OLIVEIRA, Henrique Pinho. Proteínas antifúngicas do látex de Marsdenia megalantha [GOYDER & MORILLO, 1994] – Caracterização Bioquímica e mecanismos de ação. XIV, 114 f. : Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Fortaleza-CE, 2009. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-23T12:17:56Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_hpoliveira.pdf: 2711992 bytes, checksum: 0a015faa7a4251855704e8290f0a8b0a (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-05T19:04:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_hpoliveira.pdf: 2711992 bytes, checksum: 0a015faa7a4251855704e8290f0a8b0a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T19:04:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_hpoliveira.pdf: 2711992 bytes, checksum: 0a015faa7a4251855704e8290f0a8b0a (MD5) Previous issue date: 2009 / Masdenia megalantha (Apocynaceae ) is a species which grows on the hinterland in Northeast, Brazil. Upon injuries, each organ of the plant exudates a latex which quickly coagulates on exposure to air, preventing losses of water and the penetrat ion of plant pathogens. This present work had the aim to describe the antifungal properties of M. megalantha latex and to identify the related proteins in plant defense against phytopathogenous. So, latex was harvested from trees in Quix adá, Ceará, Brazil, and diluted with 0.05 M Tris - HCl, pH 8.0, containing 0.15 M NaCl (10:1, v/v) , to prevent its coagulation. The diluted latex was centrifuged (10,000 g , 10 min, 25 ºC), dialyzed extensively against water, and further centrifuged under the same above conditi ons. The supernatant, denominated Latex Proteins (LP), after exhaustive dialysis against 0.05 M sodium acetate, pH 5.2, was applied to a Resource - Q column equilibrated with this same buffer. Two different fractionswas obtained, one the non - retained protein s (FnRq), eluted with the equilibrating buffer, and the other, the retained proteins (FRq), eluted with 0.2 M NaCl in the above buffer. The FnRq (22 μfP/mL) was the only fraction able to inhibited the spore germination of the phytophatogenic fungi Fusarium solani . In addition, the evaluation of some enzymatic activities involved in plant defense mechanisms against phytopathogenous fungi such as chitinases, peroxidases and proteases were observed in both fractions from Resource - Q. FnRq, after performed in a Superose - 12 HR 10/30 column chromatography, originated another two different protein peaks (S1 and S2), showing different enzymatic activities, but both capable to inhibit the spore germination of the phytopathogenic fungi F. solani . S1 concentrated all th e peroxidase activity, whereas S2, which concentrate the chitinolityc activity. Under SDS - PAGE, S1 was presented as a purified protein band, instead of S2. Indeed, the NH2 - Terminal sequence under Edman degradation showed that S1 protein was blocked. The an tifungal action mechanisms evaluated in this work has showed that these protein presents in M. megalantha latex were able to interfere with the proton pump present in plasmatic membrane, and also to induce the ROS production, and promote alteration in the membrane permeability within the F. solani spores. These results show the latex from M. megalantha as a rich source of antifungal proteins, with potential to been used in the defense against the phytopathogenous F. solani. / Marsdenia megalantha (Apocynaceae) é uma espécie encontrada sobre rochas graníticas no interior do Nordeste brasileiro. Ao sofrer injúrias, diferentes partes da planta exudam látex que, rapidamente, coagula, prevenindo perda de água e penetração de patógenos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar as propriedades antifúngicas do látex M. megalantha e identificar proteínas relacionadas com o mecanismo de defesa das plantas contra fitopatógenos. Para isso, indivíduos dessa espécie foram coletados no município de Quixadá-CE e o látex coletado em alíquotas de tampão Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 M (10:1, v/v), a fim de evitar sua coagulação. Esse material foi centrifugado a 10.000 x g, 10 min, 25 ºC, dialisado exaustivamente contra água destilada e, novamente, centrifugado sob as mesmas condições. O sobrenadante, denominado de proteínas totais do látex, após diálise contra tampão acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2, foi submetido à cromatografia em coluna de Resource-Q, equilibrada com esse mesmo tampão. Duas frações protéicas foram obtidas, uma não retida (FnRq), obtida com o tampão de equilíbrio, e uma retida (FRq), resultante do acréscimo de NaCl 0,2 M ao tampão. Na avaliação do potencial antifúngico, FnRq (22 μgP/mL) se mostrou capaz de inibir a germinação dos esporos de Fusarium solani. Quando avaliadas atividades enzimáticas relacionadas ao mecanismo de defesa das plantas, quitinases, peroxidases e proteases foram detectadas em ambas as frações oriundas da Resource Q. FnRq, após cromatografia em coluna de Superose 12 HR 10/30, resultou em dois picos (S1 e S2), com atividades enzimáticas distintas, porém ambas com potencial para inibir a germinação dos esporos de F. solani. Em S1 ficou concentrada toda atividade peroxidásica, diferentemente de S2 que reteve a atividade quitinásica. Por PADE-SDS, S1 se mostrou puro, como uma única banda de Mr de 67 kDa, diferindo de S2, cujo perfil apresentou várias bandas protéicas. Sequenciamento por degradação de Edman revelou que a extremidade NH2-terminal de S1 estava bloqueada. Avaliação dos mecanismos de ação antifúngica usando esporos de F. solani mostrou que proteínas presentes no látex de M. megalantha são capazes de interferir com o funcionamento de bombas de prótons, de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio e de causar alterações na permeabilidade de membranas. Esses resultados apresentam o látex de M. megalantha como uma rica fonte de proteínas antifúngicas, com potencial para serem usadas na defesa contra o fitopatógeno F. solani.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Marsdenia megalantha (Apocynaceae) à uma espÃcie encontrada sobre rochas granÃticas no interior do Nordeste brasileiro. Ao sofrer injÃrias, diferentes partes da planta exudam lÃtex que, rapidamente, coagula, prevenindo perda de Ãgua e penetraÃÃo de patÃgenos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar as propriedades antifÃngicas do lÃtex M. megalantha e identificar proteÃnas relacionadas com o mecanismo de defesa das plantas contra fitopatÃgenos. Para isso, indivÃduos dessa espÃcie foram coletados no municÃpio de QuixadÃ-CE e o lÃtex coletado em alÃquotas de tampÃo Tris-HCl 0,05 M, pH 8,0, contendo NaCl 0,15 M (10:1, v/v), a fim de evitar sua coagulaÃÃo. Esse material foi centrifugado a 10.000 x g, 10 min, 25 ÂC, dialisado exaustivamente contra Ãgua destilada e, novamente, centrifugado sob as mesmas condiÃÃes. O sobrenadante, denominado de proteÃnas totais do lÃtex, apÃs diÃlise contra tampÃo acetato de sÃdio 0,05 M, pH 5,2, foi submetido à cromatografia em coluna de Resource-Q, equilibrada com esse mesmo tampÃo. Duas fraÃÃes protÃicas foram obtidas, uma nÃo retida (FnRq), obtida com o tampÃo de equilÃbrio, e uma retida (FRq), resultante do acrÃscimo de NaCl 0,2 M ao tampÃo. Na avaliaÃÃo do potencial antifÃngico, FnRq (22 μgP/mL) se mostrou capaz de inibir a germinaÃÃo dos esporos de Fusarium solani. Quando avaliadas atividades enzimÃticas relacionadas ao mecanismo de defesa das plantas, quitinases, peroxidases e proteases foram detectadas em ambas as fraÃÃes oriundas da Resource Q. FnRq, apÃs cromatografia em coluna de Superose 12 HR 10/30, resultou em dois picos (S1 e S2), com atividades enzimÃticas distintas, porÃm ambas com potencial para inibir a germinaÃÃo dos esporos de F. solani. Em S1 ficou concentrada toda atividade peroxidÃsica, diferentemente de S2 que reteve a atividade quitinÃsica. Por PADE-SDS, S1 se mostrou puro, como uma Ãnica banda de Mr de 67 kDa, diferindo de S2, cujo perfil apresentou vÃrias bandas protÃicas. Sequenciamento por degradaÃÃo de Edman revelou que a extremidade NH2-terminal de S1 estava bloqueada. AvaliaÃÃo dos mecanismos de aÃÃo antifÃngica usando esporos de F. solani mostrou que proteÃnas presentes no lÃtex de M. megalantha sÃo capazes de interferir com o funcionamento de bombas de prÃtons, de induzir a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio e de causar alteraÃÃes na permeabilidade de membranas. Esses resultados apresentam o lÃtex de M. megalantha como uma rica fonte de proteÃnas antifÃngicas, com potencial para serem usadas na defesa contra o fitopatÃgeno F. solani. / Masdenia megalantha (Apocynaceae ) is a species which grows on the hinterland in Northeast, Brazil. Upon injuries, each organ of the plant exudates a latex which quickly coagulates on exposure to air, preventing losses of water and the penetrat ion of plant pathogens. This present work had the aim to describe the antifungal properties of M. megalantha latex and to identify the related proteins in plant defense against phytopathogenous. So, latex was harvested from trees in Quix adÃ, CearÃ, Brazil, and diluted with 0.05 M Tris - HCl, pH 8.0, containing 0.15 M NaCl (10:1, v/v) , to prevent its coagulation. The diluted latex was centrifuged (10,000 g , 10 min, 25 ÂC), dialyzed extensively against water, and further centrifuged under the same above conditi ons. The supernatant, denominated Latex Proteins (LP), after exhaustive dialysis against 0.05 M sodium acetate, pH 5.2, was applied to a Resource - Q column equilibrated with this same buffer. Two different fractionswas obtained, one the non - retained protein s (FnRq), eluted with the equilibrating buffer, and the other, the retained proteins (FRq), eluted with 0.2 M NaCl in the above buffer. The FnRq (22 μfP/mL) was the only fraction able to inhibited the spore germination of the phytophatogenic fungi Fusarium solani . In addition, the evaluation of some enzymatic activities involved in plant defense mechanisms against phytopathogenous fungi such as chitinases, peroxidases and proteases were observed in both fractions from Resource - Q. FnRq, after performed in a Superose - 12 HR 10/30 column chromatography, originated another two different protein peaks (S1 and S2), showing different enzymatic activities, but both capable to inhibit the spore germination of the phytopathogenic fungi F. solani . S1 concentrated all th e peroxidase activity, whereas S2, which concentrate the chitinolityc activity. Under SDS - PAGE, S1 was presented as a purified protein band, instead of S2. Indeed, the NH2 - Terminal sequence under Edman degradation showed that S1 protein was blocked. The an tifungal action mechanisms evaluated in this work has showed that these protein presents in M. megalantha latex were able to interfere with the proton pump present in plasmatic membrane, and also to induce the ROS production, and promote alteration in the membrane permeability within the F. solani spores. These results show the latex from M. megalantha as a rich source of antifungal proteins, with potential to been used in the defense against the phytopathogenous F. solani.

nÃo hà / EvidÃncias foram acumuladas sustentando o papel de lÃtex em proteger as plantas contra diferentes agressores, porÃm à sabido que plantas laticÃferas sÃo fortemente atacados pela lagarta monarca, incluindo Calotropis procera. O presente estudo descreve a atividade proteolÃtica relacionada com a herbivoria do quinto estÃgio da monarca, Dannaus plexippus L. (Lepidoptera: Danaidae). Extratos intestinais da monarca digeriram azocaseÃna, BANA e BApNA. A atividade proteolÃtica sobre azocaseÃna foi inibida pro E-64 e IAA, mas foi fortemente inibida por PMSF e Leupeptina inibidores de proteases serÃnicas. Extrato intestinal digeriu rapidamente as proteÃnas do lÃtex C. procera. No entanto, nÃo digeriu proteÃnas do lÃtex de Cryptostegia grandiflora e apenas uma banda protÃica do lÃtex de Plumeria rubra foi digerida, duas espÃcies livres de herbivoria monarca. Larvas alimentadas com dieta artificial contendo proteÃnas do lÃtex de C. procera nÃo foram afetadas e a taxa de crescimento foi ligeiramente melhor em relaÃÃo ao controle. Os perfis protÃicos dos fluidos laticÃferos extraÃdos de plantas saudÃveis e atacadas apresentaram diferenÃas visÃveis, com o aumento da detecÃÃo de uma proteÃna identificada como glicosÃdeo hidrolase. Danos mecÃnicos nas plantas nÃo foram suficientes para causar esta resposta. As atividades proteolÃtica, quitinolÃtica, de inibiÃÃo de protease e de enzimas antioxidantes nÃo foram alteradas em plantas atacadas pela monarca ou submetidas a danos mecÃnicos. Resultados obtidos neste trabalho fornecem informaÃÃes interessantes sobre a resistÃncia de monarca alimentadas com Calotropis procera e sugerem que a capacidade enzimas proteolÃticas da monarca de prontamente digerir proteÃnas do lÃtex pode, pelo menos em parte, explicar como os insetos superam as proteÃnas de defesa do lÃtex. / Evidence has been accumulated supporting the role of latex in protecting plants against different aggressors; however it is known that milkweeds are heavily attacked by monarch butterfly, including Calotropis procera. The present study describes the proteolytic activity related to the herbivory of 5th instars of the monarch butterfly, Dannaus plexippus L. (Lepidoptera: Danaidae) fed on diets containing latex proteins, and the proteolytic activity of larvae gut extract on latex proteins. Gut extracts of monarch digested azocasein, BANA and BApNA. The proteolytic activity on azocasein was inhibited by cysteine protease inhibitors such as E-64 and iodoacetamide but it was stronger inhibited by PMSF and leupeptin, serine proteases inhibitors. Gut extracts of monarch digested latex proteins promptly. However, gut extracts did not digest latex proteins from Cryptostegia grandiflora and only barely digested laticifer proteins from Plumeria rubra, two species free of monarch herbivory. Larvae fed on artificial diets containing latex proteins were not affected and growth rate was slightly better compared to control. The protein profile of latex proteins extracted of healthy and attacked plants exhibited visible differences with increasing detection of a protein identified as glycoside hydrolase in latex of attacked plants. The proteolytic, chitinolytc, inhibition protease and anti-oxidative activities not were altered in attacked or injured plants. Results present here give interesting information on resistance of monarch fed on Calotropis procera and suggest that the ability of monarch proteolytic enzymes to promptly digest latex proteins can at least in part explain how the insect overcomes defensive proteins of latex.

Submitted by PPG Biologia Celular e Molecular (bcm@pucrs.br) on 2018-03-15T13:05:33Z No. of bitstreams: 1 PATRICIA_FERNANDA_DASILVA_VILCHES_DIS.pdf: 1829625 bytes, checksum: d4b53df7fed69d5202d5bafec96aaa13 (MD5) / Approved for entry into archive by Tatiana Lopes (tatiana.lopes@pucrs.br) on 2018-03-23T12:17:26Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PATRICIA_FERNANDA_DASILVA_VILCHES_DIS.pdf: 1829625 bytes, checksum: d4b53df7fed69d5202d5bafec96aaa13 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-23T12:22:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PATRICIA_FERNANDA_DASILVA_VILCHES_DIS.pdf: 1829625 bytes, checksum: d4b53df7fed69d5202d5bafec96aaa13 (MD5) Previous issue date: 2017-03-30 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Potatoes (Solanum tuberosum L.) are the third most consumed crop in the world, after rice and wheat. Among the diseases affecting potato, the blackleg and tuber soft rot, caused by phytobacteria Pectobacterium spp., lead to significant losses in the yield crop. Several studies have been exploring the use of plant defense inducers as a strategy to control plant diseases. The use of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) in agriculture can lead to plant growth and enhancement of plant defense through the promotion of induced systemic resistance (ISR). However, the mechanisms involved in promoting ISR are still poorly understood. This study aimed to screen rhizobacteria of the genus Streptomyces with capacity to promote plant growth and induce Solanum tuberosum innate immunity. To achieve these objectives, we evaluated: i) the ability of Streptomyces isolates to produce auxin (3-indoleacetic acid), ACC deaminase (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase) and siderophores; ii) their capacity to promote the growth of potato plants; iii) the induction of resistance in potato plants challenged with Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis and iv) the expression of genes related to defense pathways in S. tuberosum, promoted by Streptomyces and P. carotovorum. Results indicated that the CLV163 isolate presents PGPR features, such as high auxin and siderophores production, and promoted plant defense against P. carotovorum. Although CLV145 showed the highest auxin and siderophores production, it reduced the shoot dry mass and was inefficient in promoting plant defense. Moreover, the ability of Streptomyces in producing ACC deaminase was not critical for promoting plant growth. The CLV163 isolate induced a priming state in potato plants that has occurred through the activation of the AS and ET pathways, and its interaction with S. tuberosum plants did not impair the plant growth. / A batata (Solanum tuberosum L.) ? a terceira cultura agr?cola mais consumida no mundo, ficando atr?s somente do arroz e do trigo. Dentre as diversas doen?as que afetam esta cultura, a canela-preta e a podrid?o-mole, causadas pela fitobact?ria Pectobacterium spp., levam a importantes perdas na produ??o. Neste contexto, v?rios trabalhos v?m explorando o uso de indutores da defesa vegetal como estrat?gia para o controle de doen?as. O uso de rizobact?rias promotoras do crescimento vegetal (PGPR) na agricultura pode promover tanto o crescimento quanto o aumento da defesa das plantas atrav?s da indu??o da resist?ncia sist?mica induzida (ISR). Contudo, ainda s?o pouco conhecidos os mecanismos envolvidos na promo??o da ISR. Este estudo visou selecionar rizobact?rias do g?nero Streptomyces com caracter?sticas de promotoras de crescimento e indutoras da imunidade inata de Solanum tuberosum. Para tanto, foram avaliadas: i) a capacidade de isolados de Streptomyces produzirem auxina (?cido 3- indolac?tico), ACC desaminase (?cido 1-aminociclopropano-1-carbox?lico desaminase) e sider?foros; ii) a capacidade destas rizobact?rias em promover o crescimento das plantas; iii) a promo??o da resist?ncia em plantas de batata desafiadas com Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis e iv) a express?o de genes relacionados a vias de sinaliza??o de respostas de defesa em S. tuberosum, promovida por Streptomyces sp e a fitobact?ria P. carotovorum. Os resultados indicam que o isolado CLV163 apresenta caracter?sticas de PGPR, sendo capaz de produzir auxina e sider?foros, al?m de promover o aumento da resist?ncia das plantas contra P. carotovorum. Contudo, a rizobact?ria CLV145, com a maior produ??o de auxina e sider?foros, causou a diminui??o da mat?ria seca de parte a?rea e n?o promoveu a defesa das plantas. A capacidade dos Streptomyces em produzirem ACC desaminase n?o foi determinante para a promo??o de crescimento vegetal. O isolado CLV163 induziu um estado de priming nas plantas de S. tuberosum L. atrav?s da ativa??o das vias do AS e ET e a sua intera??o com as plantas de batata n?o comprometeu o crescimento vegetal.

Orientador: Silvia Renata Siciliano Wilcken / Resumo: Essa pesquisa teve como objetivo avaliar as características bioquímicas de plantas de pimentão ‘Beti-R’ e ‘AF-8253’ sob influência ao parasitismo de Meloidogyne enterolobii e M. incognita. O experimento foi conduzido em câmaras de BOD, em delineamento inteiramente casualizado com quatro repetições. As plântulas foram transplantadas para vasos de 0,5 L contendo substrato autoclavada de solo, areia e matéria orgânica (1:2:1). A suscetibilidade e resistência dos genótipos foram determinadas e o protocolo de localização in situ de espécies reativas de oxigênio (EROs) adaptado. A classificação dos estádios de vida dos nematoides e a avaliação das enzimas superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POD) e catalase (CAT), foram realizadas 2, 7, 14, 21, 28 e 35 dias após a infestação. M. enterolobii se reproduziu nos genótipos Beti-R’ e ‘AF 8253’ considerados suscetíveis. Já M. incognita não completou seu ciclo de vida após penetrar o sistema radicular da ‘AF 8253’, considerado resistente. As adaptações do protocolo de localização in situ de EROs permitiram determinar, eficientemente, o processo e a extensão da infestação pelo aumento da área das galhas, a qual foi determinada pela formação de radicais livres, delimitada pelo processo de formação das mesmas. A capacidade de resposta de defesa das plantas de pimentão ‘Beti-R’ à infecção por M. enterolobii pôde ser acompanhada qualitativamente pelas técnicas de detecção in situ de EROs, em especial para o radical superóxido. Observou-se ai... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-01T14:56:39Z No. of bitstreams: 1 DIS_MAILA_PACHECO_DIAS_COMPLETO.pdf: 1237790 bytes, checksum: 5f0ce43f31e6bb7c9d9d5d922daa8668 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T14:56:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_MAILA_PACHECO_DIAS_COMPLETO.pdf: 1237790 bytes, checksum: 5f0ce43f31e6bb7c9d9d5d922daa8668 (MD5) Previous issue date: 2016-03-29 / Solanum lycopersicum L., tomato, is an herbaceous plant belonging to the Solanaceae family. Its fruits are consumed worldwide, reaching the world production of 160 million tons per year. In Brazil, it is the second vegetable in economic importance. However, the tomato is attacked by numerous diseases that lead to loss of production and /or poor quality of the fruit, such as the hollow stem, the disease caused by Pectobacterium spp. Due to the large number of diseases caused by plant pathogens, the tomato is a culture in which a significant amount of agrochemicals is used. Therefore, this species is among the vegetables with the greatest amount of residual pesticides. Under these circumstances, it is essential to develop sustainable plant defense techniques in order to reduce the use of agrochemicals. Then, changes in plant metabolism related to defense must be understood so that new strategies and new products can be developed. Disease control using soil microorganisms has been considered as an alternative, since the rhizobacteria, in addition to promoting plant growth, may induce resistance as the result of activation of the natural plant defenses. These, calls plant growth promoting rhizobacteria (PGPR), has been explored for their biofertilizers, biopesticides and phyto-stimulating abilities. The aims of this study were to characterize biochemically the Streptomyces spp. isolates, to determine the antagonism against Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis (Pcb), to determine the ability of Streptomyces spp. on promoting growth of tomato plants and to evaluate the modulation of the defense-related metabolism of tomato plants when treated with Streptomyces spp. The possible influence of Streptomyces spp. on reducing soft rot disease in tomato plants was also evaluated. Biochemical characterization was evaluated through the ability of Streptomyces spp. on producing siderophores, solubilizing phosphate, and activity of amylase and lipase, as well as volatile organic compounds (VOC) production. Antagonism of Streptomyces spp. against Pcb was determined by dual-culture method and I-plate for VOC effect analysis. Plant growth promotion was evaluated through VOC emission and by direct interaction with Streptomyces spp. isolates (PM1, PM3, PM4, PM5, PM6 e PM9). Enzymes related to plant defense were colorimetric analyzed in plants treated with isolates of Streptomyces spp. Evaluation of soft rot disease was performed on plants treated with Streptomyces spp. and challenged with Pcb through the area under the disease progression curve (AUDPC) and plant mortality. Isolates of Streptomyces spp. displayed characteristics of PGPR and 32 volatile compounds were identified from the different isolates. PM3 was the isolate showing efficient antagonism against Pcb. Most of the isolates promoted increase of root and shoot length of tomato plants by VOC although PM5 was efficient on promoting growth by direct interaction with Streptomyces spp. Treatment with Streptomyces spp. modulated the activity of defense-related enzymes and decrease incidence of soft rot disease. / O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) ? uma planta herb?cea pertencente ? fam?lia Solanaceae. Seus frutos s?o consumidos mundialmente, chegando ? produ??o mundial de 160 milh?es de toneladas por ano. No Brasil, ? a segunda hortali?a em import?ncia econ?mica. Contudo, o tomateiro ? alvo de in?meras doen?as que levam ? perda de produ??o e/ou m? qualidade dos frutos, como por exemplo, a doen?a Talo oco causada por Pectobacterium spp. Devido ao elevado n?mero de doen?as causadas por fitopat?genos, o tomateiro ? uma cultura onde se utiliza uma quantidade expressiva de agroqu?micos, estando entre as hortali?as que apresentam maior quantidade de agrot?xicos residuais. Por isso, torna-se imprescind?vel o desenvolvimento de t?cnicas sustent?veis de defesa para o vegetal, a fim de reduzir o uso destes compostos. Para este fim, ? fundamental compreender as altera??es no metabolismo vegetal relacionado ? defesa, para que novas estrat?gias e novos produtos agr?colas possam ser desenvolvidos. O controle de doen?as utilizando microrganismos de solo tem sido considerado uma alternativa, uma vez que as rizobact?rias, al?m de promoverem o crescimento vegetal, podem induzir ? resist?ncia como consequ?ncia da ativa??o da defesa vegetal. Estas, chamadas rizobact?rias promotoras de crescimento vegetal (PGPR), v?m sendo exploradas quanto ? capacidade biofertilizante, fito-estimuladora e biopesticida. Os objetivos deste estudo foram caracterizar seis isolados de Streptomyces spp. como PGPR, determinar o antagonismo contra Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis (Pcb), determinar a capacidade de isolados de Streptomyces spp. na promo??o do crescimento de plantas de tomate e avaliar a modula??o do metabolismo relacionado ? defesa das plantas de tomate quando tratadas com Streptomyces spp. A poss?vel influ?ncia de Streptomyces spp. na redu??o da doen?a Talo oco em plantas de tomate tamb?m foi avaliada. A caracteriza??o bioqu?mica de isolados de Streptomyces spp. foi realizada por meio da capacidade de produzir sider?foros, solubilizar fosfato, e da atividade de amilase e lipase, bem como a produ??o de compostos org?nicos vol?teis. O antagonismo de Streptomyces spp. contra Pcb foi determinado pelo m?todo de dupla cultura e placa com barreira para an?lise do efeito de compostos org?nicos vol?teis (VOC). A promo??o do crescimento das plantas foi avaliada por meio de emiss?o de VOC e pela intera??o direta com os isolados de Streptomyces spp. (PM1, PM3, PM4, PM5, PM6 e PM9). Enzimas relacionadas ? resposta de defesa foram analisadas colorimetricamente em plantas tratadas com isolados de Streptomyces spp. A avalia??o da doen?a Talo oco foi realizada em plantas tratadas com Streptomyces spp. e desafiadas com Pcb atrav?s da ?rea sob a curva de progresso da doen?a e da mortalidade das plantas em 24 dias. Os isolados de Streptomyces spp. mostraram caracter?sticas de PGPR e 32 compostos vol?teis foram identificados como produtos dos diferentes isolados. PM3 foi o isolado mais eficiente quanto ao antagonismo contra Pcb. A maioria dos isolados promoveu o aumento do comprimento de raiz e da parte a?rea do tomateiro por VOC, embora PM5 tenha sido tamb?m eficiente na promo??o do crescimento atrav?s da intera??o direta com Streptomyces spp. O tratamento com Streptomyces spp. modulou a atividade de enzimas relacionadas ? defesa e diminuiu a incid?ncia da doen?a Talo oco.

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-30T17:30:00Z No. of bitstreams: 1 DIS_JULIANA_LOPES_HORSTMANN_COMPLETO.pdf: 1711527 bytes, checksum: 7681ac709a014d574046b6207b8a9728 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-30T17:30:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DIS_JULIANA_LOPES_HORSTMANN_COMPLETO.pdf: 1711527 bytes, checksum: 7681ac709a014d574046b6207b8a9728 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-30T17:30:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_JULIANA_LOPES_HORSTMANN_COMPLETO.pdf: 1711527 bytes, checksum: 7681ac709a014d574046b6207b8a9728 (MD5) Previous issue date: 2017-03-31 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / The plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) can increase agricultural productivity by promoting growth through production of plant hormones, facilitating the uptake of nutrients and chemicals on the soil, as well as inhibiting plant stress factors. Streptomyces spp. (Stm) are bacteria with great biotechnological potential, because in addition to its growth promotion and plant defense induction, they are also known as great producers of secondary metabolites, including antibiotics and phenazines. Soybean [Glycine max (L) Merrill] is one of the main legume crop grown around the world and Brazil is the second largest producer. Its production is affected by many diseases, among which bacterial pustule caused by the pathogen Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag). The objective of this project was to evaluate isolates of Streptomyces spp. obtained from the rhizosphere of Fabaceae plants regarding characteristics of PGPR, as well as the modulation capacity of soybean defenses in response to the phytopathogen Xag. Eleven isolates of Streptomyces spp. were screened for PGPR traits by siderophores production, 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase, indole-3-acetic acid (IAA) and phenazines. For a taxonomic identification and growth evaluation of soybean plants, three isolates were selected for their biochemical characteristics. The growth promoting assay was performed in greenhouse using bacterized seeds with the selected isolate and sterile distilled water was use for the control. Length, fresh and dry weight from shoot and root at 15, 30 and 45 days of cultivation were the evaluated parameters. For evaluation of the induction capacity of defense mechanisms of soybean plants, the isolate that obtained the best performance in the growth promotion test was selected. Seeds of soybeans, from sensitive cultivars and resistant to Xag, were bacterized with the selected Stm isolate and grown under greenhouse conditions. The plants were challenged with Xag 15 days after emergence. The treatments consisted of (a) plants treated with sterile distilled water (absolute control); (b) plants bacterized with Stm CLV45 (Stm45); (c) water-treated and Xag challenged plants; and (d) plants bacterized with StmCLV45 and challenged with Xag (Stm45+Xag). The enzymatic responses related to the defense pathways were evaluated biochemically, by analyzing the activity of phenylalanine ammonia lyase (PAL) and by the production of phenolic compounds at times 0, 24, 48, 72 and 144 hours post infection (hpi) of Xag. The expression of the genes related to the defense in Xag challenged soybean plants was determined by the relative expression of the genes PAL, JAZ, ERF5 and PR1 by qPCR at times 0, 12, 24 and 48 hpi. The results of the biochemical analysis indicated the isolates CLV42, CLV44 and CLV46 as the major producers of siderophores and CLV41, CLV45 and CLV46 isolates with higher ACC deaminase activity. All isolates were able to produce IAA, highlighting the isolate CLV45, which produced 398.53 ?g AIA g-1 cell. Phenazine pyocyanin (PYO) was also detected in all isolates, but the same did not occur for the 1-carboxylic acid phenazine (PCA), only produced by CLV41, CLV43 and CLV45. The isolates CLV42, CLV44 and CLV45 were selected for their PGPR characteristics for the growth promotion trial of greenhouse soybean plants and taxonomically characterized as species of the genus Streptomyces. None of the isolates evaluated in the trial caused a growth deficit in soybean plants. The CLV45 isolate significantly promoted the growth of soybean shoots in 36.63%, corroborated by the highest dry mass, 17.97%, in relation to the control group, being selected for soybean defense pathways induction. Expression of PAL gene was moderately enhanced in susceptible Stm45+Xag plants at 12 hpi, followed by increase of PAL enzyme activity from 48 to 144 hpi, although corresponding accumulation of phenolic compounds was not recorded. In the resistant cultivar, the highlighted expression of PAL in Stm45+Xag plants resulted in high activity of this enzyme. Enhanced expression of ERF5 and decrease on JAZ gene at 12 hpi in Stm45+Xag plants from both cultivars suggested that ET and JA play a concert role on induced systemic defense by Streptomyces sp. CLV45 against Xag in soybean. / As rizobact?rias promotoras de crescimento de plantas (PGPR) podem aumentar a produtividade agr?cola, atuando atrav?s da promo??o de crescimento vegetal por meio de fitorm?nios reguladores de crescimento, facilitando a capta??o de nutrientes e de compostos qu?micos no solo, bem como inibindo fatores de estresse vegetal. Bact?rias do g?nero Streptomyces spp. (Stm) apresentam grande potencial biotecnol?gico, pois al?m de promoverem o crescimento e a indu??o de defesa vegetal, tamb?m s?o conhecidas pela grande produ??o de metab?litos secund?rios, incluindo antibi?ticos e fenazinas. A soja [Glycine max (L.) Merrill] ? uma das principais leguminosas cultivadas no mundo, sendo o Brasil o segundo maior produtor. Sua produ??o ? afetada por in?meras doen?as, como a P?stula bacteriana causada pelo fitopat?geno Xanthomonas axonopodis pv. glycines (Xag). O objetivo deste trabalho foi avaliar 11 isolados de Streptomyces spp. oriundos da rizosfera de plantas de Fabaceae quanto ?s caracter?sticas de PGPR, bem como, ? capacidade de modula??o das vias de defesa de plantas de soja em resposta ? fitobact?ria patog?nica Xag. Os isolados foram avaliados quanto ?s caracter?sticas de PGPR pela produ??o de sider?foros, de ?cido indolac?tico (AIA), da enzima 1-aminociclopropano-1-?cido carbox?lico (ACC) desaminase e de fenazinas. Para a identifica??o taxon?mica e a avalia??o da promo??o de crescimento de plantas de soja foram selecionados tr?s isolados com caracter?sticas de PGPR. O ensaio de promo??o de crescimento ocorreu em casa de vegeta??o por meio da microbioliza??o das sementes pelos isolados selecionados e o controle com ?gua destilada est?ril. Os par?metros avaliados foram: comprimento, massa fresca e seca, de parte a?rea e raiz, aos 15, 30 e 45 dias de cultivo. Para a avalia??o da capacidade de indu??o dos mecanismos de defesa de plantas de soja, foi selecionado o isolado que obteve o melhor desempenho no ensaio de promo??o de crescimento. Sementes de soja, de cultivar sens?vel e resistente ? Xag, foram microbiolizadas com o isolado de Stm selecionado e cultivadas em casa de vegeta??o. As plantas obtidas foram desafiadas com Xag, 15 dias ap?s a sua emerg?ncia. Os tratamentos consistiram de (a) sementes tratadas com ?gua destilada est?ril (controle absoluto); (b) sementes microbiolizadas com StmCLV45 (Stm45); (c) sementes tratadas com ?gua destilada est?ril e plantas desafiadas com Xag (Xag); e (d) sementes microbiolizadas StmCLV45 e plantas desafiadas com Xag (Stm45+Xag). As respostas enzim?ticas relacionadas ?s vias de defesa foram avaliadas bioquimicamente, pela an?lise da atividade da fenilalanina am?nia liase (PAL) e pela produ??o dos compostos fen?licos, nos tempos 0, 24, 48, 72 e 144 horas p?s inocula??o (hpi) da Xag. A express?o dos genes relacionados ? defesa das plantas de soja desafiadas com Xag foi determinada pela express?o relativa de JAZ, ERF5, PAL e PR1 por qPCR, nos tempos 0, 12, 24 e 48 hpi. Os resultados da an?lise bioqu?mica indicaram os isolados CLV42, CLV44 e CLV46 como maiores produtores de sider?foros e os isolados CLV41, CLV45 e CLV46 com maior atividade de ACC desaminase. Todos os isolados foram capazes de produzir AIA, com destaque para o isolado CLV45, que produziu 398,53 ?g AIA g-1 de c?lulas. A fenazina piocianina (PYO) tamb?m foi detectada em todos os isolados, entretanto o mesmo n?o ocorreu para a fenazina 1-?cido carbox?lico (PCA), somente produzida por CLV41, CLV43 e CLV45. Os isolados CLV42, CLV44 e CLV45 foram selecionados por suas caracter?sticas de PGPR para o ensaio de promo??o do crescimento de plantas de soja em casa de vegeta??o e caracterizados taxonomicamente como esp?cies do g?nero Streptomyces. Nenhum dos isolados avaliados no ensaio causou d?ficit de crescimento em plantas de soja. O isolado CLV45 promoveu significativamente o crescimento de parte a?rea de plantas soja, em 36,63%, corroborado pela maior massa seca, 17,97%, em rela??o ao grupo controle, sendo selecionado para avalia??o nas vias de defesa da soja. A express?o do gene PAL foi moderadamente aumentada em plantas suscet?veis Stm45+Xag em 12 hpi, seguido por aumento da atividade da enzima PAL de 48 a 144 hpi, embora o ac?mulo correspondente de compostos fen?licos n?o tenha sido registrado. Na cultivar resistente, a express?o de PAL em plantas Stm45+Xag resultou em alta atividade desta enzima. A express?o aumentada de ERF5 e a diminui??o de express?o do gene JAZ em 12 hpi em plantas Stm45+Xag de ambas as cultivares sugeriram que etileno e ?cido jasm?nico desempenharam fun??o na defesa sist?mica induzida por Streptomyces sp. CLV45 contra Xag em plantas de soja.

Submitted by Rosimeri Vergara (rosimerivergara@unipampa.edu.br) on 2018-12-10T20:53:33Z No. of bitstreams: 1 Daiane Pazinato 2017 Dissertação.pdf: 1418052 bytes, checksum: 68e8fe4e7a3bee2e1afec76994b7a27c (MD5) / Approved for entry into archive by Dayse Pestana (dayse.pestana@unipampa.edu.br) on 2018-12-11T15:57:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Daiane Pazinato 2017 Dissertação.pdf: 1418052 bytes, checksum: 68e8fe4e7a3bee2e1afec76994b7a27c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-12-11T15:57:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Daiane Pazinato 2017 Dissertação.pdf: 1418052 bytes, checksum: 68e8fe4e7a3bee2e1afec76994b7a27c (MD5) Previous issue date: 2017 / As condições ambientais podem influenciar a composição e produção dos metabólitos secundários, ocasionando maior ou menor capacidade antioxidante nas plantas. Em áreas de mineração ocorrem modificações no meio ambiente, alterações estas que podem vir a interferir nos constituintes do vegetal. Neste trabalho foi comparada a atividade antioxidante do extrato etanólico de Eugenia uniflora L. presente em área de mineração com uma área controle, bem como, foram feitas investigações da condição do meio ambiente. A atividade antioxidante foi analisada através de dois métodos: complexação do fosfomolibdênio e o método de sequestro de radicais livres DPPH° (2,2-difenil1-picril-hidrazila). Tendo em vista verificar a qualidade dos solos onde estavam as plantas, foi verificado o pH e investigada a presença de alguns elementos químicos. Na região de mineração não houve detecção de alguns elementos que são essenciais para a nutrição vegetal, são eles: cobre, molibdênio, níquel e zinco, assim como, ocorreu uma menor concentração de cobalto, que também é considerado um elemento essencial. A determinação do pH dos solos possibilitou definir o solo da área de mineração como básico (8,85±0,78), enquanto que o da área controle foi caracterizado como ácido (5,37±0,35). O valor de pH elevado na área de mineração é um fator que causa mais impactos na nutrição vegetal que a acidez do solo da área controle, pois a disponibilidade de nutrientes é afetada em maior proporção. As análises de água indicaram que a qualidade da água na área controle está adequada, enquanto que na área de mineração, os níveis de dureza, condutividade, cálcio e magnésio estavam elevados por se tratar de uma bacia de decantação de efluentes líquidos de fábrica de cal. A atividade antioxidante da planta localizada na área de mineração foi maior que a da planta da área controle, que não está sob influência de atividades de mineração. No método de complexo do fosfomolibdênio, a análise estatística demonstrou que entre os extratos de Eugenia uniflora L. das duas áreas analisadas não há diferença expressiva. No método de sequestro de radicais livres (DPPH) houve diferença significativa entre os distintos extratos. O maior percentual de atividade antioxidante observado foi de 96,55% para o extrato da área de mineração, enquanto que para a área controle foi 92,78%. Alguns fatores podem ocasionar estresse nas espécies vegetais, promovendo um aumento nos compostos antioxidantes, aspecto esse que pode ser relacionado ao aumento dos níveis de pH no solo da área de mineração, assim como a ausência ou deficiência de elementos que são essenciais para a nutrição vegetal. / Environmental conditions can influence the composition and production of secondary metabolites, causing greater or lesser antioxidant capacity in plants. In mining areas there are changes in the environment, which may interfere with the constituents of the plant. In this work, the antioxidant activity of the Eugenia uniflora L. ethanolic extract present in a mining area with a control area was compared, as well as investigations of the condition of the environment. The antioxidant activity was analyzed by two methods: phosphomolybdenum complexation and the free radical sequestration method DPPH ° (2,2-diphenyl1-picryl-hydrazyl). In order to verify the quality of the soils where the plants were, the pH was verified and the presence of some chemical elements was investigated. In the mining region there was no detection of some elements that are essential for plant nutrition: copper, molybdenum, nickel and zinc, as well as a lower concentration of cobalt, which is also considered an essential element. The determination of the pH of the soils allowed to define the soil of the mining area as basic (8.85 ± 0.78), while that of the control area was characterized as acid (5.37 ± 0.35). The high pH value in the mining area is a factor that causes more impacts on plant nutrition than the soil acidity of the control area, because the availability of nutrients is affected to a greater extent. The water analysis indicated that the water quality in the control area is adequate, while in the mining area the hardness, conductivity, calcium and magnesium levels were high because it was a sedimentation basin of liquid effluents from the lime factory . The antioxidant activity of the plant located in the mining area was higher than that of the control area, which is not under the influence of mining activities. In the phosphomolybdenum complex method, the statistical analysis showed that between the extracts of Eugenia uniflora L. of the two analyzed areas there is no significant difference. In the free radical sequestration method (DPPH) there was a significant difference between the different extracts. The highest percentage of antioxidant activity observed was 96.55% for the extract from the mining area, while for the control area it was 92.78%. Some factors can cause stress in the plant species, promoting an increase in the antioxidant compounds, which aspect may be related to the increase of pH levels in the soil of the mining area, as well as the absence or deficiency of elements that are essential for plant nutrition .

ARANTES, Mariana Reis. Expressão gênica da toxina da soja (SBTX) durante o desenvolvimento da soja [Glycine max (L.) Merril] e seu envolvimento na defesa vegetal. 2015. 120 f. Dissertação (Mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-09-01T19:49:36Z No. of bitstreams: 1 2015_dis_mrarantes.pdf: 2506880 bytes, checksum: 104fd156a0b0653c61de679f81e853eb (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T20:52:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_dis_mrarantes.pdf: 2506880 bytes, checksum: 104fd156a0b0653c61de679f81e853eb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T20:52:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_dis_mrarantes.pdf: 2506880 bytes, checksum: 104fd156a0b0653c61de679f81e853eb (MD5) Previous issue date: 2015 / Brazil is the second major global soybean producer, whose magnitude is due to its use multiples. However, losses in productivity of soybean grains in the field are still significant, especially those caused by pathogenic fungi. In view of this obstacle, it is important to search natural molecules able to inhibiting the progress of fungal diseases in an environmental friendly practice. Among the soybean molecules which could be used for this purpose, the soybean toxin (SBTX) stands out. SBTX is a protein composed of two subunits (17 and 27 kDa) isolated from seeds with in vitro activity against phytopathogenic fungi. The present study aimed to verify the SBTX tissue localization in soybean seed cotyledons, as well as to evaluate the gene expression profile of two SBTX subunits, both in different stages of plant development and in response to treatment with plant defense elicitors. Soybean seeds were grown in a greenhouse and plant tissues harvested at different days. In addition, soybean primary leaves were treated with salicylic acid (SA) or inoculated with the Cercospora kikuchiii (CK) spores and harvested at different times after the treatments. Based on the N-terminal sequences of the SBTX subunits, primers were designed and their gene expression evaluated by quantitative real-time PCR technique. SBTX tissue localization was performed by immunohistochemistry using anti-SBTX. Transcripts for both SBTX subunits were detected in all plant tissues, predominantly in cotyledons and unifoliate leaves in the early stages of their development, as well as in mature seeds. SBTX was found in the epidermis of the cotyledons. Transcripts were detected for both genes SBTX17 e SBTX27 in all tissues collected, but their expression levels were different. The highest transcript levels for both SBTX subunits were found in mature seeds, cotyledons and unifoliate leaves. In cotyledons, SBTX was found in the epidermis. Leaves treated with elicitors showed induction of the corresponding 17 and 27 kDa subunit transcripts, however this response was earlier in the CK treatment (from 6 h) compared to AS treatment (from 12 h). In almost all analyses, the highest transcript levels were found for the 27 kDa subunit. The ubiquitous and constitutive gene expression during plant development, the induction of gene expression by defense response elicitors and the localization on the surface of cotyledons support the role of SBTX in plant defense and its use to produce fungal-resistant transgenic soybean plants. / O Brasil é o segundo maior produtor mundial de soja, destacando-se por sua multiplicidade de uso. Entretanto, perdas na produtividade de seus grãos em campo são ainda consideráveis, particularmente oriundas das doenças causadas por fungos. Diante desse obstáculo, emerge a necessidade de busca de moléculas naturais capazes de inibir o progresso dessas doenças, sem causar impactos ambientais. Dentre as moléculas presentes na soja, com potencial de uso para essa finalidade, destaca-se a toxina da soja (SBTX), uma proteína isolada de sementes, composta por duas subunidades (17 e 27 kDa) e ativa contra fungos fitopatogênicos. Esse trabalho teve como objetivos verificar a localização tecidual da SBTX em cotilédones de sementes maduras, bem como avaliar seu perfil de expressão gênica ao longo do desenvolvimento da soja e, também, em resposta ao tratamento com elicitores de defesa vegetal. Sementes de soja foram cultivadas em casa de vegetação e, ao longo do desenvolvimento da planta, diferentes tecidos vegetais coletados. Em adição, folhas primárias da soja foram tratadas com ácido salicílico (AS) ou inoculadas com esporos do fungo Cercospora kikuchii (CK) e coletadas em diferentes tempos após os tratamentos. Iniciadores foram desenhados com base nas sequências NH2-terminal das subunidades de SBTX e a expressão gênica foi avaliada pela técnica de RT-PCR quantitativa. A localização de SBTX em sementes foi avaliada por imunohistoquímica, usando anti-SBTX. Transcritos dos genes SBTX17 e SBTX27 foram detectados em todos os tecidos vegetais coletados, porém seus níveis de expressão foram diferenciados. Níveis mais elevados de transcritos para ambas as subunidades da SBTX foram detectados em sementes maduras, cotilédones e folhas unifoliadas. Nos cotilédones, SBTX foi encontrada na epiderme. Indução da expressão de transcritos da SBTX ocorreu em ambos os tratamentos, porém essa resposta se manifestou mais rápida (a partir de 6 h) com CK ao invés de AS (a partir de 12 h). Praticamente, em todas as análises, transcritos do gene SBTX27 prevaleceram em relação àqueles do SBTX17. A presença constitutiva e ubíqua de transcritos dos genes da SBTX ao longo do desenvolvimento da planta, a indução da expressão desses genes por elicitores de resposta de defesa e a localização da toxina na superfície dos cotilédones validam o papel de defesa atribuído a SBTX, suscitando a possibilidade de uso dessa proteína na produção de soja resistente ao ataque de fungos de relevância agronômica.

VIANA, Carolina de Araújo. Caracterização bioquímica e atividades biológicas de quitinases laticíferas de Calotropis procera. 2015. 181 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by Vitor Campos (vitband@gmail.com) on 2016-09-01T23:13:32Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_caviana.pdf: 4184651 bytes, checksum: cb48948d5a8582e15dd64207712d9789 (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2016-09-02T21:14:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_caviana.pdf: 4184651 bytes, checksum: cb48948d5a8582e15dd64207712d9789 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T21:14:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_caviana.pdf: 4184651 bytes, checksum: cb48948d5a8582e15dd64207712d9789 (MD5) Previous issue date: 2015 / Calotropis procera is a latificer plant in the Apocynaceae family. Defensive proteins with activity against phytophagous insects and phytopathogenic fungi in latex have been described. Latex’s proteic fraction also performs pharmacological activities, such as selective cytotoxic effect in carcinogenic cells. From the proteic fraction effective against neoplastic cells, this work had the goal to identify and further characterize cytotoxic protein(s) biochemically, biologically, and evaluate their biotechnological prospects. Soluble proteins in latex (LP) have been fractioned in ion-exchange matrix, and the fraction capable of cytotoxicity was further fractioned in another ion-exchange matrix (Mono-Q) coupled to a medium-pressure system. P4 was identified as cytotoxic fraction, showing an IC50 of 2.2, 1.2 and 2.9 mg/mL for the cell lines HCT-116, Ovcar-8 and SF-295, respectively. Proteomic analysis of the cytotoxic fraction by two-dimensional electrophoresis allowed 15 spots to be identified, comprising acid proteins (pI among 4 and 6) with 30 kDa apparent molecular weight. All spots were identified as chitinases when evaluated by mass spectrometry, and showed intact mass of 27.4 kDa. The sample reacted positively to the Schiff reagent, suggesting glycosilations. The carbohydrate content was estimated at 12.8%. The amino-terminal sequence obtained (1QPVMNLEYPRYLNDINDYRDDNNYD28) revealed 50% similarity with Solanum lycopersicum, Oryza sativa and Nicotiana tomentosiformes chitinases, among others. The enzymes showed strong chitinolytic activity, with optimal pH varying between 5-6 and optimal temperature of 25 °C. The chitinolytic activity was diminished when treated with increasing concentrations of DTT (3, 10 and 30 mM), which suggests the presence of disulfide bonds stabilizing the enzyme. Circular dichroism analyses indicate a larger presence of alpha helices in the structure and that the isoforms has low resistance to pH and temperature variation. High-resolution images generated through atomic force microscopy suggested sample homogeneity and a hexameric configuration. The chitinases did not inhibit mycelial growth of phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum and Colletotrichum gloeosporioides, however reduced the germination C. gloeosporioides spores. In consonancy the chitinases did not induce spore oxidative stress, but caused a slight change in membrane permeability of the evaluated spores. Laticifer chitinases (0.1% w/w) showed a strong deleterious effect on the phytophagous insect Callosobruchus maculatus. Effects produced a 57% survival reduction, larval weight reduction (7.8 mg ± 0.2 / 4.0 ± 0.8), adult insets emergence reduction (50%), in addition to prolonging the mean maturation time from 28 to 33 days. The chitinases (2 mg/Kg, i.v.) showed a strong anti-inflammatory activity, reducing 95% of neutrophil infiltration into the peritoneal cavity in mouse in an inflammation induced by carrageenan assay. L-NAME and Aminoguanidine, two inhibitors of nitric oxide synthase, reversed this effect, possibly indicating involvement of nitric oxide in the effects observed. This action was associated to a reduction of pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-1 levels within the peritoneal cavity and increased serum levels of pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-6 and IL-1. The conclusion is reached that many isoforms of chitinases coexist in C. procera latex. These proteins act possibly in defense against insects, though low action against fungi is shown. Laticifer chitinases were identified as latex proteins cytotoxic on neoplastic cells and they have even been able to modulate pro-inflammatory cytokines levels and nitric oxide in an acute inflammation model. C. procera laticifer chitinases represent interesting molecules for biotechnology prospection in plant defense and pharmacology. / Calotropis procera é uma planta laticífera, pertencente à família Apocynaceae. Proteínas de defesa foram descritas no látex com atividade contra insetos fitófagos e fungos fitopatogênicos. A fração proteica do látex também apresenta atividades farmacológicas, dentre tais efeito citotóxico seletivo em células carcinogênicas. A partir da fração proteica efetiva sobre células neoplásicas, o trabalho teve por meta central identificar proteína(s) citotóxica(s) e proceder a sua caracterização bioquímica, biológica e suas perspectivas biotecnológicas. As proteínas solúveis do látex (PL) foram fracionadas em matriz de troca iônica e a fração proteica detentora da citotoxicidade foi refracionada em outra matriz de troca iônica (Mono-Q) acoplada a sistema de média pressão. P4 foi identificado como a fração citotóxica, apresentando uma IC50 de 2,2, 1,2 e 2,9 µg/mL para as linhagens celulares HCT-116, Ovcar-8 e SF-295, respectivamente. A análise proteômica da fração citotóxica por eletroforese bidimensional permitiu identificar 15 spots, contendo proteínas ácidas (pI entre 4 e 6) e com massa molecular aparente de 30 kDa. Quando avaliados por espectrometria de massas todos esses spots foram identificados como quitinases e apresentaram massa intacta de 27,4 kDa. A amostra reagiu positivamente ao reagente de Schiff, sugerindo glicosilações. O teor de carboidratos foi estimado em 12,8%. A sequência amino terminal obtida (1QPVMNLEYPRYLNDINDYRDDNNYD28) revelou 50% de similaridade com quitinases de Solanum lycopersicum, Oryza sativa, Nicotiana tomentosiformes dentre outras. As enzimas apresentaram forte atividade quitinolítica, com pH ótimo variando entre 5-6 e temperatura ótima de 25 °C. A atividade quitinolítica foi reduzida quando tratada com concentrações crescentes de DTT (3, 10 e 30 mM) o que sugere a presença de pontes dissulfeto estabilizadoras da enzima. Análises por dicroísmo circular indicam a presença majoritária de alfa-hélices na estrutura e que as isoformas se mostraram pouco resistentes a variações de temperatura e pH. Imagens de alta resolução geradas por microscopia de força atômica sugeriram homogeneidade na amostra e um arranjo hexamérico foi evidenciado. As quitinases não inibiram o crescimento micelial dos fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum e Colletotrichum gloeosporioides, mas reduziram a germinação de esporos de C. gloeosporioides. Em consonância as quitinases não induziram estresse oxidativo nos esporos, mas causaram leves alterações na permeabilidade membranar dos esporos avaliados. As quitinases laticíferas (0,1 % m/m) apresentaram forte efeito deletério sobre o inseto fitófago Callosobruchus maculatus. Os efeitos produziram 57% de redução na sobrevivência larval, redução do peso de larvas (7,8 mg ± 0,2 /4,0 ± 0,8) e emergência de insetos adultos (50%), além de prolongar de 28 para 33 dias o tempo médio de desenvolvimento de insetos adultos. As quitinases (2 mg/Kg, e.v.) apresentaram forte atividade anti-inflamatória, reduzindo em 95% a infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal em ensaio de inflamação induzido por carragenina em camundongos. Este efeito foi revertido por L-NAME e Aminoguanidina, dois inibidores da enzima óxido nítrico sintase, indicando o possível envolvimento do óxido nítrico no efeito observado. Esta ação foi associada à redução dos níveis das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1 na cavidade peritoneal e do aumento dos níveis séricos das citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-6 e IL-1. É concluído que várias isoformas de quitinases coexistem no látex de C. procera. Estas proteínas atuam possivelmente na defesa contra insetos, mas têm pouca ação contra fungos. As quitinases laticíferas foram identificadas como as proteínas citotóxicas do látex sobre células neoplásicas e ainda foram capazes de modular os níveis de citocinas pró-inflamatórias e síntese de óxido nítrico em modelo de inflamação aguda. As quitinases do látex de C. procera representam interessantes moléculas para prospecção biotecnológica em defesa vegetal e farmacologia.