Die chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen Morbus Crohn und Colitis ulzerosa sind wiederkehrende, nicht heilbare, immunvermittelte Krankheiten unklarer Ursache. Genetische Prädisposition und Umweltfaktoren können die Barrierefunktion der Darmmukosa stören, so dass eine überschiessende Entzündungsreaktion folgt, die durch kommensale Bakterien der normalen Darmflora verstärkt wird. Die Infektion mit H. pylori im Magen kann zu Gastritis, Ulkuskrankheit und der Entstehung von MALT-Lymphomen und Magenkarzinomen führen. An der Erkennung von bakteriellen Bestandteilen im Gastrointestinaltrakt sind Toll-like-Rezeptoren (TLR), als Komponenten des angeborenen Immunsystems maßgeblich beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen der Bakterienflora bei Ileitis, Colitis und bei Vorliegen einer H. pylori-Infektion im Mausmodell untersucht. Durch eine globale Florenanalyse mit klassischen mikrobiologischen und molekularbiologischen Techniken konnte gezeigt werden, dass die Konzentrationen an Gram-negativen Stäbchenbakterien während der Entzündung in Ileum und Colon anstiegen. Die bakteriellen Faktoren, die eine Ileitis induzierten, wurden durch den Einsatz von gnotobiotischen TLR-defizienten Mäusen mit definierter bakterieller Rekolonisierung ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass eine Ileitis durch das LPS von akkumulierenden E. coli über die TLR4-vermittelte Signaltransduktion verstärkt wurde. Die Entzündungsreaktionen konnten durch Behandlung mit Antibiotika oder dem LPS-Antagonisten Polymyxin B gebessert werden. In Folge einer H. pylori-Infektion kam es im Mausmagen zu einer erhöhten Diversität der Bakterienflora durch die Besiedelung mit Bakterienarten, die normalerweise das Colon kolonisieren. Eine derartige Florenverschiebung konnte durch eine Vakzinierung gegen H. pylori verhindert werden. Die Tiermodelle zur T. gondii-induzierten Ileitis und DSS-Colitis erlauben eine reproduzierbare Analyse entzündungsrelevanter Komponenten und damit die Möglichkeit, therapeutische Ansatzpunkte, wie z.B. den Einsatz von Lipopolysaccharid-Inhibitoren, die Blockade von TLR4 oder dem LPS-Bindeprotein oder den Einsatz von Probiotika, unter definierten Bedingungen zu analysieren. / Inflammatory bowel diseases like Crohn´s disease and ulcerative colitis are chronic, relapsing, immunologically mediated disorders with uncertain etiology. Genetic abnormalities and environmental factors may have negative influences on the physiologic barrier function of the intestinal mucosa with inflamamtion coming up after immune response which is aggravated by commensal intestinal bacteria. The infection of H. pylori can cause gastritis and ulcus disease and contribute to the occurence of MALT lymphoma and gastric cancer. Bacterial ligands in the intestine are recognized by toll-like receptors (TLR) which are one component of the innate immune system. This study observed variations of the bacterial flora in mice with ileitis, colitis or H. pylori-infection. Performing a global survey of the intestinal flora combining culture based techniques with molecular methods, it was observed, that the concentration of gram-negative rods is elevated during ileitis or colitis. The bacterial factors, which are capable of inducing ileitis, could be confirmed using gnotobiotic TLR-deficient mice with a defined bacterial recolonization. It was clearly shown that ileitis was aggravated by LPS of accumulating E. coli through a TLR4-mediated signal transduction. The inflammation was ameliorated through antibiotic treatment or after application of the LPS-scavenger polymyxin B. H. pylori infection of mice leads to an increase of bacterial diversity in the stomach and bacterial species which are normally colonize the colon were detected after infection. Vaccination against H. pylori could prevent this diversity shift. The animal models for the T. gondii-induced ileitis and DSS-colitis used in this study offering the reproducible analysis of inflammation relevant components so that new approaches of treatment like inhibition of lipopolysaccharide, blockage of TLR4 or LPS binding protein or application of probiotics could be studied under well defined conditions.

Einleitung: Das Probiotikum E. coli Nissle 1917 (EcN) wird seit einigen Jahren erfolgreich in der Behandlung chronisch entzündlicher Darmerkrankungen angewendet, der zugrunde liegende Wirkmechanismus ist jedoch nur unzureichend geklärt. T-Zellen spielen in der intestinalen Immunhomöostase und der Pathogenese von CED eine zentrale Rolle. Ziel: Den Einfluss von EcN auf humane T-Zellen weitergehend zu charakterisieren. Methoden: CD3-stimulierte periphere und Lamina propria T-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen eines E. coli Nissle 1917 konditionierten Mediums (EcN-CM) oder aber hitzeinaktivierten E. coli Nissle 1917 (hi-EcN) kultiviert. Die Expression von zellzyklus- und apoptoseassoziierten Regulationsproteinen sowie DNA-Gehalt, Zellzykluskinetik, Apoptoserate und Zellexpansion wurden durchflusszytometrisch und im Western Blot bestimmt. Die Sekretion von Cytokinen wurde mit dem Cytometric Bead Assay bestimmt. Ergebnisse: EcN-CM, nicht aber hitzeinaktivierte E. coli Nissle 1917 hemmt die Zellzyklusprogression und die Expansion von stimulierten, humanen peripheren T-Zellen. Ursächlich hierfür ist eine verminderte Expression der Cykline A, B1, D2 und E mit einer konsekutiv verminderten Phosphorylierung des Retinoblastomaproteins. Periphere T-Zellen sezernieren unter EcN-CM vermindert IL-2, IFN-gamma und TNF-alpha, während die Sekretion des antiinflammatorischen IL-10 durch EcN-CM heraufreguliert wird. Im Gegensatz zur potenten Beeinflussung des Zellzyklus, wurde die Apoptose von PBT durch E. coli Nissle 1917 nicht moduliert. Während periphere T-Zellen durch EcN-CM in ihrer Zellzyklusprogression und Expansion gehemmt wurden, zeigte sich kein derartiger Effekt auf ortständige Lamina propria T-Lymphozyten. Diskussion: Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen kommt es zu einer Rekrutierung und Aktivierung von peripheren T-Zellen in die intestinale Mukosa. Durch die differenzielle Beeinflussung des Immunsystems, bei der aktivierte periphere T-Zellen inhibiert, die ortsständigen T-Zellen jedoch in ihrer Funktion nicht gestört werden, könnte E. coli Nissle 1917 dazu beitragen, die mukosale Entzündungsreaktion zu limitieren, während die intestinale Immunhomöostase gewahrt bleibt. Als wirksames Agens kommen kleine, hitzestabile bakterielle Produkte wie Lipopolysaccharide, bakterielle Lipoproteine, CPG-DNA, Lipoteichonsäuren und Peptidoglykane in Frage. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern weitere Hinweise, dass Probiotika einen breiten Einfluss auf das humane Immunsystem haben und decken zugrundeliegende Mechanismen auf. / Introduction: Although probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) has been proven to be efficacious for the treatment of inflammatory bowel diseases, the underlying mechanisms of action still remain elusive. T cells play a major role in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Aims: To analyze the effects of E. coli Nissle 1917 on cell cycling and apoptosis of peripheral blood and lamina propria T cells. Methods: Anti-CD3-stimulated peripheral or lamina propria T cells were treated with E. coli Nissle 1917-conditioned medium (EcN-CM) or heat-inactivated E. coli Nissle 1917. Expression of cell cycle or apoptosis related proteins was determined by immunoblotting, DNA content, cell cycle kinetics, cell expansion and apoptosis were measured by flow cytometry. Cytokine levels in culture supernatants were assessed by cytometrc bead array. Results: EcN-CM but not heat-inactivated EcN inhibits cell cycling and expansion of peripheral T cells. EcN-CM decreases expression of Cyclin A, B1, D2 and E and thus reduces phosphorylation of retinoblastomaprotein in CD3-stimulated peripheral T cells. Further, secretion of proinflammatory cytokines IL-2, IFN-gamma and TNF-alpha is reduced while antiinflammatory IL-10 is increased under treatment with EcN-CM. In contrast to peripheral T cells, expansion and cell cycle progression of lamina propria T cells was not affected by EcN-CM. Apoptosis of was not modulated by EcN-CM. Discussion: The differential reaction of circulating and tissue-bound T cells towards E. coli Nissle 1917 may explain the beneficial effect of EcN in intestinal inflammation. EcN may downregulate the expansion of newly recruited T cells into the mucosa and thus limit intestinal inflammation, while already activated tissue-bound T cells may eliminate deleterious antigens in order to maintain immunological homeostasis. Possible agents, for which immunomodulatory effects are known, include heat-stable bacterial products like lipopolysaccharids, bacterial lipoproteins or bacterial DNA-motifs.

Die intestinale Mukosa bildet eine biologisch wichtige Barriere zwischen dem Organismus und den schädigenden Faktoren im intestinalen Lumen. Diese komplexe Aufgabe wird durch eine hochdifferenzierte intestinale Mukosa bewältigt, die eine strukturelle sowie funktionelle intestinale Barriere bildet. Das Ziel der vorliegenden Arbeiten war, ausgewählte Aspekte der Regulations- und Reparaturmechanismen der intestinalen mukosalen Barriere weitergehend zu charakterisieren. Unsere Untersuchungen zeigen, dass das Phospholipid Lysophosphatidsäure (LPA) die intestinale epitheliale Zellmigration stimuliert, die dieser Zellen jedoch inhibiert. Die Modulation der intestinalen Wundheilung durch LPA erfolgt durch einen TGF-b-unabhängigen Mechanismus und wird über einen G-Protein-abhängigen Rezeptor vermittelt, wie wir im Rahmen umfangreicher Untersuchungen zur Signaltransduktion unter Verwendung spezifischer Modulatoren der Signaltransduktion wie Bradykinin, Phorbolester, Pertussistoxin, Suramin und neutralisierender TGF-b-Antikörper belegen konnten. In weiteren Experimenten konnten wir zeigen, dass LPA auch in-vivo einen wundheilungsfördernden Effekt besitzt. Die topische Applikation von LPA in diesem experimentellen Kolitismodell bewirkte einen geringeren Gewichtsverlust sowie ein geringeres Ausmaß an intestinaler Entzündung und Nekrose in-vivo. Diese Untersuchungen legen somit nahe, dass LPA die intestinale epitheliale Wundheilung durch eine Modulation der intestinalen epithelialen Migration und Proliferation durch TGF-b-unabhängige Mechanismen stimuliert. Weitere Untersuchungen beschäftigten sich mit der funktionellen Charakterisierung von Lamina propria T-Zellen (LPT) und peripheren Blut T-Zellen (PBT). Wir konnten zeigen, dass der Zellzyklus von LPT distinkt von PBT reguliert wird. Hierbei spielt der Zellzyklusinhibitor p53 eine zentrale Rolle in der Zellzyklusregulation von LPT. Um Autoimmunität zu verhindern, muss es nach einer Eliminierung des Antigens wieder zu einer Depletion des Pools an Effektor-T-Zellen durch die Aktivierung der Apoptose kommen. Wir konnten zeigen, dass beim Antigen-induzierten Zelltod von LPT der intrinsische Apoptoseweg aktiviert wird und Caspase-8 hierbei eine zentrale Rolle spielt. Physiologischerweise sind Zellzyklus und Apoptose eng miteinander verbunden. In weiteren Versuchen konnten wir jedoch zeigen, dass dies nicht bei LPT der Fall ist und somit die von PBT distinkte Regulation von Zellzyklus und Apoptose mukosaler T-Zellen weiter unterstreichen. Zusammengefasst konnten wir durch ausgewählte Untersuchungen zeigen, dass die intestinale Barriere und ihre funktionelle Beeinflussung eine wesentliche Rolle in der Pathogenese und Therapie intestinaler Entzündungen besitzt. Eine Beeinflussung intestinaler Reparaturprozesse und Modulation abnormer T-Zellen könnte neue Möglichkeiten in der Therapie intestinaler Entzündungen, wie z.B. chronisch entzündlichen Darmerkrankungen bewirken. / The intestinal mucosa protect the host from the potential harmful content of the intestinal lumen. To accomplish this difficult goal, the highly complex mucosa forms an anatomical as well as functional barrier to protect the organism.In this work, we aimed to characterize distinct aspect of the intestinal barrier, focussing on distinct regulation and repair mechanism of the intestinal mucosa. First, we demonstrate, that the phospholipid lysophosphatidic acid (LPA) stimulate the migration of intestinal epithelial cells, but, in contrast, inhibit their proliferation. This effect is mediated by G-protein receptors and is TGF-b-independent, as we could demonstrate in further experiments using bradykinine, phorbole ester, pertussis toxin and suramine to modulate distinct signalling pathways.We then demonstrated, using a well-established animal model of colitis, that LPA enhances intestinal wound healing in-vivo. In detail, the topical application of LPA in TNBS-treated rats reduced weight loss, ameliorate intestinal inflammation and prevented necrosis in the animals. This experiments demonstrate for the first time, that LPA modulates migration and proliferation of intestinal epithelial cells by distinct TGF-b independent pathways. Further experiments aimed to explore functional differences between peripheral blood (PBT) and mucosal T-cells (LPT). We demonstrated, that the cell cycle is distinctively regulated in PBT and LPT, identifying p53 as key regulator of LPT cell cycling. To avoid auto-immunity, the pool of effector T-cells must be depleted by apoptosis, once the antigen has been cleared. We demonstrate, that intrinsic pathway of apoptosis is activated during the antigen-induced cell death in LPT and that caspase-8 activity is required to execute LPT apoptosis. Cell cycle and apoptosis are ultimately linked. However, as we show in further experiments, this is not the case in LPT, underlining the distinct regulation of LPT cell cycle and apoptosis.In conclusion, using various distinct experimental tools, we demonstrate that the intestinal barrier itself and the modulation its function plays a fundamental role in the pathogenesis mucosal inflammation. The data presented in this work may therefore open new therapeutic options in the therapy of intestinal inflammatory disorders, such as inflammatory bowel diseases.

Interleukin-10 (IL-10) is an important regulator of immune responses secreted by different cell types. Previous results from our group suggested that the biological effects of this cytokine critically depend on its cellular source. Recent studies reported IL-10 dependent immunosuppressive functions of a specialized subset of regulatory B cells and mast cells. These results relied on adoptive cell transfers, a technique which can potentially introduce artifacts. Therefore, we aimed to readdress these questions in independent models using IL-10 transcriptional reporter mice and various conditional IL-10 mutant mice. Findings in IL-10 reporter system suggested prominent IL-10 transcription in regulatory B cells upon LPS administration. Exposure of mice to contact allergen revealed robust reporter expression in CD8 T cells, moderate to mild reporter expression in CD4 T cells and dendritic cells (DC) respectively, and lack of reporter expression in B cells, mast cells and NK cells in allergen challenged ears. We generated cell-type specific IL-10 mutants by Cre/LoxP-mediated conditional gene inactivation. Efficiency and specificity of Cre-mediated recombination was demonstrated by Southern blot and PCR methods. Various immunogenic challenges in conditional IL-10 mutants did not reveal a role for B cell-derived IL-10 in restraining innate TLR or T cell-dependent inflammatory responses. Likewise, mice with selective inactivation of the il10 gene in mast cells exhibited normal CHS responses and unaltered immune response to CpG oligodeoxynucleotides. On the other hand, DC-specific IL-10 mutants developed excessive inflammatory responses to contact allergens, while innate responses to TLR ligands were not altered. This indicates a non-redundant role for DC-derived IL-10 in contact allergy. Thus, the conditional IL-10 ‘‘knockout’’ mice combined with the novel transcriptional IL-10 reporter system can serve as ideal tools to understand the cell-type specific contributions to IL-10-mediated immune regulation.

Für die Therapie chronisch entzündlicher Darmerkrankungen (CED) ist die Diagnostik befallener Darmabschnitte und enteraler Komplikationen ebenso von Bedeutung, wie die Einschätzung der klinischen und endoskopischen Entzündungsaktivität. In einer Studie soll die Wertigkeit der Magnetresonanztomographie (MRT) untersucht werden, die Entzündungsaktivität CED anhand visueller Befunde und Komplikationen einzuschätzen. Außerdem soll überprüft werden, ob auf eine Kontrastierung des Darmes zugunsten eines höheren Patientenkomforts und einer schnelleren Untersuchung verzichtet werden kann. 64 Patienten mit bekannter oder vermuteter CED wurden vor und nach intravenöser Gd-DTPA-Injektion mit dem MR-Tomographen untersucht. Während 35 Patienten eine orale und rektale Kontrastierung mit Endoskopielösung erhielten, wurden 31 nicht enteral kontrastiert. 53 der untersuchten Patienten wurden zeitnah koloskopiert. Ein neu entwickelter MR-Aktivitätsindex (MRAI), die Kontrastmittelanreicherung in der Darmwand sowie die gemessenen Darmwanddicken wurden mit klinischen Indizes (CAI, CDAI) und dem Endoskopie-Aktivitätsindex (EAI) korreliert. Weiterhin wurden koronare Bilder aller Patienten bezüglich der Distension des Darmes und der Abgrenzbarkeit der Darmwand begutachtet. Im Vergleich mit dem EAI konnten signifikante Unterschiede für die Verteilung des Darmwand-Enhancements und der gemessenen Darmdicken nachgewiesen werden. Der MRAI zeigte eine Korrelation von Eta = 0,43 mit der klinischen Aktivität. Für Colitis ulcerosa-Patienten konnte ein Eta = 0,64 erstellt werden. Untersuchte, die eine Kontrastierung des Darmes erhielten, wiesen eine exzellente Korrelation (Eta = 0,76) zwischen MRAI und CAI / CDAI auf, während dieser Zusammenhang für Patienten ohne enterale Auffüllung fehlte. Weiterhin konnten signifikante Zusammenhänge zwischen enteraler Kontrastierung und der Distension des Darmes sowie der Abgrenzbarkeit der Darmwand gezeigt werden. Die Arbeit macht deutlich, daß es möglich ist, CED mittels MRT zuverlässig zu diagnostizieren und mit Hilfe des MRAI in ihrer klinischen und endoskopischen Entzündungsaktivität einzuschätzen. Dabei sollte auf die Anwendung eines enteralen Kontrastmittels nicht verzichtet werden. Ein Einsatz der MRT ist somit nicht nur bei der Diagnostik sondern auch zur Verlaufskontrolle der CED sinnvoll. / For the therapy of Inflammatory Bowel Diseases (IBD), not only the diagnosis of affected bowel segments and enteral complications but also the assessment of the clinical and endoscopic activity is important. The value of Magnetic Resonance Imaging (MRI) to asses the activity of IBD by visual findings and complications shall be determined by a clinical study. Furthermore shall be tested how the application of enteral contrast media affects patient comfort and examination time. 64 patients with known or supposed IBD were examined by MRI before and after intravenous injection of Gd-DTPA. 35 patients received oral and rectal contrast medium (2,5% mannitol solution) while 31 patients remaining without enteral replenishment. 53 patients underwent colonoscopy.A newly developed MR Activity Index (MRAI), based on visual findings, contrast-enhancement of the bowel wall and measured wall thickness were correlated with clinical (Crohn�s Disease Activity Index, CDAI; Colitis Activity Index, CAI) and endoscopic (Endoscopy Activity Index, EAI) activity. Coronal images of all patients were evaluated referring to bowel distension and demarcation of the bowel wall. The comparision with EAI shows significant differences in the distribution for wall contrast-enhancement and wall thickness. A good correlation is determined between the MRAI and the clinical activity (Eta = 0,43). Considering only patients with Ulcerative Colitis the correlation between MRAI and CAI shows Eta = 0,64. An excellent correlation of Eta = 0,76 between MRAI and CDAI / CAI for all patients with oral and enteral replenishment was found, while there was no correlation in the group, which did not receive mannitol solution. Significant correlations were also seen between the enteral mannitol solution replenishment and bowel distension and demarcation of the bowel wall. MRI shows good accuracy in detecting the changes the of IBD. The new developed MRAI allows an assessment of the activity of IBD. The results demonstrate that oral and enteral contrast media should be applied for MR examination of the abdomen. The utilization of MRI is furthermore useful in the follow up of IBD.