Estudou-se o comportamento frente a radiação UV de células humanas XP12RO, deficientes em reparo-excisão de dímeros de pirimidina. Cinéticas de incorporação de precursor radiativo de DNA em tempos crescentes apos a exposição a UV mostraram uma rápida inibição da taxa de síntese, até se alcançar um platô bem abaixo do valor obtido para células não irradiadas. Tanto o tempo para que este platô fosse alcançado quanto o valor basal de síntese obtido dependiam da dose de UV fornecida. Este tempo era compatível com o necessário para que a maquinaria de replicação percorresse a distância média interdímeros esperada para a dose de UV aplicada. Verificou-se também que o DNA recém-sintetizado após UV apresentava um peso molecular e uma taxa de elongação bem menores que nos controles não irradiados, sugerindo todos estes resultados que o dímero se constitue num bloqueio temporário para a replicação de DNA. Utilizando uma metodologia baseada no tratamento do DNA nativo com S1 endonuclease de Aspergillus oryzae, específica para DNA simples-fita, foi possível detectar a existência de lacunas de DNA replicado após UV, lacunas estas que desaparecem gradativamente com o passar do tempo pós-irradiação. DNA não irradiado manteve-se refratário à enzima, nas mesmas condições. A digestão enzimática acarretava o aparecimento de duas populações distintas de DNA, uma de alto peso molecular e outra de peso molecular bem menor, ambas se equivalendo em quantidade. Este fenômeno pôde ser observado em uma ampla faixa de doses de UV, tanto em células XP12RO como em outras linhagens celulares, e mesmo sob condições diversas de proliferação celular. Além disso, o desaparecimento das lacunas, no caso de células de roedor previamente irradiadas com UV, era retardado pela presença de cafeína, um conhecido inibidor de reparo pós-replicação (RPR) nestas linhagens. Foi efetuada uma análise da progressão da forquilha de replicação e da distribuição de lacunas do DNA replicado após UV, através de ensaios enzimáticos combinados com bandeamento de DNA em gradientes isopícnicos de CsCl. Os resultados assim obtidos levaram-nos a considerar um modelo de replicação a partir de molde lesado onde síntese descontínua (3\'-5\') propicia a formação de lacunas, enquanto que síntese contínua (5\'-3\') é retardada temporariamente pela presença da lesão, sem contudo acarretar a formação de descontinuidades físicas no DNA replicado. A mesma metodologia de digestão de DNA com S1 endonuclease permitiu verificar a ocorrência de uma nítida relação causal entre a frequência de lacunas e a frequência correspondente de dímeros, em crescentes doses de UV, sugerindo fortemente que dímeros estão opostos às lacunas no DNA recém sintetizado. Além disso, um tratamento estatístico da cinética de clivagens enzimáticas observada para as lacunas tornou possível calcular a extensão física destas, detectando-se a presença de duas populações distintas, onde 65% correspondem a 1250 nucleotídeos e 35% correspondem a 150 nucleotídeos. Finalmente, foi verificado que DNA recém-sintetizado longos tempos após UV apresenta um drástico declínio da frequência de lacunas, não obstante a frequência de dímeros permanecer essencialmente inalterada. Estes resultados favorecem a hipótese de ocorrer um processo induzido de RPR, o qual permitiria à maquinaria de replicação transpor eficientemente os dímeros presentes, apesar destes não terem propriedades codificadoras. / The synthesis of DNA in human XP12RO cells, deficient in excision repair of pyrimidine dimers was studied. The rate of incorporation of radioactive precursors into DNA was measured at different times after irradiation. The DNA synthesis decreases shortly after irradiation, reaching a lateau whose value and time to be attained was dependent on the UV dose. This time period was the one expected for the replication machinery to coyer the interdimer distance at the UV dose applied. It was also verified that the newly synthesized DNA after UV irradiation presented much smaller molecular weight and elongation rate, when compared with the non-irradiated controls. These results suggest that the dimer imposes a delay to DNA replication machinery. Using a methodology based on the treatment of native DNA with S1-endonuclease from Aspergillus orizae, specific for single-stranded DNA, it was possible to detect gaps in the DNA replicated after UV treatment. Thesee gaps disapeared gradually with time after irradiation. The nonirradiated DNA remained refractory to the enzyme, under the same experimental conditions. The enzymatic digestion originated approximately equal alounts of two distinct double-stranded DNA populations, one of high molecular weight and other of much smaller molecular weight. This fenomenon could be seen on a wide range of UV doses, in XP12RO cells as well as in other cells lines, and did not depend on the particular conditions of cell proliferation. Furthermore, the gap disappearence, in the case of rodent cells previously irradiated with UV, was delayed by the presence of caffeine, a known post-replication repair (PRR) inhibitor in these cell lines. An analysis of the progression of the replication fork and of the distribution of gaps in the DNA replicated after UV irradiation was carried out through enzymatic assays combined with DNA banding in isopicnic CsCl gradients. The results thus obtained led us to consider a model for replication on damaged template, whereby gaps are formed only in the strand replicating opposite the fork movement (3\'-5\'). The strand replicating in the same direction as the fork movement (5\'-3\') is temporarily delayed by the presence of the lesion, without originating gaps in the replicative DNA. The same methodology of DNA digestion with S1-endonuclease permitted us to verify the occurrence of a nitid relationship between the gap frequency and the corresponding dimer frequency, for different doses of UV, strongly suggesting that the dimers are opposite the gaps in the newly-synthesized DNA. Furthermore, an statistical analysis of the dependende of DNA cleavage by S1-endonuclease on the enzyme concentration rendered it possible to calculate the size of the gaps. Two distinct populations were detected, 65% corresponding to 1250 nucleotides and 35% corresponding to 150 nucleotides. Finally, it was verified that the nascent DNA synthesized long periods after UV are essentially free of gaps although the dimer frequency remained almost unaltered. These results favour the hypothesis of the occurrence of an induced process of PRR, which would permit the replication machinery to efficiently bypass the dimers, in spite of the fact that these lesions do not exhibit codifying properties.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Rosmarinus officinalis L. is a species that has stood out for its intense popular use, the main product the essential oil. The work was ainmed determine the effect of sa-linity on the biomass period, content, yield, phytochemical composition and genotoxi-city of essential oil of rosemary.Dois experiments sheets were simultaneously per-formed between June 3, 2014 to December 12, 2015, the experiments were per-formed in the department of Plant Science at the Federal University of Santa Maria. In the first experiment, the control (T1) was employed in a nutrient solution with elet-rical conductivity (EC) of 1.0 dSm-1 and the other four treatments (T2, T3, T4, T5) was used with a nutrient solution conductivity electric 5,0 dSm-1. T2 plants were submitted to the salt solution for a period of 140 days after planting (DAP) in T3 to 150 in the 160 T4 and T5 to 170 DAP. All plants were collected on 12 December 2014 complet-ing a period of 190 days. The period in which the plants remained under saline condi-tions before the collection was 50, 40, 30 and 20 days in T2, T3, T4 and T5, respec-tively. In the second experiment it was also compared four periods of salinity (CE 5.0 dSm-1) and control (CE 1.0 dSm- 1). The planting was done on the same day of the experiment I and the supply of saline solution began on the same day of the first trial, but the harvest was delayed in order to increase the periods in which the plants re-mained in saline conditions. All plants were collected on 12 February 2015. Thus, the salinity period before the collection was 110, 100, 90 and 80 days for treatments T2, T3, T4 and T5, respectively. In both experiments the experimental design was ran-domized with five replications. The Extraction of oil from the leaves by hydrodistilla-tion in Clevenger was performed and then performed gas chromatography. The es-sential oil was evaluated for antiproliferative and genotoxic effects in cells of Allium Cepa at a concentration of 0.20 % for the oil of plants grown in different periods of salinity collected at 190 after planting. The biomass production data and essential oil were subjected to analysis of variance with polynomial regression and other data were compared by Scott-Knott test (p <0.05). The results showed that the salinity period through a nutrient solution with electrical conductivity of 5 dS m-1 linearly re-duces biomass, content and essential oil yield of rosemary plants in soilless culture. The major compounds of the essential oil were camphor, 1.8 cineol, verbenone, α-pinene and β-myrcene. And this in turn was not genotoxic nor showed significant an-tiproliferative effect, except that obtained from the plants that remained for a longer period of exposure to salinity, which inhibited cell division of Allium Cepa. / Rosmarinus officinalis L. é uma espécie que tem se destacado pelo seu intenso uso popular, tendo como principal produto o óleo essencial. O trabalho teve como objetivo determinar o efeito do período de salinidade sobre a fitomassa, teor, rendimento, composição fitoquímica e genotoxicidade do óleo essencial das folhas de alecrim. Dois experimentos foram realiza-dos simultaneamente no período entre 3 de junho de 2014 a 12 de dezembro de 2015, os experimentos foram realizados no Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal da Santa Maria. No experimento I, na testemunha (T1) foi empregada uma solução nutritiva com condutividade elétrica (CE) de 1,0 dSm-1 e nos demais quatro tratamentos (T2,T3,T4,T5) foi empregada uma solução nutritiva com condutividade elétrica de 5,0 dSm-1. Em T2 o fornecimento da solução salina foi iniciado aos 140 dias após o plantio (DAP), em T3 aos 150, em T4 aos 160 e em T5 aos 170 DAP. Todas as plantas foram coletadas no dia 12 de dezembro de 2014 completando um período de 190 dias. O período no qual as plantas permaneceram sob condições salina antes da coleta foi de 50, 40, 30 e 20 dias em T2, T3, T4 e T5, respectivamente. No experimento II também foram utilizados quatro perío-dos de salinidade (CE de 5,0 dSm-1) e a testemunha (CE de 1,0 dSm-1). O plantio foi feito no mesmo dia do experimento I e o fornecimento da solução salina iniciou-se nos mesmos dias do experimento I, porém a colheita foi retardada de forma a aumentar os períodos nos quais as plantas permaneceram em condições salinas. Todas as plantas foram coletadas no dia 12 de fevereiro de 2015. Dessa forma, o período de salinidade antes da coleta foi de 110, 100, 90 e 80 dias nos tratamentos T2, T3, T4 e T5, respectivamente. Em ambos os experi-mentos o delineamento experimental empregado foi casualizado, com cinco repetições. Foi realizada extração de óleo das folhas por hidrodestilação em Clevenger e posteriormente realizada cromatografia gasosa. Os óleos essenciais foram avaliados quanto aos efei-tos antiproliferativo e genotóxico em células de Allium cepa L. na concentração de 0,20 % para o óleo das plantas cultivadas nos diferentes períodos de salinidade coletadas aos 190 depois do plantio. Os dados de produção de fitomassa e rendimento de óleo essencial foram submetidos à análise de variância com regressão polinomial e os demais dados foram com-parados pelo teste Scott-Knott (p<0,05). Os resultados mostraram que o período de salini-dade através de uma solução nutritiva com condutividade elétrica de 5 dS m-1 reduz linear-mente a fitomassa, teor e rendimento de óleo essencial de plantas de alecrim em cultivo sem solo. Os compostos majoritários do óleo essencial foram cânfora,1,8 cineol, verbenona, α-pineno e β-mirceno. E esse, por sua vez não se mostrou genotóxico e nem apresentou efeito antiproliferativo significativo, com exceção daquele obtido a partir das plantas que permaneceram por um maior período de exposição à salinidade, que inibiu a divisão celular de Allium cepa.

A divisão bacteriana é efetuada por um complexo macromolecular conhecido como divisomo. Um componente central do divisomo é FtsZ, uma proteína homóloga de tubulina que se polimeriza no meio da célula formando uma estrutura em forma de anel (anel Z). O controle da divisão é exercido por proteínas que modulam a habilidade de FtsZ de formar o anel Z. Dois fatores principais estão envolvidos na seleção do correto sitio de divisão. O melhor estudado é o sistema Min, o qual é responsável pelo bloqueio específico de sítios de divisão não desejados nos polos da célula. O componente do sistema Min que inibe a polimerização de FtsZ é a proteína MinC e é sabido que MinC requer MinD para se ativar, mas o mecanismo dessa ativação não está completamente compreendido. No presente trabalho investigamos o papel da associação de MinD à membrana na ativação de MinC. Usando um mutante que não mais se associa à membrana (MinD&#916;MTS) mostramos que o efeito de MinC em inibir a divisão celular é altamente dependente de seu recrutamento à membrana por MinD. No entanto, ensaios in vitro mostraram que o complexo MinCD&#916;MTS é mais eficiente em desfazer polímeros de FtsZ que MinC sozinho, indicando que MinD promove a ativação de MinC por outro mecanismo além de recrutamento à membrana. Esta ativação pode resultar de um efeito alostérico ou da criação de um sítio para FtsZ na interface do complexo MinCD, porém resultados preliminares não conseguiram detectar aumento da afinidade de MinC por FtsZ quando na presença de MinD. / Bacterial division is performed by a macromolecular complex known as the divisome. The central component of the divisome is FtsZ, a tubulin protein homolog, which polymerizes at the mid-cell forming a ring-like structure (Z-ring). This division is regulated by proteins that modulate ability of FtsZ to form the Z-ring. Two principal factors are involved in selecting the correct site of division. The best-studied factor is the Min system, which is responsible for the specific blockade of unwanted potential sites in the cell poles. The component of the Min system that inhibits FtsZ polymerization is the MinC protein. MinC requires the MinD protein for activation, but the mechanism of this activation is not completely understood. Here, we investigate the role of the association of MinD to the membrane during MinC activation. Using a mutant that does not interact with the membrane (MinD&#916;MTS) we show that the effect of MinC in inhibiting cell division is highly dependent on its recruitment to the membrane by MinD. However, in vitro assays show that MinCD&#916;MTS is more efficient in disrupting FtsZ polymers than MinC alone, indicating that MinD promotes MinC activation by a mechanism other than membrane recruitment. This activation could be due to an allosteric effect or the formation of a site for FtsZ on the MinCD interface; however, preliminary results could not detect any increase in the affinity of FtsZ to MinC in the presence of MinD.

A divisão celular em B. subtilis inicia-se pela formação de um complexo multiprotéico, o divisomo, no sítio onde a bactéria irá se dividir. FtsZ é a primeira proteína a se localizar no futuro sitio de divisão, formando uma estrutura em anel (anel Z) que se estende por toda a circunferência da célula. O anel Z funciona como um arcabouço responsável por recrutar outras quinze proteínas de divisão que irão participar da montagem do divisomo. Nesta tese, utilizamos abordagens quantitativas e qualitativas de microscopia de fluorescência vital para estudarmos duas questões ainda não esclarecidas sobre o funcionamento do divisomo. A primeira delas é como o divisomo é montado. Para estudarmos a montagem do divisomo nós realizamos ensaios de co-localização entre o anel Z (FtsZ-mCherry) e as proteínas ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB , DivIVA, e MinC fusionadas a GFP. Quanto maior a freqüência de co-localização entre FtsZ e outra proteína de divisão, mais inicial é a participação da proteína na formação do divisomo. Portanto, a medida da freqüência de co-localização entre o anel Z e as proteínas componentes do divisomo permite que se deduza uma cinética da montagem deste complexo. Estes ensaios demonstraram uma freqüência de co-localização de 97,33% para ZapA; 98,31% para EzrA; 83,90% para FtsW; 78,43% para FtsL; 50% para YpsB; 41,7% para DivIVA e 31,64% para MinC. Estes resultados sugerem que o divisomo seja formado em três etapas. ZapA e EzrA se associam ao divisomo imediatamente após a formação do anel Z, em seguida FtsW e FtsL são recrutados para o divisomo, e por último YpsB, DivIVA, MinC associam-se ao divisomo. A segunda questão que investigamos nesta tese foi o mecanismo da mudança de posição do divisomo que ocorre durante a esporulação em B. subtilis. Na fase de esporulação a célula divide-se assimetricamente, com a formação do septo próxima a um dos pólos. Durante o crescimento vegetativo a divisão não ocorre próxima aos pólos por causa da ação das proteínas MinC, MinD e DivIVA, importantes reguladores espaciais da divisão. MinCD e DivIVA são inibidores da formação do anel Z que durante o crescimento vegetativo se localizam nos pólos das células.. Uma hipótese para explicar o uso dos sítios polares para a divisão durante a esporulação seria que as proteínas MinCD e DivIVA seriam removidas dos pólos celulares. Para testarmos esta hipótese, estudamos a localização das proteínas MinCD e DivIVA durante a esporulação. Nossos resultados demonstraram que MinCD e DivIVA se re-localizam e saem dos pólos celulares durante a esporulação. Porém esta dinâmica ocorre após a formação do anel Z assimétrico, sugerindo que o anel Z seja insensível a estes inibidores durante a esporulação. Por ensaios genéticos em B. subtilis demonstramos que a proteína SpoIIE, conhecida como provável proteína responsável por promover a formação do septo assimétrico, seja capaz de contrapor a ação de MinC no início da esporulação. Dessa maneira nós propomos um novo modelo de mudança da divisão simétrica para assimétrica durante a esporulação, diferentemente da simples saída do complexo MinCD dos pólos como é proposto na literatura. / Bacillus subtilis division begins through the formation of a multiprotein complex, the divisome, at the site of division. FtsZ is the earliest known protein to localize to the future division site where the protein forms a ring-like structure (Z-ring) that extends around the circumference of the cell. The Z-ring functions as a scaffold and recruits about fifteen other division proteins that compose the divisome. In this work, we used quantitative and qualitative methods of vital fluorescence microscopy to study two questions that have not been elucidated about the divisome dynamics. The first is how divisome is assembled. To address that problem, we made co-localization between Z-ring (FtsZ-mCherry) and proteins ZapA, EzrA, FtsW, FtsL, YpsB, DivIVA, and MinC fused to GFP. Higher is the match between GFP fusions to Z-ring, earlier is the assembly of division proteins to divisome. Therefore, the co-localization frequency between Z ring and divisome proteins will allow us to deduce the assemble kinetics of the divisome. This assays showed a co-localization frequency of 97,33% for ZapA; 98,31% for EzrA; 83,90 for FtsW; 78,43% for FtsL; 50% for YpsB; 41,7% for DivIVA and 31,64% for MinC. This data suggests that the divisome does not assemble in two but in three steps. ZapA and EzrA assemble into the divisome immediately after Z ring formation, secondly FtsW and FtsL were recruited to the divisome, and finally YpsB, DivIVA, MinC associated with the divisome. The second question that we investigated in this work is the mechanism responsible for change the divisome position that occurs during sporulation in B. subtilis. In sporulation the cell divides asymmetrically, with a septum formation near poles. During vegetative grown the divisiome does not occur near poles because of MinC, MinD and DivIVA action, relevant for spatial regulation of division. MinCD and DivIVA are inhibitors of Z ring formation that during vegetative growth are located at poles. A hypothesis to explain the use of polar sites for division during sporulation would be that MinCD and DivIVA would be removed from cellular poles. To test this hypothesis, we studied the location of MinCD and DivIVA proteins during sporulation. Our results demonstrated that MinCD and DivIVA re-localize and leave to cell poles during sporulation. However this process occurs after asymmetric Z ring formation, suggesting that Z ring would be unresponsive to this inhibitors during sporulation. Through genetics assays in B. subtilis we demonstrated that SpoIIE protein, known to probably play a role in asymmetric septum formation, would be able to contrapose MinC action during early sporulation. Therefore, we propose a novel model for change the symmetric to asymmetric division during sporulation, unlike the release of MinCD from pole proposed in the literature.

A utilização do vírus adeno-associado recombinante (AAVr) como vetor de transferência gênica em células tumorais está crescendo. Neste trabalho, o promotor gênico de E2F-1, um promotor ativo durante a divisão celular, foi inserido no AAVr e utilizado para dirigir a expressão do HSV-tk ou luciferase e, simultaneamente, eGFP afim de direcionar a expressão viral para células em proliferação. Em paralelo, foram construídos vetores portadores do promotor constitutivo CMV para servir como controles. O promotor gênico de E2F-1 não foi eficiente em dirigir a expressão dos transgenes na linhagem celular HT1080, enquanto o promotor CMV apresentou uma alta expressão dos repórteres e do gene terapêutico. A baixa eficiência do promotor E2F-1 ainda não foi explorada, mas poderia ser relacionada com o desempenho intrínseco deste promotor, a biologia do vetor AAVr e especificidade celular. Contudo, o bom desempenho do vetor AAVr contendo o promotor CMV abre a possibilidade de realizar novos ensaios de transferência gênica para tratamento e visualização de células tumorais / The utilization of recombinant adeno-associated virus (AAVr) as a gene transfer vector in tumor cells is increasing. In this work, the promoter of the E2F-1 gene, active during cell division, was inserted in an AAVr vector and used to drive the expression of HSV-tk or luciferase and, simultaneously, eGFP with the intent of limiting viral expression to proliferating cells. Also, vectors with the constitutive CMV promoter were constructed to be used as controls. The E2F-1 promoter was not efficient in driving the expression of the transgenes in the HT1080 cell line, while the CMV promoter shows high level expression of the reporter and the therapeutic genes. The low efficiency of E2F promoter has not yet been explored, though this problem could be related to the intrinsic performance of this promoter, the biology of the vector AAV and cell-specific factors. However, the performance of the AAVr containing the CMV promoter creates the possibility of performing new gene transfer protocols for the treatment and visualization of tumor cells.

Um dos principais componentes envolvidos no processo de divisão celular bacteriana é FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica. FtsZ polimeriza no interior da célula formando um anel ao qual dá-se o nome de anel Z, responsável pelo recrutamento de diversas outras proteínas de divisão, formando o divisomo. Como meio de sobrevivência sob condições adversas, alguns procariotos, como B. subtilis, podem sofrer um tipo de diferenciação celular que forma um organismo em estado latente, conhecido como esporo. A primeira etapa da formação do esporo é a mudança da posição do anel Z para mais próximo a um dos pólos da célula, produzindo duas células com tamanhos diferentes. SpoIIE é uma proteína fosfatase integral de membrana, que se localiza especificamente no septo assimétrico de uma célula em processo de esporulação. Além de um papel na ativação do fator de transcrição de esporulação &#963;F, SpoIIE se liga a FtsZ e a auxilia na formação do septo assimétrico. Para definirmos a região de FtsZ responsável pela interação com SpoIIE, neste trabalho foram realizados ensaios de duplo-híbrido utilizando vetores com domínios de ativação e de ligação ao DNA do fator de transcrição GAL4 de levedura fusionados a diferentes porções de FtsZ, bem como a SpoIIE. Esses experimentos não forneceram informações sobre interação entre essas proteínas, já que através deles não foi possível reproduzir o resultado positivo descrito na literatura. Como alternativa ao duplo-hibrido para identificarmos o sítio de interação entre as duas proteínas, criamos uma triagem genética capaz de identificar mutantes de FtsZ que não interagem com SpoIIE, fazendo uso de uma biblioteca de mutantes de FtsZ já disponível no laboratório. Foi padronizada uma técnica de microscopia em larga escala em placas de 96 poços, que permitiu a triagem de mais de mil de mutantes de FtsZ, em busca de um em que SpoIIE-GFP induzido não localizasse no anel Z em célula vegetativa. Porém todos os mutantes triados ainda localizavam SpoIIE-GFP. Paralelamente, foi realizada uma triagem de supressão, utilizando como ponto de partida um mutante de SpoIIE que perdeu capacidade de interagir com FtsZ e buscando mutações em FtsZ que reestabelecessem a interação com SpoIIE mutante. Foram triados cerca de 35000 mutantes nesse ensaio, dentre os quais dezoito apresentaram o fenótipo esperado para um supressor. No entanto, todos os candidatos selecionados tratavam-se de falsos-positivos. O motivo que leva esses candidatos a apresentarem o fenótipo esperado sem reestabelecer a interação entre as duas proteínas ainda é desconhecido. A fim de confirmar se não haveria outras proteínas do divisomo responsáveis por intermediar a interação entre FtsZ e SpoIIE, foram feitos experimentos de co-localização de FtsZ e SpoIIE na ausência de DivIB e FtsA. Em ambos os casos SpoIIE ainda localiza no divisomo, descartando a possibilidade de que DivIB e FtsA sejam mediadores da interação FtsZ-SpoIIE. Por fim, foram realizados experimentos de co-localização de SpoIIE com mutantes de FtsZ previamente identificados em outros experimentos em nosso laboratório. Nesse experimento foi identificado que a expressão de SpoIIE-GFP induzida por IPTG é capaz de reestabelecer a frequência de divisão no mutante FtsZ-R376T, que normalmente é deficiente na formação de divisomos. Esse resultado reforça a idéia de que essas proteínas interagem diretamente, e sugere que SpoIIE é capaz de reestabelecer a atividade de FtsZ em um mutante que apresente falhas na polimerização. / One of the major components involved in bacterial cell division is FtsZ, a protein homologous to the eukaryotic tubulin. FtsZ polymerizes inside the cell forming a ring to which is given the name Z ring, wich is responsible for the recruitment of several other proteins division, forming the divisome. As a means of survival under adverse conditions, some prokaryotes such as B. subtilis may undergo a type of cell differentiation that results in an organism in a latent state, known as a spore. The first stage of the spore formation is to change the Z ring position closer to the poles of the cell, producing two cells of different sizes. SpoIIE is an integral membrane phosphatase protein, which is specifically located in the septum of an asymmetric cell in sporulation process. In addition to a role in the activation of the sporulation transcription factor &#963;F, SpoIIE binds to FtsZ and assists in the formation of the asymmetric septum. To define the FtsZ region responsible for interaction with SpoIIE, in this work we performed tests using two-hybrid vectors with activation and DNA binding domains of the yeast transcription factor GAL4 fused to different portions of FtsZ and SpoIIE. These experiments did not provide information on the interaction between these proteins, since through them it was not possible to reproduce the positive results reported in the literature. As an alternative to the two-hybrid to identify the site of interaction between the two proteins, we created a genetic screening that can identify FtsZ mutants that cannot interact with SpoIIE, using a library of FtsZ mutants already available in the laboratory. We standardized a large scale microscopy using 96-well plates, allowing the screening of over a thousand mutants of FtsZ in search of a induced SpoIIE-GFP which would no longer localize at the vegetative cell Z ring. However, all the screened mutants still localized SpoIIE-GFP. In parallel, we performed a screening of suppression, using as a starting point a SpoIIE mutant that lost the ability to interact with FtsZ and searching for mutations in FtsZ that would reestablish interaction with the SpoIIE mutant. We screened approximately 35,000 mutants in this essay, eighteen of which showed the phenotype expected for a suppressor. However, all selected candidates were false positives. The reason why such candidates do show the expected phenotype without reestablishment of the interaction between the two proteins is still unknown. In order to confirm whether there would be other divisiome proteins responsible for mediating the interaction between FtsZ and SpoIIE, co-localization experiments were made using FtsZ and SpoIIE in the absence of DivIB and FtsA. In both cases SpoIIE still located in divisome, ruling out the possibility that DivIB and FtsA are essencial mediators of the SpoIIE-FtsZ interaction. Finally, co-localization experiments were carried out with SpoIIE and FtsZ mutants previously identified in other experiments in our laboratory. In this experiment it was identified that the expression of IPTG-induced SpoIIE-GFP is able to restore the division frequency in the FtsZ-R376T mutant, which normally is deficient in the formation of divisomes. This result reinforces the idea that these proteins interact directly, and suggests that SpoIIE is able to restore the activity of FtsZ in a mutant that presents defect in polymerization.

A divisão celular nas bactérias requer a formação do divisomo, um complexo protéico que tem como o primeira etapa a polimerização da proteína FtsZ, seguida pela associação de 15 outras proteínas conhecidas. Os mecanismos envolvidos na regulação espacial do divisomo são bem caracterizados, mas o controle temporal da divisão celular em relação a outros eventos do ciclo, como a replicação do cromossomo, segue controversa. Neste trabalho, aplicamos a metodologia de microscopia de série temporal para estudar duas questões fundamentais do processo de divisão: a montagem do complexo que executa a divisão e a possibilidade da oscilação periódica na expressão de um ou mais genes envolvidos em divisão possa participar do controle temporal da montagem do divisomo. Para investigar se há oscilação da expressão gênica, construímos inicialmente variantes instáveis GFP através da adição de sequências peptídicas C-terminais que encaminham para a degradação em B. subtilis e utilizamos estes repórteres para criar fusões transcricionais sob o controle de promotores de genes centrais do processo de divisão. Depois de otimizar as condições de microscopia de série temporal com fusões transcricionais usando a variante instável GFPAISV, observamos que a autofluorescência de B. subtilis interferia nas nossas quantificações. Como forma de contornar a autofluorescência, construímos então fusões transcricionais com duas variantes de YFP (proteína fluorescente amarela) e optamos por trabalhar com Ypet-AISV. A análise de filmes de células individuais, tanto com fusões a GFPAISV como a Ypet-AISV, indicou que apenas o promotor do operon ftsL-pbpB apresentava um padrão de oscilação significativamente diferente de um promotor artificial usado como controle negativo. Esta hipótese, no entanto, não foi confirmada por medidas estáticas de populações de células nas quais correlacionamos intensidade de fluorescência com posição no ciclo celular. Portanto, nossos dados não foram capazes de evidenciar flutuações na expressão dos genes ftsL-pbpB, minCD, ftsZ, ftsA e zapA ao longo do ciclo celular. Para estudar a cinética de montagem divisomo foram realizados experimentos de microscopia de série temporal de FtsZ-mCherry e Pbp2B-GFP, onde observamos que a associação de Pbp2B ao divisomo ocorre 3 minutos após a formação do anel de FtsZ em meio rico e 4 minutos em meio mínimo. Também realizamos experimentos de microscopia de série temporal com uma cepa contendo FtsZ-YFP e DivIVA-CFP, determinando que DivIVA é incorporado ao divisomo 16 minutos após a formação do anel de FtsZ em meio rico e 20 minutos em meio mínimo. Estes dados confirmam que a montagem do divisomo ocorre em três etapas, e não duas, como anteriormente proposto. / Cell division in bacteria requires the formation of the divisome, a protein complex that has as the first step polymerization of FtsZ, followed by the assembly of 15 other known proteins. The mechanisms that underlie spatial regulation of divisome assembly have been largely elucidated, but the temporal control that ties the timing of cell division to other cell cycle events, such as chromosomal replication, remains surrounded by controversy. In this work, we use time-lapse microscopy to address two issues in B. subtilis cell division: the timing of divisome assembly, and the possibility that a periodic oscillation in expression of one or more genes essential for divisome assembly may play a role in defining the timing of cell division. To study the possibility of oscilation in gene expression, we have first built unstable variants of GFP by adding to its C-terminus peptide sequences that target the protein for degradation and used those variants to build transcriptional fusions to access the promoter activity of core cell division genes. After optimizing time-lapse conditions with transcriptional fusions to cell divison genes with the unstable GFPAISV, we observed that B. subtilis autofluorescence was an issue to our quantifications. To improve our signal-to-noise ratio, we built transcriptional fusions with two variants of YFP (Yellow Fluorescent Protein), and decided to work with Ypet. In our single-cell analysis for GFPAISV and for Ypet-AISV, only the ftsL operon promoter presented an oscilating pattern different from our negative control. This was not confirmed, however, when we attempted to correlate fluorescence signal with cell cycle position in static single-cell measurements. Thus, we conclude that that there are no fluctuations in ftsL, pbpB, minCD, ftsZ, ftsA or zapA gene expression throughout the cell cycle. To study divisome assembly we performed time-lapse microscopy of FtsZ-mCherry and Pbp2B-GFP, and determined that the association of Pbp2B occurs 3 minutes after FtsZ polymerization in rich medium and 4 minutes in minimal medium. We also performed time-lapse microscopy with FtsZ-YFP and DivIVA-CFP, determining that DivIVA is incorporated to the divisome in 16 minutes after FtsZ polymerization in rich medium and 20 minutes in minimal medium. This data confirms the assembly of the divisome in three steps rather than two, as previously proposed.

A divisão celular bacteriana é orquestrada por FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica que possui a capacidade de polimerizar e gerar uma estrutura chamada de anel Z. O local onde esta estrutura citoesquelética contrátil é formada determina o futuro sítio de divisão. O complexo MinCD é um dos principais reguladores da posição da divisão, favorecendo a montagem do anel Z precisamente na região medial da bactéria. MinCD age como um inibidor sítio específico da polimerização de FtsZ, atuando preferencialmente nos polos celulares. MinC é a proteína do complexo que atua diretamente sobre FtsZ e inibe sua polimerização. Essa tese elucida a interação entre FtsZ e MinC e sugere o mecanismo exercido por MinC em Bacillus subtilis. Foi triada uma biblioteca de mutantes randômicos de FtsZ para identificação de mutantes resistentes à ação de MinC. Dentre estes, as substituições K243R e D287V, quando caracterizados usando espalhamento de luz e espectroscopia de fluorescência impediram a interação com MinC. Como as mutações estavam localizados em torno das hélices H-9 e H-10 no domínio C-terminal de FtsZ, concluímos que esta região representa o sítio de interação com MinC desta proteína. Como complemento ao mapeamento do sitio de ligação de MinC em FtsZ, identificamos a região de MinC que interage com FtsZ. Para tanto, escolhemos resíduos de MinC para mutagênese e caracterização. A escolha priorizou os resíduos conservados entre espécies Gram-positivas, experimentos de RMN, carga e exposição ao solvente dos mesmos. Dentre os resíduos de MinC mutados que afetaram sua capacidade de inibir a polimerização de FtsZ in vitro foram: Y8 e K12 (&#946;-1), K15 (alça-2), H55 (&#946;-3) , H84 (&#946;-4) e K149 (C-terminal). Sendo assim, podemos concluir que a face de interação para FtsZ em MinC de B. subtilis é a única folha &#946; do domínio N-terminal desta proteína. Com base nos sítios mapeados das duas proteínas experimentalmente, criamos um modelo in silico do complexo MinC-FtsZ por docking molecular. De acordo com o modelo gerado, MinC interage com a porção lateral de polímeros de FtsZ. Isto sugere que MinC atue na inibição da formação de feixes de filamentos de FtsZ, impedindo assim a formação de anéis Z funcionais. Esse mecanismo de ação do sistema Min é diferente do proposto para E. coli, no qual MinC interage com a face de polimerização FtsZ-FtsZ e impede a formação de protofilamentos de FtsZ. / Bacterial cell division is orchestrated by FtsZ, a protein homologous to eukaryotic tubulin that has the ability to polymerize and generate a cytoplasmic structure called the Z ring. The subcellular location where this cytoskeletal structure is formed determines the future division site. The MinCD complex is one of the main regulators of the position of cell division, driving the assembly of Z-ring precisely at the medial region of the cell. MinCD acts as a site-specific inhibitor of FtsZ polymerization, blocking Z ring formation at the cell poles. MinC is the protein of the complex that acts directly on FtsZ and inhibits its polymerization. This thesis elucidates the interaction between FtsZ and MinC and suggests the MinC mechanism in Bacillus subtilis. An ftsZ randomly mutagenized library was screened to identify mutants that are resistant to MinC action. Using right-angle light scattering and fluorescence spectroscopy we showed that substitutions K243R and D287V lost the interaction to MinC. These substituted residues clustered around the H-9 and H-10 helices in the C-terminal domain of FtsZ, thus, we conclude that this region is the binding site for MinC. In addition to mapping the MinC binding site on FtsZ, we also identified the FtsZ binding site in MinC. Based on residue conservation, NMR experiments and exposure to solvent, we chose residues of MinC for mutagenesis and characterization. The substituted residues that di srupted MinC ability to inhibit FtsZ polymerization in vitro were: Y8 and K12 (&#946;-1), K15 (turn-2) , H55 (&#946;-3), H84 (&#946;-4) and K149 (C-terminal). Thus, we conclude that the binding site of MinC for FtsZ is located on the &#946; only sheet at the N-terminal domain of MinC from B. subtilis. Finally, based on the binding sites of the two proteins mapped experimentally, we created a model of the complex between MinC and FtsZ by molecular docking. According to the generated model, MinC interacts with the lateral portion of FtsZ polymers. This indicates that MinC should inhibit assembly of higher order FtsZ polymers, thereby preventing the formation of a functional Z-ring. This mechanism of Min is different from that proposed in E. coli, in which MinC interacts with FtsZ polymerization interface and inhibits FtsZ protofilament formation.

O mecanismo de divisão mais comum entre procariotos é a divisão binária, na qual a célula- mãe reparte seu genoma e conteúdo citoplasmático de forma igual entre duas células filhas. Esse processo é mediado por um complexo protéico especializado, chamado divisoma, composto por cerca de 20 proteínas, que promovem a constrição da parede celular e membrana citoplasmática, formando o septo de divisão. O complexo é organizado em torno do anel Z, uma estrutura em anel composta pela proteína FtsZ, um homólogo de tubulina presente na maioria dos procariotos e em algumas organelas de eucariotos. Partindo de um levantamento detalhado da distribuição dos genes do divisoma em genomas completos de procariotos, aplicamos métodos de máxima verossimilhança para inferência de estados ancestrais e reconstruímos o conteúdo gênico do divisoma no ultimo ancestral comum das bactérias atuais. Estendendo essas análises com a aplicação de métodos filogenéticos, inferimos os eventos responsáveis pelas variações de composição deste complexo, observadas entre os diferentes grupos de bactérias. Nossos resultados mostram que o último ancestral comum de todas as bactérias já possuía a maior parte dos componentes conhecidos do divisoma, sugerindo a existência de uma parede de peptideoglicano e a presença de um aparato molecular tão ou mais complexo que o observado nas linhagens atuais, incluindo a presença de componentes considerados acessórios e de distribuição relativamente restrita, como as proteínas envolvidas na localização do anel Z (sistema Min) e alguns efetores positivos da polimerização de FtsZ. Observamos também que a evolução do complexo não foi muito afetada por eventos de transferência lateral, mas apresenta vários exemplos de perda de genes, em especial em linhagens com genoma reduzido, o que sugere a redundância de vários componentes já presentes no ancestral e a freqüente redução da complexidade, pelo menos dos componentes centrais do divisoma. Episódios de expansão de famílias de componentes do divisoma em linhagens específicas e os mecanismos evolutivos responsáveis pela incorporação de tais variações são discutidos. A caracterização da história evolutiva detalhada do divisoma, aqui apresentada, poderá servir como ponto de partida para novas análises evolutivas e como base para elaboração de experimentos funcionais. / The most common cell division mechanism among prokaryotes is binary fission, where a mother cell partitions its cytoplasm and genome equally among two daughter cells. This process is mediated by a specialized protein complex, known as the divisome, composed of around 20 proteíns, that promotes constriction of the cell wall and cytoplasmic membrane, thus forming the division septa. The complex is organized around the Z-ring, a ring-shaped struture composed by FtsZ, a tubulin homolog present in most prokaryotes and some eukaryotic organelles. After a detailed revision of the distribution of divisome genes among completely sequenced prokaryotic genomes, we applied maximum likelihood methods for the inference of ancestral states and reconstructed the gene content of the divisome in the last common ancestor of all extant bacteria. We then performed phylogeneticanalysis of all cell division genes and inferred the series of events responsible for the observed variations of the complex´s composition among bactérial lineages and their common ancestor. Our results show that the last common ancestor of all bacteria already possessed most of the known divisome components, thus suggesting the existence of a peptidoglycan cell wall and the presence of a molecular apparatus, perhaps more complex than those found in extant bacteria, including the presence of some accessory components with a somewhat restricted distribution, like the proteíns involved in the localization of the Z-ring (Min sistem) and some positive effectors os FtsZ polimerization. We also observed that the complex´s evolution was almost never the subject of horizontasl gene transfer events, but shows several examples of gene loss, specially in lineages displaying clear signs of genome reduction, thus suggesting the redundancy of several components in the ancestral divisome and a certain degree complexity reduction, at least for core components of the divisome. Lineage specific expansion of divisome component and the evolutionary mechanisms behind such processes are discussed. This characterization of the detailed evolutionary history of the divisome might serve as a starting point for new evolutionary analysis and as a basis for the design of functional experiments.

A divisão celular bacteriana é orquestrada por FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica que possui a capacidade de polimerizar e gerar uma estrutura chamada de anel Z. O local onde esta estrutura citoesquelética contrátil é formada determina o futuro sítio de divisão. O complexo MinCD é um dos principais reguladores da posição da divisão, favorecendo a montagem do anel Z precisamente na região medial da bactéria. MinCD age como um inibidor sítio específico da polimerização de FtsZ, atuando preferencialmente nos polos celulares. MinC é a proteína do complexo que atua diretamente sobre FtsZ e inibe sua polimerização. Essa tese elucida a interação entre FtsZ e MinC e sugere o mecanismo exercido por MinC em Bacillus subtilis. Foi triada uma biblioteca de mutantes randômicos de FtsZ para identificação de mutantes resistentes à ação de MinC. Dentre estes, as substituições K243R e D287V, quando caracterizados usando espalhamento de luz e espectroscopia de fluorescência impediram a interação com MinC. Como as mutações estavam localizados em torno das hélices H-9 e H-10 no domínio C-terminal de FtsZ, concluímos que esta região representa o sítio de interação com MinC desta proteína. Como complemento ao mapeamento do sitio de ligação de MinC em FtsZ, identificamos a região de MinC que interage com FtsZ. Para tanto, escolhemos resíduos de MinC para mutagênese e caracterização. A escolha priorizou os resíduos conservados entre espécies Gram-positivas, experimentos de RMN, carga e exposição ao solvente dos mesmos. Dentre os resíduos de MinC mutados que afetaram sua capacidade de inibir a polimerização de FtsZ in vitro foram: Y8 e K12 (&#946;-1), K15 (alça-2), H55 (&#946;-3) , H84 (&#946;-4) e K149 (C-terminal). Sendo assim, podemos concluir que a face de interação para FtsZ em MinC de B. subtilis é a única folha &#946; do domínio N-terminal desta proteína. Com base nos sítios mapeados das duas proteínas experimentalmente, criamos um modelo in silico do complexo MinC-FtsZ por docking molecular. De acordo com o modelo gerado, MinC interage com a porção lateral de polímeros de FtsZ. Isto sugere que MinC atue na inibição da formação de feixes de filamentos de FtsZ, impedindo assim a formação de anéis Z funcionais. Esse mecanismo de ação do sistema Min é diferente do proposto para E. coli, no qual MinC interage com a face de polimerização FtsZ-FtsZ e impede a formação de protofilamentos de FtsZ. / Bacterial cell division is orchestrated by FtsZ, a protein homologous to eukaryotic tubulin that has the ability to polymerize and generate a cytoplasmic structure called the Z ring. The subcellular location where this cytoskeletal structure is formed determines the future division site. The MinCD complex is one of the main regulators of the position of cell division, driving the assembly of Z-ring precisely at the medial region of the cell. MinCD acts as a site-specific inhibitor of FtsZ polymerization, blocking Z ring formation at the cell poles. MinC is the protein of the complex that acts directly on FtsZ and inhibits its polymerization. This thesis elucidates the interaction between FtsZ and MinC and suggests the MinC mechanism in Bacillus subtilis. An ftsZ randomly mutagenized library was screened to identify mutants that are resistant to MinC action. Using right-angle light scattering and fluorescence spectroscopy we showed that substitutions K243R and D287V lost the interaction to MinC. These substituted residues clustered around the H-9 and H-10 helices in the C-terminal domain of FtsZ, thus, we conclude that this region is the binding site for MinC. In addition to mapping the MinC binding site on FtsZ, we also identified the FtsZ binding site in MinC. Based on residue conservation, NMR experiments and exposure to solvent, we chose residues of MinC for mutagenesis and characterization. The substituted residues that di srupted MinC ability to inhibit FtsZ polymerization in vitro were: Y8 and K12 (&#946;-1), K15 (turn-2) , H55 (&#946;-3), H84 (&#946;-4) and K149 (C-terminal). Thus, we conclude that the binding site of MinC for FtsZ is located on the &#946; only sheet at the N-terminal domain of MinC from B. subtilis. Finally, based on the binding sites of the two proteins mapped experimentally, we created a model of the complex between MinC and FtsZ by molecular docking. According to the generated model, MinC interacts with the lateral portion of FtsZ polymers. This indicates that MinC should inhibit assembly of higher order FtsZ polymers, thereby preventing the formation of a functional Z-ring. This mechanism of Min is different from that proposed in E. coli, in which MinC interacts with FtsZ polymerization interface and inhibits FtsZ protofilament formation.