As distrofias musculares constituem um grupo heterogêneo de doenças caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. A fraqueza muscular se manifesta quanto existe um desequilíbrio entre os ciclos de degeneração e regeneração, com subseqüente substituição por tecido conjuntivo e adiposo das fibras musculares eliminadas. Diversos fatores estão implicados nestes processos, e as vias de atuação de cada um deles ainda não são totalmente conhecidas. Os mais importantes marcadores da via miogênica são os fatores Myf5, MyoD, Myf6 e miogenina. Os marcadores da degeneração, por sua vez, são o TGFβ-1, citocina inflamatória provavelmente envolvida no processo de fibrose do músculo distrófico, e o aumento da expressão do próprio colágeno, componente da matriz extracelular. O objetivo do presente projeto consistiu em estudar os fatores relacionados com as vias de degeneração e regeneração em modelos murinos distróficos com diferentes defeitos nas proteínas musculares, para elucidação dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos, visando terapias. Para tal, foram estabelecidas três abordagens: 1-) Estudar o potencial terapêutico de células-tronco mesenquimais de medulas óssea, nos modelos Lama2dy-2J/J (deficiente para a proteína α2-laminina) e Largemyd (defeito de glicosilação); 2-) Estudar a expressão relativa dos genes envolvidos nas vias de degeneração e regeneração nos diferentes modelos murinos para distrofias musculares; 3-) Estudar o papel da distrofina e α2-laminina na organização do complexo distrofina-glicoproteínas associadas no músculo esquelético, através da produção de um camundongo duplo-mutante deficiente para estas duas proteínas. Na primeira abordagem, células-tronco mesenquimais de medula, expressando a proteína eGFP, foram injetadas por via sistêmica em camundongos Lama2dy-2J/J e Largemyd, mas não foram localizadas posteriormente no músculo dos animais testados. Testes complementares mostraram que células MSC e C2C12 expressando eGFP permanecem por curtos períodos de tempo no tecido injetado, sugerindo que são eliminadas do músculo distrófico em virtude da expressão permanente de eGFP. Análise funcional realizada nestes animais mostrou uma grande heterogeneidade de resposta nos diversos testes aplicados, compatível com a variabilidade clínica também observada em pacientes humanos. Na segunda abordagem, analisamos a expressão dos genes da cascata de degeneração e regeneração nos modelos distróficos mdx, SJL/J, Lama2dy-2J/J e Largemyd, e correlacionamos estes resultados com o padrão histopatológico de cada modelo. Os resultados observados sugerem que o gene TGFβ-1 é ativado pelo processo distrófico em qualquer grau de degeneração, enquanto a ativação da expressão do gene PCOL possivelmente ocorre nos estágios iniciais deste processo. Observou-se também que cada mecanismo patofisiológico atuou de forma diversa na ativação da regeneração, com diferenças na indução da proliferação das células-satélite, mas sem alterações no estimulo à diferenciação. Assim, a disfunção na população de células-satélite pode representar um mecanismo importante na patogênese das distrofias musculares. Na terceira abordagem, um modelo murino duplo-mutante para as proteínas distrofina e α2-laminina foi gerado a partir de cruzamentos das linhagens mdx e Lama2dy-2J/J, com a proporção mendeliana esperada, sendo, portanto, viável. O animal duplo-afetado está apresentando fraqueza muscular mais acentuada que os modelos parentais. Estudos complementares de proteínas musculares serão ainda realizados neste novo modelo para verificar a presença ou não das demais proteínas do DGC e sua relação com o padrão de degeneração/regeneração muscular. / The muscular dystrophies are a heterogeneous group of genetic diseases characterized by progressive and irreversible degeneration of skeletal muscles. Muscle weakness is the consequence of an imbalance between successive cycles of degeneration and regeneration, with further replacement of the degraded muscle fibers by adipose and connective tissues. Several factors are involved these processes and the respective functional pathways are still not well known. Myf5, MyoD, Myf6 and myogenin are important factors responsible for the myogenesis and regeneration in the muscle. One important marker for the degeneration is TGF-1, which is an inflammatory cytokine with a possible role in the stimulation of fibrosis in the dystrophic muscle through the activation of genes related to the expression of collagen. The main objective of this project was to study the factors involved in the degeneration and regeneration pathways, in mice models for muscular dystrophies, carrying different defects in muscle proteins, to better understand the involved pathophysiological mechanisms, aiming future therapies. This was done through three strategies: 1-) The study of the therapeutic potential of transplantation of bone marrow mesenchymal-eGFP transformed stem cells, in Lama2dy-2J/J (a2 laminin deficient mice) and Largemyd (mice with defect in the glycosilation of -DG) ; 2-) The analyses of the relative expression of genes involved in regeneration and degeneration, in different mice models for muscular dystrophies; 3-) The study of the roles of dystrophin and 2-laminin proteins in the organization of the dystrophin-glycoprotein complex in muscle sarcolemma through the generation of a new mouse model, double-mutant for these two proteins. In the first approach, bone marrow mesenchymal stem cells expressing eGFP protein were intravenously injected in Lama2dy-2J/J and Largemyd mice, but these cells were not localized in the muscle of the tested animals after 3 months of experiment. Complementary studies showed that MSC and C2C12 cells expressing eGFP, when directly injected in the muscle of these models, were retained for only a few days, suggesting a rejection against cells expressing eGFP in the dystrophic muscle. Functional analysis showed a high variability among the tested mice, which is similar to the significant clinical variability observed in human patients with muscular dystrophies. In the second approach we quantified the expression of genes involved in degeneration and regeneration pathways in the dystrophic models mdx, SJL/J, Lama2dy-2J/J and Largemyd, and correlated these data with muscle histopathological pattern of each model. The result suggests that TGFβ-1 gene is activated in the dystrophic process in all the stages of degeneration while the activation of the expression of the PCOL gene possibly occurs in earliest stages of this process. We also observed that each physiopathological mechanism acted differently in the activation of regeneration, with differences in the induction of proliferation of satellite cells, but with no alterations in stimulation to differentiation. Dysfunction of satellite cells can therefore be an important additional mechanism of pathogenesis in the dystrophic muscle. In the third approach we generated a new dystrophic mouse model, carrying two simultaneous deficiencies of the proteins dystrophin and 2-laminin, by crossing mdx and Lama2dy-2J/J strains. In the offspring, the proportion of affected double-mutant mice was within the expected mendelian proportion, showing therefore, the viability of these defects with life. Only 4 alive animals were obtained up to the present date, and they are being followed for clinical characterization. The phenotype of this double-mutant mouse is very severe, presenting significant weakness, starting earlier and progressing faster that the parental strains. When more affected animals will be available, additional protein studies will be done to verify the effect of these two deficiencies in the organization of the DGC complex and its effect on the cascades of muscle degeneration and regeneration.

A partir dos resultados do trabalho (de 2006 a 2011) na Clínica de Psicanálise do Centro do Genoma Humano da Universidade de São Paulo USP, que atende prioritariamente afetados de doenças neuromusculares de origem genética, empreendemos uma pesquisa cuja hipótese de trabalho é aquela segundo a qual o diagnóstico de uma alteração genética pode funcionar para a pessoa como um insulto etimologicamente: saltar sobre - e, consequentemente, fixá-la como queixosa, triste, desinteressada do mundo etc. Assim, a pesquisa foi idealizada a partir da compreensão de que, para além da evolução natural da doença degenerativa, a pessoa piora porque, paradoxalmente, busca se relocalizar no insulto. Mostramos que, com o tratamento psicanalítico, ela pode reinventar sua vida singularmente, confrontada à surpresa do diagnóstico. Detectamos um vírus social que nomeamos de RC, as iniciais de Resignação e Compaixão. Com grande frequência, notamos que, após um primeiro momento de revolta do paciente, ele vai da raiva à resignação enquanto, sua família, do choro à compaixão. Essas duas reações, contrárias ao paciente, são, no entanto, muito valorizadas socialmente. Nosso trabalho, indo na contra vertente do RC, teve como objetivo geral discutir: a) como os pacientes da medicina do futuro, aquela que não diz o que lhe aconteceu, ou o que está lhe acontecendo, mas o que pode ou vai lhe acontecer, podem reagir à ocorrência do sofrimento humano de uma forma que piora o seu estado atual e futuro; e b) como a psicanálise pode ser um instrumento importante para o tratamento dessas pessoas, restituindo a elas a responsabilidade pela singularidade de suas vidas, tendo como consequência, não só uma evidente melhora, bem como, por causa disso, eventualmente atrasar o progredir da doença, ganhando tempo para que os avanços na pesquisa genética venham quiçá a beneficiá-los. Especificamente, estuda os efeitos que aproximadamente quinze semanas de tratamento psicanalítico podem ter sobre: a) uma população que teve o diagnóstico de portador de doença degenerativa confirmado; e b) uma população composta por não portadores de doenças degenerativas, mas que, de algum modo, dada a íntima relação estabelecida (parentesco, amorosa ou de amizade) com o portador, poderia influenciar, direta e estreitamente, no dia-a-dia do doente. Para tanto, toma como sujeitos 42 portadores de doenças degenerativas e 22 pessoas que se relacionam com eles a quem foram oferecidas 15 semanas de tratamento psicanalítico. Cada paciente foi avaliado duas vezes (no início e no fim) por meio da utilização de uma adaptação da versão brasileira de uma escala de impressão clínica de mudança. Os seguintes fatos destacaram-se em cada categoria. Geral: 80% dos casos de alteração para melhor na relação do paciente com a doença. Estado mental/cognitivo: quase 50% da população melhorou a possibilidade de se expressar. Comportamento: 72% da população apresentou melhora nos sentimentos depressivos. Vida amorosa: notável melhora em todos os domínios. Posição subjetiva: quase 80% da população passou a se responsabilizar pela própria vida. Concluímos que, o tratamento psicanalítico proporciona alto índice de melhoria imediata do paciente, e pode, ao menos potencialmente, alargar o tempo de instalação da lesão / From the results of the project (2006 to 2011) at the Psychoanalysis Clinic of the Human Genome Center at the University of São Paulo (USP), which gives priority to those suffering from neuromuscular diseases of genetic origin, we undertook a study whose hypothesis is that the diagnosis of a genetic change may act as an insult leaping upon at the patient (insult comes from the Latin insultare to assail, jump upon) and can result in the patient complaining and becoming morose and disinterested in the world. This study was conceived from the awareness that, in addition to the natural progression of the degenerative disease, the patient deteriorates because, paradoxically, they attempt to relocate themselves within the insult. We show that with the help of psychoanalytic treatment, the patient, faced with the surprise of the diagnosis, can reinvent their life in a singular way. We have detected a social virus which we call RC, Resignation and Compassion and have frequently observed that, after initial anger, the patient moves towards resignation while the family changes from weeping to showing compassion. Both reactions, which do not help the patient, are, nevertheless, highly valued socially. Our study, which goes against this RC element, discusses: a) how the patients in the medicine of the future, which does not say what happened, or what is happening, but what may or will happen, can react to the occurrence of human suffering in a way that deteriorates their present and future condition; and b) how psychoanalysis can be an important tool in the treatment of these patients, giving back to them responsibility for the singularity of their lives, resulting in not only a clear improvement but also, as a result of this, a possible delay in the progress of the disease, gaining time during which advances in genetic research may benefit them. We specifically study the effects that approximately fifteen weeks of psychoanalytic treatment may have on: a) a population that had the diagnosis of degenerative diseases confirmed; and, b) a population made up of people not suffering from degenerative diseases, but who, given their close relationship (family, affectionate or friendship) with the patient, could closely affect their day-to-day lives. In order to do so¸ 42 subjects suffering from degenerative diseases, and 22 people who had relationships with them, were offered 15 weeks of psychoanalytic treatment. Each patient was evaluated twice (at the beginning and end) by using an adaptation of the Brazilian version of a scale of clinical impression of change. The following results can be emphasized in each category. General: 80% of patients improved. Mental / cognitive state: almost 50% improved their ability to express themselves. Behavior: 72% improved their depressive tendencies. Love life: remarkable improvements in all areas. Subjective position: almost 80% of the population started to take responsibility for their own lives. We conclude that psychoanalytic treatment has a high rate of immediate improvement in the patient and can, at least potentially, extend the period the degenerative disease requires to take effect

As Distrofias Musculares Progressivas constituem um grupo de doenças genéticas caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. As diferentes abordagens terapêuticas propostas para esse grupo de doenças têm como enfoque restaurar a proteína muscular deficiente por meio da terapia celular ou terapia gênica, ou o tratamento dos sinais e sintomas patológicos do músculo pela administração de fármacos e/ou fatores de crescimento. A combinação de diferentes estratégias pode aumentar a eficiência do reparo muscular. Deste modo, este trabalho tem como objetivo principal avaliar o potencial terapêutico das célulastronco mesenquimais (MSCs) associadas ao fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) para diferentes tipos de distrofias musculares. Inicialmente avaliamos o potencial miogênico de MSCs humanas de cordão umbilical in vitro. Nossos resultados demonstraram que os fatores solúveis liberados pelo músculo distrófico de camundongos mdx foram capazes de induzir a diferenciação miogênica terminal das células-tronco. Além disso, verificamos que o IGF-1, por si só, é capaz de promover a miogênese de MSCs, com mais eficiência que os protocolos de indução padrões. Ainda nos estudos in vitro, demonstramos que MSCs são capazes de interagir com células musculares de pacientes com Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) e restaurar a expressão de distrofina, quando cultivadas em meios suplementados com IGF-1. Frente a estes resultados, prosseguimos com os estudos em modelos animais, in vivo, e demonstramos que as MSCs humanas de cordão umbilical e IGF-1, quando administrados conjuntamente por via sistêmica, são capazes de modular a inflamação, reduzir a fibrose, aumentar o reparo muscular e, consequentemente, promover uma melhora clínica significativa do músculo de camundongos LAMA2dy/2j - modelo murino de Distrofia Muscular Congênita. Cabe ressaltar que as células humanas não foram rejeitadas após administração sistêmica em modelos animais não imunossuprimidos. Esses resultados suportam o potencial uso combinado de MSCs de cordão umbilical humano e IGF-1 no tratamento de distrofias musculares. Contudo, a confirmação destes dados em um modelo animal de grande porte, como os modelos caninos de distrofia muscular, é de extrema importância visando o entendimento dos mecanismos envolvidos no reparo muscular e avaliação de eventuais efeitos adversos, o que pode representar um passo importante para o início dos testes clínicos em pacientes / Progressive muscular dystrophies are a clinically and genetically heterogeneous group of disorders caused by the deficiency or abnormal muscle proteins, resulting in progressive degeneration and loss of skeletal muscle function. Strategies for the development of a muscular dystrophy therapy have focused on the possibility of restoring the defective muscle protein by cell therapy or on delivery of growth factors to treat or ameliorate muscular pathology symptoms. Combining both strategies could be a very useful approach to enhance the efficiency of muscle repair. The aim of this study is to evaluate the therapeutic potential of human mesenchymal stem cells (MSCs) from umbilical cord tissue combined with IGF-1 for muscle regeneration. Firstly, we verified the myogenic potential of these cells in vitro. Our results demonstrated that the soluble factors released from mdx dystrophic muscle were able to promote the myogenic differentiation of MSCs. Moreover, we showed that IGF-1 is capable of enhancing considerably the myogenesis of human MSCs from UC in vitro. More interestingly, we showed that IGF-1 enhances the interaction of MSCs and DMD muscle cells in coculture and the restoration of dystrophin expression. Subsequently, our in vivo studies revealed that the association of IGF-1 and MSCs markedly reduced muscle inflammation and fibrosis, and significantly improved muscle strength in LAMA2dy/2j mice, a murine model for congenital muscular dystrophy. It is important to point out that human cells are not rejected even in xenotransplants without immunosuppression. In summary, our results suggest that a combinatorial strategy of both IGF-1 and MSCs could enhance the efficiency of muscle repair and, therefore, should be further tested as a potential therapeutic approach in muscular dystrophies. However it is important to repeat the experiments on canine dystrophic model (GRMD; Golden Retriever Muscular Dystrophy) - in order to enhance our knowledge about the mechanism involved in muscle repair and monitor any eventual long-term side effects, which could represent an important point to start the clinical trial in patients

As Distrofias Musculares Progressivas constituem um grupo de doenças genéticas caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. As diferentes abordagens terapêuticas propostas para esse grupo de doenças têm como enfoque restaurar a proteína muscular deficiente por meio da terapia celular ou terapia gênica, ou o tratamento dos sinais e sintomas patológicos do músculo pela administração de fármacos e/ou fatores de crescimento. A combinação de diferentes estratégias pode aumentar a eficiência do reparo muscular. Deste modo, este trabalho tem como objetivo principal avaliar o potencial terapêutico das célulastronco mesenquimais (MSCs) associadas ao fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) para diferentes tipos de distrofias musculares. Inicialmente avaliamos o potencial miogênico de MSCs humanas de cordão umbilical in vitro. Nossos resultados demonstraram que os fatores solúveis liberados pelo músculo distrófico de camundongos mdx foram capazes de induzir a diferenciação miogênica terminal das células-tronco. Além disso, verificamos que o IGF-1, por si só, é capaz de promover a miogênese de MSCs, com mais eficiência que os protocolos de indução padrões. Ainda nos estudos in vitro, demonstramos que MSCs são capazes de interagir com células musculares de pacientes com Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) e restaurar a expressão de distrofina, quando cultivadas em meios suplementados com IGF-1. Frente a estes resultados, prosseguimos com os estudos em modelos animais, in vivo, e demonstramos que as MSCs humanas de cordão umbilical e IGF-1, quando administrados conjuntamente por via sistêmica, são capazes de modular a inflamação, reduzir a fibrose, aumentar o reparo muscular e, consequentemente, promover uma melhora clínica significativa do músculo de camundongos LAMA2dy/2j - modelo murino de Distrofia Muscular Congênita. Cabe ressaltar que as células humanas não foram rejeitadas após administração sistêmica em modelos animais não imunossuprimidos. Esses resultados suportam o potencial uso combinado de MSCs de cordão umbilical humano e IGF-1 no tratamento de distrofias musculares. Contudo, a confirmação destes dados em um modelo animal de grande porte, como os modelos caninos de distrofia muscular, é de extrema importância visando o entendimento dos mecanismos envolvidos no reparo muscular e avaliação de eventuais efeitos adversos, o que pode representar um passo importante para o início dos testes clínicos em pacientes / Progressive muscular dystrophies are a clinically and genetically heterogeneous group of disorders caused by the deficiency or abnormal muscle proteins, resulting in progressive degeneration and loss of skeletal muscle function. Strategies for the development of a muscular dystrophy therapy have focused on the possibility of restoring the defective muscle protein by cell therapy or on delivery of growth factors to treat or ameliorate muscular pathology symptoms. Combining both strategies could be a very useful approach to enhance the efficiency of muscle repair. The aim of this study is to evaluate the therapeutic potential of human mesenchymal stem cells (MSCs) from umbilical cord tissue combined with IGF-1 for muscle regeneration. Firstly, we verified the myogenic potential of these cells in vitro. Our results demonstrated that the soluble factors released from mdx dystrophic muscle were able to promote the myogenic differentiation of MSCs. Moreover, we showed that IGF-1 is capable of enhancing considerably the myogenesis of human MSCs from UC in vitro. More interestingly, we showed that IGF-1 enhances the interaction of MSCs and DMD muscle cells in coculture and the restoration of dystrophin expression. Subsequently, our in vivo studies revealed that the association of IGF-1 and MSCs markedly reduced muscle inflammation and fibrosis, and significantly improved muscle strength in LAMA2dy/2j mice, a murine model for congenital muscular dystrophy. It is important to point out that human cells are not rejected even in xenotransplants without immunosuppression. In summary, our results suggest that a combinatorial strategy of both IGF-1 and MSCs could enhance the efficiency of muscle repair and, therefore, should be further tested as a potential therapeutic approach in muscular dystrophies. However it is important to repeat the experiments on canine dystrophic model (GRMD; Golden Retriever Muscular Dystrophy) - in order to enhance our knowledge about the mechanism involved in muscle repair and monitor any eventual long-term side effects, which could represent an important point to start the clinical trial in patients

O objetivo foi construir escala do sentar e levantar da cadeira para distrofia muscular de Duchenne (EAF-1), testar confiabilidade e correlacioná-la com tempo de execução, idade e Escala de Vignos. A construção ocorreu por meio da avaliação de 30 crianças com distrofia muscular de Duchenne (5 a 12 anos), totalizando 120 registros do sentar e levantar. Utilizou-se Índice de Correlação Intra-Classe (ICC) e Coeficiente Kappa Ponderado. A escala abrange três fases para o sentar e três para o levantar, com escores de 0 a 44 e 0 a 54 respectivamente. Encontrou-se na repetibilidade ICC >= 0,91 e Kappa > 0,91 para o sentar; ICC >= 0,91 e Kappa > 0,87 para o levantar e na reprodutibilidade ICC >= 0,90 e Kappa > 0,88 para o sentar; ICC >= 0,89 e Kappa > 0,94 para o levantar; boa correlação com tempo do sentar e levantar (r = 0.69 e r = 0.66) e entre idade e sentar (r = 0.44). EAF-1 apresentou confiabilidade de excelente a muito boa, permitindo avaliação detalhada da função. / The aim was to construction a scale of sitting and standing from chair for Duchenne muscular dystrophy (EAF-1), to test reliability and to correlate it with running time, age and Vignos scale. The construction occurred by means of 30 childrens evaluation with Duchenne muscular dystrophy (aged 5-12 years), totalizing 120 registers of sitting and standing. It was used Intraclass Correlation Coefficient (ICC) and Weighted Kappa Coefficient. The scale comprises three phases for sitting and three for standing, with scores from 0 to 44 and from 0 to 54, respectively. In the repeatability was found ICC 0,91 and Kappa > 0,91 for sitting; ICC >= 0,91 and Kappa > 0,87 for standing and in the reproducibility ICC >= 0,90 and Kappa > 0,88 for sitting; ICC >= 0,89 and Kappa > 0,94 for standing; good correlation with time of sitting and standing (r = 0.69 e r = 0.66) and between age and sitting (r = 0.44). Excellent reliability was presented by EAF-1, which permits detailed evaluation function.

O objetivo foi construir escala do sentar e levantar da cadeira para distrofia muscular de Duchenne (EAF-1), testar confiabilidade e correlacioná-la com tempo de execução, idade e Escala de Vignos. A construção ocorreu por meio da avaliação de 30 crianças com distrofia muscular de Duchenne (5 a 12 anos), totalizando 120 registros do sentar e levantar. Utilizou-se Índice de Correlação Intra-Classe (ICC) e Coeficiente Kappa Ponderado. A escala abrange três fases para o sentar e três para o levantar, com escores de 0 a 44 e 0 a 54 respectivamente. Encontrou-se na repetibilidade ICC >= 0,91 e Kappa > 0,91 para o sentar; ICC >= 0,91 e Kappa > 0,87 para o levantar e na reprodutibilidade ICC >= 0,90 e Kappa > 0,88 para o sentar; ICC >= 0,89 e Kappa > 0,94 para o levantar; boa correlação com tempo do sentar e levantar (r = 0.69 e r = 0.66) e entre idade e sentar (r = 0.44). EAF-1 apresentou confiabilidade de excelente a muito boa, permitindo avaliação detalhada da função. / The aim was to construction a scale of sitting and standing from chair for Duchenne muscular dystrophy (EAF-1), to test reliability and to correlate it with running time, age and Vignos scale. The construction occurred by means of 30 childrens evaluation with Duchenne muscular dystrophy (aged 5-12 years), totalizing 120 registers of sitting and standing. It was used Intraclass Correlation Coefficient (ICC) and Weighted Kappa Coefficient. The scale comprises three phases for sitting and three for standing, with scores from 0 to 44 and from 0 to 54, respectively. In the repeatability was found ICC 0,91 and Kappa > 0,91 for sitting; ICC >= 0,91 and Kappa > 0,87 for standing and in the reproducibility ICC >= 0,90 and Kappa > 0,88 for sitting; ICC >= 0,89 and Kappa > 0,94 for standing; good correlation with time of sitting and standing (r = 0.69 e r = 0.66) and between age and sitting (r = 0.44). Excellent reliability was presented by EAF-1, which permits detailed evaluation function.

O músculo esquelético é um tecido que tem a capacidade de se regenerar após lesão, seja ela patológica ou induzida. Para tanto, células musculares progenitoras, presentes no músculo adulto, atuam fundindo-se entre si, ou com as fibras musculares danificadas, para formar novas fibras. A via da macroautofagia, implicada na degradação e reciclagem de proteínas e organelas danificadas via lisossomo, é essencial para a manutenção da massa muscular, mas já foi também implicada na diferenciação e funcionamento de células progenitoras do músculo. Além disso, essa via está desregulada em diversas doenças neuromusculares, o que destaca seu papel nesse tecido. Nesse estudo, a regulação da autofagia foi investigada em diferentes situações de formação e degradação do músculo. Para estudar o processo de diferenciação muscular in vitro utilizamos um modelo de células musculares imortalizadas normais, e de paciente com miopatia ligada ao X com autofagia excessiva (XMEA). A análise dos genes e proteínas p62, BNIP3, BECLIN1, VPS34, ATG12 e LC3, além de alvos de mTOR, mostrou um padrão similar de expressão em mioblastos indiferenciados e miotubos diferenciados a partir de células controle e nas derivadas de paciente XMEA. Estes resultados sugerem que a desregulação da via autofágica relacionada à doença provavelmente surge em estágios mais avançados, como se observa em doenças de acúmulo lisossomal. A investigação da diferenciação muscular nessas células mostrou um aumento na capacidade de fusão de mioblastos XMEA, que não foi relacionado a mudanças na expressão de genes envolvidos na miogênese. Isso indica que o defeito primário relacionado a XMEA, como a deficiência da ATPase vacuolar, pode interferir no processo de diferenciação muscular. Para estudar o músculo em condições patológicas, utilizamos modelos animais para distrofias musculares que possuem distintos graus de afecção do músculo, como o DMDmdx, modelo para distrofia muscular de Duchenne, o SJL/J, modelo para distrofia muscular de cinturas tipo 2B e o Largemyd, modelo para distrofia muscular congênita 1D. Observamos que não há alterações globais na expressão de genes e proteínas da autofagia. Adicionalmente, cada modelo murino teve alterações pontuais, destacando a ausência de correlação entre o grau de degeneração do músculo e as alterações observadas na via autofágica. Por outro lado, quando uma lesão muscular é induzida em músculo normal, houve uma diminuição da expressão de todos os genes estudados, Bnip3, Beclin1, Vps34, Atg12, Lc3 e Gabarapl1, com possível acúmulo das proteínas autofágicas p62 e Beclin1. Com a recuperação do músculo, após cinco dias da lesão, a maior parte dos genes estudados teve sua expressão normalizada. Tais resultados indicam que a lesão aguda se relaciona a uma resposta drástica e recuperação rápida na via da autofagia. Em conjunto, nossos resultados mostram que a via da autofagia é diferencialmente afetada a depender do estímulo dado ao músculo, seja ele de regeneração e formação de novas células musculares ou de degeneração. Dessa forma, este estudo pode ter implicações para o desenvolvimento de terapias que tenham como alvo a via autofágica, já que indica que o momento da intervenção terapêutica pode ser importante, assim como o estímulo que levou a alterações no tecido muscular / The skeletal muscle is a tissue that has the ability to regenerate upon lesion, whether it occurs pathologically or induced. Therefore, progenitor muscle cells, present in the adult muscle, act by fusing with each other or with damaged fibers in order to recover the tissue. The macroautophagy pathway, related to degradation and recycling of proteins and damaged organelles via lysosome, is essential for the maintenance of muscle mass, and it was also implicated in the differentiation and functioning of muscle progenitor cells. Besides that, this pathway is deregulated in several neuromuscular disorders, highlighting its important role in this tissue. In this study, the autophagic regulation was investigated in distinct contexts of muscle formation and degradation. To study the muscle differentiation process in vitro, we used a model of immortalized muscle cells from both a normal control and a patient with X-linked myopathy with excessive autophagy (XMEA). The genes and proteins p62, BNIP3, BECLIN1, VPS34, ATG12, LC3 and mTOR targets showed a similar pattern of expression in both undifferentiated myoblasts and differentiated myotubes, from both control cells and XMEA patient-derived cells. This fact suggests that autophagic deregulation might arise in later stages of the disease, in a pattern observed in disorders with protein accumulation. The investigation of muscle differentiation in the studied cells showed an enhancement of the myoblast fusion capacity in XMEA cells, which was not related to changes in the expression of myogenic genes. This observation indicates that the primary defect related to the XMEA pathology, as the deficiency of the vacuolar ATPase, might interfere in the process of muscle differentiation. In order to evaluate muscle in pathological conditions, we studied animal models for muscular dystrophies that have distinct patterns of muscle affection, such as the DMDmdx, model for the Duchenne muscular dystrophy, the SJL/J, model for the limb-girdle muscle dystrophy type 2B and the Largemyd, model for the congenital muscular dystrophy type 1D. We did not find any global alterations in the expression of autophagic genes and proteins. Additionally, each animal model had discrete changes, highlighting the absence of correlation between the pattern of muscle degeneration and alterations in the autophagy pathway. On the other hand, when a lesion is induced in normal muscle, there is a decrease in the expression of all studied genes, such as Bnip3, Beclin1, Vps34, Atg12, Lc3 and Gabarapl1, with a possible accumulation of the autophagic proteins p62 and Beclin1. With muscle recovery, five days after lesion, most of the studied genes had their expression returning to normal levels. These results indicate that the acute lesion is related to a drastic response and rapid recovery of the autophagic pathway. Together, our results show that autophagy is differentially affected depending on the stimulus given to the muscle, either of regeneration and formation of new muscle cells or degeneration. In that sense, this study may have implications for the development of therapies that target autophagy, since it indicates that the time point of therapeutic interventions may be important, as well as the stimulus that led to alterations in the skeletal muscle tissue

Introdução: A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é caracterizada como uma fraqueza muscular progressiva que leva à incapacidade. Devido às dificuldades funcionais enfrentadas pelos indivíduos com DMD, o uso da tecnologia assistiva é essencial para proporcionar ou promover habilidades funcionais. Na DMD, além do comprometimento musculoesquelético, uma disfunção autonômica cardíaca também tem sido relatada. Assim, visamos investigar as respostas autonômicas agudas de indivíduos com DMD durante a realização de uma tarefa no computador. Método: A variabilidade da frequência cardíaca foi avaliada através de métodos lineares e não lineares, utilizando uma cinta torácica com equipamento de monitoramento de eletrocardiograma (ECG). Assim, 45 indivíduos foram incluídos no grupo com DMD e 45 no grupo de desenvolvimento típico (controle), avaliados for 20 minutos em repouso sentado e 5 minutos com a realização de uma tarefa no computador. Resultados: Os indivíduos com DMD apresentaram menor modulação cardíaca parassimpática durante o repouso, que diminuiu ainda mais durante a tarefa no computador. Conclusão: Indivíduos com DMD exibiram respostas autonômicas cardíacas mais intensas durante a tarefa no computador / Introduction: Duchenne muscular dystrophy (DMD) is characterized by progressive muscle weakness that leads to disability. Due to functional difficulties faced by individuals with DMD, the use of assistive technology is essential to provide or expand functional abilities. In DMD, as well as musculoskeletal impairment, cardiac autonomic dysfunction has also been reported. Thus, we aimed to investigate acute cardiac autonomic responses in a computer task of DMD subjects. Method: Heart rate variability was evaluated through linear and nonlinear methods, using a breast strap electrocardiogram (ECG) measuring device. Thus, 45 subjects were included in the group with DMD and 45 in the typical development (control) group, assessed for 20 minutes sitting at rest and five minutes with a task on the computer. Results: Individuals with DMD had lower parasympathetic cardiac modulation at rest, which decreased further during the task on the computer. Conclusion: Individuals with DMD exhibited more intense cardiac autonomic responses during computer tasks

Os movimentos do membro superior na distrofia muscular de Duchenne devem ser avaliados para acompanhar a evolução clínica e estabelecer abordagens terapêuticas. Testes que cronometram o desempenho em tarefas funcionais representam uma forma precisa de avaliar a independência funcional e monitorar a progressão da doença. O tempo necessário para a realização de uma tarefa pode refletir a evolução e predizer a habilidade funcional. Contudo, o desempenho pode ser influenciado por movimentos compensatórios, que são comumente adotados para a manutenção da independência funcional. Esta Tese é composta por quatro artigos científicos, que objetivaram: (1) investigar a relação entre as características cinesiológicas, avaliadas pelo teste Performance of Upper Limb e tempo no Teste de Jebsen-Taylor; (2) investigar possíveis diferenças e relações entre o desempenho do membro superior dominante e do membro superior não-dominante de pacientes com distrofia muscular de Duchenne e comparar o desempenho dos pacientes com o de controles saudáveis; (3) descrever a confiabilidade teste-reteste e a consistência interna dos tempos de pacientes com distrofia muscular de Duchenne no Teste de Jebsen-Taylor e (4) comparar os movimentos compensatórios de pacientes e controles saudáveis na tarefa de levar uma colher à boca. Os quatro estudos foram realizados de forma prospectiva observacional. Os resultados mostraram que (1) o Teste de Jebsen-Taylor está correlacionado com o Teste padrão-ouro (Performance of Upper Limb) e o tempo reflete a função motora de membros superiores de pacientes com distrofia muscular de Duchenne; (2) não há diferença na assimetria entre os membros superiores de pacientes quando comparados a indivíduos saudáveis; o desempenho do membro superior dominante é fortemente correlacionado com o do membro superior não-dominante; (3) o Teste de Jebsen-Taylor possui boas propriedades psicométricas e (4) ao levar uma colher à boca, pacientes realizam movimentos compensatórios, como aumento da flexão de cabeça e de cotovelo. Como conclusão, o Teste de Jebsen-Taylor contribui para a avaliação da função motora do membro superior em pacientes com distrofia muscular de Duchenne, por meio da medida do tempo e dos movimentos compensatórios. Os dados normativos apresentados nesta Tese podem ser usados como parâmetros para acompanhamento clínico e terapêutico de pacientes com distrofia muscular de Duchenne / The upper limb movements in Duchenne muscular dystrophy must be evaluated to monitor clinical evolution and establish therapeutic approaches. Tests that measure timed performance on functional tasks represent an accurate way of assessing functional independence and monitoring disease progression. Timed performance can accurately reflect evolution and predict functional skills. However, performance can be influenced by compensatory movements that are commonly adopted to maintain functional independence. This Thesis comprises four articles that aimed to: (1) investigate the relationship between the kinesiological characteristics evaluated by Performance of Upper Limb test and timed performance of the Jebsen-Taylor Test; (2) to investigate possible differences and relationships between the performance of the dominant and the non-dominant upper limbs of patients with Duchenne muscular dystrophy and to compare the performance of patients with healthy controls; (3) describe the timed performance of patients with muscular dystrophy and to investigate the test-retest reliability and internal consistency of the Jebsen-Taylor Test and (4) compare the compensatory movements of patients and healthy controls in bringing a spoon to the mouth. The four studies were observational and prospective. The results showed that (1) Jebsen-Taylor Test is strongly correlated to the gold standard test (Performance of Upper Limb) and timed performance reflects upper limb motor function in patients with Duchenne muscular dystrophy; (2) upper limbs asymmetry in patients with Duchenne muscular dystrophy is not higher than in healthy individuals, and the dominant upper limb performance is strongly correlated to the non-dominant upper limb performance; (3) Jebsen-Taylor test has good psychometric properties and (4) patients perform compensatory movements while bringing a spoon to the mouth, as increased head flexion and increased elbow flexion. In conclusion, Jebsen-Taylor test contributes to upper limb motor function assessment in patients with Duchenne muscular dystrophy, as it measures time and compensatory movements. This thesis provides normative data that can be parameters for clinical and therapeutic follow up of patients with muscular dystrophy

Introdução: As Distrofias Musculares Congênitas (DMCs) são um grupo clínica e geneticamente heterogêneo de doenças musculares que se manifestam ao nascimento ou no primeiro ano de vida, sendo caracterizadas por hipotonia, fraqueza muscular, retardo do desenvolvimento motor e retrações fibrotendíneas. O músculo esquelético apresenta-se distrófico, mas sem alterações estruturais específicas. Em quase metade dos casos a doença é causada pela deficiência da laminina alfa;-2 (merosina). Outras deficiências proteicas descritas incluem: colágeno VI, selenoproteína N1, várias glicosiltransferases responsáveis pela glicosilação da alfa- distroglicana e lamina A/C. Vários genes já foram identificados. Objetivo: o objetivo deste estudo foi a caracterização clínica, histológica e molecular das crianças com DMC por deficiência de lamina A/C. Método: Foram incluídos 13 pacientes com diagnóstico clínico e histológico de DMC, com expressão muscular normal para distrofina, sarcoglicanas, merosina, colágeno 6 e disferlina. Os pacientes foram reavaliados segundo protocolo clínico e neurológico. As biópsias musculares realizadas previamente foram revisadas e o estudo das mutações no gene da lamina A/C foi realizado através de sequenciamento de toda região codificadora do gene. Resultados: Identificamos mutações em 30,7% dos pacientes (quatro casos) com fenótipo clínico de DMC por deficiência de lamina A/C. Todas as mutações encontradas (p.E358K, p.R249W, e p.N39S) ocorreram em heterozigose e de novo e já haviam sido descritas na literatura em pacientes com distrofias musculares. Em geral, estes pacientes apresentavam um grave comprometimento motor com o característico aspecto de cabeça caída, com início dos sintomas nos primeiros dois anos de vida. A CPK estava elevada entre 2 a 6 vezes o padrão superior da normalidade. O padrão histológico variou desde um músculo levemente até gravemente distrófico. Curiosamente, no estudo histológico do músculo, um dos pacientes apresentou agregados intracitoplasmáticos. Um outro paciente apresentava associadamente alterações neurogênicas ao estudo eletroneuromiográfico. Em todos os casos observamos complicações respiratórias, cardíacas e distúrbios de deglutição. Houve um caso de morte súbita, provavelmente em decorrência de arritmia cardíaca. Conclusões: A correlação genótipo-fenótipo permanece difícil, mas todos os casos apresentaram sinal da cabeça caída, comprometimento respiratório, cardíaco e biópsia muscular distrófica. A ampliação do conhecimento clínico e histológico pode orientar o diagnóstico e direcionar para o estudo molecular adequado, além de permitir o diagnóstico precoce das complicações, tão frequentes na DMC por deficiência de lamina A/C. Os exons 1, 4 e 6 são os mais frequentemente mutados e devem ser pesquisados inicialmente. Esta série de casos contribui também por demonstrar a distribuição universal da doença / Background: The Congenital Muscular Dystrophies (CMD) are a clinically and genetically heterogeneous group of myopathies characterized by muscle hypotonia, delayed motor development and early onset of progressive muscle weakness with dystrophic pattern on muscle biopsy. The clinical course is broadly variable and can comprise the involvement of the brain and eyes. Almost half of the cases is caused by deficiency of laminin-alfa 2 (merosin). Other protein deficiencies described include: collagen VI, selenoprotein N1, several glycosyltransferases responsible for glycosylation of alfa-dystroglycan and lamin A/C. Several genes have been identified and the increased knowledge of new clinical and histological forms of CMD can guide diagnosis and direct appropriate molecular studies. LMNA-related CMD is often characterized by muscle weakness and a dropped head developed in the early years of life. Regarding lamin A/C deficiency, the immunohistochemical findings can be normal, probably because the protein change is functional only; this makes diagnosis using muscle samples more difficult. Objectives: The aim of this study was to characterize the clinical, histological and molecular aspects in patients with CMD related to deficiency of lamin A/C. Methods: thirteen children with clinical and histological diagnosis of CMD with normal muscle expression for dystrophin, merosin, collagen 6, sarcoglycans and dysferlin were included in this study. The LMNA gene was sequenced after amplification of all coding exons. In addition, the muscle biopsies were revised. Results: In 30.7% (four cases) of our patients with typical clinical phenotype of lamin A/C deficiency were detected mutations on LMNA gene and all of them presented dropped-head syndrome, restrictive ventilator insufficiency, cardiac changes, increased serum CPK level and myopathic/dystrophic aspect on muscle biopsy. Two of the patients had normal motor development milestones in the first months of life and subsequently developed cervical and limb weakness. The other two patients presented a more severe motor involvement and failure to walk. One patient showed associated peripheral neuropathy. Curiously one case had myofibrillar aggregates on muscle biopsy. All mutations (p.E358K, p.R249W and p.N39S) were heterozygous and de novo and had been previously described in patients with muscular dystrophy. Conclusion: Genotype/phenotype correlation in CMD remains difficult. However patients with LMNA mutation and CMD seems to have a more homogeneous phenotype characterized by dropped head, severe motor disability, and cardiac and pulmonary involvement. Mutations on exons 1, 4 and 6 should be tested first. This case series also contributes for showing the universal distribution of the disease