Orientadores: Elaine Minatel, Marcos José Salvador / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T16:01:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DosSantos_FernandaRapucciMoraes_M.pdf: 2129374 bytes, checksum: 6dd904b58af615db751be55933a6f841 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Os anti-inflamatórios corticosteróides são os fármacos mais utilizados no tratamento da distrofia muscular de Duchenne. Porém, devido aos severos efeitos colaterais que apresentam, é fundamental a busca por terapias alternativas que minimizem a evolução da doença e melhorem a qualidade de vida dos pacientes distróficos e ao mesmo tempo apresentem menos efeitos colaterais do que os corticosteróides. Recentes estudos, em modelos experimentais, demonstram que os óleos essenciais extraídos de espécies do gênero Citrus apresentam potencial efeito benéfico sobre doenças associadas ao estresse oxidativo e/ou inflamação. Sendo assim, o presente trabalho teve por objetivo realizar o estudo químico do óleo essencial de Citrus aurantifolia obtido a partir de prensagem a frio da casca dos frutos, seguido de destilação a vapor, comercializado sob o nome de Lima destilada e avaliar seu potencial efeito anti-inflamatório e antioxidante sobre células musculares distróficas de camundongos mdx. O estudo consistiu em duas partes. Na primeira realizou-se a caracterização do perfil químico por CG-EM e a avaliação da atividade antioxidante in vitro do óleo essencial utilizando-se os ensaios de redução do radical DPPH e ORACFL. A segunda parte consistiu na administração do óleo essencial de C. aurantifolia in vitro sobre células musculares distróficas de camundongos mdx. Após o tratamento, avaliou-se a toxicidade do óleo essencial, e realizou-se a quantificação de H2O2 e de TNF-?, NF-?B e 4-HNE nas células musculares (Western Blotting). O óleo essencial de C. aurantifolia estudado apresentou como constituintes químicos majoritários o limoneno (42,6%), ?-terpineol (11,76%), cimeno (11,80%), ?-terpineno (4,63%) e terpinoleno (5,30%), com resultados coerentes com o esperado para esta espécie vegetal; apresentou-se ativo com capacidade antioxidante in vitro nos ensaios DPPH (forte resultado antioxidante na diluição 1:250 (v/v) em metanol) e ORACFL (950 µmol/TE g -1); demonstrou não ser tóxico, uma vez que a viabilidade celular, tanto nas células controle (C57BL/10) como nas células distróficas, se manteve acima de 90%; atenuou os efeitos deletérios que ocorrem nas células musculares distróficas, no que diz respeito à inflamação (reduziu o conteúdo de TNF-?) e estresse oxidativo (reduziu o conteúdo de 4-HNE e a produção de H2O2). Diante do exposto, acreditamos que o óleo essencial de Lima destilada possa ser potencialmente útil para o tratamento farmacológico da distrofia muscular. Entretanto, são necessários estudos futuros para se verificar qual é a dosagem e o tempo de tratamento adequados para se obter o melhor efeito deste óleo essencial / Abstract: Anti-inflammatory corticosteroids are the most commonly used drugs for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. However, due to their severe side effects, it is essential to search for alternative therapies that minimize the evolution of the disease and improve the life quality of dystrophic patients while showing fewer side effects than corticosteroids. Recent studies in experimental models have shown that essential oils extracted from genus Citrus species have a potential beneficial effect on diseases associated with oxidative stress and/or inflammation. Thus, the aim of the present study is to perform the chemical study of the Citrus aurantifolia essential oil obtained from cold pressing the peel of the fruit, followed by steam distillation, marketed under the name Lima distilled and evaluate its potential antioxidant and anti-inflammatory effects on dystrophic muscle cells of mdx mice. The project consisted of two parts. The first was carried out to characterize the chemical profile by GC-EM and evaluation of in vitro antioxidant activity of the essential oil using trials reduction of DPPH radical and ORACFL. The second part consisted of the administration of the C. aurantifolia essential oil in vitro on dystrophic muscle cells from mdx mice. After treatment, the toxicity of essential oil was evaluated, the concentration of H2O2 was detected and TNF-?, NF-kB and 4-HNE levels in muscle cells were quantified (Western blotting). Essential Distilled Lime Oil studied showed important chemical constituents as major limonene (42.6%), ?-terpineol (11,76%), cymene (11,80%), ?-terpinene (4,63%) e terpinolene (5,30%), with results consistent with expectations for this plant species; it was active with an antioxidant capacity in vitro on the DPPH and ORACFL assays (950 µmol/TE g -1); was not toxic, the cell viability in both control cells (C57BL/10) and in dystrophic muscle cells was above 90%; it also attenuated the deleterious effects that occur in dystrophic muscle cells in relation to inflammation (reduced TNF-? content) and oxidative stress (reduced 4-HNE content and H2O2 production). Therefore, we believe that the Essential Distilled Lime Oil can be potentially useful for the pharmacological treatment of muscular dystrophy. However, future studies are needed to check what is the dosage and period of treatment suitable to achieve the best effect of this essential oil / Mestrado / Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde / Mestra em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos

Orientadores: Maria Julia Marques, Selma Maria Michelin Matheus / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T06:49:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DeCarvalho_SamaraCamacari_M.pdf: 1740331 bytes, checksum: ad4bf7c2d274ea63e20314141eeb1e83 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma miopatia progressiva causada pela ausência da proteína distrofina e necrose muscular progressiva. No camundongo mdx, modelo da DMD, a resposta inflamatória é exacerbada e populações distintas de macrófagos, M1 e M2, influenciam a degeneração e regeneração muscular, respectivamente, regulando a progressão da doença. Anti-inflamatórios esteróides são utilizados para a terapia farmacológica da DMD. Contudo, os efeitos colaterais decorrentes do seu uso contínuo estimulam o desenvolvimento de novas terapias farmacológicas para esta doença. No presente trabalho, verificamos os efeitos do ácido eicosapentaenóico (EPA) sobre os macrófagos M1 e M2 nos músculos bíceps braquial (BB), diafragma (DIA) e quadríceps femoral (QDR) do camundongo mdx. Camundongos mdx (14 dias de vida pós-natal) receberam 300mg/Kg de EPA diluído em óleo mineral, via gavagem, diariamente, por 16 dias. Camundongos mdx não tratados e camundongos C57BL/10 não tratados receberam óleo mineral via gavagem, pelo mesmo período. Verificamos que o EPA diminuiu a mionecrose (redução da CK no plasma) e aumentou o número de fibras com núcleo periférico, principalmente no BB e DIA. Em todos os músculos estudados, o tratamento com EPA diminuiu significativamente a área total de inflamação. Nos músculos BB e DIA, o tratamento com EPA aumentou a área de macrófagos M2. No QDR, observou-se predominância de regeneração muscular após o EPA, evidenciada por extensas áreas contendo fibras com núcleo central, em diferentes estágios de regeneração. Estes resultados sugerem que o EPA altera o balanço entre os macrófagos M1 e M2, promovendo diminuição de macrófagos M1, citotóxicos, o que pode contribuir para a proteção contra a mionecrose dos músculos distróficos / Abstract: Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a progressive myopathy characterized by the absence of dystrophin and progressive muscle necrosis. In the mdx mice model of DMD, the inflammatory response is exacerbated and distinct macrophage populations, M1 and M2, influence muscle degeneration and regeneration, respectively, regulating the progression of the disease. Antiinflammatory steroids are the choice pharmacological therapy for DMD. However, their side effects stimulate the development of new drug therapies for this disease. In the present study, we observed the effects of eicosapentaenoic acid (EPA) on M1 and M2 macrophages in the biceps brachii (BB), diaphragm (DIA) and quadriceps (QDR) muscles of the mdx mice. Mdx mice (14 days old) received 300mg/kg of EPA diluted in mineral oil by gavage, daily, for 16 days. Untreated mdx and C57BL/10 mice received mineral oil by gavage for the same period. We observed that EPA decreased myonecrosis (reduced plasma CK) and increased the number of fibers with peripheral nuclei, mainly in the BB and DIA. In all muscles, treatment with EPA significantly decreased the total area of inflammation. In DIA and BB muscles, treatment with EPA increased the area of M2 macrophage. In the QDR, there was a predominance of muscle regeneration after EPA, with extensive areas containing fibers with central nuclei at different stages of regeneration. These results suggest that EPA affects the balance of M1 and M2 macrophages in dystrophic muscles, with a trend towards a decrease in the cytotoxic M1 phenotype, which may contribute to the protection against myonecrosis in the dystrophic muscles / Mestrado / Anatomia / Mestra em Biologia Celular e Estrutural

Les répétitions de trinucléotides sont des séquences répétées en tandem pouvant subir, chez l'homme, de larges expansions à l'origine de nombreuses maladies génétiques. La dystrophie myotonique de type 1 (DM1) est due à l'expansion d'une répétition CTG en 3'UTR du gène DMPK. Les mécanismes d'instabilités des répétitions, peu connus, reposeraient sur leur capacité à former des structures secondaires constituant un obstacle aux mécanismes impliquant une synthèse d'ADN. Nous avons montré qu'une TALEN induisant une cassure double brin dans les répétitions CTG à l'origine de la DM1 insérées chez la levure Saccharomyces cerevisiae permettait de manière efficace et spécifique d'aboutir après réparation à leur contraction. Le mécanisme de réparation est dépendant uniquement de deux gènes, RAD50 et RAD52, suggérant la formation de structures aux extrémités de la DSB devant être retirées pour initier la réparation, suivis d'une réaction de SSA entre les répétitions aboutissant à leur contraction. L'efficacité et spécificité d'un système CRISPR-Cas9 à contracter ces répétitions chez la levure ont été comparées à la TALEN. L'induction de CRISPR-Cas9 n'aboutit pas à la contraction des répétitions mais à des réarrangements chromosomiques suggérant un manque de spécificité et un mécanisme de réparation différent de celui de la TALEN. Enfin, nous avons étudié si ces nucléases peuvent contracter ces répétitions CTG à des tailles non pathologiques dans des cellules de mammifères. L'induction de la TALEN dans des cellules de souris transgéniques DM1, puis dans des fibroblastes humains de patients DM1 montre des résultats préliminaires encourageant de contraction des répétitions. / Trinucleotides repeats are a specific class of microsatellites whose large expansions are responsible for many human neurological disorders. Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is due to an expansion of CTG repeats in the 3’UTR of DMPK gene, which can reach thousands of repeats. Molecular mechanisms leading to these large expansions are poorly understood but in vitro studies have shown the capacity of these repeats to form secondary structures, which probably interfere with mechanisms involving DNA synthesis. We shown that a TALEN used to induce double-strand break (DSB) in DM1 CTG repeats integrated in the yeast Saccharomyces cerevisiae is specific and leads to highly efficient repeat contractions after repair. Mechanism involved in TALEN-induced DSB only depends of RAD50 and RAD52 genes, suggesting the formation of secondary structures at DSB ends that need to be removed for repair initiation, followed by an intramolecular recombinaison repair such as SSA between repeats leading to their contraction. We compared the efficiency and specificity of a CRISPR-Cas9 and the TALEN to contract CTG repeats in yeast. Surprisingly, CRISPR-Cas9 induction do not lead to repeat contraction but to chromosomal rearrangement, suggesting a lack of specificity and a different repair mechanism than with the TALEN. At last, we studied whether these nucleases could contract CTG repeats to a non-pathological length in mammalian cells. Finally, TALEN induction in DM1 transgenic mice cells, and in DM1 human fibroblasts show promising repeat contractions.

Devido à carência de avaliações para Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), fisioterapeutas desenvolveram e testaram a confiabilidade da Functional Evaluation Duchenne Muscular Dystrophy (FES-DMD). Visando otimizar sua aplicação foi necessário um software. O objetivo deste estudo foi desenvolver e testar a usabilidade de software para aplicação da FES-DMD. Para desenvolver o software foi necessário um engenheiro, um programador e uma fisioterapeuta. Após finalização foi realizada avaliação técnica por cinco pareceristas e aplicado teste de usabilidade com quinze fisioterapeutas especialistas, para avaliar o uso do software na prática clínica e coletar o tempo de aplicação da FES-DMD. De acordo com as características exigidas o software foi desenvolvido com especificações: linguagem Visual Basic. Net, base de dados SQL Compact Server, Plataforma Windows XP sp3 ou superiores, Hardware de suporte, tela com resolução 1024X768 e formato do vídeo WMV/MP4. Estas permitem que o software tenha banco de dados seguro, cadastro de usuários, visualização de filmes, preenchimento da escala, cálculo do escore e geração de relatório. Como resultados, a avaliação técnica contribuiu com Layout e o teste de usabilidade mostrou que dez de quinze fisioterapeutas concordam fortemente que o software é usável na prática clínica, três concordam, enquanto que um discorda e outro discorda fortemente. Com relação ao tempo de aplicação, a FESDMD no software se mostrou mais rápida (p < 0.001). Foi possível desenvolver software para aplicação da FES-DMD. O instrumento promove ganho de tempo do fisioterapeuta, armazena dados e imagens de forma segura, gera relatórios e é usável na prática clínica / Due to the lack of reviews for Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), physiotherapists have developed and tested a confiabiliade Functional Evaluation of Duchenne Muscular Dystrophy (FES-DMD). In order to optimize your application was necessary software. The aim of this study was to develop and test the usability of software for application of FES-DMD. To develop the necessary software was an engineer, a programmer and a physiotherapist. After finalizing technical evaluation was carried out for five referees and applied usability testing with fifteen physiotherapists experts to evaluate the use of software in clinical practice and collect the time of application of FES-DMD. According to the characteristics required software has been developed with specifications: Visual Basic language.Net, database SQL Server Compact Platform, Windows XP sp3 or higher, Hardware Support, 1024X768 screen resolution and video format WMV/MP4. These allow the software to be secure database, user registration, inhouse movies, completing the scale score calculation and reporting. As a result, the technical evaluation contributed Layout and usability test showed that ten fifteen physiotherapists strongly agree that the software is usable in clinical practice, three agree, while one disagreed and one strongly disagrees. Regarding the time of application, the FES- DMD in software is faster (p < 0.001). It was possible to develop software for the application of FES- DMD. The instrument promotes gain time physiotherapist, stores images and data securely, generate reports, and is usable in clinical practice

Devido à carência de avaliações para Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), fisioterapeutas desenvolveram e testaram a confiabilidade da Functional Evaluation Duchenne Muscular Dystrophy (FES-DMD). Visando otimizar sua aplicação foi necessário um software. O objetivo deste estudo foi desenvolver e testar a usabilidade de software para aplicação da FES-DMD. Para desenvolver o software foi necessário um engenheiro, um programador e uma fisioterapeuta. Após finalização foi realizada avaliação técnica por cinco pareceristas e aplicado teste de usabilidade com quinze fisioterapeutas especialistas, para avaliar o uso do software na prática clínica e coletar o tempo de aplicação da FES-DMD. De acordo com as características exigidas o software foi desenvolvido com especificações: linguagem Visual Basic. Net, base de dados SQL Compact Server, Plataforma Windows XP sp3 ou superiores, Hardware de suporte, tela com resolução 1024X768 e formato do vídeo WMV/MP4. Estas permitem que o software tenha banco de dados seguro, cadastro de usuários, visualização de filmes, preenchimento da escala, cálculo do escore e geração de relatório. Como resultados, a avaliação técnica contribuiu com Layout e o teste de usabilidade mostrou que dez de quinze fisioterapeutas concordam fortemente que o software é usável na prática clínica, três concordam, enquanto que um discorda e outro discorda fortemente. Com relação ao tempo de aplicação, a FESDMD no software se mostrou mais rápida (p < 0.001). Foi possível desenvolver software para aplicação da FES-DMD. O instrumento promove ganho de tempo do fisioterapeuta, armazena dados e imagens de forma segura, gera relatórios e é usável na prática clínica / Due to the lack of reviews for Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), physiotherapists have developed and tested a confiabiliade Functional Evaluation of Duchenne Muscular Dystrophy (FES-DMD). In order to optimize your application was necessary software. The aim of this study was to develop and test the usability of software for application of FES-DMD. To develop the necessary software was an engineer, a programmer and a physiotherapist. After finalizing technical evaluation was carried out for five referees and applied usability testing with fifteen physiotherapists experts to evaluate the use of software in clinical practice and collect the time of application of FES-DMD. According to the characteristics required software has been developed with specifications: Visual Basic language.Net, database SQL Server Compact Platform, Windows XP sp3 or higher, Hardware Support, 1024X768 screen resolution and video format WMV/MP4. These allow the software to be secure database, user registration, inhouse movies, completing the scale score calculation and reporting. As a result, the technical evaluation contributed Layout and usability test showed that ten fifteen physiotherapists strongly agree that the software is usable in clinical practice, three agree, while one disagreed and one strongly disagrees. Regarding the time of application, the FES- DMD in software is faster (p < 0.001). It was possible to develop software for the application of FES- DMD. The instrument promotes gain time physiotherapist, stores images and data securely, generate reports, and is usable in clinical practice