Mature T-cell leukemias represent rare, but increasingly recognized diseases of which, compared to their B-cell counterparts, comparatively little is established on their pathogenesis, diagnosis, and treatment. These leukemic post-thymic T-cell neoplasms range from the spectrum of chronic, sometimes debilitating disorders such as T-large granular lymphocytic leukemia (T-LGLL), and related leukemias such as NKLGLL, to more aggressive malignancies such as T- prolymphocytic leukemia (T-PLL). In this series, entitled ‘Pathogenesis, Treatment, and Future Directions for Rare T-cell Leukemias’ we review the current state of the science of these important T-cell neoplasms to inform on their treatment, diagnosis, and pathophysiology.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Since late 1980s, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) has emerged as the most economically important swine pathogen affecting pig industries worldwide. Vaccination is the principal means that have been used for prevention of PRRSV infection. However, the currently available vaccines for PRRSV are generally considered as not very effective. One of the major obstacles for developing an effective modified live-attenuated vaccine (MLV) with broad protection is the delayed and insufficient immune responses mounted by PRRSV, and the problem is further exacerbated by the antigenic variations of the constantly-evolving field strains of PRRSV. In order to boost the immune response induced by the MLV vaccine virus, we evaluated the immunogenicity and vaccine efficacy of recombinant PRRSV MLVs expressing porcine IL-15 or IL-18 as adjuvants. The cytokine genes were fused with a GPI modification signal so that they are anchored onto the cell surface upon infection with the recombinant MLV. Both cytokines are successfully expressed on the cell membrane of porcine alveolar macrophage (PAMs) after recombinant MLVs infection in vitro. Subsequently, pigs vaccinated with cytokine-expressing recombinant PRRSV MLVs had an improved antiviral response of cytotoxic lymphocytes including natural killer (NK) cells and T cells, characterized by increased IFN-γ secretion and/or enhanced CD107a expression. The results offer a novel strategy to incorporate cytokine genes into PRRSV genome as potent bio-active adjuvants expressed by the vaccine virus itself. Since we showed that PRRSV VR2385 down-regulated swine leukocyte antigen class I surface expression, naturally the next logical question is which viral protein is responsible for this down-regulation. To answer the question, we cloned and expressed all known PRRSV structural and non-structural proteins and examined which protein(s) is involved in SLA-I downregulation. Our results identified the newly-discovered nonstructural protein Nsp2TF of PRRSV as the main mediator in down-regulating SLA-I expression. We also demonstrated that the Nsp2TF-knockout mutant virus lost its function of negatively modulating SLA-I presentation compared to the wild-type virus. The results suggest that disruption of the Nsp2TF's ability to down-regulate SLA-I expression may improve the existing PRRSV vaccines towards a better CMI response against the virus. / PHD / Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is an important swine pathogen, causing enormous economical losses in the pork industry worldwide. However, the vaccine program is not satisfactory, with the insufficient protection against genetically divergent strains and newly emerged strains. One of the most important reasons is that PRRSV is able to suppress immune responses in the host, but the underlying mechanisms are not well known. Therefore, the first dissertation study is to investigate novel strategies of developing live-attenuated vaccines with improved efficacy against PRRSV. In this study, we successfully generated recombinant PRRSV live vaccines that are able to express immuno-activating cytokines as adjuvants. Subsequently, pigs vaccinated with cytokine-expressing PRRSVs had significantly improved anti-PRRSV immune repsonses when compared to pigs vaccinated with unmodified PRRSV. Those recombinant PRRSVs also provided cross-protection against a heterologous PRRSV challenge. The second part of disseration research is to understand the mechanism of immune modulation by PRRSV. Our results showed that one of PRRSV proteins- Nsp2TF contributes to the PRSV-induced down-regulation of swine leukocyte antigen (SLA) class I expression. Since SLA class I molecules are essential in the activation of the immune response and required for the clearance of viruses, Our study suggested that knocking-out Nsp2TF could be of great value to generate PRRSV vaccines with a better immune response.

Die von T-Helfer (Th) -Zellen produzierten Zytokine spielen eine entscheidende Rolle bei der Einleitung, der Aufrechterhaltung und der Regulation von Immunantworten. Bei der Untersuchung von Immunantworten hat sich eine vereinfachte Einteilung der Th-Zellen in zwei Klassen als hilfreich erwiesen: Th1 und Th2. Stabil differenziell exprimierte Oberflächenmoleküle werden benötigt, um lebende Th1- und Th2-Zellen identifizieren, auf Einzelzellebene charakterisieren und möglicherweise die von ihnen erzeugten Immunantworten modulieren zu können. Auf der Suche nach solchen Molekülen wurde in Zusammenarbeit mit der Firma Millennium Pharmaceuticals das Oberflächenmolekül TIM-3 entdeckt. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit belegen, dass TIM-3 nicht nur von CD4+ Th-Zellen, sondern auch von CD8+ T-Zellen, gamma/delta-T-Zellen, sowie einigen Makrophagen und der Mehrheit der dendritischen Zellen in der Milz von Mäusen auf der Zelloberfläche exprimiert wird. Die Expression von TIM-3 auf Th-Zellen ist klar mit einem aktivierten Phänotyp assoziiert. TIM-3 wird unter polarisierenden Bedingungen in vitro im Vergleich zu Th2-Zellen bevorzugt, jedoch nicht ausschließlich von Th1-Zellen exprimiert. Erstmals wurde auf Einzelzellebene die Zytokinproduktion TIM-3 exprimierender Th-Zellen untersucht. Die Analyse von Th0-Zellen, welche unter nichtpolarisierenden Bedingungen in vitro hergestellt wurden, ergab keine bevorzugte Produktion von Th1-Zytokinen und keine verminderte Expression von Th2-Zytokinen durch TIM-3 exprimierende Th-Zellen. Aufgrund der in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse erlaubt die Expression von TIM-3 allein daher nicht die Identifizierung von Th1-Zellen. Nach einer Infektion mit Toxoplasma gondii lag jedoch eine bevorzugte Assoziation zwischen der Expression von TIM-3 und der pathogenspezifischen Produktion von Interferon (IFN)-gamma, Interleukin (IL)-2 und Tumor Nekrose Faktor (TNF)-alpha vor. Somit korreliert die TIM-3 Expression auf Th-Zellen nur unter bestimmten Bedingungen mit einem Th1-Phänotyp. / The cytokines that are produced by T helper (Th) cells are decisive for the initiation, the maintenance and the regulation of immune responses. A simplified classification of Th cells has proven to be useful for the analysis of immune responses: Th1 and Th2. Stably and differentially expressed surface molecules are required for the identification of live Th1- and Th2-cells, their characterisation at the single cell level and the possible modulation of the immune responses that they induce. On the search for such molecules the surface molecule TIM-3 was discovered in collaboration with Millennium Pharmaceuticals. The present work shows that TIM-3 protein is not only expressed on the cell surface by CD4+ Th cells but also by CD8+ T cells and gamma/delta T cells as well as by some macrophages and the majority of the dendritic cells in the murine spleen. TIM-3 expression on Th cells is clearly associated with an activated phenotype. Under polarising conditions in vitro TIM-3 is expressed preferentially albeit not exclusively by Th1 cells compared to Th2 cells. For the first time, the cytokine production of TIM-3 expressing Th cells has been analysed at the single cell level. The analysis of Th0 cells, generated under non-polarising conditions in vitro showed no preferential production of Th1-cytokines and no diminished production of Th2-cytokines by TIM-3 expressing Th-cells. The results obtained in this work lead to the conclusion that expression of TIM-3 does not permit the identification of Th1-cells. However upon infection with Toxoplasma gondii a positive association between the expression of TIM-3 and the pathogen-specific production of Interferon (IFN)-gamma, Interleukin (IL)-2 and Tumor Necrosis Factor (TNF)-alpha was observed. Therefore the expression of TIM-3 on Th-cells only correlates under specific conditions with a Th1-phenotype.

Streptococcus pneumoniae ist ein gram-positives Bakterium und ein Krankheitserreger des Menschen. Ein Charakteristikum des Bakteriums ist, dass es Cholin-Reste in seine dicke Zellwand einbaut. Das Ziel meiner Doktorarbeit war herauszufinden, inwiefern diese Cholin-Reste zur Virulenz des Bakteriums während experimenteller Sepsis und Meningitis beitragen. Dabei konnte ich feststellen, das cholinierte Wildtyp-Bakterien hoch virulent waren, ungestört im Wirt wachsen konnten und letztendlich zu einer massiven Überaktivierung des Wirts-Immunsystems (gemessen anhand der Zytokine IL-1beta, IL-6, IL-12, TNFalpha) sowie zum Tode der Versuchtiere führten. Im Gegensatz dazu waren cholin-freie Bakterien nicht in der Lage eine permanente Infektion im Wirt zu etablieren. So wuchsen sie nur anfangs und wurden vom Wirts-Immunsystem kontrolliert und beseitigt, sodass alle Tiere überlebten. Die Injektion von cholin-freien und cholinierten, hoch aufgereinigten Zellwänden, führte zu der Schlussfolgerung, dass Cholin in der Zellwand ein Immunevasionsmechanismus der Bakterien sein muss. Ausserdem waren cholin-freie Bakterien in der Lage einen protektiven, serotyp-spezifischen Immunschutz im Wirt zu induzieren. / Streptococcus pneumonia is a major human pathogen. Since it is a gram positive bacterium it is characterized by the production of a thick cell wall. Being auxotrophic for choline, the pneumococcus attaches this aminoalcohol to its teichoic acids thus decorating its surface with choline-residues. The aim of this work was to investigate the role that these choline residues play in the virulence of the bacterium. By using an isogenic choline-containing and choline-free pair of S. pneumoniae I was able to demonstrate that surface bound choline is essential for the virulence of the bacterium in animal models of experimental sepsis and meningitis. In either model choline-containing bacteria were able to persistently grow within the host system, continuously stimulate the production of proinflammatory cytokines (IL-1beta, IL-6, IL-12, TNFalpha) and eventually led to the death of all infected animals within 24h. In contrast, choline-free bacteria showed only transient growth within the host and induced only moderate and limited expression of cytokines. Consequently, the bacterium was virtually avirulent and all animals survived. Intracisternal application of highly purified cholinated and choline-free cell wall preparations, induced a comparable activation of the immune system. These findings led to the conclusion that choline residues contribute to an immunevasion strategy that allows the bacteria to grow despite an ongoing immune response. Although being avirulent choline-free bacteria were able to induce serotype specific immunity in the animals.

Zirkulierende inflammatorische Mediatoren spielen eine zentrale Rolle in der Induktion und Unterhaltung eines septischen Multiorganversagens (MOV). Tritt im Rahmen eines septischen MOV ein akutes Nierenversagen auf, so wird der Einsatz einer Nierenersatztherapie notwendig. Kontinuierliche Nierenersatztherapieverfahren (CRRT) haben sich hier bewährt. Der Einsatz von CRRT zur adjuvanten Therapie des septischen MOV ist in den neunziger Jahren aufgekommen. Grundlage bildet die Hypothese, dass durch die Reduktion von Spitzenpegeln pro- and anti-inflammatorischer Mediatoren im Blutplasma die Homöostase der Immunabwehr wiederhergestellt werden kann. Kommerziell erhältlichen Hämofilter weisen aufgrund ihrer Konstruktion nur eine geringe Clearanceleistung für inflammatorische Mediatoren auf. In Kooperation mit der Industrie (Gambro, Medical Research, Hechingen, Germany) entwickelten wir einen neuartigen, großporigen Hämofilter für den klinischen Einsatz. Der Hämofilter wurde konzipiert, um Moleküle in einer Größe von bis zu 60 kD aus dem Blut septischer Patienten zu eliminieren. In einer ersten Pilotstudie wurde der Hämofilter auf seine klinische Verwendbarkeit untersucht. Untersucht wurde die hämodynamische Verträglichkeit, der Verlust an Bluteiweißen und Gerinnungsfaktoren sowie die Effektivität der Mediatorelimination am Beispiel von Interleukin-6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-alpha). Wir konnten zeigen, dass die großporige Hämofiltrationstherapie ein sicheres und effizientes Nierenersatzverfahren darstellt. Es erwies sich als hämodynamisch verträglich. Der kumulative Eiweißverlust lag bei 8 g/Tag. Signifikante Verluste an essentiellen Gerinnungsfaktoren wurden nicht beobachtet. Es zeigte sich zudem eine signifikante Filtration von im Blut zirkulierendem IL-6. Die Clearancekapazität für TNF-alpha war jedoch gering. In Folgestudien konnten wir zeigen, dass die großporige Hämofiltration immunmodulatorische Eigenschaften ausübt. Sowohl die Phagozytose-Aktivität zirkulierender polymorphkerniger Leukozyten und Monozyten, als auch die Proliferationseigenschaften von T-Lymphozyten wurden günstig beeinflusst. Um den Verlust an Bluteiweißen durch den großporigen Hämofilter zu reduzieren, wurden verschiedene Nierenersatzstrategien experimentiert. Der diffusive Stofftransport scheint dem konvektiven Verfahren hinsichtlich der Mediatorelimination, bei deutlich günstigerem Effekt auf den Proteinhaushalt, gleichwertig zu sein. In wieweit die großporige Hämofiltration den Krankheitsverlauf septischer Patienten beeinflussen kann, ist Gegenstand aktueller Studien. / Inflammatory mediators play a pivotal role in the induction and maintenance of a septic syndrome. In the course of a septic multiorgan dysfunction syndrome, acute renal failure (ARF) often necessitates the use of renal replacement therapy. Continuous renal replacement therapy (CRRT) is the treatment of choice in this regard, and convection (hemofiltration) has become the most common used purification technique. Apart from representing a valuable renal replacement modality, CRRT also allows the elimination of inflammatory mediators. Since the early nineties CRRT has been used as an adjuvant treatment strategy in the septic multiorgan failure syndrome. It has been hypothesized that CRRT may re-institute the immunologic and hemostasilogic homeostasis by reducing the peak cytokine concentration in circulating blood. Commercially available hemofilters do not allow for a substantial elimination of inflammatory mediators. Their clearance capacity for septic mediators is poor. In cooperation with an industry company (Gambro, Medical Research, Hechingen, Germany), we developed a high cut-off hemofilter for clinical use in septic patients. The hemofilter was developed in order to allow the elimination of septic mediators in the molecular weight range up to 60 kilodaltons (kD). In a first pilot study the newly developed hemofilter was analyzed for clinical feasibility. We studied the hemodynamic impact, the transmembrane loss of plasma proteins and coagulation parameters as well as the efficacy in regard to mediator elimination. For mediator elimination Interleukin-6 (IL-6) and tumor-necrosis-factor-alpha (TNF-alpha) were chosen. We were able to show, that high cut-off hemofiltration is a safe and effective renal replacement procedure. Hemodynamically high cut-off hemofiltration was well tolerated. The cumulative transmembrane total plasma protein loss was around 8g/day. Coagulation parameters were not effected. We further demonstrated, that high cut-off hemofiltration is able to significantly eliminate substantial amounts of circulating IL-6. However, the elimination capacity for TNF-alpha was poor. We were also able to show, that high cut-off hemofiltration exerts immunomodulatory properties. The phagocytotic activity of polymorphnuclear leukocytes and monocytes as well as proliferative capacity of lymphocytes were positively influenced. In order to reduced transmembrane protein losses through the high cut-off hemofilter, a variety of different renal replacement strategies were tested. Diffusive purification techniques were comparable to convective techniques in regard to the mediator elimination capacity, but were associated with significantly lower transmembrane protein losses. Whether high cut-off hemofiltration can positively influence the course of critically ill septic patients is still under investigation.

Glukokortikoide (GK) zählen zu den effizientesten Medikamenten bei der Behandlung akuter und chronischer Entzündungskrankheiten. Ihr Einsatz ist häufig durch das Auftreten zahlreicher und teilweise irreversibler Nebenwirkungen beeinträchtigt. Aus diesem Grund wurden neue Glukokortikoid-Rezeptor-Liganden, wie die nicht-steroidalen selektiven Glukokortikoid-Rezeptor-Agonisten (SEGRAs), die eine potente anti-entzündliche Wirkung bei gleichzeitig vermindertem Nebenwirkungspotential aufweisen sollen, entwickelt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die SEGRA-Substanz BAY1155975 hinsichtlich ihrer hemmenden Wirkung auf die CD28-kostimulierte Aktivierung primärer humaner T-Zellpopulationen mit der von klassischen GK, wie z.B. Prednisolon, verglichen. In humanen Gedächtnis/Effektor- CD4+ T-Zellen wies die höchste Konzentration von BAY1155975 im Vergleich zu Prednisolon eine statistisch signifikant größere Hemmung der CD28-kostimulierten Sekretion von Effektorzytokinen (IFN-gamma, TNF-alpha, IL17 und IL22) auf. Proliferation, Apoptose und die Expression verschiedener Aktivierungsmarker wurden dagegen durch BAY1155975 und Prednisolon gleichermaßen reguliert. Es wird eine stärkere Hemmung des Kalzium-Kalzineurin-NFAT Signalweges durch BAY1155975 in diesen Zellen vermutet. In vivo zeigten BAY1155975 und Prednisolon eine ähnlich starke Hemmung der T-Zell-vermittelten Hautentzündung im DNFB-induzierten Kontaktallergiemodell in Mäusen, wenn die Behandlung der Mäuse mit den Substanzen vor dem Challenge erfolgte. Bei einer Substanzbehandlung der Mäuse während der Sensibilisierung wurde die Hautentzündung dagegen deutlich stärker durch BAY1155975 als durch Prednisolon gehemmt. Zusammenfassend geben die Ergebnisse dieser Arbeit einen Hinweis auf eine stärkere Hemmung der T-Zellsensibilisierung und der Effektorzytokinsekretion durch die SEGRA Substanz BAY1155975 im Vergleich zum klassischen GK Prednisolon. / Glucocorticoids (GCs) are the most effective therapeutic agents for the treatment of acute and chronic inflammatory diseases. Their use is often accompanied with numerous and sometimes irreversible side-effects. Therefore, new glucocorticoid receptor (GR) ligands with should have potent anti inflammatory efficacy but a reduced side-effect profile have been developed. Non steroidal selective glucocorticoid receptor agonists (SEGRAs) represent a new class of GR ligands with an improved therapeutic index. In this study, we compared the SEGRA, BAY1155975, and the classical GC, prednisolone, regarding their suppressive effect on CD28-costimulated activation of human primary T cell subpopulations. In human memory/effector CD4+ T cells, BAY1155975 at the highest concentration exhibited a significantly stronger inhibition of CD28-costimulated effector cytokine secretion (IFN-gamma, TNF-alpha, IL17 and IL22) in comparison to prednisolone. Interestingly, proliferation, apoptosis and expression of activation markers were similarly regulated by BAY1155975 and prednisolone. Further studies on different signal transduction pathways suggested that BAY1155975 stronger inhibited the calcium-calcineurin-NFAT pathway than prednisolone in these cells. In vivo BAY1155975 and prednisolone showed comparable efficacy in inhibition of T cell dependent skin inflammation in DNFB-induced contact hypersensitivity models in mice, when mice were treated before hapten challenge. In contrast, when mice were treated around hapten sensitization markedly stronger inhibition of skin inflammation was observed for BAY1155975 than prednisolone. In summary, the data of this study give evidence for a stronger inhibition of T cell sensitization and effector cytokine secretion by the SEGRA, BAY1155975, in comparison to the classical GC, prednisolone.

Das Auftreten des pandemischen H1N1-Influenzavirus 2009 und die kontinuierliche Übertragung hochpathogener H5N1-Viren (HPAIV) auf den Menschen verdeutlichen die Wichtigkeit zoonotischer Übertragungen. Bis heute sind die Restriktion tierpathogener Influenzaviren und die hohe Virulenz der HPAIV im Menschen nicht vollständig geklärt. Verschiedene Modelle wurden zur Studie von Influenzaviren verwendet, u. a. Zelllinien, die jedoch die Komplexität und Zelltypen der humanen Lunge nur unzureichend wiedergeben. Daher wurde ein humanes ex vivo Lungenkulturmodell etabliert in welchem die komplexe Struktur und die verschiedenen Zelltypen der humanen Lunge erhalten bleiben. Mit Hilfe dieses Modells und primären und permanenten humanen Zellen wurden saisonale, pandemische, porzine, HPAIV und niedrigpathogene aviäre Influenzaviren (LPAIV) systematisch hinsichtlich Replikation, Cytokininduktion und Zelltropismus verglichen. HPAIV replizierten wie auch saisonale und pandemische Viren zu hohen Titern, während sich LPAIV und ein porzines Virus kaum vermehrten. Einhergehend mit dem Vorhandensein aviärer Rezeptoren waren LPAIV dennoch fähig Lungenkulturen und Zellen zu infizieren und es fanden sich keine Unterschiede im Vorhandensein und in der Lokalisation viraler Proteine. Die Infektion mit HPAIV und LPAIV führten im Lungenmodell zu einer erhöhten Induktion von IP10, MIP1β, IFNβ und IL1β, während saisonale und pandemische H1N1-Viren nur geringe Cytokinspiegel hervorriefen. Trotz der hier beobachteten Unterschiede in der Replikation und Cytokininduktion infizierten alle Viren überwiegend Typ II Pneumozyten. Dies impliziert, dass sich die gezeigten Unterschiede zwischen saisonalen und aviären Viren nicht durch Unterschiede im Zelltropismus erklären lassen. Die im Rahmen dieser Studie erzielten Ergebnisse korrelieren gut mit klinischen Beobachtungen. Dies verdeutlicht den Wert humaner ex vivo Kulturen um weitere Einblicke in das pathophysiologische Verhalten von Pathogenen zu bekommen. / The emergence of the pandemic H1N1 influenza A virus in 2009 and the continuous threat by highly pathogenic avian H5N1 human infections underlines the importance of zoonotic transmissions. The inability of most animal influenza viruses to replicate efficiently in the human respiratory tract and the high virulence of highly pathogenic avian H5N1 viruses (HPAIV) are still not fully understood. Several models have been used to study influenza virus infections including human cell lines that lack the complexity and cell diversity of the human lung. Therefore, a human lung explant model in which the three-dimensional structure of the human lung is preserved along with the different cell-cell interactions was established. Using this model and commonly used primary and permanent respiratory cells, replication, cytokine induction and cell tropism of human, avian, swine and pandemic 2009 virus was systematically compared. It was shown that HPAIV as well as seasonal and pandemic 2009 viruses replicated to high titers while a low pathogenic avian (LPAIV) or a classical swine virus only replicated inefficiently. However, along with the presence of avian receptors, LPAIV was able to infect human lung explants and cells and there were no differences in abundance and localization of proteins. Infection of human lung explants with the HPAIV and LPAIV lead to a pronounced induction of IP10, MIP1β, IFNβ and IL1β while seasonal and pandemic 2009 viruses caused only a low cytokine response. Despite their differences in replication and cytokine induction, LPAIV and the seasonal virus both primarily targeted type II pneumocytes suggesting that the observed differences between the two viruses are not due to differences in cell tropism in the human lower respiratory tract. The experimental findings obtained in this study are compatible with clinical observations highlighting the value of ex vivo human lung explants to provide insights into viral pathophysiological behavior in humans.