Les électrodes en diamant polycristallin dopé au bore (BDD) présentent beaucoup d'intérêts et notamment une large fenêtre de potentiel supérieure à 3 V en milieux aqueux, un faible courant résiduel et une excellente résistance à la corrosion et à l'encrassement. Ces propriétés en font donc un matériau de choix pour le développement de capteurs chimiques. Afin d'exalter la réactivité des électrodes BDD envers certains composés, notre approche a consisté à déposer sur la surface des électrodes des nanoparticules à base de métaux de transition comme le platine ou l'iridium. Ces nanoparticules présentent une activité électro catalytique intéressante, ce qui ouvre la voie à la détection de produits dérivés de réactions enzymatiques, de pesticides ou de bien d'autres espèces non électro-actives sur les électrodes en BDD nues. L'objectif de mes travaux a été de mettre au point une nouvelle méthode de dépôt de nanoparticules métalliques sur la surface d'électrodes et de les caractériser d'un point de vue à la fois structurel et électrochimique. L'objectif est de développer un système de détection multi-capteurs composé d'électrodes BDD chacune fonctionnalisée par un catalyseur métallique différent sous forme de nanoparticules. Le système de détection permet ainsi d'obtenir une signature chimique caractéristique du composé à détecter. Par couplage des différents capteurs, des méthodes algorithmiques d'apprentissage / reconnaissance permettent alors d'apporter de la sélectivité au système de détection, à la manière d'une " langue électronique ". La technique a été appliquée à plusieurs composés d'intérêt, et notamment à l'eau oxygénée, l'indole, le scatol, le paraoxon, et l'imidaclopride. / Boron-doped polycrystalline diamond electrodes (BDD) exhibit a number of advantages, including a wide potential window above 3V in aqueous media, a low background current, and excellent resilience to corrosion and fouling. These properties make it a very interesting material for the development of chemical sensors. In order to enhance the reactivity of the BDD electrodes towards a wider range of chemical compounds, we have studied the possibility to deposit on the electrode surface nanoparticles based on transition metals such as platinum or iridium. These nanoparticles exhibit an interesting electro-catalytic activity and open the way to the detection of products derived from enzymatic reactions, pesticides or many other electrochemically non-active species. The aim of this thesis work has been to propose a new method for the deposition of metallic nanoparticles on the diamond surface and to characterize them from a structural and electrochemical point of view. The objective is to develop a multi-sensor detection system composed of several BDD electrodes each functionalized using a different metal catalyst in the form of nanoparticles. The detection system thus enables to obtain a characteristic chemical fingerprint of the product to detect. By assembling several of such sensors, and coupling them with algorithmic learning / recognition methods, the system provides an improved selectivity, in a similar way to an “electronic tongue”. This was applied to several case studies, including the detection of hydrogen peroxide, scatol, indole, paraoxon and imidaclopride.

La législation européenne impose la recherche d'entérotoxines staphylococciques dans les fromages si le niveau de S. aureus est supérieur à 105 ufc/g. Dans cette optique, l'objectif de cette thèse était de fournir des éléments scientifiques pour contrôler S. aureus par biopreservation. Dans un premier temps, la croissance de S. aureus a été suivie dans des fromages fermiers AOC Saint-nectaire. Dans ces fromages les populations de S. aureus se multiplient essentiellement durant les six premières heures de fabrication pour atteindre un maximum à 24 h. En fromages au lait cru, leur croissance et leur niveau maximal dépendraient de la concentration initiale dans le lait, du pH (en particulier pH à 6 h), de la température, mais le rôle des communautés microbiennes n'a pas pu être mis en évidence. Dans un deuxième temps, les capacités inhibitrices de souches de Lactococcus lactis et de Lactococcus garvieae ont été évaluées en lait microfiltré. L. lactis subsp. lactis inhiberait la croissance de S. aureus par abaissement du pH mais aussi par production d'H2O2 pour certaines souches. Par contre, le pH ne serait pas responsable de l'inhibition de S. aureus par L. garvieae. La compétition pour des acides aminés ne semblerait pas impliquée dans l'inhibition par L. lactis puisque cette espèce en synthétise de grande quantité en lait. Même si la thréonine, la phénylalanine, la méthionine, l’isoleucine et la valine deviennent limitants dans la co-culture de S. aureus avec L. garvieae, cette carence ne serait pas responsable de l'inhibition puisque leur ajout ne lève pas l'inhibition. Cependant du peroxyde d'hydrogène (3 mmol/l) produit par L. garvieae en co-culture en milieu BHI serait responsable de l'inhibition. En milieu de laboratoire, l'inhibition de S. aureus par L. garvieae est effective durant les premières heures de culture et diminue en cours d'incubation. Elle augmente avec la concentration de L. garvieae. Elle est plus forte à 24°C qu'à 30°C. Le rôle de la catalase de S. aureus dans l'interaction avec L. garvieae reste à préciser / The European legislation imposes the staphylococcal search for enterotoxins in cheeses if the level of S. aureus is higher than 105 ufc/g. Accordingly, the objective of this thesis was to provide scientific data to control S. aureus by biopreservation.In a first, the growth of S. aureus was monitored in farm cheeses AOC Saint-Nectaire. In these cheeses the populations of S. aureus multiplied mainly during the first six hours of manufacture to reach a maximum to 24 h. Their growth and their maximum level would depend on the initial concentration in milk, on the pH (in particular pH at 6 h), on the temperature, but the role of the microbial communities could not be highlighted. In the second step, the inhibiting capacities of strains of Lactococcus lactis and Lactococcus garvieae were evaluated in microfiltrated milk. L. lactis subsp. lactis would inhibit the growth of S. aureus by lowering the pH but also by the production of H2O2 for certain strain. On the other hand, the pH would not be responsible for the inhibition of S. aureus by L. garvieae. The competition for amino acids does not seem to be implied in inhibition by L. lactis since this species synthesis a great amount in milk. Even if threonine, phenylalanine, methionine, isoleucine and valin become limiting in the co-culture of S. aureus with L. garvieae, this would not be responsible for inhibition since their addition in milk does not raise inhibition. In laboratory medium the inhibition of S. aureus by L. garvieae was effective during the first hours of culture and decreases during incubation. It increased with the concentrations of L. garvieae. It was stronger at 24°C than at 30°C. It would be due to hydrogen peroxide (3 mmol/l) produced by L. garvieae in Co-culture in medium BHI. The role of the catalase of S. aureus in the interaction with L. garvieae remains to be specified

Ce travail est une contribution à l'étude de l'interaction entre des couches minces de silicium amorphe hydrogéné (a-Si:H) et un plasma d'hydrogène, dans un réacteur de dépôt par PECVD (Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition). Le suivi in situ de la cinétique de gravure par l'hydrogène atomique est réalisé par ellipsométrie UV-visble. Les différents paramètres de plasma (température, puissance radiofréquence, pression du gaz H2, type de dopage du matériau) pouvant impacter cette cinétique ont été sondés. L'analyse des spectres d'ellipsométrie spectroscopique, à l'aide d'un modèle optique approprié, a permis de mettre en évidence leurs effets sur le temps de formation de la couche modifiée par l'hydrogène, son épaisseur et son excès d'hydrogène, ont été analysés. Le même traitement au plasma d'hydrogène appliqué à des jonctions i/p et i/n, révèle un comportement particulier de la cinétique de gravure dans la zone de jonction. Ce comportement a été interprété dans le cadre d'un modèle simple de diffusion de l'hydrogène sous champ électrique. / This work is a contribution to the study of the interaction between hydrogenated amorphous silicon (a-Si:H) thin films and hydrogen plasma in a PECVD (Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition) reactor. The kinetics of silicon etching by atomic hydrogen is monitored in situ by UV - visble ellipsometry .Several plasma parameters (temperature, RF power, H2 gas pressure, the doping of the material) that may impact the kinetics were probed. An analysis of the spectroscopic ellipsometry spectra, thanks to an appropriate optical model, allowed evidencing their effects on the time constant, the thickness and the hydrogen excess of the H-modified layer.The same hydrogen plasma treatment repeated on i/p and i/n H base junctions revealed a particular behavior of the etching kinetics in the junction zone. This effect is interpreted in the frame of a simple of hydrogen diffusion model under an electric field.

Les voies métaboliques les plus importantes dans le contrôle du stress oxydant chez la plante restent à élucider. Celles liées au glutathion jouent un rôle important. Cependant, les réactions responsables de l'oxydation du glutathion (du GSH en GSSG) n'ont pas encore été clairement identifiées. L’analyse des données biochimiques, transcriptomiques et génétiques soulèvent des questions pour mieux comprendre comment la régulation redox liée au stress pourrait influer sur la signalisation hormonale chez les plantes. Par une approche de génétique inverse utilisant, notamment, le mutant photorespiratoire conditionnel cat2, nous avons étudié la réponse et l'importance fonctionnelle de trois voies potentielles, médiées par les glutathion S-transférases, les peroxirédoxines dépendant de la glutarédoxine et les déhydroascorbate réductases (DHARs) chez Arabidopsis. Ainsi, l'interaction entre les DHARs semble être nécessaire pour coupler les pools d'ascorbate et de glutathion lors d’un stress oxydant. En complément à l'approche expérimentale, une modélisation mécaniste a permis d'étudier la production de H2O2 et son métabolisme, en lien avec l'activité catalase et la voie ascorbate-glutathion. Le modèle révèle que la catalase et l'ascorbate peroxydase prennent en charge de concert le traitement de H2O2, y compris dans les conditions optimales de croissance. Nos simulations suggèrent que la disponibilité en NADPH peut déterminer l'oxydation du glutathion via la monodéshydroascorbate réductase. Nos résultats expérimentaux et le modèle cinétique valident que la sensibilité du statut du glutathion au stress oxydant constitue un senseur approprié des augmentations du H2O2. / The most important metabolic pathways in the control of oxidative stress remain to be elucidated in plants. Those linked to glutathione play an important role. However, the reactions responsible for its oxidation have not been clearly identified. Here, analysis based on available biochemical, transcriptomic and genetic data emphasized likely important questions to be elucidated for a full understanding of how stress-related redox regulation might impinge on phytohormone-related signaling pathways. Using a reverse genetics approach and the photorespiratory conditional cat2 mutant, we studied the response and functional importance of three potential routes for glutathione oxidation pathways mediated by glutathione S-transferases, glutaredoxin dependent peroxiredoxins, and dehydroascorbate reductases (DHAR) in Arabidopsis during oxidative stress. Hence, interplay between different DHARs appears to be necessary to couple ascorbate and glutathione pools and to allow glutathione-related signaling during enhanced H2O2 metabolism. In addition to experimental work, modelling is another way to investigate H2O2 production and its metabolism related to catalase activity and ascorbate glutathione pathway. This approach led to major conclusions, that catalase and ascorbate peroxidase can share the load in H2O2 processing even in optimal growth conditions. Furthermore, simulations propose that NADPH availability may determine glutathione oxidation through its influence on monodehydroascorbate reduction. Taken together, experimental results and our kinetic model strengthen that the sensitivity of glutathione status to oxidative stress acts as a suitable sensor of increased H2O2.

Cette thèse explore la possibilité d'utiliser des déchets solides carbonatés issus du procédé Solvay de fabrication de carbonate de sodium (Na2CO3) comme réactifs pour le traitement de l'H2S à des concentrations trouvées typiquement dans des stations d'épuration des eaux usées. Dans un premier temps, la réactivité de deux résidus issus du procédé Solvay ont été évalués en termes d'efficacité d'abattement d'H2S dans un réacteur gaz-liquide-solide à l'échelle laboratoire (250 ml). Ce réacteur fonctionne en mode semi-continu (passage continu du gaz à travers un volume fixe de suspension). L'influence des paramètres opératoires comme la teneur en solide de la suspension, la concentration en H2S, la vitesse d'agitation et le volume de suspension a été examinée. Les processus cinétiques et physico-chimiques mis en jeu ont été identifiés et expliqués malgré le milieu réactionnel complexe. Dans un deuxième temps, l'étude du traitement d'H2S a été réalisée à l'échelle pilote sur un site industriel de Solvay en utilisant une colonne à bulles avec passettes (170 L) qui fonctionne également en mode semi-continu. Les résultats de l'étude paramétrique à l'échelle laboratoire ont été confirmés à l'échelle pilote. Finalement, la colonne a été évaluée avec un effluent gazeux réel issu d'une station d'épuration d'eaux usées à Graulhet (81) qui contient jusqu'à 200 ppmv d'H2S. En présence d'autres gaz comme le méthane (0,4 % vol.), le dioxyde de carbone (2,5 % vol.), le système s'est révélé efficace pour l'abattement sélectif d'H2S. Un abattement quasi-total (100 %) a pu être maintenu pendant au moins deux semaines avec un batch de la suspension à base de résidu. Cette étude démontre la compétitivité du procédé en termes d'efficacité et de coût pour le traitement d'H2S dans des conditions ambiantes. Les résultats obtenus démontrent également la possibilité de transposition du procédé à l'échelle industrielle. / The purpose of this study to valorize solid wastes from the Solvay process for the production of sodium carbonate as reagents for the treatment of H2S in air at concentrations typically found in wastewater treatment plants (tens to hundreds of ppmv of H2S). Firstly, the reactivity of two residues was evaluated in a gas-liquid-solid reactor at laboratory scale (250 ml). This reactor operates semi-continuously (continuous passage of gas through a fixed volume of slurry). The influence of operating parameters including the solid content of the suspension, the concentration of H2S, the stirring speed and the volume of suspension was discussed. The kinetics, physicochemical processes as well as mechanism involved have been identified despite the complex reaction medium. Secondly, the H2S treatment was investigated at pilot scale using a bubble column with trays (170 L) which also operates in semi-continuous mode. The results of the parametric study obtained at laboratory scale were checked at pilot scale. Finally, the column was evaluated with a real gaseous effluent from a wastewater plant in Graulhet (Tarn, France) which contains up to 200 ppmv of H2S. In the presence of other gases as methane (0.4% vol.) and carbon dioxide (2.5% vol.), the system has proven to be effective for the selective elimination of H2S. A near total abatement (100%) was maintained for at least two weeks with only one batch of suspension. Stable and non-volatile sulfur compounds (sulfates, sulfites, thiosulfates) were formed as products of the process. This study demonstrates the competitiveness of the process in terms of cost-effectiveness for the treatment of H2S in ambient conditions. The results obtained also demonstrate the possibility of scaling-up the method to an industrial scale.

Les déchets de bois et de plastiques sont des ressources prometteuses pour la production du gaz de synthèse (syngaz) par la pyro-gazéification grâce à leurs disponibilités et leurs caractéristiques énergétiques. Cependant, le syngaz issu de ces déchets peut contenir des teneurs élevées en chlorure d’hydrogène (HCl) qui est corrosif et toxique et qui doit donc être éliminé. Premièrement, les expériences de pyrolyse des mélanges de bois de peuplier et de plastiques ont mis en évidence l’influence des plastiques sur les produits obtenus. En effet, le HDPE et PS augmentent respectivement le pouvoir calorifique du syngaz et le rendement en huiles, tandis que le PVC augmente le rendement en char et le HCl dans le syngaz. Ensuite, les expériences de pyro-gazéification à l’échelle pilote ont montré que l’ajout de 1 % en masse de PVC dans un déchet de bois augmente la teneur en goudrons et HCl dans le syngaz par un facteur respectivement de 2 et 5,5, tandis que la concentration de chlore dans le char résiduel est 16 fois plus élevée. En parallèle, un model CFD a été développé pour simuler la pyro-gazéification du déchet de bois en couplant les phénomènes d’écoulement de fluides, transfert de masse et de chaleur, et les réactions chimiques. Ce modèle se compose des sous-modèles de séchage, pyrolyse, oxydation et gazéification du char. Les résultats de simulation sont en bon accord avec les données expérimentales obtenues par des expériences dans un gazéifieur à l’échelle pilote. En outre, les analyses de sensibilités du sous-modèle de la gazéification de char ont été réalisées. Finalement, une étude expérimentale a été conduite sur le traitement de HCl dans le syngaz. L’étude se concentre sur la valorisation de deux résidus solides industriels issus de la production de bicarbonate et carbonate de sodium. Leurs réactivités sont comparées avec celles de deux adsorbants commerciaux, NaHCO3 et Ca(OH)2. L’effet de la matrice gazeuse sur la performance des adsorbants est également examiné. Les résidus industriels ont un potentiel intéressant par rapport aux adsorbants commerciaux. Les résultats obtenus montrent des nouvelles approches pour la purification du syngaz généré par la gazéification des déchets de bois et de plastiques. / Wood and plastic waste are interesting feedstock for the production of syngas via pyro- gasification, mainly due to their abundant supply and good fuel properties. However, syngas derived from waste may contain significant amounts of hydrogen chloride (HCl), which is corrosive and toxic and must therefore be removed. In this work, co-pyrolysis experiments were first conducted in order to study the influence of mixing different plastics with wood samples on the pyrolysis products. It was found that HDPE and PS significantly increase the heating value and HCl content of the gas product respectively, while PVC increases the yield of char and HCl. Next, pilot-scale experiments were performed, which revealed that adding 1 wt% PVC to wood waste raises the content of tar and HCl in syngas by factors of 2 and 5,5 respectively, and also elevates the chlorine concentration in the char residue 16 time over the value obtained in the absence of PVC. In parallel, a CFD model was developed to simulate the pyro-gasification of wood waste by coupling fluid flow, heat and mass transfer, and chemical reactions. This model consists of drying, pyrolysis, oxidation and char gasification sub-models. The simulation results were in good agreement with experimental data obtained from the pilot-scale experiments. Furthermore, sensibility analyses on the char gasification sub-model were performed. Finally, an experimental study was conducted on the removal of HCl from syngas. The study focused on valorizing two industrial solid wastes generated from the process of sodium carbonate and sodium bicarbonate manufacture. Their HCl adsorption performance were compared to those of the commercial sorbents, NaHCO3 et Ca(OH)2. Moreover, the effect of gas matrix on their performance was studied. The industrial wastes showed potential for treating acid gas as compared to the commercial sorbents used. This opens up new approaches to the purification of syngas generated by the pyro-gasification of wood and plastic waste.

Objectif—Comparer les effets de la stérilisation au plasma de gaz de peroxyde d’hydrogène (HPGP) à l’oxyde d’éthylène (EO) et à la vapeur (ST) sur les propriétés physico-chimiques et d’adhésion bactérienne de fils de nylon et de polyéthylène. Design expérimental—Etude in vitro. Matériel—Des brins non stérilisés, stérilisés au HPGP, à l’EO et ST; de fil nylon leader (FNL), de fil de nylon pêche (FNP) et de fil de polyéthylène (PE) ont été utilisés. Méthodes—Une analyse de surface au spectroscope photo-électronique à rayons X (XPS), une mesure de l’angle de contact, une analyse par microscopie à force atomique (AFM) et l’adhésion bactérienne de Staphylococcus intermedius et d’Escherichia Coli ont été testés sur les brins. Résultats—Une oxydation de la surface de tous les échantillons stérilisés a été observée quelque soit la méthode de stérilisation. La stérilisation a augmenté significativement l’angle de contact pour tous les types de fil quelque soit la méthode. La rugosité n’a pas été affectée significativement par la méthode de stérilisation pour le FNL et FNP. L’adhésion bactérienne a été affectée significativement par la méthode de stérilisation. Le PE a un angle de contact, une rugosité et une adhésion bactérienne significativement plus élevée que le FNL et FNP, peu importe la méthode de stérilisation. Conclusion—La stérilisation au HPGP constitue une alternative intéressante à la vapeur et l’EO. Le PE n’est peut être pas un matériel idéal par sa capacité d’adhésion bactérienne. De futures études sont nécessaires pour déterminer la signification clinique de ces trouvailles. / Objective—To compare the effects of hydrogen peroxide gas plasma (HPGP), ethylene oxide (EO) and steam (ST) sterilizations on the physicochemical and bioadhesive properties of nylon and polyethylene lines used for stabilization of the canine stifle joint. Study Design—In vitro study. Samples—Non-sterilized, HPGP-, EO- and ST- sterilized samples of 36.3-kg test nylon leader line (NLL), 57.8-kg test nylon fishing line (NFL) and 2-mm Ultra High Molecular Weight Polyethylene (UHMPE) were used. Methods—Surface analysis of NLL, NFL and UHMPE non-sterilized and HPGP-, EO- and ST-sterilized samples was carried out by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), contact angle (CA) measurement, and atomic force microscopy (AFM). Staphylococcus intermedius and Escherichia Coli bacterial adherence were also tested. Results—Surface oxidation was observed on all samples sterilized with HPGP, EO or ST process. All sterilization methods significantly increased the CA for the NLL, NFL and UHMPE. The roughness was not significantly affected by the method of sterilization for NLL, NFL and UHMPE. Bacterial adherence was significantly affected by the method of sterilization for NLL, NFL and UHMPE. UHMPE had significantly higher CA, roughness and bacterial adherence compared to NLL and NFL, no matter which sterilization method was used. Conclusion—The effects of HPGP on the chemico-physical and bioadhesive properties of nylon and polyethylene lines compared positively to EO or ST, making HPGP an attractive alternative. UHMPE may not be a suitable material for suture prostheses regarding bacterial adherence properties. Future studies are required to determine the clinical significance of these findings.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La production biologique d'hydrogène (H2) représente une technologie possible pour la production à grande échelle durable de H2 nécessaire pour l'économie future de l'hydrogène. Cependant, l'obstacle majeur à l'élaboration d'un processus pratique a été la faiblesse des rendements qui sont obtenus, généralement autour de 25%, bien en sous des rendements pouvant être atteints pour la production de biocarburants à partir d'autres processus. L'objectif de cette thèse était de tenter d'améliorer la production d'H2 par la manipulation physiologique et le génie métabolique. Une hypothèse qui a été étudiée était que la production d'H2 pourrait être améliorée et rendue plus économique en utilisant un procédé de fermentation microaérobie sombre car cela pourrait fournir la puissance supplémentaire nécessaire pour une conversion plus complète du substrat et donc une production plus grande d'H2 sans l'aide de l'énergie lumineuse. Les concentrations optimales d’O2 pour la production de H2 microaérobie ont été examinées ainsi que l'impact des sources de carbone et d'azote sur le processus. La recherche présentée ici a démontré la capacité de Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (un mutant déficient d’absorption-hydrogénase) de produire de l'H2 sous condition microaérobie sombre avec une limitation dans des quantités d’O2 et d'azote fixé. D'autres travaux devraient être entrepris pour augmenter les rendements d'H2 en utilisant cette technologie. De plus, un processus de photofermentation a été créé pour améliorer le rendement d’H2 à partir du glucose à l'aide de R. capsulatus JP91 hup- soit en mode non renouvelé (batch) et / ou en conditions de culture en continu. Certains défis techniques ont été surmontés en mettant en place des conditions adéquates de fonctionnement pour un rendement accru d'H2. Un rendement maximal de 3,3 mols de H2/ mol de glucose a été trouvé pour les cultures en batch tandis que pour les cultures en continu, il était de 10,3 mols H2/ mol de glucose, beaucoup plus élevé que celui rapporté antérieurement et proche de la valeur maximale théorique de 12 mols H2/ mol de glucose. Dans les cultures en batch l'efficacité maximale de conversion d’énergie lumineuse était de 0,7% alors qu'elle était de 1,34% dans les cultures en continu avec un rendement de conversion maximum de la valeur de chauffage du glucose de 91,14%. Diverses autres approches pour l'augmentation des rendements des processus de photofermentation sont proposées. Les résultats globaux indiquent qu'un processus photofermentatif efficace de production d'H2 à partir du glucose en une seule étape avec des cultures en continu dans des photobioréacteurs pourrait être développé ce qui serait un processus beaucoup plus prometteur que les processus en deux étapes ou avec les co-cultures étudiés antérieurément. En outre, l'expression hétérologue d’hydrogenase a été utilisée comme une stratégie d'ingénierie métabolique afin d'améliorer la production d'H2 par fermentation. La capacité d'exprimer une hydrogénase d'une espèce avec des gènes de maturation d'une autre espèce a été examinée. Une stratégie a démontré que la protéine HydA orpheline de R. rubrum est fonctionnelle et active lorsque co-exprimée chez Escherichia coli avec HydE, HydF et HydG provenant d'organisme différent. La co-expression des gènes [FeFe]-hydrogénase structurels et de maturation dans des micro-organismes qui n'ont pas une [FeFe]-hydrogénase indigène peut entraîner le succès dans l'assemblage et la biosynthèse d'hydrogénase active. Toutefois, d'autres facteurs peuvent être nécessaires pour obtenir des rendements considérablement augmentés en protéines ainsi que l'activité spécifique des hydrogénases recombinantes. Une autre stratégie a consisté à surexprimer une [FeFe]-hydrogénase très active dans une souche hôte de E. coli. L'expression d'une hydrogénase qui peut interagir directement avec le NADPH est souhaitable car cela, plutôt que de la ferrédoxine réduite, est naturellement produit par le métabolisme. Toutefois, la maturation de ce type d'hydrogénase chez E. coli n'a pas été rapportée auparavant. L'opéron hnd (hndA, B, C, D) de Desulfovibrio fructosovorans code pour une [FeFe]-hydrogénase NADP-dépendante, a été exprimé dans différentes souches d’E. coli avec les gènes de maturation hydE, hydF et hydG de Clostridium acetobutylicum. L'activité de l'hydrogénase a été détectée in vitro, donc une NADP-dépendante [FeFe]-hydrogénase multimérique active a été exprimée avec succès chez E. coli pour la première fois. Les recherches futures pourraient conduire à l'expression de cette enzyme chez les souches de E. coli qui produisent plus de NADPH, ouvrant la voie à une augmentation des rendements d'hydrogène via la voie des pentoses phosphates. / Biological hydrogen (H2) production represents a possible technology for the large scale sustainable production of H2 needed for a future hydrogen economy. However, the major obstacle to developing a practical process has been the low yields that are obtained, typically around 25%, well below those achievable for the production of other biofuels from the same feedstock. The goal of this thesis was to improve H2 production through physiological manipulation and metabolic engineering. One investigated hypothesis was that H2 production could be improved and made more economical by using a microaerobic dark fermentation process since this could provide the extra reducing power required for driving substrate conversion to completion and hence more H2 production might be obtained without using light energy. The optimal O2 concentrations for microaerobic H2 production were examined as well as the impact of carbon and nitrogen sources on the process. The research reported here proved the capability of Rhodobacter capsulatus JP91 hup- (an uptake-hydrogenase deficient mutant) to produce H2 under microaerobic dark conditions with limiting amounts of O2 and fixed nitrogen. Further work should be undertaken to increase H2 yields using this technology. In addition, a photofermentation process was established to improve H2 yield from glucose using R. capsulatus JP91 hup- strain either in batch and/or continuous culture conditions. Some technical challenges in establishing the proper operational conditions for increased H2 yield were overcome. A maximum yield of 3.3 mols of H2/ mol of glucose was found for batch cultures whereas in continous cultures it was 10.3 mols H2/ mol glucose, much higher than previously reported and close to the theoretical maximum value of 12 mols H2/ mol glucose. In batch cultures the maximum light conversion efficiency was 0.7% whereas it was 1.34% in continuous cultures with a maximum conversion efficiency of the heating value of glucose of 91.14%. Various approaches to further increasing yields in photofermentation processes are proposed. The overall results suggest that an efficient single stage photofermentative H2 production process from glucose using continuous cultures in photobioreactors could be developed which would be a much more promising alternative process to the previously studied two stage photofermentation or co-culture approaches. Furthermore, the heterologous expression of hydrogenases was used as a metabolic engineering strategy to improve fermentative H2 production. The capability of expressing a hydrogenase from one species with the maturation genes from another was examined. One strategy demonstrated that the orphan hydA of R. rubrum is functional and active when co-expressed in E. coli with hydE, hydF and hydG from different organisms. Co-expression of the [FeFe]-hydrogenase structural and maturation genes in microorganisms that lack a native [FeFe]-hydrogenase can successfully result in the assembly and biosynthesis of active hydrogenases. However, other factors may be required for significantly increased protein yields and hence the specific activity of the recombinant hydrogenases. Another strategy was to overexpress one of the highly active [FeFe]-hydrogenases in a suitable E. coli host strain. Expression of a hydrogenase that can directly interact with NADPH is desirable as this, rather than reduced ferredoxin, is naturally produced by its metabolism. However, the successful maturation of this type of hydrogenase in E. coli had not been previously reported. The Desulfovibrio fructosovorans hnd operon (hndA, B, C, and D genes), encoding a NADP-dependent [FeFe]-hydrogenase, was expressed in various E. coli strains with the maturation genes hydE, hydF and hydG of Clostridium acetobutylicum. Hydrogenase activities were detected in vitro, thus a multi-subunit NADP-dependent [FeFe]-active hydrogenase was successfully expressed and matured in E. coli for the first time. Future research could lead to the expression of this hydrogenase in E. coli host strains that overproduce NADPH, setting the stage for increased hydrogen yields via the pentose phosphate pathway.

Les défis conjoints du changement climatique d'origine anthropique et la diminution des réserves de combustibles fossiles sont le moteur de recherche intense pour des sources d'énergie alternatives. Une avenue attrayante est d'utiliser un processus biologique pour produire un biocarburant. Parmi les différentes options en matière de biocarburants, le bio-hydrogène gazeux est un futur vecteur énergétique attrayant en raison de son efficacité potentiellement plus élevé de conversion de puissance utilisable, il est faible en génération inexistante de polluants et de haute densité d'énergie. Cependant, les faibles rendements et taux de production ont été les principaux obstacles à l'application pratique des technologies de bio-hydrogène. Des recherches intensives sur bio-hydrogène sont en cours, et dans les dernières années, plusieurs nouvelles approches ont été proposées et étudiées pour dépasser ces inconvénients. À cette fin, l'objectif principal de cette thèse était d'améliorer le rendement en hydrogène moléculaire avec un accent particulier sur l'ingénierie métabolique et l’utilisation de bioprocédés à variables indépendantes. Une de nos hypothèses était que la production d’hydrogène pourrait être améliorée et rendue plus économiquement viable par ingénierie métabolique de souches d’Escherichia coli producteurs d’hydrogène en utilisant le glucose ainsi que diverses autres sources de carbone, y compris les pentoses. Les effets du pH, de la température et de sources de carbone ont été étudiés. La production maximale d'hydrogène a été obtenue à partir de glucose, à un pH initial de 6.5 et une température de 35°C. Les études de cinétiques de croissance ont montré que la μmax était 0.0495 h-1 avec un Ks de 0.0274 g L-1 lorsque le glucose est la seule source de carbone en milieu minimal M9. .Parmi les nombreux sucres et les dérivés de sucres testés, les rendements les plus élevés d'hydrogène sont avec du fructose, sorbitol et D-glucose; 1.27, 1.46 et 1.51 mol H2 mol-1 de substrat, respectivement. En outre, pour obtenir les interactions entre les variables importantes et pour atteindre une production maximale d'hydrogène, un design 3K factoriel complet Box-Behnken et la méthodologie de réponse de surface (RSM) ont été employées pour la conception expérimentale et l'analyse de la souche d'Escherichia coli DJT135. Le rendement en hydrogène molaire maximale de 1.69 mol H2 mol-1 de glucose a été obtenu dans les conditions optimales de 75 mM de glucose, à 35°C et un pH de 6.5. Ainsi, la RSM avec un design Box-Behken était un outil statistique utile pour atteindre des rendements plus élevés d'hydrogène molaires par des organismes modifiés génétiquement. Ensuite, l'expression hétérologue de l’hydrogénases soluble [Ni-Fe] de Ralstonia eutropha H16 (l'hydrogénase SH) a tenté de démontrer que la mise en place d'une voie capable de dériver l'hydrogène à partir de NADH pourrait surpasser le rendement stoechiométrique en hydrogène.. L’expression a été démontrée par des tests in vitro de l'activité enzymatique. Par ailleurs, l'expression de SH a restaurée la croissance en anaérobie de souches mutantes pour adhE, normalement inhibées en raison de l'incapacité de réoxyder le NADH. La mesure de la production d'hydrogène in vivo a montré que plusieurs souches modifiées métaboliquement sont capables d'utiliser l'hydrogénase SH pour dériver deux moles d’hydrogène par mole de glucose consommé, proche du maximum théorique. Une autre stratégie a montré que le glycérol brut pourrait être converti en hydrogène par photofermentation utilisant Rhodopseudomonas palustris par photofermentation. Les effets de la source d'azote et de différentes concentrations de glycérol brut sur ce processus ont été évalués. À 20 mM de glycérol, 4 mM glutamate, 6.1 mol hydrogène / mole de glycérol brut ont été obtenus dans des conditions optimales, un rendement de 87% de la théorie, et significativement plus élevés que ce qui a été réalisé auparavant. En prolongement de cette étude, l'optimisation des paramètres a également été utilisée. Dans des conditions optimales, une intensité lumineuse de 175 W/m2, 30 mM glycérol et 4.5 mM de glutamate, 6.69 mol hydrogène / mole de glycérol brut ont été obtenus, soit un rendement de 96% de la valeur théorique. La détermination de l'activité de la nitrogénase et ses niveaux d'expression ont montré qu'il y avait relativement peu de variation de la quantité de nitrogénase avec le changement des variables alors que l'activité de la nitrogénase variait considérablement, avec une activité maximale (228 nmol de C2H4/ml/min) au point central optimal. Dans la dernière section, la production d'hydrogène à partir du glucose via la photofermentation en une seule étape a été examinée avec la bactérie photosynthétique Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-). La méthodologie de surface de réponse avec Box-Behnken a été utilisée pour optimiser les variables expérimentales de façon indépendante, soit la concentration de glucose, la concentration du glutamate et l'intensité lumineuse, ainsi que d'examiner leurs effets interactifs pour la maximisation du rendement en hydrogène moléculaire. Dans des conditions optimales, avec une intensité lumineuse de 175 W/m2, 35 mM de glucose, et 4.5 mM de glutamate,, un rendement maximal d'hydrogène de 5.5 (± 0.15) mol hydrogène /mol glucose, et un maximum d'activité de la nitrogénase de 246 (± 3.5) nmol C2H4/ml/min ont été obtenus. L'analyse densitométrique de l'expression de la protéine-Fe nitrogenase dans les différentes conditions a montré une variation significative de l'expression protéique avec un maximum au point central optimisé. Même dans des conditions optimales pour la production d'hydrogène, une fraction significative de la protéine Fe a été trouvée dans l'état ADP-ribosylée, suggérant que d'autres améliorations des rendements pourraient être possibles. À cette fin, un mutant amtB dérivé de Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-) a été créé en utilisant le vecteur de suicide pSUP202. Les résultats expérimentaux préliminaires montrent que la souche nouvellement conçue métaboliquement, R. capsulatus DG9, produit 8.2 (± 0.06) mol hydrogène / mole de glucose dans des conditions optimales de cultures discontinues (intensité lumineuse, 175 W/m2, 35 mM de glucose et 4.5 mM glutamate). Le statut d'ADP-ribosylation de la nitrogénase-protéine Fe a été obtenu par Western Blot pour la souche R. capsulatus DG9. En bref, la production d'hydrogène est limitée par une barrière métabolique. La principale barrière métabolique est due au manque d'outils moléculaires possibles pour atteindre ou dépasser le rendement stochiométrique en bio-hydrogène depuis les dernières décennies en utilisant les microbes. À cette fin, une nouvelle approche d’ingénierie métabolique semble très prometteuse pour surmonter cette contrainte vers l'industrialisation et s'assurer de la faisabilité de la technologie de la production d'hydrogène. Dans la présente étude, il a été démontré que l’ingénierie métabolique de bactéries anaérobiques facultatives (Escherichia coli) et de bactéries anaérobiques photosynthétiques (Rhodobacter capsulatus et Rhodopseudomonas palustris) peuvent produire de l'hydrogène en tant que produit majeur à travers le mode de fermentation par redirection métabolique vers la production d'énergie potentielle. D'autre part, la méthodologie de surface de réponse utilisée dans cette étude représente un outil potentiel pour optimiser la production d'hydrogène en générant des informations appropriées concernant la corrélation entre les variables et des producteurs de bio-de hydrogène modifiés par ingénierie métabolique. Ainsi, un outil d'optimisation des paramètres représente une nouvelle avenue pour faire un pont entre le laboratoire et la production d'hydrogène à l'échelle industrielle en fournissant un modèle mathématique potentiel pour intensifier la production de bio-hydrogène. Par conséquent, il a été clairement mis en évidence dans ce projet que l'effort combiné de l'ingénierie métabolique et la méthodologie de surface de réponse peut rendre la technologie de production de bio-hydrogène potentiellement possible vers sa commercialisation dans un avenir rapproché. / The joint challenges of anthropogenic climate change and dwindling fossil fuel reserves are driving intense research into alternative energy sources. One attractive avenue is to use a biological process to produce a biofuel. Among the various biofuel options, biohydrogen gas is an attractive future energy carrier due to its potentially higher efficiency of conversion to usable power, low to non-existent generation of pollutants and high energy density. However, low yields and production rates have been major barriers to the practical application of biohydrogen technologies. Intensive research on biohydrogen is underway, and in the last few years several novel approaches have been proposed and studied to surpass these drawbacks. To this end the main aim of this thesis was to improve the molar hydrogen yield with special emphasis of metabolic engineering using the interactive effect with bioprocess independent variable. One investigated hypothesis was that H2 production could be improved and made more economically viable by metabolic engineering on the facultative hydrogen producer Escherichia coli from glucose as well as various other carbon sources, including pentoses. The effects of pH, temperature and carbon source were investigated in batch experiments. Maximal hydrogen production from glucose was obtained at an initial pH of 6.5 and temperature of 35°C. Kinetic growth studies showed that the μmax was 0.0495 h−1 with a Ks of 0.0274 g L−1 when glucose was the sole carbon source in M9 (1X) minimal medium. Among the many sugar and sugar derivatives tested, hydrogen yields were highest with fructose, sorbitol and d-glucose; 1.27, 1.46 and 1.51 mol H2 mol−1 substrate respectively. In addition, to obtain the interactions between the variables important for achieving maximum hydrogen production, a 3K full factorial Box–Behnken design and response surface methodology (RSM) were employed for experimental design and analysis on a metabolically engineered Escherichia coli strain, DJT135. A maximum molar hydrogen yield of 1.69 mol H2 mol−1 glucose was obtained under the optimal conditions of 75 mM glucose, 35°C and pH 6.5. Thus, RSM with Box–Behnken design was a useful statistical tool for achieving higher molar hydrogen yields by metabolically engineered organisms. Furthermore, the heterologous expression of the soluble [Ni-Fe] hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 (the SH hydrogenase) was attempted to demonstrate the introduction of a pathway capable of deriving hydrogen from NADH to surpass the stoichiometric molar hydrogen yield. Successful expression was demonstrated by in vitro assay of enzyme activity. Moreover, expression of SH restored anaerobic growth on glucose to adhE strains, normally blocked for growth due to the inability to re-oxidize NADH. Measurement of in vivo hydrogen production showed that several metabolically engineered strains were capable of using the SH hydrogenase to derive 2 mol H2 per mol of glucose consumed, close to the theoretical maximum. Using another strategy, it was shown that crude glycerol could be converted to hydrogen, a possible future clean energy carrier, by photofermentation using Rhodopseudomonas palustris through photofermentation. Here, the effects of nitrogen source and different concentrations of crude glycerol on this process were assessed. At 20 mM glycerol, 4 mM glutamate, 6.1 mol hydrogen/mole of crude glycerol were obtained under optimal conditions, a yield of 87% of the theoretical, and significantly higher than what was achieved previously. As a continuation of this study, multiprocess parameter optimization was also involved. Under optimal conditions, a light intensity of 175 W/m2, 30 mM glycerol, and 4.5 mM glutamate, 6.69 mol hydrogen/mole of crude glycerol were obtained, a yield 96% of theoretical. Determination of nitrogenase activity and expression levels showed that there was relatively little variation in levels of nitrogenase protein with changes in process variables whereas nitrogenase activity varied considerably, with maximal nitrogenase activity (228 nmol of C2H4/ml/min) at the optimal central point. In the final section, hydrogen production from glucose via single-stage photofermentation was examined with the photosynthetic bacterium Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-). Response surface methodology with Box–Behnken design was used to optimize the independent experimental variables of glucose concentration, glutamate concentration and light intensity, as well as examining their interactive effects for maximization of molar hydrogen yield. Under optimal condition with a light intensity of 175 W/m2, 35 mM glucose, and 4.5 mM glutamate, a maximum hydrogen yield of 5.5 (±0.15) mol H2/mol glucose, and a maximum nitrogenase activity of 246 (±3.5) nmol C2H4/ml/min were obtained. Densitometric analysis of nitrogenase Fe-protein expression under different conditions showed significant variation in Fe-protein expression with a maximum at the optimized central point. Even under optimum conditions for hydrogen production, a significant fraction of the Fe-protein was found in the ADP-ribosylated state, suggesting that further improvement in yields might be possible. To this end an AmtB- derivative of Rhodobacter capsulatus JP91 (hup-) was created by conjugating in amtB::Km using the suicide vector pSUP202. Preliminary experimental results showed that the newly metabolically engineered strain, R. capsulatus DG9, produced 8.2 (±0.06) mol hydrogen/mole of glucose under optimal conditions in batch cultures (light intensity, 175 W/m2; 35 mM glucose, and 4.5 mM glutamate). Western blot analyses of the ADP-ribosylation status of the nitrogenase Fe-protein were investigated on metabolically engineered strain R. capsulatus DG9. In brief, the progress on hydrogen production technology has been limited due to the metabolic barrier. The major metabolic barrier is due to lacking of potential consistent molecular tools to reach or surpass the stochiometric biohydrogen yield since last decades using microbes. To this end a novel approach “metabolic engineering” seems very promising to overcome this constraint towards industrialization to ensure the feasibility of hydrogen production technology. In this present study it has been shown that metabolically engineered facultative (Escherichia coli) anaerobe and photosynthetic bacteria (Rhodobacter capsulatus and Rhodopseudomonas palustris) can produce hydrogen as a major product through fermentative mode by metabolic redirection toward potential energy generation. On the other hand, response surface methodology has depicted in this study as another potential tool to statistically optimize the hydrogen production by generating suitable information concerning interactive correlation between process variables and metabolically engineered biohydrogen producers. Thus, multi process parameter optimization tool has been creating a novel avenue to make a crosslink between lab scale and pilot scale hydrogen production by providing potential mathematical model for scaling up biohydrogen production using metabolically engineered biohydrogen producers. Therefore, it has been clearly revealed in this project that combined effort of metabolic engineering and response surface methodology can make biohydrogen production technology potentially feasible towards its commercialization in near future.