La famille des enzymes 17β-hydroxystéroïde déshydrogénases (17β-HSDs) humaines est responsable de la biosynthèse des hormones stéroïdiennes. Les enzymes réductrices de cette famille, c'est-à-dire la 17β-HSDl, la 17β-HSD5 et la 17β-HSD7, sont impliquées dans la dernière étape de la synthèse des estrogènes actifs, jouant ainsi des rôles importants dans plusieurs cancers reliés au système endocrinien. Les autres facteurs qui permettent la progression ou la deletion de gènes sont les molécules de stéroïdes en action avec les récepteurs stéroïdiens nucléaires. Dans cette thèse, je présente la structure cristalline de la 17β-HSD1 avec plusieurs stéroïdes, incluant A-diol, 3β-diol, DHT et E₁, les deux premiers étant reconnus pour avoir une plus faible affinité pour l'enzyme. De plus, des études de cristallographie, de modélisation par ordinateur aussi bien que des études de biologie cellulaire ont démontré la propriété inhérente de translation des stéroïdes sexuels. Cette étude est d'un intérêt particulier puisqu'elle ouvre de nouvelles portes pour l'exploration d'une thérapie hormonale adjuvante. Je présente, de plus, des études d'inhibition aussi bien que le design et la prédiction de nouveaux inhibiteurs en utilisant la cristallographie, les essais enzymatiques et la modélisation de la 17β-HSD1 et de la 17β-HSD5. Finalement, je présente une étude préliminaire structure-fonction de la 17β-HSD7. Une revue sur plusieurs sujets touchant la cristallogenèse et l'activité de la 17β-HSD est aussi rapportée dans l'annexe.

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Les hormones stéroïdiennes comme les androgènes, les estrogènes, les glucocorticoïdes et dans une moindre mesure les progestines, sont des modulateurs reconnus du développement pulmonaire. Plusieurs éléments concernant la régulation de l’action de ces stéroïdes restent encore à être identifiés, surtout lors des stades sacculaire et alvéolaire. Premièrement, nous avons caractérisé l’expression des 17β-hydroxystéroïde déshydrogénases (17β-HSDs) de type 1, 2 et 5, de la 5α-réductase de type 1, de la 3α-HSD et du récepteur des androgènes (AR) dans le poumon murin en développement du jour gestationnel (JG) 19.5 au jour postnatal (PN) 30. Les niveaux de 17β-HSD de type 2 diminuaient dramatiquement à la fin du stade sacculaire alors que l’expression du AR augmentait graduellement de la naissance à l’âge adulte. Le AR fut principalement détecté dans le noyau des cellules épithéliales des voies aériennes et dans certaines cellules des voies respiratoires. Les ARNm de la 17β-HSD de type 2 et le AR colocalisaient durant le stade sacculaire, mais la 17β-HSD de type 2 était absente de l’épithélium des voies aériennes durant le stade alvéolaire. Deuxièmement, les niveaux des androgènes et des estrogènes furent mesurés dans le poumon murin du stade canaliculaire au stade alvéolaire. Les niveaux androgéniques présents dans le poumon étaient significativement différents par rapport à ceux présents dans un tissu de référence. Ces résultats sont compatibles avec la présence d’un métabolisme des androgènes régulé lors du développement pulmonaire. Troisièmement, l’expression de la 20α-HSD et des gènes associés à la voie de synthèse «surrénalienne» des glucocorticoïdes furent caractérisés du JG 15.5 au PN 15. Finalement des expériences de culture d’explants pulmonaires ont démontré qu’au JG 15.5, cette voie de synthèse était capable de produire de la corticostérone à partir d’un substrat de progestérone. L’accumulation de corticostérone n’était cependant observable que dans une sous-population des échantillons prélevés au JG 15.5 et était totalement absente après. Cette observation, la forte expression de la 21-hydroxylase, la présence de fortes activités 20α-HSD et 5α-réductase suggèrent toutes la présence d’une régulation locale de l’action du récepteur des glucocorticoïdes (GR) dans le poumon en développement s’ajoutant à celle détectée pour le AR. / Steroid hormones such as progestogens, estrogens, androgens and glucocorticoids are known modulators of lung development. Several elements concerning the role and regulation of steroid action in the developing lung, especially for the saccular and alveolar stages, remain to be investigated. First, a qPCR analysis of 17β-hydroxysteroid dehydrogenases (17β-HSD) type 1, 2 and 5, of 5α-réductase type 1, of m3α-HSD and of androgen receptor (AR) was performed during the saccular and alveolar stages of mouse lung development. AR expression showed a statistically significant increase during the alveolar stage while levels of 17β-HSD 2 expression decreased at the end of the saccular stage and remained low throughout the alveolar period. The androgen receptor (AR) protein was primarily detected in the nucleus of airway epithelial cells and of a subset of respiratory epithelial cells. 17β-HSD 2 mRNA was co-localized with AR protein during the saccular stage, but was absent from airway epithelium during the alveolar stage. Second, androgen and estrogen levels were measured in the murine developing lung from the canalicular to the alveolar stage. Significant difference of androgen levels between lung and control tissue. This fact added to the nuclear localization of AR is compatible with the presence of a regulated androgen metabolism during lung development. Third, expression of 20α-HSD and of the genes associated with the adrenal glucocorticoid synthesis pathway was characterized in the developing lung, from GD 15.5 to PN 15. Finally, corticosterone synthesis was only observed in a fraction of lung explants from gestation day (GD) 15.5. This observation and strong expression of 21-hydroxylase, of 20α-HSD and of 5α-reductase activities suggests local regulation of GC action. It thus appears that the actions of androgens and of glucocorticoids are both regulated at a pre-receptor level in the developing lung from the canalicular stage until the end of the alveolar stage.

À l'origine, la grande majorité des cancers du sein sont stimulés par les hormones estrogéniques, comme l'estradiol (E2) qui joue un rôle capital dans le développement de cette maladie. Pour bloquer l'action de cette hormone, l'utilisation des anti-estrogènes est bien connue, mais une autre alternative est de bloquer la formation de l'hormone en inhibant l'une des enzymes impliquées dans sa formation. Parmi les enzymes nécessaires à la biosynthèse de l'E2, l'isoforme 1 de la 17β-hydroxystéroïde déshydrogénase (17β-HSD1) catalyse la transformation de l'estrone (El) en E2. Il n'existe cependant pas d'inhibiteurs de la 17β-HSD1 disponibles pour une utilisation en clinique. Les travaux de notre groupe de recherche ont permis d'identifier des inhibiteurs de cette enzyme. Malheureusement ces dérivés d'E2 montraient une activité estrogénique. Pour améliorer leur potentiel inhibiteur et éliminer leur activité agoniste sur le récepteur des estrogènes (RE), différentes stratégies ont été employées. Dans le cadre de mon projet de recherche, les molécules synthétisées à cette fin ont été évaluées pour leur activité inhibitrice et leur estrogénicité résiduelle. Ces travaux ont abouti à la sélection du dérivé PBRM comme un puissant inhibiteur de la 17β-HSD1 qui, de plus, est non-estrogénique in vitro et in vivo. Pour la toute première fois, nous avons pu démontrer qu'un inhibiteur de la 17β-HSD1 est en mesure d'inhiber in vivo 100% de la croissance d'une tumeur (xénogreffes de cellules de cancer du sein) stimulées avec E1. D'autre part, il est bien connu que les médicaments utilisés en chimiothérapie ne possèdent pas toujours les qualités idéales requises : entre autres, une faible toxicité, un large indice thérapeutique et une faible capacité à induire de la chimiorésistance. Une partie des efforts de notre équipe de recherche a été consacrée au développement d'une nouvelle famille d'agents anticancéreux, les aminostéroïdes. Mon projet de recherche a porté sur l'évaluation biologique de nouvelles molécules, principalement celle nommée RM-133 qui a démontré un potentiel cytotoxique sur plusieurs lignées cellulaires de cancer (HL-60, MCF-7, T-47D, LNCaP), qui produit une concentration plasmatique acceptable chez le rat (AUC0-12 h= 752 ng*h/ml) et qui possède un indice de sélectivité (HL-60 vs lymphocytes normaux) accru par rapport aux aminostéroides de première génération.

À ce jour, les études épidémiologiques ont démontré que seulement 25% des agrégations familiales de cancer du sein observées ont lieu dans des familles ayant une mutation dans l'un des gènes de prédisposition comprenant BRCA 1, BRCA2, TP53, PTEN, ATM, STK11, CHEK2, BR/P1 et PALB2. Le nombre et les propriétés des facteurs génétiques composant le 75% restant de l'excès du risque génétique sont encore inconnus, quoique selon le modèle polygénique ce risque génétique serait causé par plusieurs allèles de susceptibilité pouvant, par exemple, influencer le métabolisme des hormones sexuelles. En effet, il est maintenant bien établi que les estrogènes jouent un rôle prédominant dans la régulation de la croissance cellulaire, ainsi que la différentiation de la glande mammaire normale et des carcinomes mammaires hormono-sensibles. Parmi les enzymes responsables de la formation et l'inactivation des stéroïdes sexuels actifs, les membres de la famille des 17~-hydroxystéroïde déshydrogénases (17~-HSDs) sont d'excellents candidats. Afin d'évaluer le rôle potentiel de ces gènes candidats, nous avons donc procédé au re-séquençage des régions promotrices, des jonctions intron-exon et des exons des gènes HSD17B1, HSD17B2, HSD17B7 et HSD17B12 chez une cohorte de 50 Canadiennes Françaises atteintes d'un cancer du sein, nonporteuses d'une mutation BRCA 1/2 et provenant de familles ayant une forte histoire de cancer du sein et/ou de l'ovaire. Pour ces gènes, nos analyses ne démontrent pas l'existence de mutations germinales qui auraient permis d'expliquer le regroupement de cas de cancer du sein chez ces familles. Toutefois, nous avons identifié 88 variants de séquence dont environ la moitié n'avaient jamais été répertoriés. De plus, nous avons aussi procédé à l'étude de l'impact fonctionnel des cinq variants résultant en un changement d'acide aminé chez les enzymes 17~-HSD de types 1 et 2 et nous avons démontré par expression in vitro que ces variations faux-sens ne modifient pas les propriétés catalytiques de ces enzymes. Finalement, des marqueurs ont été sélectionnés pour mener de futures études d'association à l'aide de larges cohortes, a'fin de mieux définir la possible association entre le risque génétique de cancer du sein et les variants de séquence des gènes HSD1781, HSD1782, HSD1787 et HSD17812.

Cette thèse de doctorat comporte 2 sections principales, reflétant les travaux réalisés dans 2 laboratoires différents, sous la direction du Dr. Yves Tremblay et la co-direction du Dr. André Tchemof. La première partie porte sur l'expression et l'activité de l'enzyme 17 beta-hydroxystéroïde déshydogénase dans l'unité foeto-placentaire. Durant la grossesse, F estradiol est nécessaire pour la maturation des poumons, de la peau et l'activation de l'axe HPA. Par contre, des quantités excessives ou incontrôlées peuvent avoir des effets délétères pour le développement foetal. De plus, la sécrétion asymétrique de l'estradiol et de l'estrone entre la circulation foetale et maternelle suggère fortement la présence d'un mécanisme de contrôle des quantités d'estradiol entrant en circulation foetale. L'enzyme 17βHSD2 a été détectée dans les vaisseaux sanguins foetaux à l'intérieur des villosités. Cette enzyme catalyse la dernière étape et la seule étape réversible de la cascade de réactions menant à la synthèse de l'estradiol. Il a été proposé que les niveaux d'estradiol entrant en circulation pourraient être régulés par la 17βHSD2. Nous avons caractérisé précisément l'expression de cette enzyme dans le villi placentaire à mi-gestation et à terme. L'expression spatiotemporelle de la 17βHSD2 et la comparaison des niveaux de stéroïdes entre le placenta et l'endomètre montrent que la 17βHSD2 pourrait agir comme barrière protégeant le foetus contre de trop grandes concentrations d'estradiol. Nous avons également démontré que la 17βHSD2 est exprimée différemment selon le type de vaisseaux sanguins dans le cordon ombilical et dans les gros vaisseaux sanguins placentaires. La deuxième partie de la thèse porte sur la caractérisation et le métabolisme du tissu adipeux chez la femme. L'accumulation de graisse viscérale ou intra-abdominale est associée à plusieurs altérations métaboliques comme la résistance à l'insuline, l'hyperinsulinémie ou des dyslipidémies. Ces altérations métaboliques augmentent significativement le risque de développer un diabète de type 2 et des maladies cardiovasculaires. Les mécanismes responsables du patron de distribution des graisses ainsi que les mécanismes selon lesquels l'accumulation de graisse viscérale serait associée à une augmentation significative des risques de maladies cardiovasculaire et un diabète ne sont pas encore bien élucidés. La morphologie et la physiologie du tissu adipeux sous-cutané et omental (viscéral) diffèrent à plusieurs niveaux. Des caractéristiques spécifiques du tissu adipeux viscéral comme le diamètre adipocytaire, la sécrétion d'adipokines ou la lipolyse peuvent en partie expliquer l'association entre l'accumulation de graisse viscérale et les altérations métaboliques. Cette section de thèse porte donc sur l'hypertrophie et l'hyperplasie du tissu adipeux omental et sous-cutané, sur la sécrétion d'adiponectine par les adipocytes des 2 dépôts adipeux en relation avec l'obésité abdominale ainsi que sur les caractéristiques des adipocytes omentaux et viscéraux en relation avec une accumulation excessive de graisse viscérale et des niveaux élevés de triglycérides chez la femme. Ces travaux ont pennis de démontrer que les femmes accumulent préférentiellement de la graisse au niveau sous-cutané via l'hyperplasie adipocytaire, que la sécrétion d'adiponectine est diminuée dans le tissu adipeux omental chez les femmes avec de l'obésité viscérale et que les caractéristiques des adipocytes, en particulier la lipolyse sont plus altérées dans le tissu adipeux omental chez les femmes avec un tour de taille et des niveaux de triglycérides élevés.

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Le Dimethyl Ampal Thiolester (DIMATE) est un inhibiteur des aldéhydes déshydrogénases (ALDHs) de type 1 et 3. L’intérêt croissant au cours de ces dernières années pour ces enzymes intra cytoplasmiques que sont les ALDHs, s’explique par leurs utilisations comme marqueurs pour distinguer les cellules souches, saines ou cancéreuses, au sein de différents tissus, comme le tissu hématopoïétique. Le traitement des Leucémies Aiguës Myéloïdes demeure une problématique clinique majeure. En effet, malgré un taux de rémission complète moyen d’environ 70% avec les traitements conventionnels, la survie moyenne des patients porteurs d’une LAM n’excède pas les 50% à 5 ans. A ce titre, le DIMATE, semble être un médicament d’avenir. Le DIMATE présente une toxicité majeure sur plusieurs lignées leucémiques humaines et sur des cellules souches leucémiques issues de patients. De manière remarquable, le DIMATE à ces doses anti-leucémiques présente une innocuité quasi-totale sur les cellules souches hématopoïétiques saines. In vivo, chez la souris, le DIMATE permet d’éradiquer spécifiquement les cellules leucémiques humaines xénogreffées et présente en monothérapie une efficacité similaire à l’association Cytarabine + Daunorubicine qui constitue le standard thérapeutique actuel. Ces résultats encourageants vont servir de support conceptuel à la mise en place prochaine d’essais cliniques. / The Dimethyl Ampal Thiolester (DIMATE) is a type 1 and 3 Aldehydes Dehydrogenases (ALDHs) inhibitor as an innovating treatment for AML. Interest in ALDH is due to its activity as a marker for identification of stem cell in different tissues. The different species of ALDHs control the levels of the endogenous apoptogenic aldehydes. Cancer cells protect themselves from the apoptogenic effect of these aldehydes by the ALDHs that oxidize them to their non-apoptogenic carboxylic acids. The vast majority of patients with AML achieve complete remission (CR) after standard induction chemotherapy. However, the majority subsequently relapses and dies of the disease. Therefore, AML remains a clinical challenge and new therapies are urgently needed. For this, DIMATE appears as a promising drug. In vitro, DIMATE is a powerful ALDH inhibitor and has a major cytotoxic activity on human AML cell lines. Moreover, DIMATE is highly active against leukemic population enriched in LSCs, but, unlike conventional chemotherapy, DIMATE is not toxic for healthy hematopoietic stem cells which retained after treatment their self-renewing and multi-lineage differentiation capacity. In immunodeficient mice, xenografted with human leukemic cells, DIMATE eradicates specifically human AML cells and spares healthy mouse hematologic cells. Moreover, DIMATE showed the same efficiency than the association Daunorubicin + Cyrabine, which is considered as the gold standard for AML induction. Results from our work open new therapeutic perspectives in AML and provide a conceptual support for initiation of a phase I-II clinical trials, but also innovating cellular therapy.

La thérapie cellulaire est une envisagée pour traiter des pathologies cardiaques ou squelettiques basée sur la médecine régénérative. Les progéniteurs cellulaires classiquement utilisés (myoblastes ou cellules mésenchymateuses) n'ont démontré qu'une efficacité limitée. Dans ce contexte, notre laboratoire a identifié une nouvelle catégorie de progéniteurs, sur la base de leur activité enzymatique aldéhyde déshydrogénase (ALDH) mise en évidence par un substrat fluorescent, l'Aldéfluor, et en association avec le marqueur CD34. Les ALDH sont impliquées dans le métabolisme et la détoxification des aldéhydes, et constituent un nouveau marqueur des cellules souches. Ce travail de thèse a permis de mieux caractériser les progéniteurs myogéniques (ALDH+/CD34-) et non myogéniques (ALDH+/CD34+), dans différents contextes physiopathologiques. Leur présence dans différents muscles de primates humains ou non humains, leur persistance au cours du vieillissement naturel ou lors d'atteinte par la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) chez l'Homme et dans des modèles animaux, suggèrent une utilisation possible des cellules ALDH+/CD34- pour des développements thérapeutiques ultérieurs. L'étude phénotypique révèle que des marqueurs transmembranaires sont associés à des sous-populations de cellules ALDH myogéniques ou non myogéniques dont la comparaison permettra de proposer de meilleurs candidats de thérapie cellulaire. En parallèle, les caractérisations histologiques et cytologiques ont identifié des sous-populations exprimant des isoenzymes et les analyses d'expressiongénique réalisées ex vivo et en culture suggèrent que certaines sont impliquées dans l'homéostasie musculaires. / Cell therapy is a regenerative medicine strategy considered for the treatment of cardiac or skeletal muscle diseases. The cellular progenitors used to date (myoblasts or mesenchymal stem cells) provided mitigated success, thus mandating the identification and characterization of new categories of progenitors. Our laboratory has identified new populations of progenitors, based on their Aldehyde Deshydrogenase activity (ALDH) detectable using the fluorescent substrate Aldefluor, associated with the expression of the CD34 marker. ALDH are involved in metabolism and detoxification of aldehydes, they play important roles in cell survival and differentiation and are considered a new marker of stem cells. The present project allowed characterizing extensively the myogenic (ALDH+/CD34-) and non myogenic (ALDH+/CD34+) progenitors, in several physiopathological contexts and animal models. The presence of ALDH+/CD34- cells in distinct muscle groups in Human and non-human Primates, their persistence through natural ageing and despite the ongoing degenerative process observed in Duchenne muscular dystrophy in Human patients and animal models suggest their future use for therapeutic applications. The phenotypic characterization indicated that membrane markers are associated to myogenic or non myogenic sub-populations of ALDH cells. The comparison on their efficacies in vito and in vivo will allow proposing new candidates for cell therapy. In parallele, histological and cytological analysis identified cell populations expressing isoenzymes The analysis of gene expressions suggested that, at least, some of them are involved in muscle homeostasis in situ or in vitro.

L'enzynle HSD3B2 humaine et la protéine STAR de souris encodées par les gènes HSD3B2 et Star, respectivement, sont retrouvées principalement au niveau des gonades et surrénales. L'importance de STAR comme transporteur du cholestérol et de HSD3B2 comme enzyme de la stéroïdogenèse est lnise en évidence par des mutations de ces gènes causant une hyperplasie congénitale des surrénales, un pseudohermaphrodisme mâle et une insuffisance des surrénales. Un rôle pour la famille de récepteurs nucléaires orphelins NUR 77 dans la stéroïdogenèse a été considéré. En effet, NUR77 est présent dans les gonades et surrénales où son expression est fortement et rapidement induite par des horlnones qui activent certains gènes impliqués dans la stéroïdogenèse. De plus, les profils d'expression de Nur77 et des gènes RSD3B2 et Star sont corrélés. Lors de cette thèse, j'ai démontré que les promoteurs HSD3B2 et Star constituent des nouvelles cibles de NUR77. Des éléments de réponse localisés à -130 pb et -95 pb des promoteurs HSD3B2 et Star respectivement, sont essentiels et suffisants pour conférer une réponse dépendante de NUR77, et la mutation de ces élélnents . diminue leurs activités basale et homlono-dépendante dans les cellules stéroïdogéniques. Dans les cellules de Leydig, un réduction de l'expression de Nur77 par siARN réduit l'induction de l'expression de Star par l'AMPc. Également, NUR77 coopère avec des co activateurs de la famille SRC et avec des membres de la famille AP-1 dans la régulation des promoteurs RSD3B2 et Star, respectivement. De plus, le dexaméthasone, un glucocorticoïde synthétique, inhibe l'activation de Star en diminuant le recrutement de NUR77, et non SF-I, à la région proximale du promoteur Star, donnant un argument moléculaire à la suppression causée par le stress de la production de testostérone dans le testicule. J'ai démontré que la voie de signalisation des CaMK est requise pour l'expression de STAR et NUR77 en réponse à l'AMPc dans les cellules de Leydig. Ainsi, CaMKI est spécifiquement exprimé dans les cellules de Leydig. Enfin, je démontre que CaMKI coopère avec NUR 77 et MEF2 pour activer les promoteurs Star et Nur77, respectivement, dans ces cellules. Ainsi, l'identification de NUR 77 comme régulateur important des promoteurs HS1J3B2 et Star et de son mécanisme d'action aident à mieux défénir la spécificité tissulaire et la régulation hormonale de ces gènes dans les cellules de Leydig en plus de soulever un rôle pour CaMKI dans ce processus.