Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000443581-Texto+Parcial-0.pdf: 2098354 bytes, checksum: 0b5ec85f1b50d0c42f83f9793d9e1af5 (MD5) Previous issue date: 2012 / Lateral amyotrophic sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disease characterized by the selective loss of both lower and upper motoneurons in the spinal cord, brain stem and motor cortex. Loss of motoneurons leads to progressive paralysis, and death in 2 to 5 years. Treatment is based on symptomatic measures and pharmacological therapy available is not curative. Thus, it is of great importance to develop new therapeutic strategies to manage this disease. Alternatively, stem cells to replace could be used to replace degenerating neurons or to stop/delay neuronal death. The aim of this study was to verify if bone marrow mononuclear cells (BMMC) have therapeutic potential in transgenic mice superexpressing SOD1G93A. These animals’ phenotypic and physiopathological characteristics mimic those of ALS. Seventy-day-old or 110-day-old mice were administered with 107 BMMC in the tail vein. BMMC were obtained from C57BL/6-EGFP or SOD1G93A donors. Control animals received saline. In order to determine disease onset and progression, animals were evaluated in the Rotarod test, by electromyography and had their body weight measured. Survival was also evaluated. Tissue samples were collected for PCR analysis of cell migration. Additional groups of animals were euthanized at 120-days-old for histological analysis and the alkaline comet assay. Our results indicate that EGFPBMMC transplantation in 70-day-old mice (pre-symptomatic) mice prolong survival, preserve motor function and preserve motoneurons in the ventral horn of the spinal cord. However, for mSOD1BMMC the observed effect is intermediary. Furthermore, in 110-day-old (symptomatic) mice, only EGFPBMMC prolonged survival. This effect was more discrete than the one observed for pre-symptomatic-treated animals. Finally, systemically administered BMMC migrate into the spinal cord where fragments of their DNA were identified by PCR. There were no differences between the experimental groups in the electromyographical evaluation or DNA integrity measured by the alkaline comet assay. Our results suggest that BMMC have therapeutic potential in ALS since we observed improved motor performance and prolonged survival in animals that received the transplant. Nonetheless, outcomes were better when intervention was early and the transplanted cells did not express the mutated SOD1. Thus, our data represent a step forward in making cell-based therapy available for ALS patients. However, questions associated to the time of intervention and the source of the cells should be carefully addressed. / A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa caracterizada por uma perda seletiva de neurônios motores na medula espinhal, tronco encefálico e córtex motor. A perda de motoneurônios dá início a uma paralisia progressiva, levando o paciente a óbito em 2 a 5 anos. O tratamento se baseia principalmente em medidas sintomáticas e a terapia farmacológica existente não é curativa. Assim, é de máxima importância o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Como alternativa, existe a perspectiva do uso de células-tronco para substituir neurônios em degeneração, ou impedir/retardar o processo de morte neuronal. O objetivo deste estudo foi verificar se as células mononucleares da medula óssea (CMMO) apresentam potencial terapêutico em camundongos transgênicos que superexpressam SOD1G93A. Estes animais apresentam características fisiopatológicas e fenotípicas que se assemelham à ELA. Aos 70 dias (pré-sintomático) ou 110 dias (sintomático) de vida os animais receberam 107 CMMO pela veia da cauda. Camundongos C57BL/6-EGFP ou SOD1G93A foram utilizados como doadores. Animais controle receberam solução salina. Para determinar a idade em que os animais passam a apresentar sintomas da doença e diferenças na progressão, foram utilizados o teste motor do Rotarod, eletroneuromiografia e o peso corporal dos animais. A sobrevida dos animais também foi analisada. Após a eutanásia foram coletadas amostras para avaliação da migração celular por PCR. Grupos adicionais de animais foram tratados conforme previamente descrito e eutanasiados aos 120 dias de vida para avaliação histológica e ensaio do cometa alcalino. Nossos resultados indicam que o transplante intravenoso de EGFPCMMO aumenta a sobrevida de animais tratados aos 70 ou aos 110 dias de vida. Quando a intervenção é feita no período pré-sintomático, o aumento da sobrevida é acompanhado de preservação da função motora e de motoneurônios do corno ventral da medula espinhal. Entretanto, quando as células transplantadas são mSOD1CMMO, o efeito observado nos mesmos parâmetros é apenas intermediário. Além disso, quando o transplante ocorre no período sintomático, somente as EGFPCMMO promovem aumento na sobrevida, embora discreto. A perda de função motora e a progressão não se modificam. Finalmente, embora as células tenham sido administradas sistemicamente, migram para a medula espinhal, onde foram identificados fragmentos de seu DNA.Não foram identificadas diferenças entre os grupos na avaliação por eletroneuromiografia, nem da integridade de do DNA avaliada pelo ensaio do cometa alcalino. Nossos resultados até o momento sugerem que a fração mononuclear da medula óssea tem potencial terapêutico no tratamento da ELA, uma vez que verificamos melhora de desempenho motor e aumento de sobrevida em animais submetidos ao transplante. Apesar disso, os desfechos são mais favoráveis quando o tratamento é precoce e as células não expressam a mutação da SOD1 desencadeadora da ELA. Assim, nossos dados representam avanço na disponibilização do tratamento com células-tronco para pacientes com ELA, mas questões relacionadas ao período de intervenção e fonte das células devem ser cuidadosamente avaliadas.

A neuroproteção é um dos tópicos mais relevantes aplicados à neurociência. As junções comunicantes (JC), formadas pelas conexinas (Cx) estão envolvidas na neurodegeneração após lesão. Estudos com animais KO apresentam resultados contraditórios sobre papel das JCs. O objetivo deste trabalho foi analisar o papel das Cxs a partir do trauma mecânico na retina, modelo que permite a visualização do foco, penumbra, e áreas adjacentes à lesão. Observamos regulação distinta das Cx36 e Cx43 durante a neurodegeneração. A Cx36 não se alterou e a Cx43 apresentou desorganização e aumento da imunorreatividade após 7 dias, concomitantemente com GFAP. Células amácrinas apoptóticas encontram-se acopladas a células vizinhas por Cx36. O papel funcional das JCs foi avaliado, utilizando bloqueadores, para verificar a viabilidade/morte de células. Carbenoxolone (CBX), reduziu o espalhamento da apoptose, após 4h, enquanto a quinina, teve o mesmo efeito após 1h. A distribuição de núcleos apoptóticos confirmou que a utilização de bloqueadores de JCs reduz a propagação da apoptose. A quinina, mas não o CBX, diminuiu a expressão de caspases iniciais e efetoras. O controle da permeabilidade de canais de JCs pode participar de estratégias de neuroproteção. / The neuroprotection stands out as one of the most pursued hot topics in applied neurosciences. The gap junctions (GJ), formed by connexin (Cx) are involved in neurodegeneration injury. Studies using KO animal models endowed apparently contradictory results in relation to the role of coupling in neuroprotection. The aim of this study was to analyze the role of Cx-mediated communication in focal lesion induced by mechanical trauma in the retina, a model that alow the visualization of the focus, penumbra and adjacent areas. We observed distinct regulation of Cx36 and Cx43 during neurodegeneration. The Cx36 did not change during the lesion progression and Cx43 showed disorganized pattern and upregulated after 7 days, the same as GFAP. Apoptotic amacrine cells are coupled with health neighborhood cells by Cx36. The functional role of GJ was evaluated using blockers to verify the viability/cell death. Carbenoxolone (CBX) reduced the spread of apoptosis after 4h while quinine had the same effect after 1h. The distribution of apoptotic nuclei confirmed that the use of GJ blockers reduced the propagation of apoptosis. Quinine, but not CBX, decreases initial and effector caspases expression. The control of GJ channels permeability can participate in neuroprotection strategies.

A doença de Parkinson é a doença motora neurodegenerativa mais comum do mundo. Agregados proteicos contendo principalmente alfa-sinucleína é a principal marca da doença. Recentemente, tem sido demonstrado que defeitos na dinâmica mitocondrial e da autofagia são causados pelo acúmulo da proteína. No nosso estudo, foram utilizados neurônios derivados de SH-SY5Y ou de hiPSC de pacientes com a doença de Parkinson hereditária, além de leveduras para analisar a dinâmica mitocondrial e da autofagia e o envolvimento de proteínas desses processos na toxicidade da alfa- sinucleína. Foi observado a diminuição do tráfego mitocondrial em neurônios derivados das células SH-SY5Y que expressavam alfa-sinucleína A53T. Além disso a proteína mutante ainda levou ao aumento de espécies reativas de oxigênio, perturbação da autofagia e aumento da sinalização apoptótica. Os neurônios então foram tratados com NAP, um peptídeo neuroprotetor, que preveniu os efeitos tóxicos da alfa-sinucleína mutante. Leveduras contendo deleções nos genes Gem (Miro), Ypt53 (Rab5) e Atg8 (LC3) e expressando alfa-sinucleína dos tipos A30P e A53T, demonstraram que a toxicidade da alfa-sinucleína é dependente das disfunções na mitocôndria e na autofagia. A agregação da alfa-sinucleína A53T foi prevenida na ausência de Gem. Além disso, a toxicidade da proteína envolvendo a disfunção mitocondrial e sinalização apoptótica causada pelo estresse do ER foi dependente dos genes Gem e Atg8, respectivamente. Neurônios derivados de hiPSC de pacientes contendo a triplicação do gene da alfa-sinucleína, mostraram diminuição do transporte de mitocôndrias e do potencial de membrana da mitocôndria. Análises sobre a quantidade de vesículas lisossomais desses neurônios, demonstraram acúmulos dessas vesículas, sugerindo que a autofagia está alterada. Em um ensaio sobre a sensibilidade dos neurônios dopaminérgicos, foi observado que os neurônios contendo a alpha-sinucleína mutante são mais susceptíveis à rotenona, quando comparado com os neurônios dopaminérgicos do controle. A exposição à rotenona também causou mudanças na distribuição de mitocôndrias, sugerindo que o tráfego retrógrado da organela está alterado / Parkinson\'s disease (PD) is the most common motor neurodegenerative disease in the world. Protein aggregates containing mainly alpha-synuclein are a hallmark of disease. Mitochondria and autophagy defects have been suggested to be caused by alpha-synuclein toxicity. In this study, we investigated mitochondria and autophagy dynamics related to alpha-synuclein toxicity in neurons derived form SH-SY5Y cells, hiPSC from patients with familial PD or yeast. We found that SH-SY5Y neuroblastoma cells expressing A53T alfa- synuclein showed significantly inhibited mitochondrial trafficking. A53T alfa- synuclein also caused the highest increase in ROS production in the dysmobilized mitochondria in comparison to wild-type or A30P alfa- synuclein. Treatment with NAP, the 8 amino acid peptide identified as the active component of activity dependent neuroprotective protein (ADNP), completely annihilated the adverse effects of A53T on mitochondrial dynamics. During disruption of retrograde transport, we found disturbed autophagy and increased apoptosis signalization in neurons expressing A53T alpha-synuclein, suggest activation of the apoptosis pathway. Curiously, all groups expressing alpha-synuclein showed decreased levels of BCL-XL, revealing that mitochondria are susceptible to changes in the membrane potential in the presence of alphasynuclein. Nevertheless, treatment with NAP was effective in blocking the apoptosis pathway and restore autophagy. We created a model to study A30P and A53T alpha-synuclein toxicity related to Gem (Miro), Ypt53 (Rab5) and Atg8 (LC3) genes in Saccharomyces cerevisiae in which these genes were knocked down. We found that A30P alpha-synuclein toxicity was dependent on mitochondrial and autophagy dysfunction. A53T alpha-synuclein was more toxic than A30P alpha-synuclein, and its aggregation was dependent on Gem expression. A53T alpha-synuclein toxicity involving damaged mitochondrial and apoptotic signaling caused by ER stress was dependent on Gem and Atg8 genes, respectively. In a study involving dopaminergic neurons derived from hiPSCs from patients containing triplicated alpha-synuclein gene (SNCA3), we reported decreased mitochondrial trafficking and mitochondrial membrane potential, besides accumulation of lysosome vesicles. In a sensitivity assay, SNCA3 neurons demonstrated more susceptibility to rotenone toxicity, which alters intracellular mitochondrial distribution, impairing retrograde transport of the organelle

A neuroproteção é um dos tópicos mais relevantes aplicados à neurociência. As junções comunicantes (JC), formadas pelas conexinas (Cx) estão envolvidas na neurodegeneração após lesão. Estudos com animais KO apresentam resultados contraditórios sobre papel das JCs. O objetivo deste trabalho foi analisar o papel das Cxs a partir do trauma mecânico na retina, modelo que permite a visualização do foco, penumbra, e áreas adjacentes à lesão. Observamos regulação distinta das Cx36 e Cx43 durante a neurodegeneração. A Cx36 não se alterou e a Cx43 apresentou desorganização e aumento da imunorreatividade após 7 dias, concomitantemente com GFAP. Células amácrinas apoptóticas encontram-se acopladas a células vizinhas por Cx36. O papel funcional das JCs foi avaliado, utilizando bloqueadores, para verificar a viabilidade/morte de células. Carbenoxolone (CBX), reduziu o espalhamento da apoptose, após 4h, enquanto a quinina, teve o mesmo efeito após 1h. A distribuição de núcleos apoptóticos confirmou que a utilização de bloqueadores de JCs reduz a propagação da apoptose. A quinina, mas não o CBX, diminuiu a expressão de caspases iniciais e efetoras. O controle da permeabilidade de canais de JCs pode participar de estratégias de neuroproteção. / The neuroprotection stands out as one of the most pursued hot topics in applied neurosciences. The gap junctions (GJ), formed by connexin (Cx) are involved in neurodegeneration injury. Studies using KO animal models endowed apparently contradictory results in relation to the role of coupling in neuroprotection. The aim of this study was to analyze the role of Cx-mediated communication in focal lesion induced by mechanical trauma in the retina, a model that alow the visualization of the focus, penumbra and adjacent areas. We observed distinct regulation of Cx36 and Cx43 during neurodegeneration. The Cx36 did not change during the lesion progression and Cx43 showed disorganized pattern and upregulated after 7 days, the same as GFAP. Apoptotic amacrine cells are coupled with health neighborhood cells by Cx36. The functional role of GJ was evaluated using blockers to verify the viability/cell death. Carbenoxolone (CBX) reduced the spread of apoptosis after 4h while quinine had the same effect after 1h. The distribution of apoptotic nuclei confirmed that the use of GJ blockers reduced the propagation of apoptosis. Quinine, but not CBX, decreases initial and effector caspases expression. The control of GJ channels permeability can participate in neuroprotection strategies.

A doença de Parkinson é a doença motora neurodegenerativa mais comum do mundo. Agregados proteicos contendo principalmente alfa-sinucleína é a principal marca da doença. Recentemente, tem sido demonstrado que defeitos na dinâmica mitocondrial e da autofagia são causados pelo acúmulo da proteína. No nosso estudo, foram utilizados neurônios derivados de SH-SY5Y ou de hiPSC de pacientes com a doença de Parkinson hereditária, além de leveduras para analisar a dinâmica mitocondrial e da autofagia e o envolvimento de proteínas desses processos na toxicidade da alfa- sinucleína. Foi observado a diminuição do tráfego mitocondrial em neurônios derivados das células SH-SY5Y que expressavam alfa-sinucleína A53T. Além disso a proteína mutante ainda levou ao aumento de espécies reativas de oxigênio, perturbação da autofagia e aumento da sinalização apoptótica. Os neurônios então foram tratados com NAP, um peptídeo neuroprotetor, que preveniu os efeitos tóxicos da alfa-sinucleína mutante. Leveduras contendo deleções nos genes Gem (Miro), Ypt53 (Rab5) e Atg8 (LC3) e expressando alfa-sinucleína dos tipos A30P e A53T, demonstraram que a toxicidade da alfa-sinucleína é dependente das disfunções na mitocôndria e na autofagia. A agregação da alfa-sinucleína A53T foi prevenida na ausência de Gem. Além disso, a toxicidade da proteína envolvendo a disfunção mitocondrial e sinalização apoptótica causada pelo estresse do ER foi dependente dos genes Gem e Atg8, respectivamente. Neurônios derivados de hiPSC de pacientes contendo a triplicação do gene da alfa-sinucleína, mostraram diminuição do transporte de mitocôndrias e do potencial de membrana da mitocôndria. Análises sobre a quantidade de vesículas lisossomais desses neurônios, demonstraram acúmulos dessas vesículas, sugerindo que a autofagia está alterada. Em um ensaio sobre a sensibilidade dos neurônios dopaminérgicos, foi observado que os neurônios contendo a alpha-sinucleína mutante são mais susceptíveis à rotenona, quando comparado com os neurônios dopaminérgicos do controle. A exposição à rotenona também causou mudanças na distribuição de mitocôndrias, sugerindo que o tráfego retrógrado da organela está alterado / Parkinson\'s disease (PD) is the most common motor neurodegenerative disease in the world. Protein aggregates containing mainly alpha-synuclein are a hallmark of disease. Mitochondria and autophagy defects have been suggested to be caused by alpha-synuclein toxicity. In this study, we investigated mitochondria and autophagy dynamics related to alpha-synuclein toxicity in neurons derived form SH-SY5Y cells, hiPSC from patients with familial PD or yeast. We found that SH-SY5Y neuroblastoma cells expressing A53T alfa- synuclein showed significantly inhibited mitochondrial trafficking. A53T alfa- synuclein also caused the highest increase in ROS production in the dysmobilized mitochondria in comparison to wild-type or A30P alfa- synuclein. Treatment with NAP, the 8 amino acid peptide identified as the active component of activity dependent neuroprotective protein (ADNP), completely annihilated the adverse effects of A53T on mitochondrial dynamics. During disruption of retrograde transport, we found disturbed autophagy and increased apoptosis signalization in neurons expressing A53T alpha-synuclein, suggest activation of the apoptosis pathway. Curiously, all groups expressing alpha-synuclein showed decreased levels of BCL-XL, revealing that mitochondria are susceptible to changes in the membrane potential in the presence of alphasynuclein. Nevertheless, treatment with NAP was effective in blocking the apoptosis pathway and restore autophagy. We created a model to study A30P and A53T alpha-synuclein toxicity related to Gem (Miro), Ypt53 (Rab5) and Atg8 (LC3) genes in Saccharomyces cerevisiae in which these genes were knocked down. We found that A30P alpha-synuclein toxicity was dependent on mitochondrial and autophagy dysfunction. A53T alpha-synuclein was more toxic than A30P alpha-synuclein, and its aggregation was dependent on Gem expression. A53T alpha-synuclein toxicity involving damaged mitochondrial and apoptotic signaling caused by ER stress was dependent on Gem and Atg8 genes, respectively. In a study involving dopaminergic neurons derived from hiPSCs from patients containing triplicated alpha-synuclein gene (SNCA3), we reported decreased mitochondrial trafficking and mitochondrial membrane potential, besides accumulation of lysosome vesicles. In a sensitivity assay, SNCA3 neurons demonstrated more susceptibility to rotenone toxicity, which alters intracellular mitochondrial distribution, impairing retrograde transport of the organelle

Orientador: Roger Frigério Castilho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T07:07:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Melo_DanielaRodriguesde_D.pdf: 21069496 bytes, checksum: f3406a56ba7ffca25021b4803fc73a92 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A acidemia metilmalônica é uma desordem metabólica hereditária envolvendo uma deficiência na atividade da enzima metilmalonil-CoA mutase, com resultante acúmulo de ácido metilmalônico (MMA) no organismo dos pacientes. Há evidências de comprometimento do metabolismo energético mitocondrial por MMA levando à neurodegeneração. Neste estudo avaliou-se o efeito in vitro de MMA no consumo de oxigênio por mitocôndrias isoladas de cérebro de rato na presença de diferentes substratos para a cadeia respiratória. MMA (1-10 mM) inibiu fortemente a respiração mantida por glutamato ou succinato. Nós confirmamos, por meio de experimentos sobre o transporte mitocondrial de succinato, que o efeito inibitório do MMA na respiração mantida por succinato deve-se à inibição do transportador mitocondrial de dicarboxilatos, impedindo a captação de succinato pela mitocôndria. Medidas do transporte mitocondrial de glutamato revelaram que o efeito do MMA na respiração mitocondrial mantida por glutamato não está relacionado à inibição da captação deste substrato pela mitocôndria. Enquanto o MMA mostrou um fraco efeito inibitório sobre a atividade das enzimas glutamato desidrogenase e aspartato transaminase, a atividade da 'alfa'-cetoglutarato desidrogenase foi significativamente inibida por MMA (Ki = 3,65 mM). Medidas do transporte mitocondrial de 'alfa'-cetoglutarato mostraram que o MMA extramitocondrial pode ser trocado pelo 'alfa'-cetoglutarato intramitocondrial, depletando este substrato da matriz mitocondrial, com consequente inibição da respiração mantida por glutamato. Nós observamos que organelas isoladas de cérebro podem acumular aproximadamente o triplo da concentração de MMA presente no meio extramitocondrial. Em adição, a inibição pelo MMA do consumo de oxigênio por fragmentos de cérebro de rato foi parcialmente prevenida pela presença de malato. Os efeitos in vivo do MMA foram estudados por meio das medidas de respiração e produção de espécies reativas de oxigênio em mitocôndrias isoladas de cérebro de ratos jovens cronicamente tratados (ip, 15 d) com MMA. Nenhuma diferença foi observada entre as amostras controle e tratadas com MMA, indicando que o tratamento in vivo com MMA não leva à disfunção mitocondrial permanente. Ainda, estudos sobre o efeito do MMA na viabilidade e metabolismo de células neuronais e gliais foram realizados. Na linhagem neuronal tumoral PC12, o MMA diminuiu a viabilidade celular após 24h de tratamento. Os parâmetros de potencial de membrana mitocondrial e respiração foram avaliados após 7h de tratamento com MMA. MMA inibiu a respiração nas células intactas, porém, não alterou a respiração nas células permeabilizadas, nas quais não há restrição de substratos. A viabilidade de células de glioblastoma humano, U-87MG, não foi afetada pelo tratamento com MMA. Já em astrócitos de cérebro de rato em cultura primária exposta ao MMA, a viabilidade e área celular foram reduzidas significativamente e alterações morfológicas também foram notadas. Tais observações nas células gliais primárias sugerem que as células tumorais sejam mais resistentes aos efeitos deletérios do MMA. Em conjunto, estes resultados indicam que o efeito inibitório de MMA no metabolismo oxidativo mitocondrial pode ser atribuído à inibição concomitante de enzimas específicas e transportadores, limitando a disponibilidade de substratos para as vias metabólicas mitocondriais / Abstract: Methylmalonic acidemia is an inherited metabolic disorder involving a deficiency in the activity of the enzyme methylmalonyl-CoA mutase or its cofactor 5'-deoxyadenosylcobalamin that results in an accumulation of methylmalonate (MMA) in the body. There is evidence that MMA impairs mitochondrial oxidative metabolism, leading to neurodegeneration. In this study we evaluated the in vitro effect of MMA on oxygen consumption by isolated rat brain mitochondria in the presence of different respiratory chain substrates. MMA (1-10 mM) strongly inhibited glutamate-supported and succinatesupported respiration. We confirmed that the inhibitory effect of MMA on succinatesupported respiration is due to inhibition of the mitochondrial dicarboxylate transporter by MMA, blocking succinate uptake by mitochondria. Glutamate transport measurements revealed that the MMA effect on glutamate-supported respiration is not due to inhibition of mitochondrial uptake of this substrate. While MMA showed a weak inhibitory effect on glutamate dehydrogenase and aspartate transaminase, _'alfa'-ketoglutarate dehydrogenase activity was significantly inhibited by MMA (Ki = 3.65 mM). 'alfa'-ketoglutarate transport measurements showed that an exchange can take place between extramitochondrial MMA and intramitochondrial 'alfa'-ketoglutarate, depleting this substrate and consequently causing inhibition of glutamate-supported respiration. We observed that isolated brain organelles can accumulate nearly three times the concentration of extramitochondrial MMA. In addition, MMA inhibition of respiration by diced rat brain tissue was partially prevented by malate. MMA effects in vivo were studied by measuring respiration and reactive oxygen species generation in isolated brain mitochondria from young rats chronically injected (ip, 15 d) with MMA. No differences were observed between control and MMA-treated samples, indicating that in vivo MMA treatment does not lead to permanent mitochondrial dysfunction. In addition, a study into the effect of MMA on the viability and metabolism of neuronal and glial cells was carried out. In the PC12 neuronal tumor cell line, MMA decreased cell viability after 24 hours of treatment. Mitochondrial membrane potential and respiration were evaluated after 7 hours of MMA treatment. MMA inhibited respiration in intact cells but did not alter respiration in permeabilized cells, where there is no substrate deprivation. Cell viability of U-87MG human glioblastoma cells was not affected by MMA treatment. However, in cells from a primary culture of rat cerebral astrocytes, viability and cell area were significantly reduced and morphological alterations were also noted. The most evident effects of MMA were observed in primary cells, suggesting that tumor cells are more resistant to the deleterious effects of MMA. Taken together, these results indicate that the inhibitory effect of MMA on mitochondrial oxidative metabolism can be ascribed to the concurrent inhibition of specific enzymes and transporters, limiting the availability of substrates for mitochondrial metabolic pathways / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Ciências

Orientador: Francesco Langone / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T03:17:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rezende_AlexandreCesarSantosde_M.pdf: 2677724 bytes, checksum: 332acee58d6f9fc544b659f930833e41 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A investigação de agentes terapêuticos para o tratamento de doenças neurodegenerativas e neurotraumas recebeu um grande impulso nas últimas décadas, em virtude do desenvolvimento de técnicas que permitiram a clonagem de moléculas com reconhecida ação neurotrófica. O emprego de modelos experimentais para o estudo de processos neurodegenerativos contribuiu significativamente ao conhecimento dos mecanismos de ação e especificidade dessas moléculas. O fator neurotrófico ciliar (CNTF) despertou grande interesse com a descoberta do seu efeito neuroprotetor sobre motoneurônios após secção de nervos periféricos em ratos neonatos e camundongos adultos. Contudo, os testes clínicos em pacientes com esclerose lateral amiotrófica revelaram efeitos colaterais importantes associados às diferentes doses e esquemas de tratamento com CNTF ecombinante humano. Estes resultados tiveram como conseqüência a interrupção dos testes clínicos e estimularam a busca de vias alternativas para a administração do CNTF com o objetivo de eliminar os efeitos colaterais indesejáveis. Uma via alternativa muito promissora parece ser a administração do CNTF conjugado com peptídeos que possuem domínio de transdução ou translocação de proteínas (PTDprotein transduction domain). Neste estudo investigamos o efeito do CNTF conjugado com um PTD derivado do vírus HIV-1 (Tat-CNTF) quando administrado a ratos neonatos (P2) após secção do nervo ciático. Um grupo de ratos (Wistar) teve o nervo ciático esquerdo seccionado e recebeu um fragmento de gelfoam embebido em CNTF (6µg), Tat-CNTF (6µg ou 3µg) ou PBS. Outro grupo sofreu o mesmo tipo de lesão e foi tratado diariamente, durante 5 dias, com doses subcutâneas de CNTF (1,2µg/g), Tat-CNTF (1,2, 0,6 ou 0,3µg/g) ou PBS. O peso corporal foi registrado diariamente entre P2 e P7. Na idade de P7 os animais foram perfundidos (paraformaldeído 4%) e a medula lombar foi embebida em parafina para obtenção de cortes seriais transversais. Os cortes foram corados com cresil violeta e os motoneurônios do grupamento ventrolateral de ambos os lados foram contados. A razão entre o número de motoneurônios do lado lesado e do lado íntegro correspondeu ao índice de sobrevivência neuronal (ISN). Uma série de 9 cortes de cada animal foi reagida para investigação imunoistoquímica da expressão de GFAP pelos astrócitos. Nossos resultados mostraram que o ISN de todos os grupos tratados com Tat-CNTF, local e subcutaneamente, foi similar aos dos grupos tratados da mesma forma com CNTF e maior que nos grupos tratados com PBS. O acompanhamento do ganho de peso dos animais entre P2 e P7 mostrou que aqueles que receberam tratamento local com CNTF ou Tat-CNTF apresentaram crescimento semelhante ao do observado nos animais do grupo controle. Por outro lado, a curva de crescimento dos animais tratados com doses subcutâneas diárias de CNTF (1,2µg/g), revelou que estes tiveram ganho de peso significativamente inferior ao dos animais tratados com a mesma dose, ou com as doses inferiores, de Tat-CNTF. O menor crescimento dos animais tratados com CNTF foi significativo a partir do segundo dia de tratamento. Na idade P7 o peso corporal desses animais foi 25% e 30% inferior aos dos animais tratados com Tat-CNTF e aos animais controle, respectivamente. Não houve diferença significativa de ganho de peso entre os animais tratados com as diferentes doses de Tat-CNTF e os animais tratados com PBS subcutaneamente. Além disso, a administração subcutânea de CNTF provocou intensa mobilização da gordura marrom interescapular, fenômeno não verificado nos animais tratados com Tat-CNTF. Os dados da análise imunoistoquímica para GFAP revelaram que a resposta astroglial nos animais tratados com Tat-CNTF foi menos intensa que a observada nos animais que receberam tratamento subcutâneo com CNTF. Nossos resultados revelaram que a Tat-CNTF além de possuir ação neuroprotetora não produziu os efeitos colaterais indesejáveis do CNTF, mesmo quando administrado em dose igual à deste último. Estes dados suportam a hipótese que a adição do domínio PTD a moléculas neurotróficas é uma estratégia de neuroproteção eficaz e abre perspectivas para possível emprego da Tat-CNTF em moléstias neurodegenerativas que afetam os motoneurônios espinhais, tais como a esclerose lateral amiotrófica / Abstract: The investigation of therapeutical agents for the treatment of neurodegenerative diseases and neurotrauma received a great attention in the last decades due to cloning techniques for neurotrophic molecules. Experimental models contributed to the knowledge of the mechanisms of action and specificity of such molecules. Ciliary neurotrophic factor (CNTF) is known as a neuroprotective agent on motoneurons after peripheral nerve section in neonatal rats and adult mice. However, clinical trials with human recombinat CNTF showed dose dependent-side effects. Consequently, new approaches for avoiding those side effects have been investigated, such as CNTF fused with domain transduction protein (PTD). In the present work, we studied the effects of CNTF fused with the PDT of the HIV-1 (Tat-CNTF) in neonatal rats (P2) after sciatic nerve transection. Wistar rats had their left sciatic nerve cut and embedded in gelfoam with either CNTF (6µg), Tat-CNTF (6µg or 3µg) or PBS. Other lesioned rats were treated subcutaneously with either CNTF (1.2µg/gr), Tat-CNTF (1.2, 0.6 or 0.3µg/gr) or PBS, once a day, for 5 days. The body weight was registered from P2 to P7. At P7 the rats were perfused (4% paraformaldehyde) and the lumbar spinal cord was infiltrated with paraffin. Serial transverse sections were stained with cresyl violet and used for ventrolateral motoneuron counting. The ratio between the number of motoneurons counted in the operated and control sides was defined as neuronal survival ratio (NSR). From each animal, a series of nine sections was used for immunohistochemical detection of glial fibrillary acidic protein (GFAP) expressed by astrocytes. The animals that received either local or subcutaneous Tat-CNTF showed NSR similar to those observed in CNTF groups and higher than the registered in the controls (PBS). Body weight of rats from P2 to P7 treated with a local dose of CNTF or Tat-CNTF was similar to that of the control groups. On the other hand, rats treated with subcutaneous daily doses of CNTF had lower body weight than the observed in the other groups. Animals treated with CNTF had lower weight gain from the second day on. At P7 the body weight of CNTF treated animals was 25% and 30% lower than those receiving Tat-CNTF and PBS, respectively. The animals treated with different subcutaneous doses of Tat-CNTF had similar body growth as the control groups. Moreover, only subcutaneous administration of CNTF led to fat mobilization from the intrascapular brown adipose tissue. Immunostaining for GFAP showed that astrocytic response was less intense after Tat-CNTF administration in comparison with subcutaneous treatment with CNTF. Our results showed that Tat-CNTFis a neuroprotective agent not associated with the side effects attributed to CNTF, even when administered in similar doses. These data support the hypothesis that the addition of PTD to neurotrophic molecules is an efficient neuroprotective strategy and opens up perspectives for using Tat-CNTF in neurodegenerative diseases that affect the spinal motoneurons, such as the amyotrofic lateral sclerosis / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Introdução: Pacientes que sobrevivem ao traumatismo crânio-encefálico (TCE) apresentam declínio cognitivo e sinais indiretos de atrofia cerebral maiores que o esperado para a população normal. Dentro do universo das lesões englobadas sob o termo TCE há diferentes tipos de lesões, que podem ser divididas entre focais e difusas. A lesão axonial difusa (LAD), está presente em quase todos os pacientes com TCE moderado e grave. Não há estudos que descrevam longitudinalmente o que ocorre nos exames de imagem após o TCE em um grupo com diagnóstico clínico e radiológico de LAD sem lesões focais significativas. Este estudo tem como objetivo avaliar a carga de lesões da LAD através de uma contagem sistematizada, avaliar a taxa de atrofia de diferentes compartimentos do encéfalo de forma longitudinal, e verificar se o número de lesões mostra correlação com tais taxas de atrofia e ou com testes neuropsicológicos que avaliam desempenho executivo e de memória. Método: Foram selecionados 24 pacientes com diagnóstico clínico-radiológico de LAD e realizados exames de RM nos meses 2 (fase 1), 6 (fase 2) e 12 (fase 3) após o TCE. Nas fases 2 e 3 foi realizada avaliação neuropsicológica. Foi realizada contagem de lesões segundo a Microbleed Anatomical and Rating Scale (MARS). Nos definidos momentos foi realizada avaliação do volume do encéfalo através do software FreeSurfer. Foram avaliados a capacidade executiva através dos testes Trail Making Test (TMT) A e B, e a capacidade de recordação através do teste Hopkins Verbal Learning Test (HLVT) em seus componente de recordação imediata (HVLT-RI), tardia (RVLT-RT) e reconhecimento (HVLT-R). Foi testada correlação da carga lesional com a redução de volume dos compartimentos substância branca (VSB), substância cinzenta cortical (VCC), substância cinzenta subcortical (VCS) volume cerebral total (VCT). Foram ainda realizados testes de correlação da carga lesional total e por sítio anatômico com os testes TMT e HVLT e de correlação do grau de atrofia do VSB, VCC, VCS e VCT com os testes HVLT e TMT. Foram considerados positivos os resultados com p<0,05. Resultados: O VSB foi significativamente diferente entre as fases 2 e 3 e entre as fases 1 e 3, com redução de volume de 4,0% no intervalo total do estudo. O VCT foi significativamente diferente entre as fases 2 e 3 meses e entre as fases 1 e 3, com redução de volume de 1,9% no intervalo total do estudo. O VCC não foi significativamente diferente nas 3 fases. O VCS foi significativamente diferente entre as fases 1 e 2; fases 2 e 3 e entre as fases 1 e 3, com redução de volume de 3,7%. O número médio de lesões pela tabela MARS foi de 128 (DP 95), e mostrou correlação positiva e significativa com a redução do VSB, e não demonstrou correlação com a redução de volume dos demais compartimentos. Houve diferença significativa nos resultados dos testes TMT-A e TMT-B entre as fases 2 e 3, com maior rapidez na execução do teste na fase 3. Houve diferença significativa entre os resultados do teste HVLT-RI as fases 2 e 3, com maior número de palavras recordada na fase 3. Não houve diferença significativa nos resultados dos testes HVLT-RT e HVLT-R nas 2 fases. Houve correlação entre o resultado dos testes TMT-B nas fases 2 e 3 com a redução do VCT e entre os resultados do teste TMT-A na fase 3 com a redução do VSB. Não foi encontrada qualquer correlação entre o número de lesões segundo o sítio anatômico da tabela MARS com o desempenho nos testes TMT-A ou TMT-B. Não foi encontrada correlação entre os testes HVLT-RI, HVLT-RT ou HVLT-R com a redução dos volumes de VCT, VSB ou VCC. Discussão e Conclusões: Houve redução significativa do VCT, VSB e VCC ao longo do intervalo entre as fases 1 e 3 do estudo, e simultaneamente houve melhora no desempenho dos testes executivos TMT-A e TMT-B. Tais achados podem ser interpretados como uma resultante daquilo que modelos animais têm demonstrado na evolução do TCE: existe um processo contínuo no tecido cerebral após o TCE, que inclui o clareamento dos debris celulares irremediavelmente lesados e reparação de parte do tecido neural que sofreu lesões reversíveis no momento do trauma, tudo isso contribuindo para uma melhora no desempenho cognitivo, ao mesmo tempo em que ocorre redução do volume dos compartimentos encefálicos. A avaliação da carga lesional mostrou-se de valor prognóstico, pois manteve correlação com o grau de atrofia do VSB no intervalo do estudo / Introduction: Patients who survive traumatic brain injury (TBI) present cognitive decline and indirect signs of brain atrophy greater than expected for the normal population. Within the universe of injuries encompassed under the term TBI there are different types of injuries, which can be divided between focal and diffuse. Diffuse axonal injury (DAI) is present in almost all patients with moderate and severe TBI. There are no longitudinal studies describing imaging findings after TBI in a group with clinical and radiological diagnosis of DAI without significant focal lesions. This study aims to evaluate the DAI lesion load through a systematic counting approach, to evaluate longitudinally the atrophy rate of various brain compartments and to verify correlations between the lesion load and atrophy rates and their correlation with neuropsychological tests evaluating executive and memory performances. Method: 24 patients with clinical and radiological diagnosis of DAI were selected and they were submitted to MRI scans in 2, 6 and 12 months after TBI, as defined as the phase 1, phase 2, and phase 3 of the study. In phases 2 and 3 neuropsychological assessment was performed. Lesion load was quantified according to Microbleed Anatomical and Rating Scale (MARS). In all the 3 phases brain volume assessment was performed by FreeSurfer software. The executive capacity was evaluated by the Trail Making Test (TMT) A and B, and the memory capacity by the Hopkins Verbal Learning Test (HLVT) in its immediate recall component (HVLT-IR), late recall (RVLT-LR) and recognition (HVLT-R). The lesional load was correlated to the reduction in white matter volume (WMV), cortical gray matter volume (CGV), and subcortical gray matter (SGV) and total brain volume (TBV). Correlation of the total lesion load and anatomical site were correlated to TMT and HVLT tests. It was also performed correlation between degree of atrophy of the WMV, CGV, SGV and TGV with HVLT and TMT tests. Positive results were considered with p < 0.05. Results: The WMV was significantly different between phases 2 and 3 and between phases 1 and 3, with volume reduction of 4.0% in the total study interval. TBV was significantly different between the phases 2 and 3 and between phases 1 and 3, with volume reduction of 1.9% in the total study interval. The CGV was not significantly different in any of the 3 phases. The SGV was significantly different between phases 1 and 2, phases 2 and 3 and between phases 1 and 3, with 3.7% volume reduction in the total study interval. The mean lesion load assessment by MARS was 128 (SD 95) and showed a positive and significant correlation with the reduction in the WMV, and no correlation with the volume reduction of the other evaluated compartments. There were significant differences in the results of the TMT-A and TMT-B tests between phases 2 and 3, with faster execution of the test in phase 3. There were significant differences between the HVLT-IR results phases 2 and 3, with the largest number of words recalled in phase 3. There were no significant differences in the results of HVLT-LR tests and HVLT-R in 2 phases. There were correlations between the result of TMT-B test at phases 2 and 3 to the reduction of the TBV and the results of the TMT at phase 3 to the WMV reduction. There were no correlations between the anatomical site lesion load with the performance in the TMT-A and TMT-B. No correlations were found between HVLT-IR, HVLT-LR or HVLT-R with volume reduction of TBV, WMV or CGM. Discussion and Conclusions: There was a significant volume reduction in TBV, WMV and SGV during the study interval, while there was an improvement the executive tests TMT-A and TMT-B performance. These findings can be interpreted as a result of what animal models have shown the evolution of the ECT: there is a continuous process in the brain tissue after TBI, including clearing irreparably damaged cell debris and repair of the neural tissue components that suffered reversible injuries at the moment of trauma. Those processes contribute to an improvement in cognitive performance, while reduction of the volume of the encephalic compartments occurs at the same time. The lesion evaluation has proven its prognostic value as it showed correlation with the degree of WMV reduction

Introdução: Os processos degenerativos vêm sendo considerados determinantes da progressão do déficit neurológico na esclerose múltipla (EM) e são associados sobretudo à perda neuronal e axonal. A patologia na substância branca (SB) manifesta-se pela quebra de membranas e perda da complexidade microestrutural dos tratos cerebrais, o que pode ser estudado indiretamente pelas alterações nos índices de fração de anisotropia (FA) e difusividade média (DM), obtidos por meio das análises das imagens por tensores de difusão (diffusion tensor imaging - DTI). Essa técnica oferece outros dois índices mais específicos, a difusividade axial () e difusividade radial (), que são associados aos processos de perda axonal e desmielinização, respectivamente. A perda neuronal na substância cinzenta (SC) pode ser avaliada pelo grau de atrofia do córtex cerebral. Este estudo tem como objetivos mensurar os índices de DTI na maior comissura cerebral, o corpo caloso (CC), e o grau e distribuição da atrofia cortical em indivíduos com EM remitente-recorrente (EMRR) e baixos escores de incapacidade funcional, correlacionando essas alterações com o volume de lesões macroscópicas e os principais parâmetros clínicos. Método: 31 indivíduos (22 mulheres, idade média 30,5 anos ± 8,7) com EMRR e um grupo controle (GC) composto por 34 indivíduos saudáveis (27 mulheres, idade média 32,3 anos ± 7,8) realizaram exames de crânio em aparelho de ressonância magnética de 3 Tesla (3T), sendo adquiridas imagens de DTI com 32 direções de gradiente, obtendo-se os índices de FA, DM, e de cinco segmentos na secção sagital do corpo caloso (CC). Através da segmentação de imagens volumétricas ponderadas em T1 foram obtidas as espessuras corticais regionais nos grupos. Esses resultados foram correlacionados com os volumes lesionais de imagens ponderadas em T1 e T2/FLAIR e os escores da escala expandida do estado de incapacidade (Expanded Disability Status Scale - EDSS), considerando-se significativos resultados com p< 0,05. Resultados: Os índices de FA, DM e do CC estavam difusamente alterados no grupo EMRR e a , alterada significativamente no esplênio, tronco médio anterior e tronco médio posterior do CC. Observou-se atrofia cortical significativa no terço anterior dos lobos temporais, bilateralmente, e nas regiões parietal inferior, insular e fronto-orbitária direitas, com uma tendência à atrofia no giro frontal superior esquerdo. As FA, DM e correlacionaram-se com os volumes lesionais T1 e, mais significativamente, com os volumes lesionais T2/FLAIR, porém não houve correlação entre os volumes lesionais e a . A espessura cortical no grupo EMRR apresentou correlações com ambos os volumes lesionais, mais significativamente com as lesões em T1. O escore médio da EDSS era 1,1 ± 0,9 (variando de 0-3), apresentando correlações com a DM e a no esplênio, tronco médio anterior e posterior do CC, com uma correlação com a no tronco médio posterior. O EDSS correlacionou-se com a espessura cortical na topografia do giro frontal superior esquerdo. Discussão e conclusão: Houve alteração difusa nos índices de FA, DM e nos segmentos do CC, com acometimento mais localizado, predominantemente médio posterior, da , o que pode sugerir desmielinização difusa do CC, porém axonopatia ou degeneração mais acentuada em algumas regiões da SB. A atrofia cortical também apresentou uma distribuição regional característica, afetando sobretudo as regiões temporais, bilateralmente, parietal inferior, insular e fronto-orbitária direitas. As correlações encontradas entre os índices de DTI e a espessura cortical e os volumes lesionais demonstraram que, ao menos em parte, as degenerações das SB e SC podem ser relacionadas à degeneração Walleriana, secundária ao acúmulo de placas lesionais. As correlações entre a DM, de alguns segmentos do CC e a espessura cortical do giro frontal superior com os escores da EDSS favoreceram à hipótese de que a degeneração tecidual na EM foi um fator preponderante na progressão do déficit neurológico na EMRR / Introduction: The degenerative processes are gaining attention as predictors of the neurological deficit in multiple sclerosis (MS), being reflected by the degree of axon loss and central nervous system atrophy. The white matter pathology (WM) is characterized by cellular membranes disruption and loss of the microstructural complexity, which can be accessed by the diffusion tensor imaging (DTI) indices of fractional anisotropy (FA) and mean diffusivity (MD). This imaging technique also offers two more specific indices: the axial diffusivity () and radial diffusivity (), which are useful to differentiate between axon loss and demyelination, respectively. The gray matter (GM) neuronal loss can be accessed by the degree of cortical atrophy. The aim of this study is to measure the DTI indices in the greatest WM commisure, the corpus callosum (CC), and the degree and distribution of cortical atrophy in patients with relapsing remitting MS (RRMS) and low disability scores, correlating them to the macroscopic lesion load and the main clinical scores. Method: 31 RRMS patients (22 women, mean age 30.5 years ± 8.7) and 34 healthy control (HC) subjects (27 women, mean age 32.3 years ± 7.8) were submitted to brain examinations in a 3T magnetic resonance image scanner. From DTI with 32 gradient encoding directions were extracted the indices of FA, MD, and , which were measured in 5 segments of the mid-sagital section of the corpus callosum (CC). The cortical thickness was obtained from the segmentation of volumetric T1 images. These results were correlated with the macroscopic lesion loads in the T1 and T2/FLAIR images and the scores in the Expanded Disability Status Scale EDSS, considering significant the results with p< 0.05. Results: The FA, MD and were diffusively abnormal in all 5 segments of the CC in the RRMS group and the was abnormal only in the splenium, anterior midbody and posterior mid-body. The anterior area of the both temporal lobes and right inferior parietal, some orbital-frontal and insular regions showed significant atrophy, with a tendency of atrophy in the superior frontal gyrus. The FA, MD and correlated with the T1 lesion load and, more significantly, with the T2/FLAIR lesion load. The cortical thickness correlated with T1 and T2/FLAIR lesion loads, more significantly with the T1 lesion load. The mean EDSS in the RRMS group was 1.1 ± 0.9 (range 0-3), correlating with the MD and of the splenium, anterior and posterior mid-body of the CC. The EDSS correlated to cortical thickness in the topography of the superior frontal gyrus. Discussion and conclusion: The FA, MD and are diffusively abnormal in the CC, with abnormalities in the , restricted to the medial and posterior segments. These results can be interpreted as signs of diffuse demyelination in the CC and a predominance of axonopathy or more advanced degeneration in some segments. The cortical atrophy also followed a characteristic regional distribution, affecting predominantly the bilateral temporal lobes, and inferior parietal, orbital-frontal and insular regions, in the right hemisphere. The correlations found between the DTI indices and the cortical thickness and the macroscopic lesion loads show that, at least partially, the WM and GM degeneration can be related to Wallerian degeneration secondary to macroscopic lesion accumulation. The correlations between the DM, , in some of the CC segments, and cortical thickness, in the superior frontal gyrus, and the EDSS scores reinforces the hypothesis that the degenerative processes in MS can play a role in the disability status of the patients

Introdução: Pacientes que sobrevivem ao traumatismo crânio-encefálico (TCE) apresentam declínio cognitivo e sinais indiretos de atrofia cerebral maiores que o esperado para a população normal. Dentro do universo das lesões englobadas sob o termo TCE há diferentes tipos de lesões, que podem ser divididas entre focais e difusas. A lesão axonial difusa (LAD), está presente em quase todos os pacientes com TCE moderado e grave. Não há estudos que descrevam longitudinalmente o que ocorre nos exames de imagem após o TCE em um grupo com diagnóstico clínico e radiológico de LAD sem lesões focais significativas. Este estudo tem como objetivo avaliar a carga de lesões da LAD através de uma contagem sistematizada, avaliar a taxa de atrofia de diferentes compartimentos do encéfalo de forma longitudinal, e verificar se o número de lesões mostra correlação com tais taxas de atrofia e ou com testes neuropsicológicos que avaliam desempenho executivo e de memória. Método: Foram selecionados 24 pacientes com diagnóstico clínico-radiológico de LAD e realizados exames de RM nos meses 2 (fase 1), 6 (fase 2) e 12 (fase 3) após o TCE. Nas fases 2 e 3 foi realizada avaliação neuropsicológica. Foi realizada contagem de lesões segundo a Microbleed Anatomical and Rating Scale (MARS). Nos definidos momentos foi realizada avaliação do volume do encéfalo através do software FreeSurfer. Foram avaliados a capacidade executiva através dos testes Trail Making Test (TMT) A e B, e a capacidade de recordação através do teste Hopkins Verbal Learning Test (HLVT) em seus componente de recordação imediata (HVLT-RI), tardia (RVLT-RT) e reconhecimento (HVLT-R). Foi testada correlação da carga lesional com a redução de volume dos compartimentos substância branca (VSB), substância cinzenta cortical (VCC), substância cinzenta subcortical (VCS) volume cerebral total (VCT). Foram ainda realizados testes de correlação da carga lesional total e por sítio anatômico com os testes TMT e HVLT e de correlação do grau de atrofia do VSB, VCC, VCS e VCT com os testes HVLT e TMT. Foram considerados positivos os resultados com p<0,05. Resultados: O VSB foi significativamente diferente entre as fases 2 e 3 e entre as fases 1 e 3, com redução de volume de 4,0% no intervalo total do estudo. O VCT foi significativamente diferente entre as fases 2 e 3 meses e entre as fases 1 e 3, com redução de volume de 1,9% no intervalo total do estudo. O VCC não foi significativamente diferente nas 3 fases. O VCS foi significativamente diferente entre as fases 1 e 2; fases 2 e 3 e entre as fases 1 e 3, com redução de volume de 3,7%. O número médio de lesões pela tabela MARS foi de 128 (DP 95), e mostrou correlação positiva e significativa com a redução do VSB, e não demonstrou correlação com a redução de volume dos demais compartimentos. Houve diferença significativa nos resultados dos testes TMT-A e TMT-B entre as fases 2 e 3, com maior rapidez na execução do teste na fase 3. Houve diferença significativa entre os resultados do teste HVLT-RI as fases 2 e 3, com maior número de palavras recordada na fase 3. Não houve diferença significativa nos resultados dos testes HVLT-RT e HVLT-R nas 2 fases. Houve correlação entre o resultado dos testes TMT-B nas fases 2 e 3 com a redução do VCT e entre os resultados do teste TMT-A na fase 3 com a redução do VSB. Não foi encontrada qualquer correlação entre o número de lesões segundo o sítio anatômico da tabela MARS com o desempenho nos testes TMT-A ou TMT-B. Não foi encontrada correlação entre os testes HVLT-RI, HVLT-RT ou HVLT-R com a redução dos volumes de VCT, VSB ou VCC. Discussão e Conclusões: Houve redução significativa do VCT, VSB e VCC ao longo do intervalo entre as fases 1 e 3 do estudo, e simultaneamente houve melhora no desempenho dos testes executivos TMT-A e TMT-B. Tais achados podem ser interpretados como uma resultante daquilo que modelos animais têm demonstrado na evolução do TCE: existe um processo contínuo no tecido cerebral após o TCE, que inclui o clareamento dos debris celulares irremediavelmente lesados e reparação de parte do tecido neural que sofreu lesões reversíveis no momento do trauma, tudo isso contribuindo para uma melhora no desempenho cognitivo, ao mesmo tempo em que ocorre redução do volume dos compartimentos encefálicos. A avaliação da carga lesional mostrou-se de valor prognóstico, pois manteve correlação com o grau de atrofia do VSB no intervalo do estudo / Introduction: Patients who survive traumatic brain injury (TBI) present cognitive decline and indirect signs of brain atrophy greater than expected for the normal population. Within the universe of injuries encompassed under the term TBI there are different types of injuries, which can be divided between focal and diffuse. Diffuse axonal injury (DAI) is present in almost all patients with moderate and severe TBI. There are no longitudinal studies describing imaging findings after TBI in a group with clinical and radiological diagnosis of DAI without significant focal lesions. This study aims to evaluate the DAI lesion load through a systematic counting approach, to evaluate longitudinally the atrophy rate of various brain compartments and to verify correlations between the lesion load and atrophy rates and their correlation with neuropsychological tests evaluating executive and memory performances. Method: 24 patients with clinical and radiological diagnosis of DAI were selected and they were submitted to MRI scans in 2, 6 and 12 months after TBI, as defined as the phase 1, phase 2, and phase 3 of the study. In phases 2 and 3 neuropsychological assessment was performed. Lesion load was quantified according to Microbleed Anatomical and Rating Scale (MARS). In all the 3 phases brain volume assessment was performed by FreeSurfer software. The executive capacity was evaluated by the Trail Making Test (TMT) A and B, and the memory capacity by the Hopkins Verbal Learning Test (HLVT) in its immediate recall component (HVLT-IR), late recall (RVLT-LR) and recognition (HVLT-R). The lesional load was correlated to the reduction in white matter volume (WMV), cortical gray matter volume (CGV), and subcortical gray matter (SGV) and total brain volume (TBV). Correlation of the total lesion load and anatomical site were correlated to TMT and HVLT tests. It was also performed correlation between degree of atrophy of the WMV, CGV, SGV and TGV with HVLT and TMT tests. Positive results were considered with p < 0.05. Results: The WMV was significantly different between phases 2 and 3 and between phases 1 and 3, with volume reduction of 4.0% in the total study interval. TBV was significantly different between the phases 2 and 3 and between phases 1 and 3, with volume reduction of 1.9% in the total study interval. The CGV was not significantly different in any of the 3 phases. The SGV was significantly different between phases 1 and 2, phases 2 and 3 and between phases 1 and 3, with 3.7% volume reduction in the total study interval. The mean lesion load assessment by MARS was 128 (SD 95) and showed a positive and significant correlation with the reduction in the WMV, and no correlation with the volume reduction of the other evaluated compartments. There were significant differences in the results of the TMT-A and TMT-B tests between phases 2 and 3, with faster execution of the test in phase 3. There were significant differences between the HVLT-IR results phases 2 and 3, with the largest number of words recalled in phase 3. There were no significant differences in the results of HVLT-LR tests and HVLT-R in 2 phases. There were correlations between the result of TMT-B test at phases 2 and 3 to the reduction of the TBV and the results of the TMT at phase 3 to the WMV reduction. There were no correlations between the anatomical site lesion load with the performance in the TMT-A and TMT-B. No correlations were found between HVLT-IR, HVLT-LR or HVLT-R with volume reduction of TBV, WMV or CGM. Discussion and Conclusions: There was a significant volume reduction in TBV, WMV and SGV during the study interval, while there was an improvement the executive tests TMT-A and TMT-B performance. These findings can be interpreted as a result of what animal models have shown the evolution of the ECT: there is a continuous process in the brain tissue after TBI, including clearing irreparably damaged cell debris and repair of the neural tissue components that suffered reversible injuries at the moment of trauma. Those processes contribute to an improvement in cognitive performance, while reduction of the volume of the encephalic compartments occurs at the same time. The lesion evaluation has proven its prognostic value as it showed correlation with the degree of WMV reduction