Background: Increased numbers of intestinal E. coli are observed in inflammatory bowel disease, but the reasons for this proliferation and it exact role in intestinal inflammation are unknown. Aim of this PhD-project was to identify E. coli proteins involved in E. coli’s adaptation to the inflammatory conditions in the gut and to investigate whether these factors affect the host. Furthermore, the molecular basis for strain-specific differences between probiotic and harmful E. coli in their response to intestinal inflammation was investigated. Methods: Using mice monoassociated either with the adherent-invasive E. coli (AIEC) strain UNC or the probiotic E. coli Nissle, two different mouse models of intestinal inflammation were analysed: On the one hand, severe inflammation was induced by treating mice with 3.5% dextran sodium sulphate (DSS). On the other hand, a very mild intestinal inflammation was generated by associating interleukin 10-deficient (IL-10-/-) mice with E. coli. Differentially expressed proteins in the E. coli strains collected from caecal contents of these mice were identified by two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis. Results DSS-experiment: All DSS-treated mice revealed signs of a moderate caecal and a severe colonic inflammation. However, mice monoassociated with E. coli Nissle were less affected. In both E. coli strains, acute inflammation led to a downregulation of pathways involved in carbohydrate breakdown and energy generation. Accordingly, DSS-treated mice had lower caecal concentrations of bacterial fermentation products than the control mice. Differentially expressed proteins also included the Fe-S cluster repair protein NfuA, the tryptophanase TnaA, and the uncharacterised protein YggE. NfuA was upregulated nearly 3-fold in both E. coli strains after DSS administration. Reactive oxygen species produced during intestinal inflammation damage Fe-S clusters and thereby lead to an inactivation of Fe-S proteins. In vitro data indicated that the repair of Fe-S proteins by NfuA is a central mechanism in E. coli to survive oxidative stress. Expression of YggE, which has been reported to reduce the intracellular level of reactive oxygen species, was 4- to 8-fold higher in E. coli Nissle than in E. coli UNC under control and inflammatory conditions. In vitro growth experiments confirmed these results, indicating that E. coli Nissle is better equipped to cope with oxidative stress than E. coli UNC. Additionally, E. coli Nissle isolated from DSS-treated and control mice had TnaA levels 4- to 7-fold higher than E. coli UNC. In turn, caecal indole concentrations resulting from cleavage of tryptophan by TnaA were higher in E. coli Nissle- associated control mice than in the respective mice associated with E. coli UNC. Because of its anti-inflammatory effect, indole is hypothesised to be involved in the extension of the remission phase in ulcerative colitis described for E. coli Nissle. Results IL-10-/--experiment: Only IL-10-/- mice monoassociated with E. coli UNC for 8 weeks exhibited signs of a very mild caecal inflammation. In agreement with this weak inflammation, the variations in the bacterial proteome were small. Similar to the DSS-experiment, proteins downregulated by inflammation belong mainly to the central energy metabolism. In contrast to the DSS-experiment, no upregulation of chaperone proteins and NfuA were observed, indicating that these are strategies to overcome adverse effects of strong intestinal inflammation. The inhibitor of vertebrate C-type lysozyme, Ivy, was 2- to 3-fold upregulated on mRNA and protein level in E. coli Nissle in comparison to E. coli UNC isolated from IL-10-/- mice. By overexpressing ivy, it was demonstrated in vitro that Ivy contributes to a higher lysozyme resistance observed for E. coli Nissle, supporting the role of Ivy as a potential fitness factor in this E. coli strain. Conclusions: The results of this PhD-study demonstrate that intestinal bacteria sense even minimal changes in the health status of the host. While some bacterial adaptations to the inflammatory conditions are equal in response to strong and mild intestinal inflammation, other reactions are unique to a specific disease state. In addition, probiotic and colitogenic E. coli differ in their response to the intestinal inflammation and thereby may influence the host in different ways. / Hintergrund: Chronisch entzündliche Darmerkrankungen zeichnen sich unter anderem durch eine starke Proliferation intestinaler E. coli aus. Unbekannt ist jedoch, ob diese Vermehrung eine Ursache oder eine Folge der Erkrankung darstellt. Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es daher, E. coli-Proteine zu identifizieren, welche der Anpassung an die entzündlichen Bedingungen im Darmtrakt dienen und unter Umständen einen Effekt auf den Gesundheitszustand des Wirtes haben. Weiterhin sollten die molekularen Ursachen für stammesspezifische Unterschiede zwischen probiotischen und gesundheitsschädlichen E. coli näher untersucht werden. Methoden: In den tierexperimentellen Analysen wurden keimfreie Mäuse entweder mit dem probiotischen E. coli Nissle oder dem adhärent-invasiven E. coli UNC monoassoziiert und in zwei verschiedenen Entzündungsmodellen näher untersucht. Einerseits wurde eine starke Darmentzündung durch die Gabe von 3,5% Natrium-Dextransulfat (DSS) ausgelöst. Andererseits wurde in Interleukin 10-defizienten (IL-10-/-) Mäusen eine sehr milde Form der Entzündung durch Besiedlung mit E. coli induziert. Die E. coli Bakterien wurden am Ende der Versuche aus den Caecuminhalten der Mäuse isoliert und die bakterielle Proteinexpression wurde mittels zwei-dimensionaler Gelelektrophorese analysiert. Ergebnisse des DSS-Versuchs: Alle Tiere des DSS-Versuchs entwickelten unabhängig vom E. coli Stamm, mit dem sie besiedelt waren, eine moderate Entzündung im Caecum und eine starke im Colon, wobei die Entzündungsreaktion durch die Monoassoziation mit E. coli Nissle leicht abgeschwächt wurde. In beiden E. coli Stämmen führte die Darmentzündung zu einer verringerten Expression von Enzymen des Kohlenhydratabbaus und der Energiegewinnung. In Folge dessen waren die intestinalen Konzentrationen bakterieller Fermentationsprodukte in den entzündeten Tieren geringer als in den gesunden Kontrolltieren. Weitere differentiell exprimierte Proteine umfassen das Fe-S- Cluster Reparaturprotein NfuA, die Tryptophanase TnaA und das uncharakterisierte Protein YggE. In beiden E. coli Stämmen, welche aus den DSS-Tieren isoliert wurden, war das NfuA Protein dreifach höher exprimiert. Eine Darmentzündung führt zu einer vermehrten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, welche die Fe-S-Cluster in Eisen-Schwefel-Proteinen zerstören und damit zu einer Inaktivierung dieser Proteine führen. In vitro Untersuchungen bestätigten, dass die Reparatur der Eisen-Schwefel-Proteine durch NfuA ein wichtiger Mechanismus ist um oxidativem Stress entgegenzuwirken. Das YggE Protein, welches laut Literaturangaben einen hemmenden Einfluss auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies hat, war in E. coli Nissle 4- bis 8-fach erhöht (verglichen mit E. coli UNC unter Kontroll- und Entzündungsbedingungen). In vitro Versuche bestätigten diese Daten und zeigten, dass E. coli Nissle im Vergleich zu E. coli UNC eine erhöhte Resistenz gegenüber oxidativem Stress aufweist. Außerdem wurde im Vergleich E. coli Nissle vs. E. coli UNC (unter Entzündungs- und Kontrollbedingungen) ein 4- bis 7-fach erhöhter TnaA-Gehalt nachgewiesen. Indol, das Produkt der TnaA-katalysierten Tryptophanspaltung wurde in erhöhten Mengen im Intestinaltrakt E. coli Nissle-assoziierter Kontrolltiere detektiert. Seit längerem werden entzündungshemmende Eigenschaften für Indol postuliert, die aufgrund der Ergebnisse dieser Doktorarbeit nun auch mit den gesundheitsfördenden Eigenschaften von E. coli Nissle in Zusammenhang gebracht werden können. Ergebnisse des IL-10-/-- Versuchs: Nach einer 8-wöchigen Assoziationsdauer wurde nur in den mit E. coli UNC besiedelten IL-10-/- Tieren eine schwache Entzündungsreaktion nachgewiesen. Bedingt durch diese sehr schwach ausgeprägte Entzündungsantwort waren auch die Veränderungen im bakteriellen Proteom von E. coli UNC nur gering. Wie im DSS-Versuch waren Proteine des bakteriellen Energiestoffwechsels reprimiert, allerdings wurde keine Induktion von NfuA beobachtet. Daher scheint die Induktion von NfuA nur der Anpassung an eine starke Entzündung zu dienen. Weiterhin wurde nachgewiesen, dass E. coli Nissle aus IL-10-/- Tieren den Hemmer für das vertebrate C-Typ Lysozym (Ivy) sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene stärker exprimiert als E. coli UNC. Überexpression von Ivy unter in vitro Bedingungen zeigte, dass es an der erhöhten Lysozymresistenz von E. coli Nissle beteiligt ist und somit eine Rolle als möglicher Fitnessfaktor von E. coli Nissle spielt. Schlussfolgerungen: In dieser Doktorarbeit wurde gezeigt, dass Darmentzündungen die Proteinexpression eines im Darm lebenden Bakteriums beeinflussen. Einige der aufgedeckten bakteriellen Anpassungsreaktionen werden sowohl bei einer starken als auch bei einer schwachen Entzündung ausgelöst; andere wiederum sind spezifisch für nur einen dieser Entzündungszustände. Weiterhin wurde deutlich, dass sich E. coli-Stämme hinsichtlich ihrer Reaktion auf eine Darmentzündung unterscheiden und damit möglicherweise den Wirt beeinflussen. 

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Die vorliegende wissenschaftliche Arbeit widmet sich epidemiologischen Frage-stellungen zu CED bei Kindern und Jugendlichen am Anfang des 21. Jahrhunderts in Deutschland. Konkrete Aufgabenstellungen bestanden in der Vervollständigung, Validierung, Aufbereitung, Auswertung und Publikation der über 15 Jahre (2000-2014) erhobenen Daten des Sächsischen Kinder-CED-Registers mit dem Ziel, die hypothetische Zunahme der CED in Sachsen zu untersuchen, zu dokumentieren und quantifizieren. Im Fokus der Auswertung stehen vor allem die Inzidenz, Prävalenz und die bisherigen und zukünftigen Trends von CED bei Kindern und Jugendlichen bis zum 15. Lebensjahr in einem der neuen Bundesländer Deutschlands.:Abkürzungsverzeichnis V Abbildungsverzeichnis VII Tabellenverzeichnis VIII Zusammenfassung 1 Abstract 4 1 Einführung in die Thematik 7 1.1 Wissenschaftliche Ausgangssituation 7 1.2 Hintergrund für die Registergründung in Sachsen 8 1.3 Aufgabenstellung 9 2 Theoretisch wissenschaftlicher Ansatz der eigenen Arbeiten 10 2.1 Material und Methoden 10 2.1.1 Sächsisches Kinder-CED-Register 10 2.1.2 Finanzielle Förderung 11 2.1.3 Zweite Datenquelle und Registervollständigkeit 12 2.1.4 Population unter Risiko 12 2.1.5 Merkmale der Patientenkohorte 13 2.2 Statistische Auswertungen 13 3 Wesentliche wissenschaftliche Ergebnisse 15 3.1 Inzidenzraten und Prävalenz 15 3.2 Analyse von Inzidenztrends 18 3.3 Analyse des Alterstrends bei Manifestation 20 3.4 Diagnostische Latenz 21 3.5 Prognostizierte Inzidenztrends 23 4 Diskussion 26 4.1 Langzeitentwicklung der Anzahl von CED-Patienten 26 4.2 Internationale und nationale Einordnung der Ergebnisse 27 4.3 Stärken und Limitationen 32 4.3.1 Stärken der Arbeit 32 4.3.2 Limitationen der Arbeit 32 5 Schlussfolgerungen und Ausblick 33 Literatur IX Danksagung XVIII Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens XIX Anlage 2: Erklärung über die Einhaltung gesetzlicher Bestimmungen XXI Anlage 3: Kern et al. (2021) XXII Anlage 4: Kern et al. (2022) XLI Anlage 5: Einwilligungserklärung der Eltern LXI Anlage 6: Erstmeldebogen LXII Anlage 7: Dokumentationsbogen LXIII Anlage 8: Eigenanteil LXIV

Chronisch entzündliche Darmerkrankung (CED) bereiten in der Diagnostik durch das meist jüngere Patientenalter, die Tendenz zu Rezidiven im Erkrankungsverlauf, welche häufig den Einsatz diagnostischer Mittel erfordert, und die extraintestinalen Pathologien, die endoskopisch nicht zugänglich sind, Probleme. Durch die bisherigen etablierten Untersuchungsmethoden sind in diesen speziellen Fragestellungen CED nicht immer befriedigend darstellbar. Daher wäre die Einführung der Magnetresonanztomographie (MRT) als Diagnostikalternative von Vorteil. Experimentell soll überprüft werden, wie valide die MRT den pathologischen Befund abbilden kann, ferner die Möglichkeiten einer rechnergestützten, nach festgelegten Algorithmen durchgeführten Auswertung. An einem Kaninchenmodell werden durch Irritantienapplikation chronisch entzündliche Darmerkrankungen simuliert, die resezierten Darmabschnitte mit Wandpathologien im MRT durch eine Mikrospule vermessen und in der Pathologie mikroskopisch untersucht. Am MRT werden die Darmschnitte durch einen konventionellen Editor und einen DICOM-Editor rechnergestützt semiautomatisch ausgewertet. Die transmurale Darmwanddickenmessung zeigt eine gute Korrelation zwischen den maximalen Dickenmessungen der Pathologie und dem konventionellen Editor (rho = 0,850) bzw. der Pathologie und dem DICOM-Editor (r = 0,843). In der Varianzanalyse der nach den Befunden "Normalbefund", "akute Entzündung" und "chronische Entzündung" aufgeschlüsselten maximalen Darmwanddickenbefunde können signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen "Normalbefund" und "chronische Entzündung" sowie "akute Entzündung" und "chronische Entzündung" festgestellt werden (jeweils p < 0,01). Dabei enthält die Gruppe der chronischen Entzündungen durchschnittlich die höchsten Darmwanddicken. In einer Analyse der transmuralen Profile liegen die Maxima überwiegend in der dem Lumen zugewandten Seite. Das Kaninchenmodell kann zur Simulation chronisch entzündlicher Darmerkrankungen genutzt werden und ist ausreichend stabil. Höhere Auflösung, kürzere Meßzeiten sowie kostengünstigere MRTs und die Nutzung rechnergestützter Auswertung erweitern die Einsatzmöglichkeiten der bei Problemfällen in der Diagnostik der CED. / Several problems exist in the diagnosis of chronic inflammatory bowel diseases (CIBD). Most patients are young, the diseases have a tendency to recur, which requires repeat diagnostic evaluation, and they may have extraintestinal pathologies, which can not reached by endoscopy. The capabilities of magnetic resonance imaging (MRI) shall be tested by an experiment. CIBD are simulated in a rabbit model by application of an irritating solution. The resected bowel walls with pathologies are measured by using a MRI micro coil system and examined by a pathologist. Bowel sections are evaluated by the conventional editor of the MRI scanner and semiautomatic by fixed algorithms with a DICOM-Editor. The measurement of the bowel thickness shows a good correlation between the maximum thickness of the pathology and the maximum thickness of the conventional editor (rho = 0,850), and , pathology and DICOM-editor (r = 0,843), respectively. In the analysis of variance the measured thickness differed significantly between "normal findings", "acute inflammation" and "chronic inflammation". It differed between the groups "normal findings" and "chronic inflammation" as well as between "acute inflammation" and "chronic inflammation" (each p < 0.01). On average, the group of chronic inflammation contains the highest bowel thickness. In an analysis of the location of signal intensity maximum, the greatest signal was found on the luminal side of the bowel wall. The rabbit model can be used to simulate chronic inflammatory bowel diseases. It is sufficiently reproducible. Higher resolution, shorter measurement periods and more cost-effective MRIs as well as semiautomatic computerized evaluation by fixed algorithms will increase the use of MRI in the case of chronic inflammatory bowel diseases.

Die chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen Morbus Crohn und Colitis ulzerosa sind wiederkehrende, nicht heilbare, immunvermittelte Krankheiten unklarer Ursache. Genetische Prädisposition und Umweltfaktoren können die Barrierefunktion der Darmmukosa stören, so dass eine überschiessende Entzündungsreaktion folgt, die durch kommensale Bakterien der normalen Darmflora verstärkt wird. Die Infektion mit H. pylori im Magen kann zu Gastritis, Ulkuskrankheit und der Entstehung von MALT-Lymphomen und Magenkarzinomen führen. An der Erkennung von bakteriellen Bestandteilen im Gastrointestinaltrakt sind Toll-like-Rezeptoren (TLR), als Komponenten des angeborenen Immunsystems maßgeblich beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurden Veränderungen der Bakterienflora bei Ileitis, Colitis und bei Vorliegen einer H. pylori-Infektion im Mausmodell untersucht. Durch eine globale Florenanalyse mit klassischen mikrobiologischen und molekularbiologischen Techniken konnte gezeigt werden, dass die Konzentrationen an Gram-negativen Stäbchenbakterien während der Entzündung in Ileum und Colon anstiegen. Die bakteriellen Faktoren, die eine Ileitis induzierten, wurden durch den Einsatz von gnotobiotischen TLR-defizienten Mäusen mit definierter bakterieller Rekolonisierung ermittelt. Hierbei zeigte sich, dass eine Ileitis durch das LPS von akkumulierenden E. coli über die TLR4-vermittelte Signaltransduktion verstärkt wurde. Die Entzündungsreaktionen konnten durch Behandlung mit Antibiotika oder dem LPS-Antagonisten Polymyxin B gebessert werden. In Folge einer H. pylori-Infektion kam es im Mausmagen zu einer erhöhten Diversität der Bakterienflora durch die Besiedelung mit Bakterienarten, die normalerweise das Colon kolonisieren. Eine derartige Florenverschiebung konnte durch eine Vakzinierung gegen H. pylori verhindert werden. Die Tiermodelle zur T. gondii-induzierten Ileitis und DSS-Colitis erlauben eine reproduzierbare Analyse entzündungsrelevanter Komponenten und damit die Möglichkeit, therapeutische Ansatzpunkte, wie z.B. den Einsatz von Lipopolysaccharid-Inhibitoren, die Blockade von TLR4 oder dem LPS-Bindeprotein oder den Einsatz von Probiotika, unter definierten Bedingungen zu analysieren. / Inflammatory bowel diseases like Crohn´s disease and ulcerative colitis are chronic, relapsing, immunologically mediated disorders with uncertain etiology. Genetic abnormalities and environmental factors may have negative influences on the physiologic barrier function of the intestinal mucosa with inflamamtion coming up after immune response which is aggravated by commensal intestinal bacteria. The infection of H. pylori can cause gastritis and ulcus disease and contribute to the occurence of MALT lymphoma and gastric cancer. Bacterial ligands in the intestine are recognized by toll-like receptors (TLR) which are one component of the innate immune system. This study observed variations of the bacterial flora in mice with ileitis, colitis or H. pylori-infection. Performing a global survey of the intestinal flora combining culture based techniques with molecular methods, it was observed, that the concentration of gram-negative rods is elevated during ileitis or colitis. The bacterial factors, which are capable of inducing ileitis, could be confirmed using gnotobiotic TLR-deficient mice with a defined bacterial recolonization. It was clearly shown that ileitis was aggravated by LPS of accumulating E. coli through a TLR4-mediated signal transduction. The inflammation was ameliorated through antibiotic treatment or after application of the LPS-scavenger polymyxin B. H. pylori infection of mice leads to an increase of bacterial diversity in the stomach and bacterial species which are normally colonize the colon were detected after infection. Vaccination against H. pylori could prevent this diversity shift. The animal models for the T. gondii-induced ileitis and DSS-colitis used in this study offering the reproducible analysis of inflammation relevant components so that new approaches of treatment like inhibition of lipopolysaccharide, blockage of TLR4 or LPS binding protein or application of probiotics could be studied under well defined conditions.

Einleitung: Das Probiotikum E. coli Nissle 1917 (EcN) wird seit einigen Jahren erfolgreich in der Behandlung chronisch entzündlicher Darmerkrankungen angewendet, der zugrunde liegende Wirkmechanismus ist jedoch nur unzureichend geklärt. T-Zellen spielen in der intestinalen Immunhomöostase und der Pathogenese von CED eine zentrale Rolle. Ziel: Den Einfluss von EcN auf humane T-Zellen weitergehend zu charakterisieren. Methoden: CD3-stimulierte periphere und Lamina propria T-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen eines E. coli Nissle 1917 konditionierten Mediums (EcN-CM) oder aber hitzeinaktivierten E. coli Nissle 1917 (hi-EcN) kultiviert. Die Expression von zellzyklus- und apoptoseassoziierten Regulationsproteinen sowie DNA-Gehalt, Zellzykluskinetik, Apoptoserate und Zellexpansion wurden durchflusszytometrisch und im Western Blot bestimmt. Die Sekretion von Cytokinen wurde mit dem Cytometric Bead Assay bestimmt. Ergebnisse: EcN-CM, nicht aber hitzeinaktivierte E. coli Nissle 1917 hemmt die Zellzyklusprogression und die Expansion von stimulierten, humanen peripheren T-Zellen. Ursächlich hierfür ist eine verminderte Expression der Cykline A, B1, D2 und E mit einer konsekutiv verminderten Phosphorylierung des Retinoblastomaproteins. Periphere T-Zellen sezernieren unter EcN-CM vermindert IL-2, IFN-gamma und TNF-alpha, während die Sekretion des antiinflammatorischen IL-10 durch EcN-CM heraufreguliert wird. Im Gegensatz zur potenten Beeinflussung des Zellzyklus, wurde die Apoptose von PBT durch E. coli Nissle 1917 nicht moduliert. Während periphere T-Zellen durch EcN-CM in ihrer Zellzyklusprogression und Expansion gehemmt wurden, zeigte sich kein derartiger Effekt auf ortständige Lamina propria T-Lymphozyten. Diskussion: Bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen kommt es zu einer Rekrutierung und Aktivierung von peripheren T-Zellen in die intestinale Mukosa. Durch die differenzielle Beeinflussung des Immunsystems, bei der aktivierte periphere T-Zellen inhibiert, die ortsständigen T-Zellen jedoch in ihrer Funktion nicht gestört werden, könnte E. coli Nissle 1917 dazu beitragen, die mukosale Entzündungsreaktion zu limitieren, während die intestinale Immunhomöostase gewahrt bleibt. Als wirksames Agens kommen kleine, hitzestabile bakterielle Produkte wie Lipopolysaccharide, bakterielle Lipoproteine, CPG-DNA, Lipoteichonsäuren und Peptidoglykane in Frage. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern weitere Hinweise, dass Probiotika einen breiten Einfluss auf das humane Immunsystem haben und decken zugrundeliegende Mechanismen auf. / Introduction: Although probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) has been proven to be efficacious for the treatment of inflammatory bowel diseases, the underlying mechanisms of action still remain elusive. T cells play a major role in the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Aims: To analyze the effects of E. coli Nissle 1917 on cell cycling and apoptosis of peripheral blood and lamina propria T cells. Methods: Anti-CD3-stimulated peripheral or lamina propria T cells were treated with E. coli Nissle 1917-conditioned medium (EcN-CM) or heat-inactivated E. coli Nissle 1917. Expression of cell cycle or apoptosis related proteins was determined by immunoblotting, DNA content, cell cycle kinetics, cell expansion and apoptosis were measured by flow cytometry. Cytokine levels in culture supernatants were assessed by cytometrc bead array. Results: EcN-CM but not heat-inactivated EcN inhibits cell cycling and expansion of peripheral T cells. EcN-CM decreases expression of Cyclin A, B1, D2 and E and thus reduces phosphorylation of retinoblastomaprotein in CD3-stimulated peripheral T cells. Further, secretion of proinflammatory cytokines IL-2, IFN-gamma and TNF-alpha is reduced while antiinflammatory IL-10 is increased under treatment with EcN-CM. In contrast to peripheral T cells, expansion and cell cycle progression of lamina propria T cells was not affected by EcN-CM. Apoptosis of was not modulated by EcN-CM. Discussion: The differential reaction of circulating and tissue-bound T cells towards E. coli Nissle 1917 may explain the beneficial effect of EcN in intestinal inflammation. EcN may downregulate the expansion of newly recruited T cells into the mucosa and thus limit intestinal inflammation, while already activated tissue-bound T cells may eliminate deleterious antigens in order to maintain immunological homeostasis. Possible agents, for which immunomodulatory effects are known, include heat-stable bacterial products like lipopolysaccharids, bacterial lipoproteins or bacterial DNA-motifs.

Die intestinale Mukosa bildet eine biologisch wichtige Barriere zwischen dem Organismus und den schädigenden Faktoren im intestinalen Lumen. Diese komplexe Aufgabe wird durch eine hochdifferenzierte intestinale Mukosa bewältigt, die eine strukturelle sowie funktionelle intestinale Barriere bildet. Das Ziel der vorliegenden Arbeiten war, ausgewählte Aspekte der Regulations- und Reparaturmechanismen der intestinalen mukosalen Barriere weitergehend zu charakterisieren. Unsere Untersuchungen zeigen, dass das Phospholipid Lysophosphatidsäure (LPA) die intestinale epitheliale Zellmigration stimuliert, die dieser Zellen jedoch inhibiert. Die Modulation der intestinalen Wundheilung durch LPA erfolgt durch einen TGF-b-unabhängigen Mechanismus und wird über einen G-Protein-abhängigen Rezeptor vermittelt, wie wir im Rahmen umfangreicher Untersuchungen zur Signaltransduktion unter Verwendung spezifischer Modulatoren der Signaltransduktion wie Bradykinin, Phorbolester, Pertussistoxin, Suramin und neutralisierender TGF-b-Antikörper belegen konnten. In weiteren Experimenten konnten wir zeigen, dass LPA auch in-vivo einen wundheilungsfördernden Effekt besitzt. Die topische Applikation von LPA in diesem experimentellen Kolitismodell bewirkte einen geringeren Gewichtsverlust sowie ein geringeres Ausmaß an intestinaler Entzündung und Nekrose in-vivo. Diese Untersuchungen legen somit nahe, dass LPA die intestinale epitheliale Wundheilung durch eine Modulation der intestinalen epithelialen Migration und Proliferation durch TGF-b-unabhängige Mechanismen stimuliert. Weitere Untersuchungen beschäftigten sich mit der funktionellen Charakterisierung von Lamina propria T-Zellen (LPT) und peripheren Blut T-Zellen (PBT). Wir konnten zeigen, dass der Zellzyklus von LPT distinkt von PBT reguliert wird. Hierbei spielt der Zellzyklusinhibitor p53 eine zentrale Rolle in der Zellzyklusregulation von LPT. Um Autoimmunität zu verhindern, muss es nach einer Eliminierung des Antigens wieder zu einer Depletion des Pools an Effektor-T-Zellen durch die Aktivierung der Apoptose kommen. Wir konnten zeigen, dass beim Antigen-induzierten Zelltod von LPT der intrinsische Apoptoseweg aktiviert wird und Caspase-8 hierbei eine zentrale Rolle spielt. Physiologischerweise sind Zellzyklus und Apoptose eng miteinander verbunden. In weiteren Versuchen konnten wir jedoch zeigen, dass dies nicht bei LPT der Fall ist und somit die von PBT distinkte Regulation von Zellzyklus und Apoptose mukosaler T-Zellen weiter unterstreichen. Zusammengefasst konnten wir durch ausgewählte Untersuchungen zeigen, dass die intestinale Barriere und ihre funktionelle Beeinflussung eine wesentliche Rolle in der Pathogenese und Therapie intestinaler Entzündungen besitzt. Eine Beeinflussung intestinaler Reparaturprozesse und Modulation abnormer T-Zellen könnte neue Möglichkeiten in der Therapie intestinaler Entzündungen, wie z.B. chronisch entzündlichen Darmerkrankungen bewirken. / The intestinal mucosa protect the host from the potential harmful content of the intestinal lumen. To accomplish this difficult goal, the highly complex mucosa forms an anatomical as well as functional barrier to protect the organism.In this work, we aimed to characterize distinct aspect of the intestinal barrier, focussing on distinct regulation and repair mechanism of the intestinal mucosa. First, we demonstrate, that the phospholipid lysophosphatidic acid (LPA) stimulate the migration of intestinal epithelial cells, but, in contrast, inhibit their proliferation. This effect is mediated by G-protein receptors and is TGF-b-independent, as we could demonstrate in further experiments using bradykinine, phorbole ester, pertussis toxin and suramine to modulate distinct signalling pathways.We then demonstrated, using a well-established animal model of colitis, that LPA enhances intestinal wound healing in-vivo. In detail, the topical application of LPA in TNBS-treated rats reduced weight loss, ameliorate intestinal inflammation and prevented necrosis in the animals. This experiments demonstrate for the first time, that LPA modulates migration and proliferation of intestinal epithelial cells by distinct TGF-b independent pathways. Further experiments aimed to explore functional differences between peripheral blood (PBT) and mucosal T-cells (LPT). We demonstrated, that the cell cycle is distinctively regulated in PBT and LPT, identifying p53 as key regulator of LPT cell cycling. To avoid auto-immunity, the pool of effector T-cells must be depleted by apoptosis, once the antigen has been cleared. We demonstrate, that intrinsic pathway of apoptosis is activated during the antigen-induced cell death in LPT and that caspase-8 activity is required to execute LPT apoptosis. Cell cycle and apoptosis are ultimately linked. However, as we show in further experiments, this is not the case in LPT, underlining the distinct regulation of LPT cell cycle and apoptosis.In conclusion, using various distinct experimental tools, we demonstrate that the intestinal barrier itself and the modulation its function plays a fundamental role in the pathogenesis mucosal inflammation. The data presented in this work may therefore open new therapeutic options in the therapy of intestinal inflammatory disorders, such as inflammatory bowel diseases.

Für die Therapie chronisch entzündlicher Darmerkrankungen (CED) ist die Diagnostik befallener Darmabschnitte und enteraler Komplikationen ebenso von Bedeutung, wie die Einschätzung der klinischen und endoskopischen Entzündungsaktivität. In einer Studie soll die Wertigkeit der Magnetresonanztomographie (MRT) untersucht werden, die Entzündungsaktivität CED anhand visueller Befunde und Komplikationen einzuschätzen. Außerdem soll überprüft werden, ob auf eine Kontrastierung des Darmes zugunsten eines höheren Patientenkomforts und einer schnelleren Untersuchung verzichtet werden kann. 64 Patienten mit bekannter oder vermuteter CED wurden vor und nach intravenöser Gd-DTPA-Injektion mit dem MR-Tomographen untersucht. Während 35 Patienten eine orale und rektale Kontrastierung mit Endoskopielösung erhielten, wurden 31 nicht enteral kontrastiert. 53 der untersuchten Patienten wurden zeitnah koloskopiert. Ein neu entwickelter MR-Aktivitätsindex (MRAI), die Kontrastmittelanreicherung in der Darmwand sowie die gemessenen Darmwanddicken wurden mit klinischen Indizes (CAI, CDAI) und dem Endoskopie-Aktivitätsindex (EAI) korreliert. Weiterhin wurden koronare Bilder aller Patienten bezüglich der Distension des Darmes und der Abgrenzbarkeit der Darmwand begutachtet. Im Vergleich mit dem EAI konnten signifikante Unterschiede für die Verteilung des Darmwand-Enhancements und der gemessenen Darmdicken nachgewiesen werden. Der MRAI zeigte eine Korrelation von Eta = 0,43 mit der klinischen Aktivität. Für Colitis ulcerosa-Patienten konnte ein Eta = 0,64 erstellt werden. Untersuchte, die eine Kontrastierung des Darmes erhielten, wiesen eine exzellente Korrelation (Eta = 0,76) zwischen MRAI und CAI / CDAI auf, während dieser Zusammenhang für Patienten ohne enterale Auffüllung fehlte. Weiterhin konnten signifikante Zusammenhänge zwischen enteraler Kontrastierung und der Distension des Darmes sowie der Abgrenzbarkeit der Darmwand gezeigt werden. Die Arbeit macht deutlich, daß es möglich ist, CED mittels MRT zuverlässig zu diagnostizieren und mit Hilfe des MRAI in ihrer klinischen und endoskopischen Entzündungsaktivität einzuschätzen. Dabei sollte auf die Anwendung eines enteralen Kontrastmittels nicht verzichtet werden. Ein Einsatz der MRT ist somit nicht nur bei der Diagnostik sondern auch zur Verlaufskontrolle der CED sinnvoll. / For the therapy of Inflammatory Bowel Diseases (IBD), not only the diagnosis of affected bowel segments and enteral complications but also the assessment of the clinical and endoscopic activity is important. The value of Magnetic Resonance Imaging (MRI) to asses the activity of IBD by visual findings and complications shall be determined by a clinical study. Furthermore shall be tested how the application of enteral contrast media affects patient comfort and examination time. 64 patients with known or supposed IBD were examined by MRI before and after intravenous injection of Gd-DTPA. 35 patients received oral and rectal contrast medium (2,5% mannitol solution) while 31 patients remaining without enteral replenishment. 53 patients underwent colonoscopy.A newly developed MR Activity Index (MRAI), based on visual findings, contrast-enhancement of the bowel wall and measured wall thickness were correlated with clinical (Crohn�s Disease Activity Index, CDAI; Colitis Activity Index, CAI) and endoscopic (Endoscopy Activity Index, EAI) activity. Coronal images of all patients were evaluated referring to bowel distension and demarcation of the bowel wall. The comparision with EAI shows significant differences in the distribution for wall contrast-enhancement and wall thickness. A good correlation is determined between the MRAI and the clinical activity (Eta = 0,43). Considering only patients with Ulcerative Colitis the correlation between MRAI and CAI shows Eta = 0,64. An excellent correlation of Eta = 0,76 between MRAI and CDAI / CAI for all patients with oral and enteral replenishment was found, while there was no correlation in the group, which did not receive mannitol solution. Significant correlations were also seen between the enteral mannitol solution replenishment and bowel distension and demarcation of the bowel wall. MRI shows good accuracy in detecting the changes the of IBD. The new developed MRAI allows an assessment of the activity of IBD. The results demonstrate that oral and enteral contrast media should be applied for MR examination of the abdomen. The utilization of MRI is furthermore useful in the follow up of IBD.