Il existe diverses pathologies rétiniennes qui affectent la macula, la région responsable de la vision centrale. En raison du développement rapide des connaissances scientifiques et médicales, les méthodes diagnostiques ainsi que les traitements utilisés dans le domaine de l'ophtalmologie sont en constante évolution. L'objet à l'étude dans le cadre de cette maîtrise porte sur l'impact des récents traitements de deux atteintes maculaires : le trou maculaire et la dégénérescence maculaire. Cet ouvrage comporte donc deux principaux volets résultant de deux projets de recherche différents. Le premier volet aborde le débat sur l'innocuité de deux colorants utilisés couramment au cours de la chirurgie du trou maculaire idiopathique, soit le vert indocyanine et le bleu trypan. Le second volet approfondit la question du traitement offert aux patients souffrant de dégénérescence maculaire de type exsudative, tant du point de vue du choix de la molécule utilisée (Avastin versus Lucentis) que de l'intervalle d'administration.

Le long de l’axone d’un neurone mature, les microtubules (MTs) sont organisés en faisceaux parallèles et orientés. Cette géométrie devrait en théorie favoriser la formation de fagots serrés de MTs par encombrement macromoléculaire au sein de l’axoplasme (distance interMT < 5 nm). Or, des images de coupes d’axones obtenues par microscopie électronique ont révélé qu’ils y étaient bien séparés (distance interMT ≈ 75 nm). Dans la littérature, cette singularité pourrait s’expliquer par la présence de Tau, une protéine associée aux MTs. Cependant, l’effet de Tau sur l’organisation de MTs est encore sujet à controverse et deux modèles antagonistes ont été proposés. Le premier modèle avance que le domaine de projection de Tau connecte les MTs tout en les maintenant espacés en formant des ponts d’origine électrostatiques, à l’inverse du second qui explique l’espacement des MTs par un effet de « polymer brush » dû à la présence de Tau à la surface du MT. Afin d’éclairer la fonction de Tau dans l’organisation des MTs, nous avons combiné des approches expérimentales à différentes échelles, in vitro et in cellulo, avec des données issues de la modélisation analytique et numérique. Les résultats obtenus nous ont permis de proposer un modèle alternatif où la protéine Tau formerait des ponts transitoires. Ces derniers permettraient de maintenir les MTs suffisamment éloignés les uns des autres afin d’éviter l’effet de forces attractives à courte portée qui déclencheraient une mise en fagot irréversible des MTs. Enfin, notre modèle tient compte de la faible densité de Tau sur la surface des MTs axonaux. En effet, même à un bas ratio molaire Tau : Tubuline, Tau permet de garder les MTs éloignés les uns des autres grâce à la mobilité relative de Tau sur les MTs. / In mature neurons, axonal microtubules (MTs) are arranged in parallel arrays. Interestingly, even though both macromolecular crowding and their parallel orientation should force the formation of tightly packed bundles, they remain well separated. For decades, Tau, a microtubule-associated protein, has been implicated in this unique organization of axonal MTs. However, Tau properties still remain controversial as two antagonist models of interaction with MTs exist. Tau projection domains are either thought to connect MTs by forming electrostatic cross-bridges or to repulse them via a polymer brush mechanism. To gain a comprehensive view of Tau function, we then performed in vitro and in cells experiments, combined to analytical and mathematical modelling. We also reviewed the data traditionally used to support the cross-bridging and the polymer brush models and compared them with our interdisciplinary approach. Taken together, these results are indicating that tau can form transient and long-range cross-bridges at the interface between microtubules. These cross-bridges could prevent short-range attractive interactions that trigger an irreversible microtubule bundling. Finally, our model explain how MTs are kept apart at very low Tau:Tubulin molar ratio thanks to tau diffusion on microtubules.

Plusieurs indices nous portent à croire que le tremblement essentiel (TE) soit relié à un trouble neurodégénératif du cervelet. Une collaboration avec les neurologues Dr Ali et Alex Rajput nous a permis d’obtenir une banque d’échantillons post-mortems de cervelets : 14 de patients atteints du TE, 15 de patients atteints de la maladie de Parkinson (MP) et 20 de sujets témoins. Plusieurs maladies neurodégénératives sont caractérisées par une accumulation d’agrégats protéiques. Nous avons donc évalué dans le cervelet de ces groupes la présence de protéinopathies classiques telles que la synucléinopathie, la protéinopathie « TAR DNA binding protein 43 » (TDP-43) et la taupathie, que l’on retrouve chez des maladies neurodégénératives classiques. J’ai effectué des immunobuvardages de type « Western » et mes analyses n’indiquent pas la présence d’une protéinopathie franche dans le TE, outre une augmentation non significative de l’hyperphosphorylation de l’épitope AT100 de la protéine tau, un marqueur neuropathologique de la maladie d’Alzheimer (MA), chez les personnes atteintes de TE. / Various studies have led to the hypothesis that essential tremor (ET) is a syndrome resulting from a neurodegenerative process in the cerebellum. The collaboration with the neurologists, Dr Ali and Alex Rajput has allowed to a bank of post-mortem cerebellar cortices: 14 ET patients, 15 Parkinson disease (PD) patients and 20 control subjects. Most neurodegenerative diseases involve a proteinopathy, characterized by the accumulation of misfolded-proteins. I investigated common types of proteic abnormalities such as: synucleinopathies, « TAR DNA binding protein 43 » (TDP-43) and taupathies observed in classic neurodegenerative diseases, using Western immunoblotting. However, results do not indicate a distinctively the presence of a proteinopathy in ET cerebellum, except for a non-significant increase of tau epitopes AT100, a neuropathological marker of Alzheimer's disease (AD).

L’échec des différents essais cliniques souligne la nécessité de développer des nouvelles thérapies pour la maladie d'Alzheimer (MA), la cause la plus commune de démence. Les microARNs (miARNs) sont les ARNs non-codants les plus étudiés et ils jouent un rôle important dans la modulation de l'expression des gènes et de multiples voies de signalisation. Des études antérieures, dont celles de mon laboratoire d’accueil, ont permis de développer l’hypothèse que certains membres de la famille miR-15/107 (c.-à-d. miR-15ab, miR-16, miR-195, miR-424, and miR-497) pourraient être utilisés comme agents thérapeutiques dans MA. En effet, cette famille avait le potentiel de réguler de multiples gènes associés à MA, tels que la protéine précurseur de l'amyloïde (APP), la β-secrétase (BACE1), et la protéine Tau. Tel que démontré dans ce projet de thèse, j’ai choisi miR-16 comme cible thérapeutique potentielle pour MA parmi tous les membres de la famille. L’essai luciférase dans ce projet confirme que miR-16 peut réguler simultanément APP et BACE1, directement par une interaction avec la région non-codante en 3’ de l’ARNm). Notamment, nous observons aussi une réduction de la production des peptides amyloïdes et de la phosphorylation de Tau après une augmentation de miR-16 en cellule. J’ai ensuite validé mes résultats in vivo dans la souris en utilisant une méthode de livraison de miR-16 via une pompe osmotique implanté dans le cerveau. Dans ce cas, l'expression des protéines d’intérêts (APP, BACE1, Tau) a été mesurée par immunobuvardage et PCR à temps réel. Après validation, ces résultats ont été complémentés par une étude protéomique (iTRAQ) du tronc cérébral et de l'hippocampe, deux régions associées à la maladie. Ces données m’ont permis d’identifier d'autres protéines régulées par miR-16 in vivo, incluant α-Synucléine, Transferrine receptor1, et SRm300. Une autre observation intéressante : les voies régulées par miR-16 in vivo sont directement en lien avec le stress oxydatif et la neurodégénération. En résumé, ce travail démontre l’efficacité et la faisabilité d’utiliser un miARN comme outil thérapeutique pour la maladie d’Alzheimer. Ces résultats rentrent dans un cadre plus vaste de découvrir de nouvelles cibles pour MA, et en particulier la forme sporadique de la maladie qui représente plus de 95% de tous les cas. Évidemment, la découverte d’une molécule pouvant cibler simultanément les deux pathologies de la maladie (plaques amyloïdes et hyper phosphorylation de tau) est nouvelle et intéressante, et ce domaine de recherche ouvre la porte aux autres petits ARNs non-codants dans MA et les maladies neurodégénératives connexes. / Failure at different clinical trials emphasizes the need for developing new therapeutics for Alzheimer disease (AD) as the most common cause of dementia. MicroRNAs (miRNA) are the most studied groups of non-coding RNAs and have a critical role in modulating multiple signaling pathways and fine-tuning gene expression. Supporting evidence from other studies, including host lab, suggest that multiple members of the miR-15/107 family (miR-15ab, miR-16, miR-195, miR-424, and miR-497) could be used as therapeutic agents in AD. The potential ability of this miRNA family to modify disease pathway by multiple targeting of AD-associated genes such as Amyloid precursor protein (APP), β-site amyloid-β precursor protein cleaving enzyme (BACE1) and microtubule-associated protein Tau is of attention. Based on documented results in this study I chose miR-16 as candidate therapeutic miRNA in AD. This choice is based on data obtain from cells and in vitro luciferase assay indicating the role of this miRNA in the simultaneous regulation of APP, BACE1 (directly by targeting 3’UTR of these genes). Decrease in Tau phosphorylation and amyloid beta peptides were further observed following increased miR-16 levels. Furthermore, I validated these results in vivo by delivering miR-16 oligos using Osmotic pumps implanted subcutaneously to deliver oligos to lateral ventricles of mouse brain also providing a wide distribution of these oligos. Expression of desired protein targets was measured by western blot and qPCR in different brain regions. Results demonstrated a context-dependent action of delivered miR-16 increase on the potential AD involved targets in mouse brain. These results were complemented by proteomics study of Brainstem and Hippocampus regions. Data indicated the potential regulation of other proteins by miR-16 in vivo such as α-Synuclein in Brainstem and Transferrin receptor1 and SRm300 in Hippocampus. The increase in miR-16 levels in vivo and in vitro was sufficient to downregulate the protein product of these genes confirmed by western blot. Enrichment study predicted oxidative stress and neurodegeneration as top terms in close connection with miR-16. This work provided a proof-of-principle for possibility and efficiency of miRNA replacement based therapeutics delivered to CNS using miR-16 a member of the miR-15/107 family. Understanding the molecular mechanisms involved in the regulation of AD-related genes could have important implications for sporadic AD, which accounts for more than 95% of all cases with no effective therapy available. Multi-target therapy by non-coding RNA in AD is an emerging concept that would have the potential to change the way that therapeutics is developed for AD and other neurodegenerative diseases with complex nature and no effective therapy available.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

De nombreuses pathologies du système nerveux sont associées à une augmentation de l'apolipoprotéineD (apoD), une lipocaline également exprimée au cours du développement normal et du vieillissement. Un gène homologue de l'apoD chez la drosophile a un rôle protecteur dans les situations de stress et son absence réduit la résistance au stress oxydatif et accélère la neurodégénerescence. Notre équipe a été la première à démontrer le rôle protecteur de l'apoD chez les vertèbrés (souris) face à l'encéphalite induite par le cornavirus humain OC43 et aussi face au stress oxydatif induit par le paraquat. Afin de démontrer davantage l'effet bénéfique de l'apoD dans les situations pathologiques du système nerveux central, on a induit la neurodégénerescence en injectant l'acide kaïnique chez des souris transgéniques qui surexpriment l'apoD et des souris témoins non-transgéniques. L'acide kaïnique (analogue du glutamate) est un acide aminé excitateur dont l'activation des récepteurs dans le cerveau cause la dépolarisation des neurones et finalement la mort neuronale par apoptose (mimant la maladie d'Alzheimer). Ainsi ce modèle nous permettra de mesurer l'effet protecteur de l'apoD contre l'apoptose. Suite à l'injection intrapéritonéale, nous avons observé que l'acide kaïnique provoque des crises épileptiques chez les deux groupes de souris peu après l'injection; une légère différence concernant le taux et la gravité des convulsions entre les transgéniques et les non-transgéniques a été détectée. Cependant nous avons démontré par des analyses de type Northern, des immunobuvardages et par RT-PCR semi-quantitatif que l'acide kaïnique induit la surexpression de l'apoD endogène et provoque l'activation des cellules gliales (GFAP) dans l'hippocampe et le cervelet des souris au troisième jour après l'injection. Par contre, on a remarqué la présence de la cyclooxygénase-2 (inflammation) seulement dans l'hippocampe et le cortex de certaines souris (les souris ayant des très fortes convulsions) et son absence totale dans le cervelet. Nous avons aussi montré par la méthode TUNEL que l'acide kaïnique induit l'apoptose dans le cortex, le cervelet et surtout dans l'hippocampe, la zone la plus endommagée dans la maladie d'Alzheimer. Chez les souris transgéniques surexprimant l'apoD, dans les mêmes conditions, il y a moins d'apoptose comparativement aux souris de type sauvage, donc l'apoD pourrait jouer un rôle en modulant l'apoptose ainsi que protéger les neurones en prévenant l'apoptose. Les résultats obtenus au cours de différentes étapes de ce projet, tout d'abord mettent au point un modèle animal de neurodégénérescence associé à une surexpression de l'apoD et ensuite révèlent un autre aspect mal connu de rôle protecteur de l'apoD dans la régulation d'apoptose induite par l'acide kaïnique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Apolipoprotéine D, Neurodégénérescence, Acide kaïnique, Transgénique, TUNEL, Alzheimer, Apoptose.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Une des causes principales de la Maladie d’Alzheimer et des autres Tauopathies est la présence d’enchevêtrements neurofibrillaires (ENF). Les ENF sont des agrégations intracellulaires de la protéine Tau hyperphosphorylée. Plusieurs études ont montré que les ENF sont associés à la pathogénèse des troubles neurodégénératifs et à la neurotoxicité. De plus, il a été démontré qu’une diminution du niveau de la protéine Tau permet de prévenir les déficits cognitifs dans les modèles murins. Basé sur ces études, notre hypothèse de recherche est que réduire le niveau total de Tau dans le cerveau, pourrait diminuer les ENF et retarder la pathologie. Notre objectif est de développer une molécule capable de cibler l’ARNm de Tau plutôt que la protéine Tau hyperphosphorylée. Ainsi, nous avons développé le SOFA-delta ribozyme, capable de cliver l’ARNm de Tau. Notre ribozyme a trois composantes soit le bloqueur, le biosenseur et l’effecteur. Nous avons développé des deltaribozymes capable cibler les exons constitutifs et l’exon 10 (spécifique au Tau4R) de l’ARNm de Tau, ainsi nous pouvons cibler tous les isoformes de Tau. Dans ce projet, nous avons tout d’abord synthétisé le deltaribozyme par clonage moléculaire et nous avons confirmé son effet grâce au clivage in vitro. Dans un second temps, nous avons transfecté le ribozyme dans des cellules neuronales, et nous avons caractérisé son effet sur l’ARNm de Tau par RT-PCR. Enfin, nous avons produit des virus AAV, infecté des cellules neuronales et caractérisé encore une fois l’effet du ribozyme sur l’ARNm de Tau par RT-PCR. Cette approche thérapeutique est basée sur la spécificité et l’efficacité du SOFA-delta-ribozyme, qui identifie et coupe l’ARNm de Tau. Ainsi, dans ce mémoire nous avons identifié le ribozyme 350 et 395 comme candidats potentiellement capable de cliver l’ARNm de Tau. / One of the main causes of Alzheimer’s disease and Tauopathies is the presence of neurofibrillary tangles (NFT). NFT consist in intracellular aggregation of the abnormally hyperphophorylated protein Tau. Several studies have shown that NFT are associated with the pathogenesis of neurodegenerative disorders and neurotoxicity. Moreover, it has been demonstrated that decreasing the level of Tau protein could prevent cognitive deficits in mouse models. Based on these studies, our hypothesis is that reducing the level of total Tau in the brain could decrease NFTs and delay the pathology. Our objective is to design a molecule that will target directly Tau mRNA instead of the hyperphosphorylated protein. We developed a modified delta-ribozyme, the SOFA (Specific On/Off Adaptor) ribozyme, which is able to cleave the Tau mRNA. Our ribozyme is composed of three components: the blocker, the biosensor, and the effector. We have designed delta-ribozymes that target constitutive exons of Tau mRNA as well as the exon 10 specific of Tau 4R. Therefore, we can target all the Tau isoforms. In this project, we first synthesized the delta-ribozyme by molecular cloning and we confirmed its effect by in vitro cleavage. Secondly, by transfecting it in neuronal cells we characterized its effects on Tau mRNA by RT-PCR. Finally, we produced AAV viruses and infected neuronal cells and characterized its effects on Tau mRNA by RT-PCR. This therapeutic approach is based on specificity and efficiency of the SOFA-ribozymes, which identify and cut the Tau mRNA. Thus, in this project we identified ribozymes 350 and 395 as potential good candidates able to cleave the Tau mRNA.

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