Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Méthodologie d'addition-cyclisation de guanidines et amidines sur les quinones pour la synthèse de 2-aminobenzimidazole. Application de cette stratégie à la synthèse de benzo-bis-2-aminoimmidazole, un motif important de la benzosceptrine.Valorisation de produits synthétisés par évaluation biologique : l'inhibition de kinase, la cytotoxicité sur les lignées cellulaires cancéreuses du sang. / Methodology of addition-cyclization of guanidines and amidines on quinones for the synthesis of 2-amino-benzimidazole. Applying this strategy to the synthesis of benzo-bis-2-aminoimmidazole, an analogue of benzosceptrine.Reclamation of products synthesized by biological evaluation: inhibition of kinase, cytotoxicity on cancer cell lines of blood.

La Combrétastatine A-4 (CA-4), molécule naturelle isolée d’un saule d’Afrique du sud est le chef de file des agents antivasculaire qui détruit sélectivement le réseau vasculaire tumoral et qui conduit à une nécrose ischémique d’une tumeur solide. Sa prodrogue, la fosbrétabuline (CA-4P, First-in-class) a reçu en 2016 le statut de médicament orphelin aux USA et en Europe pour le traitement de tumeurs neuro-endocrines et des glioblastomes multiformes. Malgré un intérêt thérapeutique certain, la fosbrétabuline a montré une instabilité chimique (isomérisation de la double liaison Z conduisant à l’isomère inactif E) et à des effets indésirables de type cardiotoxique. Notre groupe a conçu l’isoCA-4, une forme plus stable et non isomérisable de la CA-4 qui a montré des activités biologiques similaires à la CA-4. Il a été supposé que la cardiotoxicité de la CA-4 et de ses analogues soit probablement due à la présence du groupement 3,4,5-triméthoxyphényle considéré comme crucial pour l’activité cytotoxique et antitubuline. Afin de surmonter ce problème et contrairement au dogme précédent, nos efforts se sont été concentrés sur le remplacement de ce cycle par divers hétérocycles. Nous avons identifié trois nouvelles classes d’agents antivasculaires hétérocycliques voire bis-hétérocycliques. Nous avons montré que ces molecules “drug-like” sont douées d’une excellente activité antiproliférative à des concentrations nanomolaires, d’une activité antivasculaire supérieure à celle de la CA-4 et possèdent un index de sécurité cardiaque très élevé. Ces résultats démontrent pour la première fois que le remplacement du cycle 3,4,5-triméthoxyphényle de l’isoCA-4 par un hétérocycle approprié est une approche prometteuse pour identifier de nouveaux agents antivasculaires ayant une faible cardiotoxicité. / Combretastatin A-4 (CA-4), is a natural antivascular agent isolated from a South African Sallow tree that selectively destroys tumor vasculature leading to ischemic necrosis. In 2016, the prodrug fosbretabulin (CA-4P) obtained designation as orphan drug in USA and Europe for the treatment of neuroendocrine tumors and glioblastoma. Despite its importance as a therapeutic agent, fosbretabulin has shown chemical instability. In fact, the double bond form Z isomerizes to an inactive E form of the drug. Moreover, fosbretabulin is associated to several side-effects including cardiotoxicity. Our group succeeded in the design of a more stable and non-isomerizable form of CA-4 as isoCA-4 which exhibited similar biological activities as CA-4. It was thought that cardiotoxicity of CA-4 and analogs is probably due to the presence of the 3,4,5-trimethoxyphenyl A-ring however the latter seems to have an essential role for the cytotoxic and antitubulin activities of the drug. Despite the role of the trimethoxyphenyl ring, we have focused our challenges on the remplacement of this moiety by various heterocycles to reduce the cardiotoxicity and to put an end to this dogma. We have identified three new classes of heterocyclic and bis-heterocyclic antivascular agents. We have demonstrated that these "drug-like" molecules have excellent antiproliferative activities at nanomolar ranges, an antivascular activity superior to that of CA-4 and possesses a very high cardiac safety index. Regarding these results, we have been able to show for the first time that the replacement of the 3,4,5-trimethoxyphenyl ring of isoCA-4 by various heterocyclic systems is a promising approach to synthesize new antivascular agents having a low level of cardiotoxicity.

La nécrolyse épidermique toxique (NET) est une réaction cutanée médicamenteuse (CADR - Cutaneous Adverse Drug Reaction) rare et sévère qui se caractérise par une nécrose brutale de l’épiderme, entraînant un décollement cutané plus ou moins étendu. Il s’agit d’une urgence vitale avec jusqu’à 30% de décès à la phase aiguë. L’importance de la surface décollée définit deux entités cliniques : le syndrome de Stevens-Johnson quand le décollement est inférieur à 10% et le syndrome de Lyell quand il est supérieur à 30%. A distance, le risque de complications, notamment sous forme de synéchies des muqueuses, est particulièrement élevé et doit être prévenu systématiquement. Le mécanisme physiopathologique repose essentiellement sur une réaction d’hypersensibilité médicamenteuse retardée dans laquelle les lymphocytes cytotoxiques jouent un rôle majeur. Le terrain génétique intervient également avec des associations HLA-médicament maintenant bien décrites, notamment dans les populations asiatiques. La question du traitement reste encore très débattue : il repose essentiellement sur la corticothérapie systémique, la ciclosporine ou encore les immunoglobulines IV. Quelques études suggèrent également un intérêt des anti-TNF-alpha. Le but de ce travail est de comprendre les mécanismes à l’origine des CADRs les plus sévères, à travers la caractérisation de patients atteints de NET à la phase aiguë et en les comparant à une CADR bénigne comme l’EMP. Nous avons dans un premier temps déterminé quelles étaient les principales populations CD45+ présentes à la phase aiguë des NET et de patients ayant présenté un exanthème maculo-papuleux (EMP) bénin, à la fois dans la peau et dans le sang. Nous avons cherché à déterminer la présence de populations cellulaires spécifiques de ces pathologies, notamment au sein des lymphocytes T CD8+ qui étaient la population majoritaire dans ces deux CADRs. Nous avons notamment montré qu’il existait une expansion majeure de lymphocytes T CD8+ effecteurs mémoires et polycytotoxiques au cours de la NET comparativement à l’EMP. Puis, nous nous sommes intéressés à la clonalité de ces populations lymphocytaires T CD8+ au travers de l’analyse de leurs séquences V-béta puis au moyen d’un séquençage ADN haut débit : nous avons notamment montré que ces expansions lymphocytaires T CD8+ étaient clonotypiques dans la peau. Nous avons également étudié l’expansion de ces clones cutanés dans le sang des patients atteints de NET et avons montré que leur expansion sanguine était directement corrélé à la sévérité clinique. Enfin, nous avons pu démontré in vitro chez deux patients que ces clones étaient spécifiques du médicament inducteur. / Toxic epidermal necrolysis (TEN) is a rare and severe cutaneous adverse drug reaction (CADR). The histologic hallmark of this reaction is necrosis with detachment of the epidermis resulting in skin blistering. This is a vital emergency with up to 30% deaths at the acute phase. The percentage of blistering skin determines two clinical entities: Stevens-Johnson syndrome when detachment represents less than 10% and Lyell's syndrome when it is greater than 30%. The development of late complications, notably mucous synechiae, is frequent and must be systematically prevented. Pathophysiologic mechanism consists in a delayed drug hypersensitivity reaction in which cytotoxic T lymphocytes play a major role. Genetic background is also very important with HLA-drug associations which have been reported, notably in asian ppopulations. Treatment remains very debated : systemic steroids, ciclosporin or intravenous immunoglobulins are commonly used. Some studies also suggest that TNF-alpha inhibitors are of interest in treating this disease. The aim of this work is to understand the mechanisms underlying the most severe CADRs, through the characterization of TEN patients. We first determined the main CD45+ populations present in the acute phase of both TEN and patients who devloped a benign maculo-papular exanthema (MPE). We sought to determine the presence of cell populations specific to these pathologies, particularly within CD8+ T lymphocytes, which were the majority population in these two CADRs. In particular, we have shown that there is a major expansion of CD8+ T lymphocytes in memory and polycytotoxic effectors during TEN compared to MPE. Then, we focused on the clonality of these CD8+ T lymphocyte populations through the analysis of their V-beta sequences and then by means of high throughput DNA sequencing: in particular, we showed that these CD8+ T lymphocyte expansions were clonotypic in the skin. We also studied the expansion of these skin clones in the blood of TEN patients and showed that their blood expansion was directly correlated with clinical severity. Finally, we were able to demonstrate in vitro in two patients that these clones were specific to the suspected drug

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’activation des lymphocytes T nécessite un double signal. Le premier est antigénique et permet la reconnaissance d’un peptide spécifique présenté à la surface de cellules présentatrices d’antigène (APC). Le second signal est co-stimulateur et implique l’interaction avec des molécules activatrices exprimées par les APC et la présence de cytokines proinflammatoires. Les cellules dendritiques (DC) sont les uniques APC capables de délivrer ce double signal et d'activer les lymphocytes T naïfs, initiant ainsi les réponses immunes primaires. L’immaturité du système immunitaire du nouveau-né est responsable d’une plus grande susceptibilité aux maladies infectieuses ainsi qu’une faible réponse vaccinale. Des déficiences tant au niveau de l’immunité innée que de l’immunité acquise participe à une faible défense face aux agressions. A la naissance, les DC expriment des niveaux faibles de molécules co stimulatrices et présentent un défaut majeur de synthèse d'IL 12, cytokine cruciale pour l’établissement de réponses de type Th1. Le but de ce travail est d’évaluer la capacité des DC du nouveau-né humain à activer les lymphocytes T CD8+. Dans une première approche, nous avons utilisé un modèle unique d’induction de réponse primaire in vitro qui permet d'étudier l'activation de lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène Melan-A, une protéine du soi exprimée par les mélanocytes. Ces lymphocytes existent à des fréquences particulièrement élevées chez les individus sains HLA-A2 et présentent les caractéristiques de lymphocytes T naïfs. Dans ce modèle, nous avons d’abord analysé les capacités immunostimulatrices de différentes populations de DC différenciées in vitro. Nous avons observé que les DC différenciées par la culture de monocytes purifiés en présence d'IL-3 et d’IFN-beta sont capables d’initier une réponse fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, analogue à celle induite par les DC différenciées en présence de GM-CSF et d’IL-4. Ce même modèle nous a permis de démontrer que, en dépit de leur défaut de production d’IL 12, les DC du nouveau-né sont capables d'induire efficacement une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique. Afin dévaluer la relevance in vivo de nos observations, nous avons étudié le phénotype et la fonction des DC circulantes chez des nouveau-nés infectés par le cytomégalovirus (CMV). L’infection par le CMV au cours de la vie fœtale représente une situation clinique où le nouveau-né développe une réponse mature et fonctionnelle des lymphocytes T CD8+, alors que celle des lymphocytes T CD4+ est déficiente. Ces expériences ont montré que le phénotype, la fonction et la réponse à différents stimuli des APC présentes en périphérie ne sont pas affectés par l’infection congénitale par le CMV. Ces résultats suggèrent que l’observation des DC circulantes des nouveau-nés infectés par le CMV ne permet pas d’analyser l’influence du virus sur la fonction des DC néonatales. Dans ce but, nous avons reproduit un modèle d’infection in vitro de DC par une souche primaire du CMV. L’utilisation de micropuces à ADN nous a permis de comparer l’expression de gènes différentiellement induits par l’infection des DC d’adultes et de nouveau-nés. Nous avons ainsi révélé une proportion importante de gènes différentiellement induits, parmi lesquels celui de l’IFN-beta. Nous avons confirmé ce défaut au niveau protéique et mis en évidence une production d’IL 12 déficiente en réponse à l’infection par CMV. L’ensemble de nos résultats indique que malgré leur immaturité, les DC du nouveau-né sont capables, dans certaines circonstances, d’induire une réponse lymphocytaire T CD8+ cytotoxique. Cependant, le défaut de production de certaines cytokines co-stimulatrices pourrait être impliqué dans la faible réponse des lymphocytes T CD4+ à l’infection par CMV. Ces observations ont d’importantes implications pour la compréhension de l’induction de réponses cytotoxiques au cours d’infections virales et pour l’élaboration de stratégies vaccinales en début de vie.

Le traitement de l’asthme concerne une large population et fait appel très majoritairement à une administration par voie pulmonaire. Cette voie présente certains inconvénients qui pourraient être palliés par le recours à la voie buccale comme envisagé dans cette étude, avec une amélioration attendue de la compliance et de la biodisponibilité. Aussi ce travail a eu pour objectif de développer et caractériser une formulation mucoadhésive thermogélifiante à base de salbutamol. Au regard des contraintes liées à la voie buccale et à la prise en charge du traitement de l’asthme aigu, les principales propriétés pharmacotechniques attendues pour optimiser la biodisponibilité de cette formulation ont été : (i) une gélification optimale autour de 30°C après pulvérisation pour faciliter notamment l’administration ; (ii) des propriétés mécaniques et mucoadhésives importantes pour assurer un maintien de la forme au site d’absorption ; (iii) une cinétique de libération compatible avec le traitement de la phase aigüe de la pathologie. Le choix des excipients a été défini afin d’avoir la plus grande innocuité de la formulation finale. Les travaux expérimentaux ont mis en évidence l’intérêt de certaines techniques innovantes pour la caractérisation de ce type de formulation comme notamment l’étude de libération à l’aide de l’appareil de dissolution à flux continu, la détermination de la cytotoxicité par microscopie holographique digitale et l’évaluation de la mucoadhésion in vitro et in vivo par imagerie. Les résultats ont aussi permis de proposer des modèles mathématiques pour l’interprétation des mécanismes de libération du salbutamol et quantifier l’importance des phénomènes de diffusion et d’érosion. Les conclusions de cette étude sont favorables à la poursuite du développement en vue d’une commercialisation. / The treatment of asthma concerns a large population and generally necessitates an administration by the pulmonary route. This route has some drawbacks which could be overcome by the buccal route, like considered in this study expecting an improvement of the compliance and the bioavailability. The aim of this work was to develop and characterize a thermogelling mucoadhesive formulation containing salbutamol sulfate. The main properties of the formulation were: (i) thermogelation around 30°C to facilitate the administration by spray; (ii) strong mechanical properties and high mucoadhesive strength to maintain the formulation in situ; (iii) drug release kinetics adapted to the treatment. The excipients were selected with regard to the final formulation safety. The experimental work emphasized the great interest of certain techniques in the characterization of this kind of formulation, for example the drug release study using flow through apparatus, the cytotoxicity study using digital holographic microscopy and also the mucoadhesion study by in vivo imaging. The use of mathematical models provided a relevant understanding of drug release mechanisms. The conclusion of this study is favorable to a further development of the project for a future marketing.

Tout au long de la chaîne alimentaire, des moisissures peuvent se développer et produire des mycotoxines. Ce sont des composés toxiques naturels issus du métabolisme secondaire des moisissures, susceptibles de contaminer l'alimentation animale et humaine, provoquant de nombreuses pathologies (hépatotoxicité, néphrotoxicité, neurotoxicité, mutagénicité, tératogénicité, cancérogénicité,…). La première étape de ce travail était d'évaluer la présence simultanée de l'ochratoxine A (OTA), de la citrinine (CIT), des aflatoxines (AFs), de la zéaralénone (ZEA), de la fumonisine (FB) et des trichothécènes dans des aliments destinés aux humaines (céréales, lait, café, jambon) et aux animaux (croquettes de chat et chien, foins). En général plusieurs mycotoxines coexistaient. Certains échantillons pour les humains dépassaient les limites autorisées en mycotoxines dans l'Union Européenne. Suite à l'étude de simulation d'apport en mycotoxines dans une ration quotidienne, nous avons constaté que les doses journalières admissibles (DJA) peuvent être dépassées. La deuxième phase consistait à étudier l'impact des mycotoxines seules ou en combinaison sur la viabilité cellulaire et la génotoxicité sur des modèles cellulaires (cellules rénales d'opossum (OK), cellules rénales humaines (HK2), cellules humaines de glandes mammaires (MCF7)) et chez des animaux (porc, rat). Nous avons montré que la CIT, la FB1 et la ZEA agissent en synergie sur la génotoxicité de l'OTA. Chez les animaux, nous avons montré qu'à des doses (5 ng d'OTA/kg poids corporel/ jour et de 200ng FB1/kg pc/j) correspondantes aux DJA, il y avait des effets génotoxiques (formation d'adduits à l'ADN). Nous avons mis en évidence l'implication des mycotoxines dans l'alimentation animale sur la baisse de fertilité et la tératogénicité chez les chats, ainsi que sur la mort des chevaux. Au cours de la troisième partie de cette étude, nous avons testé sur des cultures cellulaires (HK2 et MCF7) et in vivo (poulet) l'effet protecteur du glutathion (GSH) et de la sélénométhionine (SeMet) contre l'OTA responsable de cancers de voie urinaire et la ZEA responsable de baisse de fertilité. Le GSH est un puisant antioxydant et le sélénium est un oligoélément indispensable qui intervient comme co-facteur de nombreuses enzymes ayant des propriétés antioxydantes, comme les glutathion peroxydases. D'une manière générale, au niveau des cellules rénales, le GSH seul et la levure correspondante ont un effet bénéfique vis-à-vis de la génotoxicité de l'OTA ; par contre la sélénométhionine et la levure séléniée augmentent la génotoxicité de l'OTA et de la ZEA. Dans les cellules des glandes mammaires, il y a une nette amélioration vis-à-vis de la génotoxicité des deux mycotoxines lorsque les cellules sont exposées à une seule mycotoxine simultanément au GSH, à la sélénométhionine et aux levures enrichies. Chez les poulets, la diminution de la génotoxicité n'est pas exclusivement corrélée à la capacité des parois de levure ou des levures à adsorber l'OTA. Ces dérivés de levure ont gardé la propriété de partiellement métaboliser l'OTA dans l'intestin. Les parois de levures et les levures enrichies en GSH ont un meilleur pouvoir protecteur que celles enrichies en SeMet / Throughout the food chain, mold can grow and produce mycotoxins. These are toxic compounds "natural" from the secondary metabolism of molds that may contaminate the feed and food, causing many diseases (hepatotoxicity, nephrotoxicity, neurotoxicity, mutagenicity, teratogenicity, carcinogenicity, ...). The first stage of this work was to assess the level of multi-contamination by mycotoxins (OTA, CIT, Afs, ZEA, FB, DON) in food (cereals, milk, coffee, ham) and feed (pet food). Some samples analyzed exceeded the limits of mycotoxins in the European Union. Through the simulation study of mycotoxin intake in a daily diet, we found that the acceptable daily intake (ADI) may be exceeded. The second phase was to study the impact of mycotoxins alone or in combination on cell proliferation, genotoxicity in cellular models (OK, HK2, and MCF7) and animal (pig, rat). We have demonstrated genotoxic effects (formation of DNA adducts) at doses (5 ng OTA / kg bw / day and 200 ng FB1/kg bw / day) considered safe (ADI). We have shown that the CIT, FB1 and ZEA act synergistically on the genotoxicity of OTA. We pointed to the involvement of mycotoxins in animal feed on declining fertility and teratogenicity in cats, as well as the death of horses. In the third part of this study, we tested in cell cultures (HK2 and MCF7) and in vivo (chicken) the protective effect of glutathione (GSH) and selenomethionine (SeMet) against OTA responsible for urinary tract cancers and ZEA reducing fertility. GSH is considered as a potent antioxidant and selenium is a trace essential element that acts as a cofactor of enzymes such glutathione peroxidase. In summary, in kidney cells, GSH and GSH enriched yeast decrease OTA genotoxicity whereas SeMet and SeMet enriched yeast increase genotoxicity of OTA and ZEA. In mammary cells, whatever the compounds gentoxicty of OTA and ZEA significantly decrease. Decrease of OTA genotoxicity in chicken kidney cannot be exclusively explained by adsorption of OTA on yeast by products. The yeast products retain their ability to metabolize the OTA. GSH enriched yeast and yeast cell wells are more efficient than SeMet enriched yeast

Ce travail a porté sur une nouvelle protéine impliquée dans l’apoptose, la mitogaligine, et plus particulièrement sur le fragment interne [31-53] responsable de son adressage à la mitochondrie. L’objectif général du projet est de comprendre au niveau atomique son mécanisme d’action sur les membranes mitochondriales. Le fragment d’adressage est à lui seul cytotoxique. C’est pourquoi j’ai concentré l’essentiel de mon travail de thèse sur son étude. Nous avons défini sa toxicité sur des cellules humaines et montré qu’il perturbait l’intégrité membranaire, excluant certaines protéines de la mitochondrie. Ce phénomène concorde avec le relargage de cytochrome c, à l’origine du déclenchement de l’apoptose par la voie mitochondriale. Pour mieux comprendre le mode d’action du fragment d’adressage et le rôle joué par la cardiolipine, lipide caractéristique des membranes mitochondriales, j’ai étudié par différentes techniques biophysiques complémentaires l’effet du milieu membranaire sur la structuration du peptide et l’effet du peptide sur la membrane. Le peptide a une très forte affinité (13nM) pour des membranes contenant de la cardiolipine. Il se place à plat sur la membrane, s’enfouissant dans l’interface, sans induire d’organisation particulière des lipides. De plus, nous avons mis en évidence que le peptide était capable d’induire une courbure positive de la membrane, ce qui va interférer avec de nombreux processus vitaux pour la cellule. Enfin, pour réaliser les études structurales et fonctionnelles de la protéine entière, j’ai participé aux premières étapes de production de mitogaligine, qui s’est avéré très délicate aussi bien par voie d’expression que par synthèse chimique. / This work is about a new protein of apoptosis, mitogaligin, and more particularly about the internal fragment [31-53] responsible for its mitochondrial targeting. General aim of the project is to understand at the atomic scale its mechanism of action on mitochondrial membranes. The addressing fragment is cytotoxic by itself. That is the reason why I focused the main part of my work on this peptide. We defined its toxicity on human cells and showed that it was capable of disrupting the membrane integrity, excluding some proteins from mitochondrion. This phenomenon agrees with the release of cytochrom c, which induces apoptosis by the mitochondrial pathway. In order to better understand the mode of action of the addressing fragment and the role played by Cardiolipin, a specific lipid of mitochondrial membranes, I studied by various and complementary biophysics techniques the effect of membrane environments on the peptide structuration and the effect of the peptide on the membrane. The peptide has a very high affinity (13nM) for cardiolipin-containing membranes. It takes place parallel to the membrane, standing at the interface, without leading to a particular lipids organization. Furthermore, we highlighted that the peptide was capable of inducing a positive curvature of the membrane, what is going to interfere with numerous vital processes for the cell. Finally, to realize the structural and functional studies of the whole protein, I was involved in the first stages of mitogaligin’s production, which has proved to be very tricky either by recombinant pathway or by chemical synthesis.