. Acredita-se que, tal qual ocorre na população normal, tanto a PON1 quanto a CYP2E1 tenham importante papel na gravidade e na sobrevida dos pacientes com ICV. OBJETIVO: estudar os polimorfismos de PON1 e CYP2E1, bem como a atividade arilesterase da PON1, e sua relação com o perfil lipídico, características clínicas, morbidade e mortalidade em pacientes com ICV. MÉTODOS/RESULTADOS: Foram avaliadas as frequências alélicas dos polimorfismos de PON1 e CYP2E1, o perfil lipídico e a atividade arilesterase da PON1 em 101 pacientes com ICV e 16 pacientes com hipogamaglobulinemia secundária (HS) e 130 controles saudáveis. Nos dois grupos de pacientes foi analisada a presença de parâmetros clínicos e laboratoriais, morbidade e gravidade da doença. Houve diferença na frequência dos genótipos de PON1-L55M entre pacientes primários e secundários, sendo o alelo 55L e o genótipo 55LM mais frequente no grupo HS. A atividade arilesterase de PON1 mostrou-se menor nos pacientes com ICV em relação ao grupo controle, com pacientes do genótipo 55MM apresentando os menores valores de atividade. Pacientes com o genótipo 55MM apresentaram doença mais grave quando comparados aos demais grupos genotípicos, sendo essa diferença causada não por uma característica deletéria deste genótipo, mas pelo papel protetor desempenhado pelo alelo 55L; pacientes portadores desse alelo apresentaram menor prevalência de manifestações graves como neoplasias, hepatomegalia, sepse e óbitos, bem como maior sobrevida daqueles que apresentavam ao menos uma cópia deste alelo. CONCLUSÃO: Este constitui o primeiro relato demonstrando maior frequência do genótipo 55LM e do alelo 55L em pacientes com hipogamaglobulinemia secundária e de menor atividade arilesterase em pacientes com ICV portadores do genótipo 55MM. Nossos resultados são sugestivos de que a presença do alelo 55L possa desempenhar papel protetor na ICV. Além disso, foi constatado que a presença de linfonodomegalia, hepatomegalia, esplenomegalia, sepse e hipertensão portal possam ser fatores preditivos tanto de um quadro de doença mais grave quanto de maior mortalidade / Introduction: Common Variable Immunodeficiency (CVID) is a heterogeneous disease characterized by reduced levels of IgG, IgA and / or IgM and antibody function. Clinical manifestations include the presence of recurrent or chronic infections, inflammatory/autoimmune diseases, and increased incidence of malignancies such as lymphomas and carcinomas, which is characterized by a state of persistent immune activation and alterations in oxidative metabolism. Both paraoxonase 1 (PON1) and cytochrome p450 (CYP) 2E1 polymorphism have an important role in oxidative processes, controlling the extent of damage caused by changes in oxidant concentration. It is believed that, as in the normal population, both PON1 and CYP2E1 play an important role in the severity and survival of patients with CVID. Objectives: to study the polymorphisms of PON1 and CYP2E1, as well as the arilesterase activity of PON1, and its relation with the lipid profile, clinical characteristics, morbidity and mortality in patients with CVID. Methods/Results: The allelic frequencies of the PON1 and CYP2E1 polymorphisms, the lipid profile and the arilesterase activity of PON1 in 101 patients with CVID and 16 patients with secondary hypogammaglobulinemia (HS) and 130 healthy controls were evaluated. The presence of clinical and laboratory parameters, morbidity and severity of the disease were analyzed in both groups of patients. There was a difference in the frequency of PON1-L55M genotypes between primary and secondary patients, being the 55L allele and the 55LM genotype more frequent in the HS group. The arilesterase activity of PON1 was lower in patients with CVID than in the control group, with patients of the 55MM genotype showing the lowest values. Patients with the 55MM genotype presented a more severe disease when compared to the other genotype groups, this difference is being caused not by a deleterious characteristic of this genotype, but by the protective role played by the 55L allele; patients with this allele had a lower prevalence of severe manifestations such as malignancies, hepatomegaly, sepsis and deaths, as well as a longer survival of those who had at least one copy of this allele. CONCLUSION: This is the first report showing a higher frequency of the 55LM genotype and the 55L allele in patients with secondary hypogammaglobulinemia and of lower arilesterase activity in patients with CVID with 55MM genotype. Our results suggest that the presence of the 55L allele may play a protective role in CVID. In addition, it was found that the presence of lymph node enlargement, hepatomegaly, splenomegaly, sepsis and portal hypertension may be predictive factors of both a more severe disease and a higher mortality rate

Neben Zigarettenrauchen und chronischem Alkoholkonsum scheinen genetische Faktoren bei der Entstehung und im Verlauf der Kopf-Hals-Karzinom Erkrankung bedeutsam zu sein. Genvariationen in den Enzymen, die zigarettenrauch-assoziierte Karzinogene (Glutathion-S-Transferase, GST, Cytochrom P450, CYP) metabolisieren, sowie Genvariationen in immunregulierenden Zytokinen (Tumor-Nekrose-Faktor) könnten Grund dieser Beeinflussung sein. Ziel dieser Studie war es, genetische Wirtsfaktoren zu identifizieren, die das Erkrankungsrisiko und das Tumorverhalten bzw. den Krankheitsverlauf von Plattenepithelkarzinomen im oberen Aerodigestivtrakt beeinflussen. Wir beschreiben den Zusammenhang zwischen Genotypen an GSTM1, M3, T1, P1, CYP2D6, 1A1, 2E1 und TNF Mikrosatelliten-Genorten und der Krankheitsentstehung sowie Tumorcharakteristika wie der initialen Tumorgröße, der Halslymphknotenmetastasierung, dem histologischen Differenzierungsgrad des Tumorgewebes und dem rezidivfreien Überleben bei 465 Patienten. Die Genotypen wurden aus der Leukozyten-DNA mittels PCR in Kombination mit Restriktionsenzymverdauungen und Elektrophoresetechniken identifiziert. Sowohl bei den Genvariationen in den entgiftenden Enzymen als auch bei den TNF Mikrosatelliten-Polymorphismen konnten Risikogenotypen festgestellt werden. Die Beeinflussung des Krankheitsverlaufs war teilweise deutlicher ausgeprägt, als die Beeinflussung der Krankheitsentstehung. Patienten mit Mehrfachkarzinomen wiesen die stärkste Anhäufung von Risikogenotypen auf. In dieser Studie konnte erstmals gezeigt werden, daß individuelle Genotypkonstellationen die Entstehung und das Verhalten von Plattenepithelkarzinomen im oberen Aerodigestivtrakt beeinflussen. / Cigarette smoking and alcohol consumption are the main risk factors for the development of head and neck cancer. Additionally, genetic factors seem to be influential. Gene variations in detoxifying enzymes such as glutathione S-transferase (GST) and cytochrome P450 (CYP) and variations in immune regulating proteins like tumor necrosis factor (TNF) are candidate genes. Accordingly, we have examined, in 465 patients with squamous cell carcinoma (SCC) of the head and neck, associations between GSTM1, GSTT1, GSTM3, GSTP1, CYP2D6, CYP1A1, CYP2E1 genotypes and TNF microsatellite polymorphisms and cancer susceptibility, outcome parameters like tumor extension, histological grade, and presence of lymph nodes, and tumor recurrence. Genotypes were determined by PCR; logistic regression and a step-wise model were used to investigate the influence of the individual genes. Individual genotypes in the detoxifying enzymes and TNF were associated with altered cancer risk. The influence on tumor behavior was partially stronger. Patients suffering multiple head and neck cancer showed the highest cumulation of risk mediating genotypes. The data demonstrate site-dependent associations between GST, CYP and TNF genotypes and tumor susceptibility, tumor extension, differentiation, and lymph node involvement, and tumor recurrence in SCC of the head and neck.

Abstract not available