Orientadora: Profa. Dra. Silvia Ribeiro de Souza / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2017. / As plantas possuem mecanismos de defesas que sao classificados como diretos e indiretos, ativando varias vias de respostas. As defesas diretas estao presentes constitutivamente nas plantas e podem estar relacionadas com o sistema antioxidante que possui componentes tais como glutationa oxidada (GSSH), glutationa reduzida (GHS), acido ascorbico (AA) e acido dehidroascorbico (DHA) que agem na manutencao do balanco oxi/antioxidante das plantas, visando minimizar os danos no sistema celular. As defesas indiretas estao relacionadas com as interacoes ecologicas e sao atribuidas aos compostos organicos volateis (COV) que podem combater o ataque de herbivoros e patogenos mediando as interacoes troficas. A ativacao das defesas ocorre quando as plantas estao expostas ao agente agressor. Dentre os varios agentes, destaca-se ozonio, por ser um poluente fitotoxico que promove estresse oxidativo e danos celulares. Nesse sentido, o presente trabalho tem o objetivo de verificar se o ozonio, e capaz de alterar as defesas quimicas diretas e indiretas de individuos de Croton floribundus e Pipitadenia gonoacantha estudadas em situacao isolada e combinada. Experimentos foram realizados em condicoes controladas e plantas foram expostas a 100 ppb de ozonio em situacao isolada e combinada. As exposicoes ocorreram durante 7 dias por 5 horas. Determinou-se os niveis dos antioxidantes acido ascorbico e glutationa por meio da espectroscopia UV-vis. Os valores dos pares AA/DHA e GHS/GSSH foram comparados com o potencial redox de cada par, obtido para as formas reduzidas/oxidadas pela equacao de Nernst. Os COV foram quantificados por cromatografia gasoasa acoplada a espectroscopia de massas. Os resultados obtidos mostraram que para as defesas diretas, a especie P.gonoacantha nao apresentou diferencas entre os tratamentos ar filtrado (AF) e ar filtrado enriquecido com ozonio (AF+O3) e entre as situacoes (isolada e combinada). Ja C.floribundus apresentou diferencas entre os tratamentos dos potenciais redox AA/DHA e GHS/GSSH na situacao combinada, mesmo assim a dose de ozonio aplicada nao foi capaz de promever danos oxidativos graves. No entanto, as defesas indiretas apresentaram emissao e inibicao de alguns compostos na presenca de ozonio. C.floribundus, em situacao isolada induziu os compostos Hexanal e 1-Hexanol,2-etil, ¿À-Felandreno, Cariofileno, cis-¿À-Farneseno, ¿¿-Muuroleno e (-) Spatulenol, enquanto que na situacao combinada apenas os compostos 3-Hexanal,1 ol (z) e o MeSa foram induzidos, os demais compostos foram inibidos na presenca do ozonio. Ja P.gonoacantha apresentou uma emissao maior de compostos na situacao isolada do que na combinada. Na situacao combinada houve majoritariamente a inducao de um sesqueterpeno nao identificado e do ¿À-Ocimeno. Esses compostos foram considerados como marcadores da coexistencia entre esssas duas especies. / Plants have mechanisms of defenses that are classified as direct and indirect, activating several response pathways. Direct defenses are constitutively present in plants and may be related to the antioxidant system that has components such as oxidized glutathione (GSSG), reduced glutathione (GSH) and ascorbic acid (AA) and dehydroascorbic acid (DHA), acting in the pro-antioxidant balance, minimizing damages in the cellular system. Indirect defenses are related to ecological interactions and are attributed to volatile organic compounds (VOCs) that can be against the attack of herbivores and pathogens mediater in the trophic interactions. Activation of defenses occurs when plants are exposed to the stressor agent. Among several agents, ozone stands out because it is a phytotoxic pollutant that promotes oxidative stress and cellular damage. In this sense, the present work has the objective of verifying that the ozone is capable of altering the direct and indirect chemical defenses of individuals of Croton floribundus and Pipitadenia gonoacantha studied in an isolated and combined situation. Experiments were carried out under controlled conditions and plants were exposed to 100 ppb of ozone in an isolated and combined situation. Exposures occurred for 7 days for 5 hours. The levels of the antioxidants ascorbic acid and glutathione were determined by UV-vis spectroscopy. The values of the DHA/AA and GSH / GSSGpairs were compared with the redox potential of each pair, obtained for the reduced / oxidized forms by the Nernst equation. The VOCs were quantified by gas chromatography coupled to mass spectroscopy. The results showed that the P.gonoacantha species did not indicate any differences between the treatments (AF) and filtered air enriched with ozone (AF + O3) and between situations (isolated and combined). C.floribundus presented differences between treatments of redox DHA/AA and GSH / GSSG potentials in the combined situation, even though the dose of ozone applied was not able to promise serious oxidative damages. However, the indirect defenses showed emission and inhibition of some compounds in the presence of ozone. C.floribundus, in the isolated situation induced the compounds Hexanal and 1-Hexanol, 2-ethyl, â-Felandren, Cariophilene, cis-â-Farnesene, á-Muurolene and (-) Spatulenol, whereas in the combined situation only compounds 3 -Hexanal, 1 ol (z) and MeSa were induced, the other compounds were inhibited in the presence of ozone. Already P.gonoacantha presented a greater emission of compounds in the isolated situation than in the combined one. In the combined situation, there was mainly the induction of an unidentified sesqueterpene and â-Ocimene. These compounds were considered as markers of coexistence between these two species.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Calotropis procera à uma planta laticÃfera, pertencente à famÃlia Apocynaceae. ProteÃnas de defesa foram descritas no lÃtex com atividade contra insetos fitÃfagos e fungos fitopatogÃnicos. A fraÃÃo proteica do lÃtex tambÃm apresenta atividades farmacolÃgicas, dentre tais efeito citotÃxico seletivo em cÃlulas carcinogÃnicas. A partir da fraÃÃo proteica efetiva sobre cÃlulas neoplÃsicas, o trabalho teve por meta central identificar proteÃna(s) citotÃxica(s) e proceder a sua caracterizaÃÃo bioquÃmica, biolÃgica e suas perspectivas biotecnolÃgicas. As proteÃnas solÃveis do lÃtex (PL) foram fracionadas em matriz de troca iÃnica e a fraÃÃo proteica detentora da citotoxicidade foi refracionada em outra matriz de troca iÃnica (Mono-Q) acoplada a sistema de mÃdia pressÃo. P4 foi identificado como a fraÃÃo citotÃxica, apresentando uma IC50 de 2,2, 1,2 e 2,9 Âg/mL para as linhagens celulares HCT-116, Ovcar-8 e SF-295, respectivamente. A anÃlise proteÃmica da fraÃÃo citotÃxica por eletroforese bidimensional permitiu identificar 15 spots, contendo proteÃnas Ãcidas (pI entre 4 e 6) e com massa molecular aparente de 30 kDa. Quando avaliados por espectrometria de massas todos esses spots foram identificados como quitinases e apresentaram massa intacta de 27,4 kDa. A amostra reagiu positivamente ao reagente de Schiff, sugerindo glicosilaÃÃes. O teor de carboidratos foi estimado em 12,8%. A sequÃncia amino terminal obtida (1QPVMNLEYPRYLNDINDYRDDNNYD28) revelou 50% de similaridade com quitinases de Solanum lycopersicum, Oryza sativa, Nicotiana tomentosiformes dentre outras. As enzimas apresentaram forte atividade quitinolÃtica, com pH Ãtimo variando entre 5-6 e temperatura Ãtima de 25 ÂC. A atividade quitinolÃtica foi reduzida quando tratada com concentraÃÃes crescentes de DTT (3, 10 e 30 mM) o que sugere a presenÃa de pontes dissulfeto estabilizadoras da enzima. AnÃlises por dicroÃsmo circular indicam a presenÃa majoritÃria de alfa-hÃlices na estrutura e que as isoformas se mostraram pouco resistentes a variaÃÃes de temperatura e pH. Imagens de alta resoluÃÃo geradas por microscopia de forÃa atÃmica sugeriram homogeneidade na amostra e um arranjo hexamÃrico foi evidenciado. As quitinases nÃo inibiram o crescimento micelial dos fungos fitopatogÃnicos Fusarium oxysporum e Colletotrichum gloeosporioides, mas reduziram a germinaÃÃo de esporos de C. gloeosporioides. Em consonÃncia as quitinases nÃo induziram estresse oxidativo nos esporos, mas causaram leves alteraÃÃes na permeabilidade membranar dos esporos avaliados. As quitinases laticÃferas (0,1 % m/m) apresentaram forte efeito deletÃrio sobre o inseto fitÃfago Callosobruchus maculatus. Os efeitos produziram 57% de reduÃÃo na sobrevivÃncia larval, reduÃÃo do peso de larvas (7,8 mg  0,2 /4,0  0,8) e emergÃncia de insetos adultos (50%), alÃm de prolongar de 28 para 33 dias o tempo mÃdio de desenvolvimento de insetos adultos. As quitinases (2 mg/Kg, e.v.) apresentaram forte atividade anti-inflamatÃria, reduzindo em 95% a infiltraÃÃo de neutrÃfilos na cavidade peritoneal em ensaio de inflamaÃÃo induzido por carragenina em camundongos. Este efeito foi revertido por L-NAME e Aminoguanidina, dois inibidores da enzima Ãxido nÃtrico sintase, indicando o possÃvel envolvimento do Ãxido nÃtrico no efeito observado. Esta aÃÃo foi associada à reduÃÃo dos nÃveis das citocinas prÃ-inflamatÃrias TNF-α e IL-1 na cavidade peritoneal e do aumento dos nÃveis sÃricos das citocinas prÃ-inflamatÃrias TNF-α, IL-6 e IL-1. à concluÃdo que vÃrias isoformas de quitinases coexistem no lÃtex de C. procera. Estas proteÃnas atuam possivelmente na defesa contra insetos, mas tÃm pouca aÃÃo contra fungos. As quitinases laticÃferas foram identificadas como as proteÃnas citotÃxicas do lÃtex sobre cÃlulas neoplÃsicas e ainda foram capazes de modular os nÃveis de citocinas prÃ-inflamatÃrias e sÃntese de Ãxido nÃtrico em modelo de inflamaÃÃo aguda. As quitinases do lÃtex de C. procera representam interessantes molÃculas para prospecÃÃo biotecnolÃgica em defesa vegetal e farmacologia. / Calotropis procera is a latificer plant in the Apocynaceae family. Defensive proteins with activity against phytophagous insects and phytopathogenic fungi in latex have been described. Latexâs proteic fraction also performs pharmacological activities, such as selective cytotoxic effect in carcinogenic cells. From the proteic fraction effective against neoplastic cells, this work had the goal to identify and further characterize cytotoxic protein(s) biochemically, biologically, and evaluate their biotechnological prospects. Soluble proteins in latex (LP) have been fractioned in ion-exchange matrix, and the fraction capable of cytotoxicity was further fractioned in another ion-exchange matrix (Mono-Q) coupled to a medium-pressure system. P4 was identified as cytotoxic fraction, showing an IC50 of 2.2, 1.2 and 2.9 mg/mL for the cell lines HCT-116, Ovcar-8 and SF-295, respectively. Proteomic analysis of the cytotoxic fraction by two-dimensional electrophoresis allowed 15 spots to be identified, comprising acid proteins (pI among 4 and 6) with 30 kDa apparent molecular weight. All spots were identified as chitinases when evaluated by mass spectrometry, and showed intact mass of 27.4 kDa. The sample reacted positively to the Schiff reagent, suggesting glycosilations. The carbohydrate content was estimated at 12.8%. The amino-terminal sequence obtained (1QPVMNLEYPRYLNDINDYRDDNNYD28) revealed 50% similarity with Solanum lycopersicum, Oryza sativa and Nicotiana tomentosiformes chitinases, among others. The enzymes showed strong chitinolytic activity, with optimal pH varying between 5-6 and optimal temperature of 25 ÂC. The chitinolytic activity was diminished when treated with increasing concentrations of DTT (3, 10 and 30 mM), which suggests the presence of disulfide bonds stabilizing the enzyme. Circular dichroism analyses indicate a larger presence of alpha helices in the structure and that the isoforms has low resistance to pH and temperature variation. High-resolution images generated through atomic force microscopy suggested sample homogeneity and a hexameric configuration. The chitinases did not inhibit mycelial growth of phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum and Colletotrichum gloeosporioides, however reduced the germination C. gloeosporioides spores. In consonancy the chitinases did not induce spore oxidative stress, but caused a slight change in membrane permeability of the evaluated spores. Laticifer chitinases (0.1% w/w) showed a strong deleterious effect on the phytophagous insect Callosobruchus maculatus. Effects produced a 57% survival reduction, larval weight reduction (7.8 mg  0.2 / 4.0  0.8), adult insets emergence reduction (50%), in addition to prolonging the mean maturation time from 28 to 33 days. The chitinases (2 mg/Kg, i.v.) showed a strong anti-inflammatory activity, reducing 95% of neutrophil infiltration into the peritoneal cavity in mouse in an inflammation induced by carrageenan assay. L-NAME and Aminoguanidine, two inhibitors of nitric oxide synthase, reversed this effect, possibly indicating involvement of nitric oxide in the effects observed. This action was associated to a reduction of pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-1 levels within the peritoneal cavity and increased serum levels of pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-6 and IL-1. The conclusion is reached that many isoforms of chitinases coexist in C. procera latex. These proteins act possibly in defense against insects, though low action against fungi is shown. Laticifer chitinases were identified as latex proteins cytotoxic on neoplastic cells and they have even been able to modulate pro-inflammatory cytokines levels and nitric oxide in an acute inflammation model. C. procera laticifer chitinases represent interesting molecules for biotechnology prospection in plant defense and pharmacology.

Orchids are characterized by producing minute endosperm-lacking seeds, which depend on mycorrhizal fungi for germination and embryo development. Some aclorophyllous orchids remain dependent on the mycorrhizal association for carbon acquisition during their whole life history, whereasother orchids develop photosynthesis. Despite the biological significance of orchid mycorrhiza, gene expression studies are lacking. We have used different highthroughput approaches in order to understanding the mechanisms regulating orchid mycorrhiza development and functioning. Firstly, we have used a 2D-LC-MS/MS approach coupled to isobaric tagging for relative and absolute quantification (iTRAQ) to identify proteins with differential accumulation in Oncidium sphacelatum at different stages of mycorrhizal protocorm development (achlorophyllous and green protocorms) after seed inoculation with a Ceratobasidium sp. isolate. Quantitative analysis showed that the expected changes in carbon metabolism in green protocorms were accompanied by enhanced accumulation of proteins involved in the modulation of reactive oxygen species homeostasis, defense related responses, phytoalexins and carotenoid biosynthesis, suggesting that orchid protocorms undergo profound metabolic changes during the switch from the fully mycoheterotrophic to the photosynthethic stage. Secondly, three different proteomic techniques were carried out in independent experiments aiming to identify changes in protein accumulation in mycorrhizal roots of the terrestrial orchid Oeceoclades maculata.Finally, O. maculatamycorrhizal roots were used for transcriptome analyses. The data revealed a strong increase in general stress responses, accompanied by changes in signaling pathways possibly related to fungal recognition and establishment of a compatible interaction. Some of the upregulated genes may be involved in the reorganization of cell structure, likely related to accommodation of the fungal symbiont in the plant roots. We have also observed in mycorrhizal roots up-regulation of genes involved in carbon metabolism, including glycolysis/gluconeogenesis and amino sugars metabolism, as well as genes involved innitrogen assimilation. The down-regulation of genes involved in the jasmonate and ABA transduction pathways, and key genes encoding anti-fungal proteins, such as chitinase and a mannose-specific binding lectin, strongly suggests an alleviation of plant defense responses in O. maculata mycorrhizal roots. In general, our data suggest that the physiology of an orchid mycorrhiza is more similar to a compatible interaction than to an arm-race between plant and fungi. Overall orchid mycorrhiza have proved to be a promising model for investigating plantfungal interactions and further studies should now address the specific roles of the genes showing differential regulation in this study. / As orquídeas são caracterizadas por produzirem sementes diminutas, que não possuem endosperma. Necessitam, portanto, da interação com fungos micorrízicos para germinação e desenvolvimento do embrião. Algumas orquídeas aclorofiladas se mantêm dependentes dos fungos micorrízicos para a aquisição de carbono, enquanto outras desenvolvem a maquinaria fotossintética. Apesar do significado biológico das micorrizas de orquídeas, alterações na expressão gênica e no acúmulo de proteínas foram altamente negligenciads nos últimos anos. Neste trabalho, foram utilizadas diferentes técnicas sequenciamento e identificação de genes e proteínas em larga-escala para acessar as alterações moleculares responsáveis pela regulação das micorrizas de orquídeas. Uma abordagem baseada em 2D-LC MS/MS acoplada a técnica de quantificação absoluta e relativa iTRAQ, foiutilizada para identificar proteínas com acúmulo diferencial em Oncidium sphacelatum em diferentes estágios do desenvolvimento do protocormo (protocormos aclorofilados versus protocormos fotossintetizantes), após inoculação com um fungo do gênero Ceratobasidium. As análises mostraram que, as alterações esperadas no metabolismo do carbono foram acompanhadas de um acúmulo aumentado de proteínas envolvidas na modulação de espécies reativas de oxigênio, respostas de defesa, biossíntese de fitoalexinas e carotenóides, sugerindo que os protocormos de orquídeas passam por profundas alterações metabolicas durante a transição do metabolismo micoheterotrófico para o fotossintético. Posteriormente foram utilizadas três diferentes técnicas de proteômica quantitativa para explorar alterações fisiológicas em raízes micorrizadas e não-micorrizadas de Oeceoclades maculata.Este estudo foi ampliado, pela utilização de uma abordagem transcritômica ao mesmo modelo biológico. Em conjunto, os dados revelaram um forte aumento em respostas relacionadas ao estresse, acompanhadas de alterações em vias de transdução de sinal possivelmente relacionadas ao reconhecimento do simbionte fúngico e estabelecimento de uma interação compatível. Alguns genes com expressão aumentada devem estar envolvidos na reorganização celular, provavelmente ligada a acomodação do simbionte fúngico nas raízes das plantas. Também foi observado o aumento de genes envolvidos no metabolismo do carbono e de açúcares aminados, juntamente a genes relacionados a assimilação de nitrogênio em raízes micorrizadas. A expressão diminuída de genes envolvidas nas vias do jasmonato e ácido abscícico, juntamente a genes-chave que codificam para proteínas anti-fúngicas sugerem fortemente uma atenuação das respostas de defesa da planta em raízes micorrizadas de Oeceoclades maculata. No geral, parece que as micorrizas de orquídeas são fisiológicamente mais próximas de uma simbiose compatível do que de uma interação unilateral em favor da planta. Sobretudo, este sistema biológico provou ser promissor para investigação de interações planta-fungo e, próximas pesquisas devem agora ser focadas em funções específicas dos genes que mostraram regulação diferencial neste estudo.

Orchids are characterized by producing minute endosperm-lacking seeds, which depend on mycorrhizal fungi for germination and embryo development. Some aclorophyllous orchids remain dependent on the mycorrhizal association for carbon acquisition during their whole life history, whereasother orchids develop photosynthesis. Despite the biological significance of orchid mycorrhiza, gene expression studies are lacking. We have used different highthroughput approaches in order to understanding the mechanisms regulating orchid mycorrhiza development and functioning. Firstly, we have used a 2D-LC-MS/MS approach coupled to isobaric tagging for relative and absolute quantification (iTRAQ) to identify proteins with differential accumulation in Oncidium sphacelatum at different stages of mycorrhizal protocorm development (achlorophyllous and green protocorms) after seed inoculation with a Ceratobasidium sp. isolate. Quantitative analysis showed that the expected changes in carbon metabolism in green protocorms were accompanied by enhanced accumulation of proteins involved in the modulation of reactive oxygen species homeostasis, defense related responses, phytoalexins and carotenoid biosynthesis, suggesting that orchid protocorms undergo profound metabolic changes during the switch from the fully mycoheterotrophic to the photosynthethic stage. Secondly, three different proteomic techniques were carried out in independent experiments aiming to identify changes in protein accumulation in mycorrhizal roots of the terrestrial orchid Oeceoclades maculata.Finally, O. maculatamycorrhizal roots were used for transcriptome analyses. The data revealed a strong increase in general stress responses, accompanied by changes in signaling pathways possibly related to fungal recognition and establishment of a compatible interaction. Some of the upregulated genes may be involved in the reorganization of cell structure, likely related to accommodation of the fungal symbiont in the plant roots. We have also observed in mycorrhizal roots up-regulation of genes involved in carbon metabolism, including glycolysis/gluconeogenesis and amino sugars metabolism, as well as genes involved innitrogen assimilation. The down-regulation of genes involved in the jasmonate and ABA transduction pathways, and key genes encoding anti-fungal proteins, such as chitinase and a mannose-specific binding lectin, strongly suggests an alleviation of plant defense responses in O. maculata mycorrhizal roots. In general, our data suggest that the physiology of an orchid mycorrhiza is more similar to a compatible interaction than to an arm-race between plant and fungi. Overall orchid mycorrhiza have proved to be a promising model for investigating plantfungal interactions and further studies should now address the specific roles of the genes showing differential regulation in this study. / As orquídeas são caracterizadas por produzirem sementes diminutas, que não possuem endosperma. Necessitam, portanto, da interação com fungos micorrízicos para germinação e desenvolvimento do embrião. Algumas orquídeas aclorofiladas se mantêm dependentes dos fungos micorrízicos para a aquisição de carbono, enquanto outras desenvolvem a maquinaria fotossintética. Apesar do significado biológico das micorrizas de orquídeas, alterações na expressão gênica e no acúmulo de proteínas foram altamente negligenciads nos últimos anos. Neste trabalho, foram utilizadas diferentes técnicas sequenciamento e identificação de genes e proteínas em larga-escala para acessar as alterações moleculares responsáveis pela regulação das micorrizas de orquídeas. Uma abordagem baseada em 2D-LC MS/MS acoplada a técnica de quantificação absoluta e relativa iTRAQ, foiutilizada para identificar proteínas com acúmulo diferencial em Oncidium sphacelatum em diferentes estágios do desenvolvimento do protocormo (protocormos aclorofilados versus protocormos fotossintetizantes), após inoculação com um fungo do gênero Ceratobasidium. As análises mostraram que, as alterações esperadas no metabolismo do carbono foram acompanhadas de um acúmulo aumentado de proteínas envolvidas na modulação de espécies reativas de oxigênio, respostas de defesa, biossíntese de fitoalexinas e carotenóides, sugerindo que os protocormos de orquídeas passam por profundas alterações metabolicas durante a transição do metabolismo micoheterotrófico para o fotossintético. Posteriormente foram utilizadas três diferentes técnicas de proteômica quantitativa para explorar alterações fisiológicas em raízes micorrizadas e não-micorrizadas de Oeceoclades maculata.Este estudo foi ampliado, pela utilização de uma abordagem transcritômica ao mesmo modelo biológico. Em conjunto, os dados revelaram um forte aumento em respostas relacionadas ao estresse, acompanhadas de alterações em vias de transdução de sinal possivelmente relacionadas ao reconhecimento do simbionte fúngico e estabelecimento de uma interação compatível. Alguns genes com expressão aumentada devem estar envolvidos na reorganização celular, provavelmente ligada a acomodação do simbionte fúngico nas raízes das plantas. Também foi observado o aumento de genes envolvidos no metabolismo do carbono e de açúcares aminados, juntamente a genes relacionados a assimilação de nitrogênio em raízes micorrizadas. A expressão diminuída de genes envolvidas nas vias do jasmonato e ácido abscícico, juntamente a genes-chave que codificam para proteínas anti-fúngicas sugerem fortemente uma atenuação das respostas de defesa da planta em raízes micorrizadas de Oeceoclades maculata. No geral, parece que as micorrizas de orquídeas são fisiológicamente mais próximas de uma simbiose compatível do que de uma interação unilateral em favor da planta. Sobretudo, este sistema biológico provou ser promissor para investigação de interações planta-fungo e, próximas pesquisas devem agora ser focadas em funções específicas dos genes que mostraram regulação diferencial neste estudo.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O lÃtex vegetal à produzido e estocado em sistemas de canais formados por cÃlulas altamente especializadas, os laticÃferos. Uma caracterÃstica marcante destes fluidos à a presenÃa de sistemas proteolÃticos complexos. Muitos estudos relatam que proteÃnas de defesa contra insetos e fungos sÃo encontradas em lÃtex. No entanto, alguns insetos sobrepÃem esta defesa e alimentam-se de plantas laticÃferas, como Pseudosphinx tetrio e Danaus plexippus, ambas da ordem Lepidoptera. As bases bioquÃmicas da resistÃncia de insetos Ãs proteÃnas defensivas do lÃtex ainda nÃo sÃo amplamente elucidadas. Esta problemÃtica foi abordada neste trabalho. Inicialmente a atividade proteolÃtica do extrato intestinal de P. tetrio foi caracterizada e avaliada sua capacidade de degradar as proteÃnas do lÃtex de sua planta hospedeira, Plumeria rubra, bem como de plantas laticÃferas nÃo hospedeiras (Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora). AlÃm disso, foi avaliado se inibidores de proteases de fluidos laticÃferos (C. procera, P. rubra e Cr. grandiflora) inibem as proteases intestinais de P. tetrio e D. plexippus e vice-versa. Em adiÃÃo, foi analisado o efeito de enzimas laticÃferas sobre a membrana peritrÃfica (MP) de D. plexippus. As proteases intestinais de P. tetrio sÃo predominantemente do tipo serÃnica e suas atividades sÃo maiores em pHs bÃsicos. O extrato intestinal de P. tetrio rapidamente e completamente digeriu as proteÃnas do lÃtex de sua planta hospedeira e de C. procera, bem como digeriu parcialmente as proteÃnas do lÃtex de Cr. grandiflora. Larvas de D. plexippus se desenvolveram plenamente quando alimentadas com dieta artificial contendo 1% das fraÃÃes proteicas dos lÃtex de plantas nÃo hospedeiras. Ensaios in vitro indicaram que ambos, extratos intestinais e lÃtex das espÃcies em estudo, possuem inibidores de proteases serÃnicas e cisteÃnicas. Inibidores provenientes dos fluidos laticÃferos em estudo inibiram a atividade proteolÃtica dos extratos intestinais de ambas as larvas. Entretanto, anÃlise in vivo demonstrou que estes inibidores nÃo afetam o desenvolvimento de D. plexippus. Somente o extrato intestinal de D. plexippus apresentou atividade inibidora de proteases do lÃtex de sua planta hospedeira (Calotropis procera). Apenas discretas mudanÃas foram observadas no perfil proteico das MPs de D. plexippus submetidas Ãs fraÃÃes proteicas dos fluidos laticÃferos in vivo, enquanto que o tratamento in vitro resultou em danos mais acentuados. A partir dos resultados obtidos conclui-se que proteÃlise e a inibiÃÃo de proteÃlise fazem parte do sistema defensivo das larvas especialistas em plantas laticÃferas e de suas plantas hospedeiras. Embora inibidores de proteases de fluidos laticÃferos sejam capazes de inibir as proteases intestinais das larvas (in vitro), in vivo, a habilidade das proteases intestinais em prontamente digerir as proteÃnas do lÃtex parece ser crucial para a sobreposiÃÃo da defesa vegetal. / Plant latex is produced and stored in channels formed by highly specialized cells structures. A remarkable feature of these fluids is the presence of complex proteolytic systems. Many studies report that latex possesses a variety of defense proteins against insects and fungi. However, some insects overlap this defense and feed on latex-producing plants, for example Pseudosphinx tetrio and Danaus plexippus, both of the order Lepidoptera. The biochemical aspects of insect resistance to latex defense proteins are still not widely elucidated. This issue was addressed in this work. Initially, the proteolytic activity of Pseudosphinx tetrio gut was characterized and evaluated in its ability to degrade latex proteins of its host plant (Plumeria rubra) and non-host plants (Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora). Furthermore, we assessed whether protease inhibitors from latex fluids (C. procera, P. rubra and Cr. grandiflora) inhibit intestinal proteases from P. tetrio and D. plexippus and vice versa. The effect of latex enzymes on peritrophic membrane (PM) of D. plexippus was also assessed. Intestinal proteases from P. tetrio are predominantly of serine type and their activities are higher in basic pHs. P. tetrio gut proteases rapidly and completely digested latex proteins of its host plant and C. procera and partially digested proteins from Cr. grandiflora. D. plexippus larvae were not affected when fed on artificial diet containing latex proteins (1%) from non-host plants. In vitro assays detected serine and cysteine peptidase inhibitors in both gut homogenates and latex fluids. Protease inhibitors from latex inhibited the proteolytic activity of gut homogenates of both larvae. Nevertheless, in vivo analysis demonstrated that latex inhibitors do not affect the development of D. plexippus. Only the gut homogenate from D. plexippus showed inhibitory activity towards proteases latex from its host plant (Calotropis procera). Slight changes were observed in the protein profile of the PMs from D. plexippus subjected to latex protein fractions in vivo, whilst in vitro treatment resulted in more severe damage. This study concludes that proteolysis and inhibition of proteolysis are involved in the defensive systems of both caterpillars and their host plants. Even though latex peptidase inhibitors inhibit gut peptidases (in vitro), the ability of gut peptidases to promptly digest latex proteins (in vivo) regardless of their origin seems to be a pivotal event favoring caterpillars overcoming plant defense.

Com o propósito de contribuir para o esclarecimento dos mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos na resistência sistêmica adquirida (SAR) em plantas suscetíveis contra fitopatógenos, foram conduzidos estudos na interação Coffea arabica-Hemileia vastatrix. A indução de atividade de quitinases e b-1,3-glucanases e o envolvimento dessas enzimas na resistência sistêmica adquirida contra H. vastatrix foram avaliados em cafeeiro suscetível cultivar Mundo Novo (MN) após o tratamento com acibenzolar-S-metil (ASM) (200 mg de i.a./mL). O produto induziu aumento local e sistêmico das atividades de quitinases e b-1,3-glucanases nos tecidos foliares, a partir do primeiro e segundo dia da aplicação do indutor, respectivamente. As atividades enzimáticas atingiram níveis máximos de aumento nas plantas tratadas em relação ao controle, sete dias após a aplicação do ASM. Resistências local e sistêmica ao patógeno foram induzidas a partir do primeiro dia após o tratamento com ASM. A proteção e atividades enzimáticas foram detectadas até 35 dias, após aplicação do indutor. A indução de resistência local contra a ferrugem atingiu um nível máximo de 87% entre 7 e 14 dias. Níveis máximos de proteção sistêmica de 53 a 68% foram observados entre 2 e 21 dias após o tratamento de cafeeiro com o indutor. Neste intervalo de tempo foi observado, também, um aumento sistêmico máximo de atividade enzimática. Os resultados sugerem que o aumento de atividade dessas hidrolases está relacionado com a resistência local e sistêmica, induzida por ASM, em cafeeiro MN contra a ferrugem. Genes relacionados à SAR foram identificados em cafeeiro através de hibridização subtrativa por supressão (HSS), a partir de mRNAs isolados de plantas suscetíveis cv. MN, 72 h após o tratamento com ASM (200 mg i.a./mL). Os mecanismos de respostas de defesa associados à SAR ativada em MN foram comparados, através do isolamento de genes por HSS, com a resistência raça-cultivar específica observada no cafeeiro resistente Híbrido de Timor (HT), 72 h após a inoculação com H. vastatrix. Através da HSS, produziram-se duas bibliotecas de cDNAs subtraídas, enriquecidas de fragmentos de genes induzidos em MN pelo ASM (MN-ASM) ou ativados em HT pelo patógeno (HT-Hv). Os genes encontrados estão envolvidos em diversos processos relacionados à resistência contra fitopatógenos como: formação de espécies de oxigênio reativas, resposta de hipersensibilidade, morte celular programada, síntese e transporte de metabólitos antimicrobianos, percepção e transdução de sinal, síntese de proteínas relacionadas à patogênese, metabolismo de lipídeos e degradação controlada de proteínas. Foi identificado em HT-Hv um número maior de genes implicados em mecanismos de defesa (22%), do que em MN-ASM (16%). Na interação HT-Hv foi detectado um número maior de genes implicados na percepção e transdução de sinal (44%), do que em MN-ASM (30%). Entretanto, o número de genes codificadores de proteínas antimicrobianas foi maior no MN com resistência induzida (22%), do que no cafeeiro resistente HT inoculado com o patógeno (6%). Foram isolados de HT-Hv e MN-ASM, genes codificadores de b-1,3-glucanases e as seqüências completas puderam ser determinadas através da técnica RACE. Os resultados obtidos sugerem que a resistência em HT-Hv e MN-ASM ocorre através de mecanismos distintos. / Studies on the interaction Coffea arabica-Hemileia vastatrix were performed in order to contribute to the elucidation of biochemical and molecular mechanisms involved in systemic acquired resistance (SAR) developed in susceptible plants against pathogens. Induction of chitinase and b-1,3-glucanase activities and their involvement in systemic acquired resistance against H. vastatrix were evaluated in susceptible coffee plants cultivar "Mundo Novo" (MN) after treatment with acibenzolar-S-methyl (ASM) (200 mg a.i./mL). The product induced local and systemic increases in chitinase and b-1,3-glucanase activities in leaf tissues, starting from the first and second days after inducer application, respectively. The increases in enzymatic activity reached their maximum levels in treated plants compared to control seven days after application of ASM. Induction of local and systemic resistance against pathogen was detected one day after ASM treatment. Protection and increases in enzyme activities were detected up to 35 days after product application. Induction of local resistance against coffee leaf rust reached a highest level of 87% between 7 and 14 days. Highest levels of systemic protection ranging from 53% to 68% were observed in coffee plants between 2 and 21 days after inducer treatment. During the same time frame maximum increases in systemic enzymatic activity were also observed. Results suggest that the increases in these hydrolase activities were correlated with the local and systemic resistance induced by ASM in coffee plants against coffee leaf rust. Genes related to SAR were identified in coffee plants by suppression subtractive hybridization (SSH), from mRNA isolated from susceptible plants cv. MN 72 h after treatment with ASM (200 mg a.i./mL). The mechanisms of defense responses associated with SAR activated in MN were compared through the isolation of genes by SSH, with the race-specific resistance observed in the resistant coffee plant "Híbrido de Timor" (HT) 72 h after the inoculation with H. vastatrix. By SSH technique two subtracted cDNA libraries were constructed enriched for gene fragments induced in MN by ASM (MN-ASM) or activated in HT by pathogen infection (HT-Hv). The isolated genes were involved in different processes related to resistance against pathogens, such as: production of active oxygen species, hypersensitive response, programmed cell death, synthesis and transport of antimicrobial metabolites, signal perception and transduction, synthesis of pathogenesis-related proteins, lipid metabolism and selective degradation of proteins. It was identified in HT-Hv a higher number of defense-related genes (22 %) than in MN-ASM (16 %). The incompatible interaction HT-Hv showed a higher number of genes implicated in the signal perception and transduction (44 %) than MN-ASM (30 %). However, the number of genes encoding antimicrobial proteins was higher in the susceptible cultivar MN with induced resistance (22 %) than in the resistant coffee plant HT inoculated with the incompatible pathogen (6 %). Genes encoding b-1,3-glucanases were isolated from HT-Hv and MN-ASM and their complete sequences could be obtained by RACE procedure. Results suggest that distinct recognition events and defense pathways are involved in the expression of resistance in HT-Hv and MN-ASM.

O feijão-comum (Phaseolus vulgaris) é atacado por uma gama de patógenos que afetam a produtividade das lavouras e a qualidade dos grãos. Dentre os patógenos de importância econômica para a cultura no Brasil, destaca-se o nematoide das galhas (Meloidogyne incognita). Embora haja relatos sobre a avaliação de cultivares na presença de M. incognita, as fontes de resistência tem se mostrado pouco efetivas. Por isso, pesquisas que possibilitem um melhor entendimento sobre a interação planta-nematoide são de extrema valia e devem nortear novas estratégias para o melhoramento do feijoeiro. Assim, no presente estudo, 18 cultivares de P. vulgaris foram avaliadas quanto à resistência a M. incognita raça 3, sendo que quatro comportaram-se como pouco suscetíveis, 11 como moderadamente suscetíveis e três altamente suscetíveis. A cultivar IPR Saracura mostrou menor grau de suscetibilidade e foi, então, usada na construção de 12 bibliotecas de RNAseq, visando à identificação dos genes envolvidos na reposta à infecção pelo nematoide. Foram adotados dois tratamentos, 4 e 10 DAI (dias após inoculação), compostos de plantas inoculadas e controles. Primeiramente, realizou-se o mapeamento dos transcritos de cada biblioteca, tomando como referência o genoma de P. vulgaris (G19833), o que resultou na identificação de 27.195 unigenes. Em seguida, foi realizada a quantificação da expressão dos transcritos mapeados e genes diferencialmente expressos foram identificados. No total, 191 genes do hospedeiro apresentaram expressão diferencial, considerando-se: i) o tratamento inoculado em relação ao controle; ii) a razão de expressão (Fold Change - FC) mínima absoluta igual a 4; iii) o nível de significância ? = 0,05. Do total, 120 genes foram identificados aos 4 DAI e 71 aos 10 DAI. As sequências mapeadas foram contrastadas àquelas dos bancos de dados NCBI e TAIR, usando a ferramenta BLASTx e, posteriormente, anotadas usando os softwares Blast2GO e MapMan. Detectou-se similaridade com genes codificadores de proteínas conhecidas para 90% (24.604/27.195) dos unigenes, sendo que 69% (16.991/24.604) deles foram anotados. Quanto à expressão diferencial, 98% (188/191) dos transcritos mostraram similaridade com proteínas conhecidas e 67% (127/188) puderam ser anotados. Os transcritos foram atribuídos a diferentes categorias funcionais putativas, predominando o termo ontológico \'processos metabólicos\', em ambas as plataformas. A anotação dos genes na plataforma MapMan mostrou abundância das categorias da via de resposta a estresse, com predominância de genes de defesa superexpressos aos 4 DAI e reprimidos aos 10 DAI. Por fim, 10 genes mostraram expressão diferencial tanto aos 4 como aos 10 DAI: sete deles foram estáveis, sendo superexpressos nas plantas inoculadas, e três apresentaram comportamentos opostos nos momentos avaliados. Ênfase foi dada a um gene que codifica uma \'probable inactive ADP-ribosyltransferase\' e a quatro genes de resposta a ferimento. / The common bean (Phaseolus vulgaris) is attacked by a range of pathogens, which affect crop yield and the quality of grains. Among the pathogens of economic significance to the crop in Brazil, the root-knot nematodes (Meloidogyne incognita) deserve attention. Though there are some reports on cultivar evaluation in presence of M. incognita, the resistance sources have not being effective. Therefore, it is of valuable importance research projects that could lead to a better understanding of plant-nematode interaction and to indicate new strategies for common bean breeding. In the present study, 18 cultivars of P. vulgaris were evaluated in regard to their resistance to M. incognita race 3; four were less susceptible, 11 moderately susceptible, and three were highly susceptible. \'IPR Saracura\' behaved as the less susceptible cultivar and then was selected for the construction of 12 RNAseq libraries, aiming at the identification of genes differentially expressed in response to nematode infection. Two treatments were adopted, 4 and 10 days after inoculation (DAI), each comprised of inoculated and control plants. Firstly, the transcripts were mapped to the reference genome of P. vulgaris (G19833), resulting in the identification of 27,195 unigenes. Then, the mapped transcript\'s expression was quantified and differentially expressed genes were identified. In total, 191 genes of the host plant showed differential expression taking into consideration: i) the inoculated treatments in relation to their control; ii) an absolute fold change (FC) >= 4; iii) a level of significance ? = 0,05. Of the total, 120 genes were detected at 4 DAI and 71 at 10 DAI. The mapped sequences were compared against those deposited in NCBI and TAIR databanks using BLASTx and subsequently annotated using Blast2GO and MapMan softwares. Similarity to known proteins was detected for 90% of the unigenes (24,604/27,195) and 69% (16,991/24,604) of them were annotated. Regarding assessing differential expression, 98% (188/191) of the transcripts showed similarity to known proteins and 67% (127/188) were annotated. Transcripts were attributed to different putative functional categories and the ontological term \'metabolic process\' was predominant within both platforms. Gene annotation within MapMan platform showed predominance of stress-related pathway categories, with prevalence of defense genes overexpressed at 4 DAI and repressed at 10 DAI. Finally, 10 genes showed differential expression at both 4 and 10 DAI: seven were stably overexpressed in the inoculated plants, and three showed an opposite behavior regarding the evaluation periods. Attention was given to a gene encoding a probable inactive ADP-ribosyltransferase and four genes related to wound response.

As plantas apresentam diferentes e complexos mecanismos de defesa, que atuam em conjunto, em respostas a estresses bióticos e abióticos, cuja natureza e intensidade de resposta variam com a idade, o grau de adaptação e a fenologia (OLIVEIRA, 2003). O objetivo principal da pesquisa consiste em: (i) identificar os ácidos clorogênicos nas folhas de Coffea arabica L., cultivar Obatã IAC 1669-20, Catuaí Vermelho IAC 99, e das populações em seleção H14945-46 e H20049, e (ii) quantificar as várias classes de ácidos clorogênicos, nos mesmos genótipos, durante a fase reprodutiva do cafeeiro (florescimento, frutochumbinho, expansão/granação e maturação). Os compostos fenólicos foram separados por meio da cromatografia líquida de alta eficiência (Shimadzu, modelo LC-20A) para as análises em CLAE-DAD. O perfil cromatográfico dos genótipos estudados não diferiram entre si. Durante as fases de frutificação houve variação nos teores de ácido clorogênico e dos fenóis totais, no qual apresentou menores valores na fase de granação. O genótipo H14954-46 resistente ao bicho-mineiro apresentou o ácido clorogênico referente ao pico 5, incomum aos outros genótipos estudados. As folhas infestadas por bichomineiro (Leucoptera coffeella) apresentaram menores concentrações de fenóis totais, bem como de alguns ácidos clorogênicos e flavanóides, já as folhas inoculadas por ferrugem (Hemileia vastatrix) apresentaram maiores concentração. Há evidências de que os ácidos clorogênicos participem do complexo mecanismo de defesa das plantas. / The plants present different and complex mechanisms of defense, that work together, in responses to biotic and abiotic stresses, whose nature and intensity of response varies with age, the degree of adaptation and phenology. The main objective from the research is: (i) detect the chlorogenic acids in the leaves of Coffea arabica L., cultivars Obatã IAC 1669-20 and Catuaí Vermelho IAC 99, and of the populations into selection H14945-46 and H20049, and (ii) quantify the several classes of chlorogenic acids, in the same coffee plants, during the fructification phases of the coffee tree (flowering, fruits at the beginning of growth , grain expansion/seed, grain maturation). The phenolic compounds have been apart through high performance liquid chromatography (Shimadzu , model LC -20A) for the analyses in CLAE DAD. The studied chromatography profile of the coffee plants has presented no difference between them. During the fructification phases there was variation at the content of chlorogenic acid and of the total phenols, in which has presented under age values at the phase as of grain expansion. The plants of H14954-46 resistant to the coffee leaf miner have presented the chlorogenic acid referring to pico 5, no common to the other coffee plants studied. The infested leaves by coffee leaf miner (Leucoptera coffeella) presented lower concentrations of total phenols, as well as, of some chlorogenic acids and flavanoids, unlike, the leaves inoculate by rust (Hemileia vastatrix) presented greater concentration. There is evidence that chlorogenic acids have involved in the complex defense mechanism of plants.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O Brasil à o segundo maior produtor mundial de soja, destacando-se por sua multiplicidade de uso. Entretanto, perdas na produtividade de seus grÃos em campo sÃo ainda considerÃveis, particularmente oriundas das doenÃas causadas por fungos. Diante desse obstÃculo, emerge a necessidade de busca de molÃculas naturais capazes de inibir o progresso dessas doenÃas, sem causar impactos ambientais. Dentre as molÃculas presentes na soja, com potencial de uso para essa finalidade, destaca-se a toxina da soja (SBTX), uma proteÃna isolada de sementes, composta por duas subunidades (17 e 27 kDa) e ativa contra fungos fitopatogÃnicos. Esse trabalho teve como objetivos verificar a localizaÃÃo tecidual da SBTX em cotilÃdones de sementes maduras, bem como avaliar seu perfil de expressÃo gÃnica ao longo do desenvolvimento da soja e, tambÃm, em resposta ao tratamento com elicitores de defesa vegetal. Sementes de soja foram cultivadas em casa de vegetaÃÃo e, ao longo do desenvolvimento da planta, diferentes tecidos vegetais coletados. Em adiÃÃo, folhas primÃrias da soja foram tratadas com Ãcido salicÃlico (AS) ou inoculadas com esporos do fungo Cercospora kikuchii (CK) e coletadas em diferentes tempos apÃs os tratamentos. Iniciadores foram desenhados com base nas sequÃncias NH2-terminal das subunidades de SBTX e a expressÃo gÃnica foi avaliada pela tÃcnica de RT-PCR quantitativa. A localizaÃÃo de SBTX em sementes foi avaliada por imunohistoquÃmica, usando anti-SBTX. Transcritos dos genes SBTX17 e SBTX27 foram detectados em todos os tecidos vegetais coletados, porÃm seus nÃveis de expressÃo foram diferenciados. NÃveis mais elevados de transcritos para ambas as subunidades da SBTX foram detectados em sementes maduras, cotilÃdones e folhas unifoliadas. Nos cotilÃdones, SBTX foi encontrada na epiderme. InduÃÃo da expressÃo de transcritos da SBTX ocorreu em ambos os tratamentos, porÃm essa resposta se manifestou mais rÃpida (a partir de 6 h) com CK ao invÃs de AS (a partir de 12 h). Praticamente, em todas as anÃlises, transcritos do gene SBTX27 prevaleceram em relaÃÃo Ãqueles do SBTX17. A presenÃa constitutiva e ubÃqua de transcritos dos genes da SBTX ao longo do desenvolvimento da planta, a induÃÃo da expressÃo desses genes por elicitores de resposta de defesa e a localizaÃÃo da toxina na superfÃcie dos cotilÃdones validam o papel de defesa atribuÃdo a SBTX, suscitando a possibilidade de uso dessa proteÃna na produÃÃo de soja resistente ao ataque de fungos de relevÃncia agronÃmica. / Brazil is the second major global soybean producer, whose magnitude is due to its use multiples. However, losses in productivity of soybean grains in the field are still significant, especially those caused by pathogenic fungi. In view of this obstacle, it is important to search natural molecules able to inhibiting the progress of fungal diseases in an environmental friendly practice. Among the soybean molecules which could be used for this purpose, the soybean toxin (SBTX) stands out. SBTX is a protein composed of two subunits (17 and 27 kDa) isolated from seeds with in vitro activity against phytopathogenic fungi. The present study aimed to verify the SBTX tissue localization in soybean seed cotyledons, as well as to evaluate the gene expression profile of two SBTX subunits, both in different stages of plant development and in response to treatment with plant defense elicitors. Soybean seeds were grown in a greenhouse and plant tissues harvested at different days. In addition, soybean primary leaves were treated with salicylic acid (SA) or inoculated with the Cercospora kikuchiii (CK) spores and harvested at different times after the treatments. Based on the N-terminal sequences of the SBTX subunits, primers were designed and their gene expression evaluated by quantitative real-time PCR technique. SBTX tissue localization was performed by immunohistochemistry using anti-SBTX. Transcripts for both SBTX subunits were detected in all plant tissues, predominantly in cotyledons and unifoliate leaves in the early stages of their development, as well as in mature seeds. SBTX was found in the epidermis of the cotyledons. Transcripts were detected for both genes SBTX17 e SBTX27 in all tissues collected, but their expression levels were different. The highest transcript levels for both SBTX subunits were found in mature seeds, cotyledons and unifoliate leaves. In cotyledons, SBTX was found in the epidermis. Leaves treated with elicitors showed induction of the corresponding 17 and 27 kDa subunit transcripts, however this response was earlier in the CK treatment (from 6 h) compared to AS treatment (from 12 h). In almost all analyses, the highest transcript levels were found for the 27 kDa subunit. The ubiquitous and constitutive gene expression during plant development, the induction of gene expression by defense response elicitors and the localization on the surface of cotyledons support the role of SBTX in plant defense and its use to produce fungal-resistant transgenic soybean plants.

Com o propósito de contribuir para o esclarecimento dos mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos na resistência sistêmica adquirida (SAR) em plantas suscetíveis contra fitopatógenos, foram conduzidos estudos na interação Coffea arabica-Hemileia vastatrix. A indução de atividade de quitinases e b-1,3-glucanases e o envolvimento dessas enzimas na resistência sistêmica adquirida contra H. vastatrix foram avaliados em cafeeiro suscetível cultivar Mundo Novo (MN) após o tratamento com acibenzolar-S-metil (ASM) (200 mg de i.a./mL). O produto induziu aumento local e sistêmico das atividades de quitinases e b-1,3-glucanases nos tecidos foliares, a partir do primeiro e segundo dia da aplicação do indutor, respectivamente. As atividades enzimáticas atingiram níveis máximos de aumento nas plantas tratadas em relação ao controle, sete dias após a aplicação do ASM. Resistências local e sistêmica ao patógeno foram induzidas a partir do primeiro dia após o tratamento com ASM. A proteção e atividades enzimáticas foram detectadas até 35 dias, após aplicação do indutor. A indução de resistência local contra a ferrugem atingiu um nível máximo de 87% entre 7 e 14 dias. Níveis máximos de proteção sistêmica de 53 a 68% foram observados entre 2 e 21 dias após o tratamento de cafeeiro com o indutor. Neste intervalo de tempo foi observado, também, um aumento sistêmico máximo de atividade enzimática. Os resultados sugerem que o aumento de atividade dessas hidrolases está relacionado com a resistência local e sistêmica, induzida por ASM, em cafeeiro MN contra a ferrugem. Genes relacionados à SAR foram identificados em cafeeiro através de hibridização subtrativa por supressão (HSS), a partir de mRNAs isolados de plantas suscetíveis cv. MN, 72 h após o tratamento com ASM (200 mg i.a./mL). Os mecanismos de respostas de defesa associados à SAR ativada em MN foram comparados, através do isolamento de genes por HSS, com a resistência raça-cultivar específica observada no cafeeiro resistente Híbrido de Timor (HT), 72 h após a inoculação com H. vastatrix. Através da HSS, produziram-se duas bibliotecas de cDNAs subtraídas, enriquecidas de fragmentos de genes induzidos em MN pelo ASM (MN-ASM) ou ativados em HT pelo patógeno (HT-Hv). Os genes encontrados estão envolvidos em diversos processos relacionados à resistência contra fitopatógenos como: formação de espécies de oxigênio reativas, resposta de hipersensibilidade, morte celular programada, síntese e transporte de metabólitos antimicrobianos, percepção e transdução de sinal, síntese de proteínas relacionadas à patogênese, metabolismo de lipídeos e degradação controlada de proteínas. Foi identificado em HT-Hv um número maior de genes implicados em mecanismos de defesa (22%), do que em MN-ASM (16%). Na interação HT-Hv foi detectado um número maior de genes implicados na percepção e transdução de sinal (44%), do que em MN-ASM (30%). Entretanto, o número de genes codificadores de proteínas antimicrobianas foi maior no MN com resistência induzida (22%), do que no cafeeiro resistente HT inoculado com o patógeno (6%). Foram isolados de HT-Hv e MN-ASM, genes codificadores de b-1,3-glucanases e as seqüências completas puderam ser determinadas através da técnica RACE. Os resultados obtidos sugerem que a resistência em HT-Hv e MN-ASM ocorre através de mecanismos distintos. / Studies on the interaction Coffea arabica-Hemileia vastatrix were performed in order to contribute to the elucidation of biochemical and molecular mechanisms involved in systemic acquired resistance (SAR) developed in susceptible plants against pathogens. Induction of chitinase and b-1,3-glucanase activities and their involvement in systemic acquired resistance against H. vastatrix were evaluated in susceptible coffee plants cultivar "Mundo Novo" (MN) after treatment with acibenzolar-S-methyl (ASM) (200 mg a.i./mL). The product induced local and systemic increases in chitinase and b-1,3-glucanase activities in leaf tissues, starting from the first and second days after inducer application, respectively. The increases in enzymatic activity reached their maximum levels in treated plants compared to control seven days after application of ASM. Induction of local and systemic resistance against pathogen was detected one day after ASM treatment. Protection and increases in enzyme activities were detected up to 35 days after product application. Induction of local resistance against coffee leaf rust reached a highest level of 87% between 7 and 14 days. Highest levels of systemic protection ranging from 53% to 68% were observed in coffee plants between 2 and 21 days after inducer treatment. During the same time frame maximum increases in systemic enzymatic activity were also observed. Results suggest that the increases in these hydrolase activities were correlated with the local and systemic resistance induced by ASM in coffee plants against coffee leaf rust. Genes related to SAR were identified in coffee plants by suppression subtractive hybridization (SSH), from mRNA isolated from susceptible plants cv. MN 72 h after treatment with ASM (200 mg a.i./mL). The mechanisms of defense responses associated with SAR activated in MN were compared through the isolation of genes by SSH, with the race-specific resistance observed in the resistant coffee plant "Híbrido de Timor" (HT) 72 h after the inoculation with H. vastatrix. By SSH technique two subtracted cDNA libraries were constructed enriched for gene fragments induced in MN by ASM (MN-ASM) or activated in HT by pathogen infection (HT-Hv). The isolated genes were involved in different processes related to resistance against pathogens, such as: production of active oxygen species, hypersensitive response, programmed cell death, synthesis and transport of antimicrobial metabolites, signal perception and transduction, synthesis of pathogenesis-related proteins, lipid metabolism and selective degradation of proteins. It was identified in HT-Hv a higher number of defense-related genes (22 %) than in MN-ASM (16 %). The incompatible interaction HT-Hv showed a higher number of genes implicated in the signal perception and transduction (44 %) than MN-ASM (30 %). However, the number of genes encoding antimicrobial proteins was higher in the susceptible cultivar MN with induced resistance (22 %) than in the resistant coffee plant HT inoculated with the incompatible pathogen (6 %). Genes encoding b-1,3-glucanases were isolated from HT-Hv and MN-ASM and their complete sequences could be obtained by RACE procedure. Results suggest that distinct recognition events and defense pathways are involved in the expression of resistance in HT-Hv and MN-ASM.